MXPA97010522A - Lectina de muerdago recombinante (rml) - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas deácido nucleico que codifican para prepro-proteínas las cuales, después de la maduración, exhiben la actividad biológica del dímero de lectina de muérdago, vectores que contienen estas moléculas deácido nucleico, huéspedes transformados por estos vectores y polipéptidos y dímeros de polipéptido codificados por estas moléculas deácido nucleico. Los polipéptidos y dímeros de polipéptido de acuerdo con la invención tienen muchas aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, la invención además se refiere a inmunotoxinas y fármacos que contienen el polipéptido y dímeros de polipéptido de acuerdo con la invención. La invención además se refiere a composiciones de diagnóstico, las cuales contienen las moléculas deácido nucleico de acuerdo con la invención y los polipéptidos y dímeros de polipéptido, y/o iniciadores de acuerdo con la invención, los cuales específicamente se hibridizan sobre las moléculas deácido nucleico de acuerdo con la invención. Finalmente, la invención se refiere a agentes de protección de plantas que contienen los polipéptidos y/o dímeros de polipéptido de acuerdo con la invención.

Description

LECTINA DE MUÉRDAGO RECOMBINANTE frML) DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican preproteínas que tienen, después de la maduración , actividad biológica del dímero de lectina de muérdago, a vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, a huéspedes transformados con dichos vectores y a polipéptidos y/o dímeros de polipéptido, los cuales son codificados a través de estas moléculas de ácido nucleico. Los polipéptidos y/o dimeros de polipéptido de la invención son amplia y terapéuticamente aplicables. Así, la presente invención además se refiere a inmunotoxinas , así como también a composiciones farmacéuticas que contienen los polipéptidos y/o los dímeros de polipéptido de la invención . Además , la invención se refiere a composiciones de diagnóstico que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención , los polipéptidos y/o dímeros de polipéptido de la invención y/o iniciadores, los cuales hibridizan específicamente a moléculas de ácido nucleico de la invención . Finalmente, la invención se refiere a agentes protectores de plantas que comprenden los péptidos de la invención y/o los dímeros de polipéptido de la invención . Los extractos de muérdago ha n sido terapéuticamente utilizados durante siglos. Desde el inicio de este siglo, la preparaciones de muérdago han sido utilizadas en la terapia de cáncer con éxito variable [Bocci, 1993; Gabius y otros; 1993; Gabius & Gabius , 1994; Ganguly & Das, 1994]. Hajto y otros [1989, 1990] pudieron mostrar que los efectos terapéuticos son mediados en particular por las así llamadas lectinas de muérdago (viscuminas, aglutininas de Viscum álbum, VAA) . Además, un efecto tóxico en la actualidad que la técnica en particular discute es la inmunoestimulación (no específica) , los efectos positivos de la cual son utilizados para la terapia acompañante y el cuidado posterior de pacientes con tumor. Un incremento en la calidad de vida es posiblemente mediado en dichos pacientes a través de la secreción de endorfinas endógenas [Heiny y Beuth , 1994] . Numerosos estudios in vitro [Hajto y otros, 1990; Mánnel y otros, 1991 ; Beuth y otros, 1993] e in vivo [Hajto, 1986; Hajto y otros, 1989; Beuth y otros, 1991 ; Beuth y otros , 1992], así como estudios clínicos [Beuth y otros, 1992] reportan una liberación incrementada de citoquinas inflamatorias (TN F-a, I L- 1 , I L-6) así como una activación de componentes celulares del sistema inmunológico (células TH, células NK) . En la actualidad , se considera que una proteína de lectina de m uérdago de 60 kDa es el principio activo de los extractos de muérdago, la cual pueden ser bioquímicamente obtenidos de extractos [Franz y otros, 1977; Gabius y otros , 1992] . La prote ína de ML consiste de dos subunidades covalentemente enlazadas S-S , la cadena A de la cual siendo responsable de la inactivación enzimática de ribosomas [Endo y otros, 1988] y su cadena B siendo responsa ble de la unión de carbohidrato. La actividad biológica en la actualidad es principalmente atribuida a la actividad de la lectina de la cadena B [Hajto y otros, 1990]. Sin embargo, se sabe poco con respecto a las relaciones de estructura/función de la lectina de muérdago (ML). La contribución , en donde las cadenas individuales y sus diferentes actividades bioquímicas y enzimáticas hacen el modo de acción y/o los efectos terapéuticos observados, aún no es clara . El análisis de las relaciones de estructura/función se hace difícil por la contaminación de las preparaciones con otros ingredientes del muérdago [Stein & Berg, 1994]. Se discute que la actividad de las preparaciones de extracto puede depender de las difere ntes composiciones de las preparaciones, las cuales a su vez dependen del tipo de árbol huésped (v. gr. , manzana, pino, álamo) [Hülsen y otros, 1986]. Tanto las viscotoxinas [Garcia-Olmedo y otros, 1983; Méndez y otros, 1990] como otras viscuminas (tal como ML-2 , M L-3) se dice que tienen efectos similares [Eifler y otros, 1994] . Aún las preparaciones de ML, las cuales han sido altamente purificadas de manera biológica (cromatografía de afinidad) son substancialmente heterogéneas (Figura 8) . Esta heterogeneidad se refiere a las actividades bioqu ímicamente determinables de las cadenas, a los efectos evocados in vitro e in vivo y a las estructuras de proteína como tales. Las variantes estructurales son discutidas para las glicosilaciones de la ML de cadenas A y B , así como para variaciones de secuencia. Gabius y otros [1992] y Dietrich y otros [1992] muestran una variabilidad de secuencia de las cadenas A 1 y A2 de ML-1 . Para un análisis más detallado de los efectos terapéuticos de la lectina de muérdago, es deseable que esté disponible como una substancia estructuralmente homogénea en forma pura. Además, es importante para los científicos poder preparar lectina de muérdago o sus componentes en grandes cantidades en forma pura, de manera que puede/pueden ser empleados a una gran escala como un ingrediente activo de composiciones farmacéuticas. Estos