DE4123263C2 - Verfahren zur selektiven quantitativen Bestimmung der Konzentration von Lektinen, insbesondere Mistel-Lektinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven quan­ titativen Bestimmung der Konzentration einzelner Lektine aus Gemischen von Lektinen, insbesondere Mistel-Lektine, enthaltenden Pflanzenpräparaten.

Mistelpräparate, insbesondere Mistelextrakte, werden seit langer Zeit in der Krebstherapie eingesetzt. Als mögliche aktive Stoffe enthalten die Mistelpräparate verschiedene Lektine sowie Viscotoxine und weitere Zellproteine, deren cytotoxische, cytostatische und immunmodulatorische "in vitro" Aktivitäten nachgewiesen wurden. Mistel-Lektine zeigen solche Aktivitäten bereits in hoher Verdünnung. In Mengen im Mikrogramm-Bereich sind sie bereits giftig. Mistelpräparate enthalten je nach Herkunft (Art des Wirts und Standort) unterschiedliche Konzentrationen an Mi­ stel-Lektinen, wobei man zumindest zwei verschiedene Lek­ tine unterscheidet. Diese werden Mistel-Lektin I (ML I) und Mistel-Lektin II (ML II) genannt, wobei die Existenz weiterer Mistel-Lektine vermutet wird. Da die Mistel-Lek­ tine unterschiedliche Aktivität besitzen, besteht nicht nur ein Interesse daran, die gesamte Konzentration an Mistel-Lektinen in einem Präparat bestimmen zu können, sondern eine selektive quantitative Bestimmung der Kon­ zentration einzelner Lektine in einem Mistelpräparat.

Bisher beschriebene Nachweismethoden sind nicht quanti­ tativ oder nur halbquantitativ durchführbar. Hierzu gehö­ ren die Methode nach Rouge unter Anwendung der Immundif­ fusion (Rouge, P., Pere, D., In: Bog-Hansen, T.C. Ed.: Lectins. Biology, Biochemistry, Clinical Biochemistry, Vol. II, 137-150 (1982)), die Bestimmung durch Hämagglu­ tination (Lis, H., Sharon, N., Ann. Rev. Biochem., 42:541-574 (1982)), der von Ziska publizierte ELISA mit anti-ML Antikörpern als erstem "Layer" (Ziska, P., Franz, H., Determination of lectin contents in commercial mistletoe preparations for cancertherapy using the ELISA technique. In: Bog-Hansen, T. (Ed.): Proc. 6th Int. Lectin Meeting, Poznan 1984, Vol. IV: Lectins. Biology, Bio­ chemitry, Clinical Biochemistry, 473-480 (1985)), der so­ wohl aktives Lektin als auch inaktivierte Lektin-Bestand­ teile erfaßt, sowie der von Vang beschriebene ELISA-Test mit Asialoorosomucoid oder Asialofetuin als erstem "Layer", der nur aktive Lektine nachweist, jedoch nicht zwischen Mistel-Lektin-Subgruppen zu diffenzieren vermag (Vang, O., Larsen, K., Bog-Hansen, T., A new quantitative and hihgly specific assay for lectin-binding activity. In: Bog-Hansen, van Driesche. Proc. 7th Int. Lectin Meet­ ing, Brussels, 1985, Vol. V: Lectins. Biology, Bio­ chemistry, Clinical Biochemistry, 637- 644 (1986)). Dies ist darauf zurückzuführen, daß die einzelnen Lektine der Mistel sich ähnlich verhalten.

Ein von Willer publizierter ELISA benutzt einen Anti-Lektin- Antikörper (in diesem Falle gegen ein Lektin aus der Brennessel) ebenfalls als ersten "Layer" (F. Willer, H. Wagner, E. Schecklies, Deutsche Apothekerzeitung 131, Jahrgang 1991, Nr. 24, S. 1217-1221).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine se­ lektive quantitative Nachweismethode zur getrennten Kon­ zentrationsbestimmung einzelner Lektine, insbesondere Mistel-Lektine in Mistelpräparaten zu schaffen, die auch noch zuverlässige Konzentrationsbestimmungen in hochver­ dünnten Präparaten ermöglicht.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen im Anspruch 1.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß bestimmte Neoglykoproteine in trägergebundener Form einzelne Lektine, insbesondere sehr ähnliche Lektine, aus einem Gemisch von Lektinen in selektiver Weise zu binden ver­ mögen, die eine quantitative Bestimmung dieser Lektine auch aus hoher Verdünnung ermöglicht. Es können verschie­ dene Lektine einer Pflanzenart und insbesondere der glei­ chen bzw. derselben Pflanze und besonders Mistel-Lektine aus Gemischen bestimmt werden. Gemäß der Erfindung werden Neoglykoproteine in trägergebundener Form in einem ELISA zur selektiven Adsorption, insbesondere zur quantitativen Bestimmung einzelner Lektine aus Gemischen eingesetzt. Die Erfindung eignet sich besonders zur selektiven Be­ stimmung von gleichzeitig vorhandenen Subgruppen von Lek­ tinen derselben Pflanzenart.

Die Erfindung besteht insbesondere darin, daß das auf seinen Gehalt an Lektinen zu untersuchende Präparat im Rahmen eines ELISA mit einem trägergebundenen Neoglyko­ protein in Kontakt gebracht wird, an das das zu bestim­ mende Lektin selektiv zu binden vermag, an das Neoglyko­ protein gebundenes Lektin mit Lektin-Antikörper enthal­ tendem Blutserum behandelt wird und der an das Lektin ge­ bundene Antikörper in an sich bekannter Weise mit einem markierten Anti-Antikörper verbunden und der anhand der Markierung gemessene Wert zur Konzentrationsbestimmung mit Vergleichswerten von bekannten Konzentrationen ver­ glichen wird.

Neoglykoproteine sind synthetische Glyko-Proteine aus be­ stimmten Zuckern bzw. Zuckerderivaten, die kovalent an ein Protein gebunden sind. Derartige Neoglykoproteine sind bekannt und im Handel erhältlich. Sie können bei­ spielsweise hergestellt werden, indem bestimmte Zucker bzw. Zuckerderivate mit Hilfe der Carbodiimid-Methode mit Protein verknüpft werden. Das Protein des Neoglykopro­ teins ist vorzugsweise Rinderserumalbumin (BSA). Ein be­ stimmtes Neoglykoprotein enthält nur eine Art eines Zuckers bzw. Zuckerderivats. Es können mehrere Zucker­ moleküle (in der Regel ca. 20) an ein Proteinmolekül ge­ bunden sein.

Das für das jeweilige Lektin selektive Neoglykoprotein wird vorzugsweise in Abhängigkeit der Selektivität und Affinität seines Bindevermögens an das zu bestimmende Lektin ausgewählt. Diese Auswahl kann mit Vorteil in der Weise vorgenommen werden, daß die Selektivität des Bin­ dungsvermögens eines bestimmten Neoglykoproteins anhand eines bestimmten Lektins in Form von Hemmversuchen in Ge­ genwart von konkurrierenden Zuckern und Zuckerderivaten bestimmt wird und zwar insbesondere im interessierenden Konzentrationsbereich des Lektins. Auf diese Weise können die geeigneten Neoglykoproteine ausgewählt und unspezi­ fische Bindungen, wie sie bei der Bestimmung von Mistel- Lektin mit natürlichem Fetuin bzw. Asialofetuin gegeben sind, vermieden werden.

Für die im Rahmen des ELISA durchzuführende Antikörper­ reaktion wird Blutserum von mit Lektine enthaltenden Prä­ paraten behandelten Warmblütern verwendet. Dabei erweist sich Human-Serum als besonders geeignet, da bei der Be­ handlung des Menschen mit Lektin-, insbesondere Mistel­ präparaten besonders hohe Spiegel an Lektin-Antikörpern erhalten werden. Auch andere Seren von Säugetieren, wie Ziegenserum, sind geeignet.

Als markierte Anti-Antikörper sind Peroxidase-konjugierte anti-IgG-Antikörper (PO anti G) besonders geeignet, da die hierdurch erzeugten Farbveränderungen in einfacher Weise optisch abgelesen bzw. verglichen werden können. Auch andere bekannte Markierungen sind möglich. Für die Bindung des Neoglykoproteins an den Träger reicht norma­ lerweise eine adsorptive Bindung aus. Als Träger wird in der Regel eine Mikrotiter-Platte mit entsprechender Loch­ zahl verwendet. Je nach Art des ELISA, können auch andere Träger, wie z. B. Perlen, Ringe u. dgl. vorgesehen sein.