objetivos casi no pueden ser obtenidos a través de los procedimientos bien conocidos en la técnica. El aislamiento del material de planta de acuerdo con la presente invención, siempre producirá una mezcla heterogénea de substancias. La heterogeneidad de preparaciones de lectina de muérdago, entre otras cosas, resulta del procesamiento post-translacional de la ML- 1 a las isoformas ML-2 y ML-3, de manera que las preparaciones de lectina de muérdago tienen un contenido de ML-1 , MI-2 y MI-3 dependiendo del método de aislamiento o la duración de la fermentación [Jággy y otros, 1995] . Cualquiera de las isoformas antes mencionadas además es enormemente microheterogénea , lo cual se ilustra en la Figura 8 para ML- 1 mediante cromatoenfoque isoeléctrico. El problema que subraya la presente invención es, por lo tanto , proveer lectina de muérdago en forma pura y en cantidades que permitan su uso a gran escala . El problema se resuelva a través de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones. La invención de esta manera se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica, (a) una preproteína que tiene, después de la maduración, la función biológica del dímero de lectina de muérdago y que tiene la secuencia de nucleótido representada en la Figura 4c; (b) un fragmento de la preproteína de acuerdo con (a), el fragmento siendo un componente biológicamente activo del dímero de lectina de muérdago; el cual (c) se distingue por sí mismo de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) o (b) mediante la degeneración del código genético; o (d) hibridizar a la molécula de ácido nucleico a (a), (b) o (c) , bajo condiciones severas y codifica un polipéptido que tiene la función y/o actividad biológica indicada en (a) o (b) . Proveyendo las secuencias de gene de lectina de muérdago por primera vez, cadenas individuales altamente purificadas , recombinantes (rMLA , rMLB) , que pueden reasociarse in vitro y así dan una holoproteína de rML que es homogénea en términos de su química de proteína, su actividad enzimática y su estructura , pueden ser obtenidas empezando de dicha secuencia. La proteína recombinante reasociada no es variable ni microheterogénea , particularmente con respecto a su estructura primaria y las modificaciones post-tranlacionales (glicosilación , fosforilación) y, por lo tanto, es particularmente útil para terapia tanto como holoproteína, como cadena parcial y en forma de subfragmentos . De acuerdo con la presente invención , un "fragmento" de una preproteína de lectina de muérdago se entiende que es cualquier fragmento, no sólo un fragmento de existencia natural, sino siendo un componente biológicamente activo del dímero de lectina de muérdago. Por razones de claridad, se señala que los expertos en la técnica obviamente entienden que dicho componente biológicamente activo del dímero de lectina de muérdago también son aquellos componentes que son componentes de cadenas individuales del dímero. Por lo tanto, también las cadenas individuales o fragmentos de las mismas, que forman parte de la secuencia presentada en la Figura 4c, son cubiertos por la presente invención. En la presente invención, el término "naturalmente" junto con "componente de lectina de muérdago" se entiende, de manera que el fragmento así caracterizado es ya sea una cadena del dímero de lectina de muérdago o un subfragmento de la cadena que existe naturalmente en dicha cadena. Estos fragmentos son de preferencia biológicamente activos. En la presente invención, el término "biológicamente activo" es entendido, de manera que estos fragmentos tienen por lo menos una función biológica de las cadenas o del dímero, como se describe en la presente solicitud o cualquier otra función biológica de las cadenas individuales o del dímero. Además, el término "biológicamente activo" significa también que está relacionado a una actividad farmacológica y/o inmunológica. El uso de proteínas de ML recombinante además por primera vez, permite examinar las contribuciones de los dominios individuales y subdominios a manera de experimentación. Las proteínas de ML recombinantes y subunidades recombinantes/cadenas parciales son la base de preparaciones de monosubstancia correspondientemente definidas, las cuales pueden ser utilizadas en lugar de preparaciones de extracto y extractos estandarizados. La clonación del gen que codifica la lectina de muérdago sorprendentemente pueden obtenerse con base en una nueva estrategia de clonación, después de las estrategias de clonación convencionales han fallado: Un número de datos químicos de proteína son conocidos para la lectina de muérdago ML- 1 . Además de su peso molecular y estructura de subunidad particularmente cortos, los péptidos N-terminales son secuencias de aminoácido conocidas, las cuales han sido descritas por Dietrich y otros [1992] y Gabius y otros [1992] [ver también DE4221836]. Debido a la composición de aminoácido y el alto grado pertinente de degeneración de los péptidos N-terminales de la cadena A y/o B empezando de estos péptidos, es virtualmente imposible preparar oligonucleótidos sintéticos cuyo grado de degeneración es suficientemente bajo para permitir la identificación de los fragmentos del gen ML cuando se clasifican colecciones de gen . También esto es verdadero para colecciones de gen de ADNc que fueron preparadas con base en el poli-(A + ) ARN de Viscum álbum. La reacción de cadena de polimerasa permite amplificar extensiones de A DN que están ubicadas entre extensiones conocidas [Erlich y otros, 1988]. Utilizando un oligonucleótido de "sentido" comenzando del término N de M LA y un oligonucleótido de "antisentido" del término N de MLB, una amplificación de la región genética de intervención es concebible, siempre que el gen de ML esté libre de introns (Figura 1 a). Sin embargo, en la práctica , un análisis de la secuencia N-terminal de la cadena B muestra que el grado de degeneración de las combinaciones concebibles de oligonucleótidos es demasiado alta para una realización exitosa de este aspecto. La razón puede ser particularmente la secuencia del término N de la cadena B, la cual no es favorable para una construcción de oligonucleótido y la cual hace una amplificación de las secuencias del gen de ML, que empieza de