Die Erfindung eignet sich besonders zur quantitativen selektiven Bestimmung von Mistel-Lektinen, insbesondere Mistel-Lektin I und Mistel-Lektin II. Die am interessan­ teste Mistelart ist Viscum album. Als besonders selektiv für die Bestimmung von Mistel-Lektin I hat sich als Neo­ glykoprotein Galaktose-BSA herausgestellt. Für die Be­ stimmung von Mistel-Lektin II eignen sich demgegenüber besonders Glyko-Proteine von N-acylierten Aminozuckern und hier wiederum insbesondere N-Acetyl-galactosamin-BSA. Auch N-Acetyl-neuraminsäure-BSA ist geeignet, ist jedoch nicht so selektiv wie N-Acetyl-galactosamin-BSA. Die Er­ findung eignet sich auch für die Bestimmung der verschie­ denen Lektine von anderen Pflanzenarten, wie Heleberus­ arten, z. B. Heleberus niger oder Heleberus fötitus, wo Lektine in den Wurzeln gefunden wurden, und Urtica dioika.

Für die Selektivität des trägergebundenen Neoglykoprote­ ins hat es sich als günstig erwiesen, wenn das Neoglyko­ protein in Form von Lösungen mit einer Konzentration im Bereich von 10 bis 50 µg/ml insbesondere mit einer Kon­ zentration von ca. 20 µg/ml mit dem Träger in Kontakt ge­ bracht und verbunden wird. In bezug auf die Inkubations­ dauer des trägergebunden Neoglykoproteins mit dem Pflan­ zenpräparat hat sich ein Zeitraum von 60 bis 120 Minuten, insbesondere eine Dauer von ca. 90 Minuten, als besonders günstig erwiesen und zwar insbesondere im Hinblick auf die Konzentrationen von zu bestimmenden Mistel-Lektinen in Mistelpräparaten bzw. deren Verdünnungen. So liegen die Lektin-Konzentrationen in den zu untersuchenden Prä­ paraten bzw. Verdünnungen, in denen sie zum Beispiel für die Krebstherapie eingesetzt werden, gewöhnlich im Be­ reich von 4 bis 1000 ng/ml, insbesondere im Bereich von 20 bis 500 ng/ml. Gerade in diesem, für die Praxis inte­ ressierenden Konzentrationsbereich arbeitet das erfin­ dungsgemäße Bestimmungsverfahren selektiv und quantitativ mit ausreichender Genauigkeit. Bei der Bestimmung wird normalerweise so vorgegangen, daß die Konzentrations­ bestimmung verschiedener Lektine mit Hilfe verschiedener trägergebundener Neoglykoproteine im Rahmen des beschrie­ benen ELISA getrennt bzw. parallel durchgeführt wird, wo­ bei dann parallel die entsprechenden Kontrollen gefahren werden. Dadurch kann in einer parallelen Bestimmung die Konzentration der gesuchten Lektine ermittelt werden, wo­ bei natürlich auch festgestellt werden kann, ob die je­ weiligen Lektine überhaupt in dem Präparat vorhanden sind.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nach­ folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungen an­ hand der Bestimmung von Mistel-Lektinen, wobei bestimmte Ausführungen auch beispielhaft anhand bestimmter Stoffe oder Stoffkombinationen beschrieben sind, die in entspre­ chender Abwandlung auch für andere Stoffe und Stoffkombi­ nationen und die Untersuchung anderer Pflanzenpräparate auf ihren Gehalt an verschiedenen Lektinen entsprechend der Erfindung anwendbar sind.

Verschiedene natürliche und synthetische Zuckerkonjugate (Glyko-Proteine) mit unterschiedlicher Bindungsspezifität für Mistel-Lektin I (ML I) und Mistel-Lektin II (ML II) wurden auf Mikrotiterplatten für die Etablierung eines ELISA-Systems auf Spezifität und Reproduzierbarkeit un­ tersucht. Dabei wurde gefunden, daß insbesondere das Kon­ jugat aus Galactose und Rinder-Serum-Albumin (BSA) sehr spezifisch für den Nachweis von ML I über einen Konzen­ trationsbereich von 4 bis 1000 ng/ml eingesetzt werden kann. ML II bindet in diesem Bereich nicht an Galactose- Rinder-Serum-Albumin (Gal-BSA). Dagegen kann ML II bis zu einer Konzentration von 2000 ng/ml an N-Acetyl-galactosa­ min-Rinder-Serum-Albumin (NAcGal-BSA) gemessen werden. Da die Spezifität bzw. Selektivität dieses Systems bei höhe­ ren Konzentrationen von gleichzeitig anwesendem ML I nachläßt und es dann auch zu einer Bindung von ML I kommt, wird vorzugsweise mit Mistel-Lektin-Konzentratio­ nen unter 1000 ng/ml, insbesondere mit Konzentrationen bis zu 500 ng/ml an gleichzeitig vorhandenem Mistel-Lek­ tin I gearbeitet. Liegt Mistel-Lektin I in diesem Konzen­ trationsbereich vor, kann die Konzentration von Mistel- Lektin II mit hinreichender Genauigkeit bestimmt werden, ohne daß das gleichzeitig vorhandene Mistel-Lektin I stört.

Es wird vermutet, daß die Mistel-Lektine nicht nur mit einem, sondern mit mehreren Zuckern bzw. Glyko-Proteinen reagieren können, sich aber in der Affinität zu den ein­ zelnen Zuckern bzw. in ihren Bindungskonstanten deutlich unterscheiden. Eine Störung durch eine solche Unspezifi­ tät kann mit Vorteil dadurch vermieden werden, daß durch entsprechende Verdünnung die Konzentration des jeweils störenden Mistel-Lektins ausreichend niedrig gehalten wird. Die Konzentration des gesuchten bzw. zu bestimmen­ den Lektins kann dann selbst noch in hoher Verdünnung hinreichend genau gemessen werden. Im einzelnen geht dies aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Bestim­ mungsmethoden und deren Auswertung hervor.

Für die Durchführung der Bestimmungen, Kontrollproben und Vergleichsversuche verwendetes Material 1. Standard-Reagenzien

Mistel-Lektin I (ML I):

Affinitätschromatographisch nach Ziska et al. (Ziska, P., Franz, H. und Kindt, A. - The lectins from Viscum album L.; purification by biospecific af­ finitychromatography, Experientia 34/1:123-124 (1978) an hydrolysierter Sepharose 4B isoliertes ML I aus Viscum album mit D-Galactose-Spezifität.

Mistel-Lektin II (ML II):

ML II, affinitätschromatographisch an Amino-Caproyl- D-Galactosamin-Agarose gereinigt.

2. Untersuchte Mistel und Mistelpräparate

Es wurden frische Mistel-Homogenate sowie im Handel befindliche Mistelpräparate untersucht.

3. Glyko-Proteine

Die Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch Konzentrationsbestimmung der Mistel-Lek­ tine unter Verwendung von Rinder-Serum-Albumin(BSA)- Konjugaten von Galactose(GAL-BSA) und N-Acetyl-galac­ tosamin(NAcGal-BSA) als Neoglykoproteine im Vergleich zu Asialofetuin(ASF) und Fetuin als natürliche Gly­ ko-Proteine bzw. Glykoprotein-Derivate untersucht.

4. Reagenzien

Als Testreagenzien wurden weiterhin verwendet: Rin­ der-Serum-Albumin(BSA), Galactose(GAL), Glucose(Glu), N-Acetyl-galactosamin(NAcGal), N-Acetyl-glucosamin- (NAcGLu), N-Acetyl-neuraminsäure(NANA) sowie 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid × HCL(EDC), o-Phenylendiamin(O-PD) und phosphatgepuf­ ferte Salzlösung (PBS).

5. Antiserum

Es wurde Anti-ML I/II positiver Serum-Pool von Mi­ stelextrakt-therapierten Patienten verwendet.

6. Anti-Antikörper

Peroxidase-konjugierte anti-human IgG Antikörper (PO-anti G) aus Ziege.

Durchführung der Versuche Evaluierung der optimalen Bedingungen und Spezifitäten von anti-ML I und anti-ML II-Seren im ELISA

Maxisorp-Mikrotiterplatten wurden mit Lösungen (100 µl/Loch) von Gal-BSA, NAcGal-BSA, ASF, Fetuin und NANA-BSA in 0,1 M Carbonat-Puffer bei pH 9,5 beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Konzentrationen an den Glykoprotein-Lösungen betrugen jeweils 5, 10, 20 bzw. 40 µg/ml.

Zum Abblocken der freien Bindungsstellen auf den Mikro­ titerplatten wurde anschließend 90 Minuten mit 2%igem BSA/PBS-Puffer bei pH 7,4 inkubiert.