las regiones de secuencia de aminoácido, impracticable (Figura 1 b) . Cuando se trata de clonar el gen de ML usando una estrategia de PCR modificada, los científicos, de esta manera , trataron de incorporar más datos de proteína, particularmente con base en el parentesco de la lectina de muérdago a las proteínas de inactivación de ribosoma clase I y I I (R I Ps), para construir oligonucleótidos de amplificación [Stripe y otros, 1992]. C on base en alineaciones múltiples de (a) proteínas de R I P tipo I y cadenas de ricina A , así como (b) las cadenas de regiones conservadas de abrina y ricina , fueron identificadas en un total de 8 extensiones de secuencia . Empezando de estas regiones de secuencia y mientras se consideran tablas de uso de codon de especies relacionadas, un total de 21 oligonucleótidos se fueron construidos y usados en varias combinaciones en más de 200 pruebas de amplificación . En ninguno de estos casos, sin embargo, se pueden obtener productos de amplificación específicos, aunque las condiciones de PCR fueron ampliamente variadas con respecto a temperatura de recocido, contenido de Mg2+, así como parámetros de ciclo. Tanto la clasificación de colecciones genómicas y ADNc como el uso de técnicas de PCR no permitió llegar a las secuencias de ADN de ML específicas , cuando se siguieron las deliberaciones antes mencionadas. Por lo tanto, se hicieron intentos para encontrar nuevas formas de incluir más propiedades estructurales de la estructura de ricina y abrina en la construcción de los oligonucleótidos de amplificación. Ya que el mecanismo enzimático de las proteínas de inactivación de ribosoma (RIPs), aquí particularmente la ricina R I P de tipo I I , es similar a aquella de ML [Endo y otros , 1988a + 1988b], no puede ser excluido que también sean estructuralmente similares al nivel de las estructuras primaria y terciaria funcionales. Empezando de la estructura cristalina de ricina [Katzin y otros, 1991 ; Rutenber & Robertus, 1991 ; Wetson y otros, 1994] , un análisis de las flexibilidades de cadena en la cadena A de ricina señaló una baja movilidad de Arg 180, el cual está ubicad o dentro de una región de secuencia conservada. Además, se hizo un análisis de las posibles substituciones de aminoácido en esta región del centro activo , que pueden ocurrir debido a la disposición estérica de la "estructura de base" de la cadena, mientras se consideran correctamente las interacciones del substrato. Los resultados de estas deliberaciones fueron correlacionados con una evaluación de las alineaciones de secuencia extensa de la cadena de ricina Ay otros RIPs de tipo I. La suplementación de los resultados de ias comparaciones de secuencia a través de la inclusión de datos estructurales, de esta manera, produjeron datos probabilísticos de la ocurrencia de ciertos residuos de aminoácido en ciertas posiciones. Estos datos pueden ser utilizados para postular un número de secuencias de aminoácido de ML teóricas para esta región y, con base en lo último, para construir un oligonucleótido correspondiente (RMLA2) de degeneración sorprendentemente baja (Fig. 1c). Combinando RMLA1 (un oligonucleótido de degeneración derivado de la secuencia de aminoácido N-terminal de la cadena de MLA; cf. Figura 1b) y el RMLA2 de oligonucleótido de "sitio activo" construido con base en las deliberaciones anteriores, se pueden obtener fragmentos a parámetros de PCR definidos empezando del ML-ADN genómico de complejo, después de que todos los aspectos descritos anteriormente han fallado, Después, la información de secuencia del gen fue contemplada vía iniciadores de oligonucleótido sin degeneración, específicos, derivados de la secuencia de gen parcial de MLA, obtenida clonando y secuenciando un fragmento (Figura 3) y los oligonucleótidos de degeneración, derivados de RIP I y alineaciones de secuencia de ricina/abrina, usando amplificaciones de PCR adicionales. Con el fin de construir los oligonucleótidos de cadena B de degeneración, las alineaciones de secuencia de las cadenas B de las ricinas y abrinas fueron utilizadas cuando se encontraron algunas regiones altamente conservadas . Para la determinación de los extremos 5' y 3' de la proteína holo, los fragmentos parciales de cadena B y las regiones no traducidas de 5' y 3'. Se sintetizó ADNc análogo a través de transcripción inversa empezando de ARN de muérdago aislado y se obtuvieron secciones de gen respectivas usando la técnica RACE [Frohman y otros, 1988]. Una vez que estuvo disponible una multitud de fragmentos de gen de traslape (Figura 3, se obtuvieron , a través de PCR específica, secciones completas de cadena A y cadena B , empezando del ADN de muérdago genómico de complejo. Las secuencias de gen de rMLA y rMLB, ambas provistas con modificaciones terminales , se representan en la Figura 4a y la Figura 4b. La secuencia de gen de ML completa, la cual comprende también regiones sin translación 5' y 3', así como secciones de gen que codifican endopéptido y péptido de señal , se representa en la Figura 4c. En una modalidad preferida de la molécula de ácido nucleico de la invención , el fragmento es la cadena B de lectina de muérdago , la cual es codificada a través de la secuencia de nucleótido representada en la Figura 4b (MLB). U na modalidad más de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, la cual es una molécula de ADN . En la presente invención , el término "molécula de ADN" se entiende que se refiere tanto a una molécula genómica y de ADN como a una molécula (semi)sintética . En el conocimiento de la presente invención, los procedimientos para la preparación de estas varias moléculas de ADN son bien conocidos por los expertos en la técnica. En una modalidad adicional de la invención , la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN. La invención además se refiere a una molécula de ácido nucleico que es una cadena antisentido para cualquiera de las moléculas de ácido nucleico antes mencionadas de la invención . Dicha cadena antisentido puede ser ilustrativamente utilizada para la inhibición de transcripción y, así, para estudios de expresión y de regulación en plantas. La invención también se refiere a un vector que contiene por lo menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención .

El vector de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, contener una molécula de ácido nucleico individual de acuerdo con la invención que codifica a toda la preproteína de lectina de muérdago .

Siempre que dicho vector sea un vector de expresión , la preproteína puede ser procesada en un huésped transformado adecuado y las unidades monoméricas pueden ser unidas in vivo o in vitro para da r un dímero de lectina de muérdago . En otra modalidad , el vector de acuerdo con la invención es un vector que solamente es utilizado para la propagación del ácido nucleico de acuerdo con la invención. En una modalidad preferida , el vector de acuerdo con la invención contiene tanto una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena A de la lectina de muérdago como un fragmento de la misma, y una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena B o un fragmento de la misma. Preferiblemente, los fragmentos de los monómeros son biológicamente activos. En una modalidad preferida, el vector de acuerdo con la invención es un vector de expresión. Es evidente a los expertos en la técnica cómo proveer vectores de expresión adecuados para varios organismos huésped. De acuerdo con la invención, una secuencia que codifica la cadena A de lectina de muérdago fue producida para la expresión heteróloga a través de PCR específica, empezando del ADN de muérdago genómico de complejo. A través de regiones no complementarias de los oligonucleótidos de iniciador usados, se añadieron elementos de control de translación así como secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción, permitiendo así la clonación y la expresión separada de la cadena A de lectina de muérdago con base en el gen de lectina de muérdago, que está presente en forma genómica. La región 5' de la secuencia que codifica rM LA correspondiente a los residuos de aminoácido, tirosina1 - tirosina1 7 [Dietrich y otros , 1992 ; Gabius y otros, 1992], se preparó como u n fragmento de gen sintético a través de hibridación y clonación de dos oligonucleótidos y mediante la adición de un codon de inicio de translación . De esta manera , la secuencia de gen fue optimizada con respecto a la elección de codon, tal como se describe para los genes fuertemente expresados en Escherichia coli [Gribskov y otros, 1984]. En el extremo 3' del fragmento de gen de rMLA sintético, así como en el extremo 5' del fragmento de gen de rMLA obtenido mediante PCR, se introdujo un sitio de restricción de Ssp I mediante intercambio específico del codon de tirosina17 a partir de TAC o TAT, dicho sitio de restricción permitió la fusión de los dos fragmentos de gen de rMLA , mientras que se obtiene el vector pML14- 17 (Figura 5). La secuencia que codifica rMLA fue confirmada a través de secuenciación de A DN (Fig ura 4a). Para la expresión de rMLA en Eschericha coli, la secuencia de gen se aisló del vector pML14-17 y se colocó bajo el control del promotor de polimerasa de T7-A R N y un terminador de transcripción a través de la inserción al vector de expresión pT7-7 [Studier & Moffart, 1986]. El vector de expresión resultante, pT7-MLA, (Figura 5), se utilizó para transformar la cepa de expresión de E. coli, BL21 . La inducción de la expresión de gen se caracteriza por la ocurrencia de una banda de proteína correspondiente a la cadena A de lectina de muérdago recom binante , no glicosilada, la cual posee un peso molecular relativo de 26 kDa . El análisis y la identificación del producto de expresión recombinante se realizó a través de análisis de tinción Western usando un anticuerpo anti-M LA específico (Figura 7). Para una expresión heteróloga de la cadena B de m uérdago , la secuencia que codifica MLB, completa, se amplificó a través de PC R específica a partir del A DN de Viscum álbum genómico de complejo .