Anschließend wurden Verdünnungen von ML I und ML II mit Konzentrationen von 2000, 1000, 500, 125, 32, 8, 4 und 2 ng/ml Lektin in PBS hergestellt und je 100 µl in die jeweiligen Löcher der Mikrotiterplatte pipettiert. Nach 90 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Platten viermal für je 5 Minuten mit Wasch-Puffer (0,2% BSA, 0,02% Triton X-100, PBS) unter Schütteln gewaschen.

Anti-ML I/II positives Serum aus dem Serum-Pool wurde auf das 300fache verdünnt (Verdünnung in Vorversuchen ermit­ telt). Je 100 µl wurden in die Löcher der Mikrotiter­ platte pipettiert. Nach 90minütiger Inkubation bei Zim­ mertemperatur wurde wieder wie oben gewaschen. Danach wurden jeweils 100 µl PO-anti-human IgG-Konjugat als Anti-Antikörper (Verdünnung 1:2500) pipettiert und 90 Minuten lang inkubiert.

Nach dem Waschen der Platten wurde die Substrat-Reaktion durch Zugabe von 100 µl o-PD in 0,1 M Citrat-Puffer und H₂O₂ gestartet. Beim Erreichen einer Extinktion (OD bei 492 nm) von 1.8 für die höchste Konzentration wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl 25%iger H₂SO₄ gestoppt.

Durch grafische Darstellung der Extinktion gegen die Lek­ tionkonzentrationen der verschiedenen Lektinverdünnungen erhielt man die optimalen Konzentrationen (Quotient aus hoher Aktivität und niederer unspezifischer Hintergrund- Färbung), sowie Aussagen über Spezifität und Sensitivität des ELISA-Tests. Die Zeitabhängigkeit der Bindung von ML I und ML II an die Glyko-Konjugate (Glyko-Proteine) wurde durch 30-, 60-, 90- und 180minütige Inkubation von 100 ng/ml Lektin auf mit 20 µg Glyko-Protein beschichte­ ten Platten bestimmt.

Die Beeinflussung der Bindung von ML I an ASF durch ML II und der Bindung von ML II an ASF durch ML I wurde auf einer mit 20 µg/ml ASF beschichteten Mikrotiterplatte im ELISA ermittelt. Über einen Konzentrationsbereich von 1 bis 1000 ng wurden ML I und ML II getrennt inkubiert. Da­ neben wurden über denselben Konzentrationsbereich ML I plus ML II in gleichen Löchern inkubiert und die Lektin- Konzentrationen gemessen.

Herstellung eines Neoglykoproteins am Beispiel der Kopplung von NANA an BSA

NANA wurde nach der von Lönngren (Lönngren, I., Gold­ stein, I.J., Niederhuber, I.E. - Aldonate Couling, a simple procedure for the preparation of carbohydrate-pro­ tein conjugates for studies of carbohydrate-binding pro­ teins - Arch. Biochem. Biophys, 175: 661-669 (1976)) be­ schriebenen Aldonat-Methode an BSA gekoppelt. Hierzu wur­ den 250 mg NANA mit 170 mg BSA in Wasser vermischt, der pH auf 4,7 eingestellt, und innerhalb von 30 Minuten wur­ den 260 mg Ethylendiamincarbodiimid × HCL (EDC) unter pH-Konstanz dazugegeben. Nach 6 Stunden wurde die Reak­ tion durch Zugabe von Acetat-Puffer (pH 5,5) gestoppt, und die niedermolekularen Bestandteile wurden durch Dia­ lyse gegen H₂O entfernt.

Hemmversuche zur Ermittlung der Bindungsspezifität der Mistel-Lektine an verschiedene Glyko-Proteine

Es wurden Mikrotiterplatten mit Gal-BSA, ASF bzw. Fetuin beschichtet. Anschließend wurde mit 100 ng/ml ML I bzw. ML II inkubiert, die zuvor mit 0, 1, 10, 100 und 200 mM Gal, NAcGal, NAcGlu, NANA oder Glu während 30 Minuten vorinkubiert worden waren.

Die prozentuale Hemmung wurde nach der Formel:

%-Hemmung = (1-OD 492 mit Hemmer/OD 492 ohne Hemmer) × 100

berechnet. Durch Plotten der %-Hemmung gegen die Molari­ tät der Inhibitoren erhält man die Molarität für eine 50%ige Hemmung. Sie ist ein Maß für die Spezifität der Hemmung.

Optimierung und Standardisierung der ELISA-Systeme

Zur Bildung eines möglichst sensiblen ELISA-Tests zur Er­ fassung von ML I- und ML II-Konzentrationen wurde zu­ nächst die optimale Bindung von definierten ML I- und ML II-Fraktionen an Neoglykoproteine (synthetische Gly­ ko-Konjugate) und an natürliche Glyko-Proteine unter­ sucht. Getestet wurde unter Anwendung von Gal-BSA, NAcGal-BSA, NANA-BSA einerseits sowie ASF und Fetuin an­ dererseits. Versuche mit Mikrotiterplatten, die in vier verschiedenen Konzentrationen beschichtet waren, wurden gegen acht unterschiedliche Konzentrationen an ML I und ML II durchgeführt.

In den Abb. 1 und 2 und den zugehörigen Tabellen 1 und 2 sind am Beispiel von Gal-BSA und NAcGal-BSA die Er­ gebnisse der Bindungsaktivitäten von ML I und ML II als Funktion der Glykoprotein-Konzentration dargestellt. Aus den Kurven in den Abb. 1 und 2 ergibt sich, daß bei beiden Systemen oberhalb einer Konzentration von 10 µg/ml für das Glyko-Protein keine Steigerung der Lek­ tin-Bindungsaktivität erfolgt.

Da sich bei einer Beschichtung mit 20 µg/ml Glyko-Protein aber eine geringere unspezifische Hintergrund-Färbung er­ gab, ist diese Konzentration bevorzugt und wurde als Standard für alle weiteren Tests eingesetzt.

Vergleichsversuche mit ASF, Fetuin und NANA-BSA, die hier nicht dargestellt sind, bestätigten, daß eine Glykoprote­ in-Konzentration im Bereich von ca. 20 µg/ml einen opti­ malen Wert für die Konzentrationsabhängigkeit von Lektin und Glyko-Protein darstellt.

Bei der Untersuchung der Zeitabhängigkeit der Bindung der Lektine an die Glyko-Proteine ergab sich, wie sich aus den Tabellen 4a und 4b ergibt, ein Optimum von 90 Minuten für die Inkubationsdauer, ohne wesentliche unspezifische Hintergrund-Färbung. Hier zeigte sich ebenfalls Überein­ stimmung bei den verschiedenen Glyko-Proteinen.

Vorversuche zur Ermittlung optimaler Verdünnungen von An­ tikörper-Serum und Anti-Antikörper zeigten, daß eine Ver­ dünnung von 1:300 beim anti-Lektin Antikörper enthalten­ den Human-Serum und eine Verdünnung von 1:2500 beim PO- konjugierten anti-human IgG besonders gute Ergebnisse bringen. Je nach Herkunft der Antikörper bzw. Anti-Anti­ körper können sich für geeignete Verdünnungen andere Werte ergeben, die durch Vorversuche ermittelt werden können.

Untersuchung der ML I- und ML II-Spezifität der Glyko-Proteine

Der Verlauf der Titrationskurven von ML I und ML II in Abb. 1 zeigt, daß ML I über einen weiten Konzentrations­ bereich von 4 bis 500 ng/ml sehr spezifisch mit Gal-BSA nachgewiesen werden konnte, ohne daß es zu einer Bindung bzw. Reaktion mit ML II kam.

Im ELISA mit NAcGal-BSA (vgl. Titrationskurven in Abb. 2) konnte die Bestimmung von ML II für Konzentrationen von 16 bis 1000 ng durchgeführt werden. Dabei ist aus dem Kurvenverlauf in Abb. 2 ersichtlich, daß ab einer ML I-Konzentration von ca. 500 ng/ml eine schwache Bindung von ML I an NAcGal-BSA festzustellen ist. Deshalb werden die Mistelpräparate zur Bestimmung der Konzentration von ML II vorzugsweise mit einer solchen Verdünnung unter­ sucht, bei der ML I im Bereich von ca. 500 ng/ml oder darunter liegt.

Im ELISA mit NANA-BSA beschichteten Platten wurde bei Konzentrationen bis 1000 ng/ml Aktivität nur gegen ML II festgestellt. Zur Bestimmung der Konzentration von ML II eignet sich somit als Glyko-Protein auch NANA-BSA, auch wenn dies eine etwas geringere Lektin-Bindungsaktivität als NAcGal-BSA besitzt, welches deshalb bevorzugt ist. Der Konzentrationsbereich von ML II für die Konzentra­ tionsbestimmung mit Hilfe von NANA-BSA liegt vorzugsweise zwischen ca. 30 und 1000 ng ML II/ml. Dieser Konzentra­ tionsbereich kann anhand von Vorversuchen durch entspre­ chende Verdünnung eingestellt werden.