Los elementos de control de translación y las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción fueron introducidos (Figura 6) vía regiones no complementarias de los oligonucleótidos de iniciado usados. El producto de PCR de 0.8 kbp se colocó bajo el control de los elementos de control de transcripción después de la clonación en el vector de clonación TA, pCRIl, a través de la inserción en el vector de expresión pT7-7 y la cepa de expresión de E. coli, BL21, se transformó con el vector de expresión resultante, pT7-MLB. La integridad de la secuencia que codifica rMLB se confirmó a través de secuenciación de ADN (Figura 4b). La expresión se detectó en un análisis de tinción Western usando un anticuerpo anti-MLB específico (TB33, Tonevitsky y otros, 195), en donde 2 horas después de la inducción de la expresión del gen, ocurrió una proteína inmunorreactiva que tiene un peso molecular relativo de 31 kDa correspondiente a la cadena B de lectina de muérdago recombinante, no glicosilado (Figura 7b). El análisis de las fracciones celulares después de la ruptura de célula completa de las células de E. coli mostró una división de la cadena de rMLB sintetizado a una fracción soluble en el sobrenadante así como una fracción de cuerpo de inclusión insoluble en el sedimento de la ruptura de célula de E. coli. 4 horas después de la inducción las fracciones soluble e insoluble representaron 50% cada una del rendimiento total (Figura 7b). La invención además se refiere a un huésped transformado con por lo menos un vector de acuerdo con la invención . Dependiendo del objeto perseguido por los expertos en la técnica, el huésped de acuerdo con la invención solamente puede se usado para preparar ya sea uno de los monómeros o una combinación de ambos monómeros, preferiblemente como dímero asociado. El huésped de acuerdo con la invención puede ser una célula eucariótica o procariótica, una planta transgénica o un animal transgénico. Preferiblemente, el huésped de acuerdo con la invención es una célula de mamífero, una célula de planta , una bacteria, una célula fúngica , una célula de levadura, una célula de insecto o una planta transgénica. En una modalidad particularmente preferida , el huésped de acuerdo con la invención es la bacteria E. coli, una célula Aspergillus o u na célula Spodoptera, preferiblemente Spodoptera frugiperda. La invención además se refiera a un polipéptido, el cual es codificado a través de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o a través del vector de acuerdo con la invención y/o es producido a través del huésped de acuerdo con la invención . El polipéptido de acuerdo con la invención preferiblemente tiene la actividad biológica de la cadena A o la cadena B de la lectina de muérdago. En otras modalidades, sin embargo, el polipéptido de acuerdo con la invención puede exhibir sólo parte de la actividad biológica o ninguna actividad biológica . En la invención , "parte de la actividad biológica" se entiende que se refiere ya sea a una actividad reducida y/o a un número de actividades de la escala de actividades biológicas. El polipéptido de acuerdo con la invención puede ser un fragmento de la cadena A o B , la cual exhibe las propiedades antes mencionadas.

Examen de las propiedades de la holoproteína de rMLA, RMLB y rML.

(I) Pesos Moleculares Relativos y Estructura Los pesos moleculares relativos fueron determinados a través de electroforesis en gen de poliacrilamida de SDS bajo condiciones de reducción y subsecuente tinción de la proteína con plata o Azul Brillante de Coomassie o través de tinción inmunológica en un análisis de tinción Wester. Se encontró sorprendentemente que la cadena A de lectina de muérdago no glicosilada, recombinante , tiene un peso molecular relativo de 25 kDa y así difiere significativamente de las cadenas A , A L de lectina de muérdago de existencia natural con 31 kDa y A2 con 29 kDa. Esta diferencia en el peso molecular relativa es particularmente sorprendente, ya que se asume en la técnica anterior que la cadena A no está glicosilada. La cadena B de muérdago recombinante tiene un peso molecular relativo de 31 kDa y es, por lo tanto, substancialmente más ligera que la cadena B de lectina de muérdago de existencia natural, glicosilada, con 36 kDa (Figura 7) .