Vergleichsversuche mit den natürlichen bzw. modifizierten Glyko-Proteinen Fetuin und Asialofetuin (ASF) zeigten, daß diese beiden Glyko-Proteine mit gleicher Aktivität reagieren. Die Abb. 3 zeigt, daß die Affinitäten von ML I (Erfassungsbereich 6 bis 500 ng) zu ASF höher sind als die von ML II (Erfassungsbereich 16 bis 1000 ng) zu ASF. Der Unterschied reicht jedoch nicht für die getrennte quantitative Bestimmung von ML I und ML II aus, da die Selektivität nicht hoch genug ist.

Anwendung des standardisierten ELISA-Systems

Mehrere Proben käuflicher Mistelpräparate wurden mit dem Gal-BSA- und dem NAcGal-BSA-System auf ihren Gehalt an ML I und ML II getestet. Die ML I-Konzentrationen der Proben waren niedrig, wurden aber vom Meßbereich des Gal-ELISA-Systems sicher erfaßt. Die ML II-Konzentratio­ nen waren demgegenüber wesentlich höher und konnten vom NAcGal-BSA-System ebenfalls sicher erfaßt werden. Die Intra-Assay-Abweichungen der Bestimmungen waren mit ±4% niedrig und zeigen die Zuverlässigkeit der Bestimmungs­ methode. Wiederholte Messungen an mehreren Tagen ergaben ebenfalls nur geringe Abweichungen, wenn die einmal ge­ öffneten Proben bei Gefriertemperatur von -20°C gelagert wurden. Eine offene Lagerung bei 4°C oder Zimmertempera­ tur führte sowohl für ML I als auch für ML II zu einer raschen Konzentrationsabnahme und zeigt einerseits die Empfindlichkeit der Mistelpräparate und andererseits die Notwendigkeit einer standardisierten Konzentrationsbe­ stimmung.

Vergleichsversuche zur Messung der ML I- und ML II-Konzentration im ASF-ELISA

In Abb. 3 und Tabelle 3 sind die Versuchsergebnisse der Messung der Lektin-Konzentrationen mit Hilfe des ASF- ELISA dargestellt. Die untere und die obere Kurve in Abb. 3 anhand von Testlösungen, die nur ML I oder nur ML II enthalten, zeigen, daß ML I und ML II eine unter­ schiedliche Bindungsaktivität zu ASF besitzen. Der Unter­ schied reicht jedoch nicht zu einer getrennten quantita­ tiven Bestimmung aus, wenn ML I und ML II gemeinsam in einem Mistelpräparat vorhanden sind. Interessant ist wei­ terhin, daß es bei gleichzeitiger Anwesenheit von ML I und ML II in der Testlösung nicht zu einer Addition der Titer kommt. Daraus kann gefolgert werden, daß sowohl ML I als auch ML II dieselbe Bindungsstelle auf dem ASF- Molekül erkennen.

Hemmversuche

Die für die Konzentrationsbestimmung der gesuchten Mi­ stel-Lektine geeigneten Neoglykoproteine können durch Be­ stimmung der Zuckerbindungs-Spezifität der Mistel-Lektine an die zur Verfügung stehenden Glyko-Proteine mit Hilfe von Hemmversuchen ermittelt werden. Zur Ermittlung der Zuckerbindungs-Spezifität der Mistel-Lektine I und II wurden Hemmversuche mit Gal, NAcGal, NAcGlu, NANA und Glu durchgeführt. Aus Tabelle 5 ist ersichtlich, daß für eine 50%ige Lektin-Hemmung Gal sehr spezifisch sowohl die Bindung von ML I an Gal-BSA, ASF, Fetuin und NAcGal-BSA hemmt als auch die Bindung von ML II an ASF und Fetuin. Andererseits hemmt NAcGAL spezifisch die Bindung von ML II an NAcGal-BSA, ASF und Fetuin. NAcGal hemmt auch spezifisch die Bindung von ML I an Gal-BSA, NAcGal-BSA, ASF und Fetuin. NAcGlu hemmt dagegen erst bei relativ ho­ hen Konzentrationen die Reaktionen von ML I und ML II, während Glu und NANA in diesem Test-System keine 50%ige Hemmung erzielten. Daraus ergibt sich die Bevorzugung von Gal-BSA als Neoglykoprotein zur Bestimmung von ML I- und von NAcGal-BSA als Neoglykoprotein zur Bestimmung von ML II- Konzentrationen. Diese Hemmversuche erlauben somit die Ermittlung von geeigneten und spezifischen Bindungs­ paaren von Neoglykoprotein und Lektin.

Tabelle 1

Gal-BSA gegen ML I und ML II

Tabelle 2

NAcGal-BSA gegen ML I und ML II

Tabelle 3

Messung der Konzentrationen von ML I und ML II als Einzelsubstanzen und im Gemisch

Tabelle 4a

Gal-BSA (10 µg/ml)

Tabelle 4b

NAcGal-BSA (20 µg/ml)

Tabelle 5

Hemmung der Lektin-Bindung durch unterschiedliche Zucker und Zucker-Derivate

Claims (17)

1. Verfahren zur selektiven quantitativen Bestimmung der Konzentration einzelner Lektine aus Gemischen von Lektine enthaltenden Pflanzenpräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Präparat mit Hilfe eines ELISA mit einem trägergebundenen Neoglykoprotein in Kontakt gebracht wird, an das Neoglykoprotein gebundenes Lektin mit Lektin-Anti­ körper enthaltendem Blutserum behandelt wird, der an das Lektin gebundene Antikörper mit einem markierten Anti-Antikörper behandelt und der aufgrund der Mar­ kierung meßbare Wert zur Bestimmung der Konzentra­ tion des gesuchten Lektins mit aus vorbekannter Kon­ zentration erhaltenen Werten verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Neoglykoprotein in Abhängigkeit seiner Bindungsaktivität und Selektivität zu dem zu bestimmenden Lektin ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Selektivität und Bindungsaktivität für die Bindung eines bestimmten Lektins an ein be­ stimmtes Neoglykoprotein anhand von Hemmversuchen in Gegenwart von zum Zuckerbestandteil des Neoglykopro­ teins konkurrierenden Zuckern bzw. Zuckerderivaten bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrations­ bestimmung verschiedener Lektine mit Hilfe verschie­ dener Neoglykoproteine in Parallelbestimmungen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Neoglykoproteine verwen­ det werden, deren Proteinbestandteil Rinder-Serum- Albumin (BSA) ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Neoglykoproteine verwen­ det werden, die eine Vielzahl von identischen Saccharid­ einheiten am Protein kovalent gebunden enthalten.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Konzentrations­ bestimmung von Mistel-Lektinen, vorzugsweise der Mistel-Lektine ML I und ML II, insbesondere von Viscum album, eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung von ML I mit Hilfe von Galak­ tose-Rinder-Serum-Albumin durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bestimmung von ML II mit Hilfe von N-acylierten Glyko-Proteinen durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bestimmung von ML II mit Hilfe von N-Acetyl-galactosamin-Rinder-Serum-Albumin durchge­ führt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung von ML II mit Hilfe von N-Ace­ tyl-neuraminsäure-Rinder-Serum-Albumin durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper enthal­ tendes Serum Lektin-Antikörper enthaltendes Human- Serum verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper enthaltendes Serum Lektin-Antikörper enthaltendes Ziegen-Serum verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß trägergebundene Neogly­ koproteine eingesetzt werden, die durch Behandeln der Träger mit Neoglykoprotein-Lösungen mit einer Konzentration im Bereich von 10 bis 50 mg/ml, insbe­ sondere ca. 20 mg/ml erhalten wurden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lektine während einer Inkubationsdauer von 60 bis 120 Minuten, ins­ besondere ca. 90 Minuten, mit den Neoglykoproteinen in Kontakt gebracht werden.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das auf die Lektin-Kon­ zentrationen zu untersuchende Präparat in einer sol­ chen Verdünnung eingesetzt wird, daß die Konzentra­ tion des gesuchten Lektins im Bereich von 4 bis 1000 ng/ml, insbesondere 20 bis 500 ng/ml liegt.

17. Verwendung von trägergebundenen Neoglykoproteinen zur selektiven Adsorption verschiedener Lektine der gleichen Pflanzen, insbesondere von Mistel-Lektinen.