La heterogeneidad de las proteínas de ML de existencia natural debido a la glicosilación y/o variaciones de secuencia, que se hace evidente en el gel de SDS como banda amplia, no ocurre en las especies recombinantes en cualquiera de los casos examinados. Los pesos moleculares relativos de las holoproteínas (rML) rMLA/rMLB sumaron hasta 56 kDa según comparado con la nML más pesada con 65-67 kDa.

(II) Homogeneidad Isoeléctrica rMLA cambió a se una proteína isoeléctricamente homogénea teniendo un punto isoeléctrico de 6.8, según comparado con cadenas A de lectina de muérdago de existencia natural, las cuales se dividen en 4 especies con puntos isoeléctricos de 5.2; 5.4; 5.7 y 6.2 (Figura 8). RMLB prueba ser una proteína isoeléctricamente homogénea que tiene un punto isoeléctrico de 5.1, según comparado con la cadena B de lectina de muérdago de existencia natural, la cual se divide en por lo menos 2 especies con puntos isoeléctricos de 7.1 y 7.3 (Figura 8). Por lo tanto, para la holoproteína de ML de existencia natural, existe una multitud de posibles variantes y combinaciones (Figura 8, fondo), mientras que para las proteínas de lectina de muérdago recombinante, existe una movilidad uniforme en el cromatoenfoque de IEF, el cual revela la homogeneidad de rML vis á vis la microheterogeneicidad de las especies de proteína de existencia natural .

(III) Actividad Enzimática de rMLA Cuando se utilizan preparaciones de rMLA purificadas por inmunoafinidad en un ensayo de transcripción/translación combinado, la actividad inhibidora de translación puede ser detectada para rMLA (aislada de la fracción de producción de expresión soluble) y rMLA (aislada de la fracción de "cuerpo de inclusión" insoluble). RMLA mostró una característica inhibidora diferente vis á vis la cadena A de lectina de muérdago de existencia natural con respecto a la dependencia de dosis de la inhibición de translación , así como con respecto a la actividad de translación residual q ue no se puede inhibir en el lisato de reticulocito usado (ver Figura 9). La propiedad enzimática que forma la base para el efecto tóxico de las holoproteínas de ML es significativamente reducido en especies recombinantes.

(IV) Actividad de Unión de Carbohidrato de rMLB Las cadenas de rMLB que se producen a través de la renaturalización y reoxidación de los productos de expresión primarios, como las holoproteínas rMLA/rMLB, rMLA/rMLB y MLA/MLB, reasociadas in vitro, tienen actividad de unión de carbohidrato que puede ser detectada a través del ensayo de lectina enlazada a la enzima (ELLA) uniéndose a las asialofetuina o fetuina de matrices de carbohidrato. El carácter específico de carboh idrato de la cadena recombinante de rMLB puede ser determinado y cuantificado en el sistema de ELLA bajo condiciones competitivas para galactosa, ß-lactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico, NANA). La prueba de ELLA competitiva sorprendentemente muestra diferentes caracteres específicos de carbohidrato para nMLB y rMLB. La afinidad de unión se caracteriza a través de los valores IC50 específicos en el sistema para el desplazamiento medio máximo de las proteínas del ligando de asialofetuina inmobolizada a través de galactosa (IC50 de nMLB: 4.5 mM; IC50 de rMLB: no determinable debido a una interacción demasiado baja) , ß-lactosa (IC50 de nMLB: 4.9 mM; IC50 de rMLB; > 70 mM), N-acetil-galactosamina (IC50 nMLB: 20.7 mM; IC50 de rMLB: 109 mM) o del ligando fetuina inmovilizada a través de ácido siálico (IC50 de nMLB: 49.8 mM ; IC50 de rMLB : 47. 1 mM). Ya que la cadena rMLB descrita como lectina específica de galactosa puede ser desplazada a través de galactosa y ß-lactosa como se espera , la cadena rMLB obtenida recombinantemente en E. coli no muestra ninguna interacción detectable con galactosa y sólo una pobre interacción con ß-lactosa. La rMLB recombinante a su vez posee una clara afinidad a N-acetilgalactosamina y ácido siálico y sorprendentemente muestra un desplazamiento substancial del carácter específico de carboh idrato hacia un rM LB de plasta vis a vi s de lectina específico en N-acetil-galactosamina/ácido siálico. Con respecto a la actividad biológica de rM LB y rMLB conteniendo holoproteínas, esta da como resultado la posibilidad de una escala de ligandos, receptores o células objetivo que se extiende más allá de o es diferente de aquella de las proteínas de lectina de muérdago de planta. En una modalidad preferida, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene por lo menos una modificación química o enzimática .

Esta modificación puede cambiar, reducir o incrementar la actividad biológica del polipéptido, si la hay. Dicha modificación puede ser realizada, v. gr. , después de la translación y aislamiento del polipéptido. Dichas modificaciones también pueden ser introducidas durante la preparación química o semi-sintética del polipéptido de acuerdo con la invención . Estas modificaciones pueden ser introducidas por el experto en la técnica a través de métodos conocidos per se para alterar la actividad farmacológica de la lectina de muérdago, preferiblemente para mejorarla. En otra modalidad preferida, el polipéptido de acuerdo con la invención es una proteína de fusión. La proteína de fusión preferiblemente tiene la actividad biológica antes definida . Esta modalidad del polipéptido de acuerdo con la invención es también preferiblemente diseñado para alterar las propiedades farmacológicas de los polipéptidos de lectina de muérdago para objetivos a nivel celular y preferiblemente para mejorarlas. La invención además se refiere además a un dímero de polipéptido que tiene las actividades biológicas de la lectina de muérdago, con los dos monómeros siendo codificados a través de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo co n la invención .

El término "actividad biológica de la lectina de muérdago" se entiende que comprende cualquier actividad biológica del espectro de las actividades biológicas de la lectina de muérdago. Dicha función es, por ejemplo, el efecto farmacológico de la lectina de muérdago. El muérdago de planta 1 indujo citólisis en numerosas líneas de célula de tumor de origen humano y de murino a través de mecanismos apoptóticos [Janssen, 1993]. La lectina de muérdago 1 o la cadena B sólo indujo la liberación de citoquinas de las células mononucleares periféricas de donadores de sangre humanos, saludables [Hajto, 1990]. La lectina de muérdago 1 indujo la secreción de aniones de superóxido de granulocitos neutrofílicos de pacientes con cáncer [Timoshenko, 1993]. La lectina de muérdago 1 indujo la expresión de la cadena A del receptor de interleucina 2 (CD25) y/o el antígeno HLA DQ en linfocitos periféricos de donadores de sangre humanos, saludables [Beuth, 1992]. Después de la aplicación de lectina de muérdago 1 en ratones, se pudo observar un incremento en el número de timocitos, el número de linfocitos T citotóxicos (Lyt-2 + ) y células T auxiliares (L3T4 + ) en el timo y el número de macrófagos peritoneales, particularmente de aquellos que llevan el marcados de activación MAC-3, [Beuth, 1994]. La relación de L3T4 + /Lyt2+ en el timo de los animales experimentales se incrementó. En la sangre periférica de los ratones, la densidad de los leucocitos, linfocitos, monocitos, en general, y en particular de los linfocitos, que expresan el receptor de interleucina 2 como marcador de activación en la superficie de la célula , y los monocitos , los cuales expresan el marcador de activación MAC3, se incrementó después del tratamiento con lectina de muérdago 1 [Beuth, 1994]. En la sangre de pacientes con cáncer, la lectina de muérdago 1 incrementó la densidad de linfocitos T (CD4+, CD8+), de las células aniquiladoras naturales y los linfocitos B [Beuth , 1992]. Además, se pudo detectar un incremento del mediador de opiato endógeno, ß-endorfina, en el plasma de la sangre de pacientes con carcinoma en la mama, después de la aplicación de lectina de muérdago 1 [Heiny, 1994]. Además, se determinó que la lectina de muérdago 1 aumenta el efecto citotóxico de células aniquiladoras naturales, periféricas vis á vis células de tumor K-562 y la densidad de linfocitos granulados, grandes (LG L) en la sang re periférica [Hajto, 1989] . U na actividad anti-metastática de lectina de muérdago 1 en células de sarcoma en ratones , también pudo ser detectada [Beuth, 1991 ] . En otra modalidad, el dímero de pol ipéptido de acuerdo con la invención tiene la misma escala de actividades biológicas como el d ímero de lectina de muérdago de existencia natural .

(V) Actividades Biológicas de la Lectina de Muérdago Recombinante Las holoproteínas rML fueron producidas utilizando las cadenas individuales que fueron recombinantemente sintetizadas en un paso separado in vitro, empezando de las cadenas solubles dobladas o de cadenas rMLA y rMLB desnaturalizadas en un paso de co-flexión, en donde rMLB preferiblemente fue reasociado con un exceso molar de rMLA en presencia de un sistema redox de glutation y parcialmente en presencia de isomerasa de disulfuro de proteína. La holoproteína rMLB que corresponde al heterodímero se aisló y se purificó de la reacción de reasociación a través de cromatografía de afinidad sobre agarosa de N-acetilgalactosamina o lactosil agarosa, separándola así de los dímeros rMLA y rMLB libres. En una manera análoga se prepararon las holoproteínas de los heterodímeros rMLA/rMLB (rM L) y rMLA/nMLB.

Actividad Citotóxica El efecto citotóxico, como un ejemplo de la actividad biológ ica de holoproteínas reasociadas, se probó en una l ínea de célula de leucemia de monocito humano (MOLT4). Tanto la cadena B (unión de superficie) como la cadena A (inactivación de ribosoma enzimático) contribuyen al efecto citotóxico observado. U na holoproteína rMLA/rMLB reasociada in vitro así como una holoproteína rMLA/nM LB reasociada in vitro fueron comparadas con dos lotes de holoproteína nML de existencia natural . Las holoproteínas rMLA/rMLB y rMLA/nMLB recombinantes muestran propiedades citotóxicas comparablemente altas con valores IC de aproximadamente 10-30 pg/ml (Figura 1 1 ), lo cual revela la integridad funcional y la actividad biológica de las holoproteínas rML que fueron reasociadas in vitro utilizando cadenas recombinantes. Para que la actividad citotóxica tenga efecto, es necesario que la cadena B sea operativamente enlazada con una cadena A enzimáticamente activa, ya que la cadena rMLB aislada sorprendentemente no tiene actividad citotóxica. La actividad citotóxica de las preparaciones de cadena B de lectína de muérdago, la cual ya ha sido discutida, puede, por lo tanto, probablemente ser atribuida a un contenido residual de holoproteína nML. La producción recombinante de las cadenas individuales, por lo tanto, por primera vez hace posible separadamente describir y emplear unión de carbohidrato y actividad enzimática de la lectina de muérdago.

Inducción de Apoptosis La capacidad de inducción de apóptosis como un ejemplo de una actividad biológica de lectina de muérdago, fue demostrada para la holoproteína rML recombinante, utilizando la línea de célula de monocito U937. 24 horas después del tratamiento de las células con 70 pg/ml, se pudo detectar la inducción de apoptosis a través de la holoproteína rML (Figura 12) . Las pruebas con lectina de muérdago en células MOLT-4 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mostraron que en la escala de dosis baja , la inducción de procedimientos apoptóticos es la base paira la actividad citotóxica de la lectina de muérdago. Ya que la inducción de citoquina ocurre en la escala de concentración de citotoxicidad baja (Figura 13 , Figura 14) , una correlación con la actividad de inducción de apoptosis es posible, mientras en la escala de dosis alta, así como con tiempos de incubación más largos, la apoptosis es superimpuesta a través de efectos necróticos. Una citotoxicidad como resultado de apoptosis no puede ser detectada cuando se tratan las células MOLT-4 sensibles con la cadena B recombinante, de manera que la actividad biológica de la inducción de apoptosis en la escala de dosis baja sólo puede ser atribuida al efecto de la holoproteína.

Actividad Inmunoestimulante Los efectos inmunoestimulantes, como ejemplo de actividades biológicas de holoproteína de lectina de muérdago recombinante, fueron probados ilustrativamente para la inducción de una liberación de factor a de necrosis tumoral (TNF-a) e interferon ? (IFN-?) a partir de células mononucleares de donares de sangre sanos (modelo PBMC) así como para la inducción de una liberación de interleucina-1a (IL-a) e interleucina-6 (IL-6) en un co-cultivo de queratinocitos primarios y fibroblastos de piel humanos (modelo de piel2 ZK1200). En el modelo PMCBC, 3-48 ng/ml de holoproteína rML recombinante dio como resultado una liberación, dependiente de la dosis, de TNF-a e IFN-?, en el modelo de piel2, de 0.25-8 ng/ml de la holoproteína rML recombinante dio como resultado una liberación, dependiente de la dosis, de IL-1a e IL-6. Todas las citoquinas mencionadas son relevantes mediadores de estimulación del sistema inmunológico del ser humano, las cuales tienen funciones centrales en la activación, particularmente, de la respuesta inmune celular.

En contraste al estado de la técnica hasta ahora, de acuerdo con lo cual , la actividad Inmunoestimulante puede ser principalmente atribuida a la actividad de lectina de la cadena B [Hajto y otros , 1990], ninguna de las liberaciones de citoquina antes mencionadas puede ser inducida sólo con la cadena rMLB recombinante. La actividad inmunoestimulante sólo puede ser lograda en la escala de dosis baja a través de la holoproteína rM L operativamente enlazada. Este sorprendente hallazgo sugiere que las preparaciones inmunoestimulantes de la cadena rMLB de planta siguió conteniendo hullas de holoproteínas nML y que el efecto inm unoestimulante, que fue atribuido a la cadena nMLB debe ser atribuido a un contenido residual de nML. Ya los procedimientos para preparar nMLB, los cuales han sido descritos ya , no permiten una separación cuantitativa de holoproteína , la realización recombinante de las cadenas de lectina de muérdago individuales por primera vez hace posible examinar y proveer preparaciones de cadena B de lectina de muérdago homogéneas. Esto permite por primera vez describi r y emplear, por separado , las actividades biológicas de la cadena A y B y para distinguir las actividades las actividades biológicas de las cadenas individuales y holoproteína operativamente enlazada .

(VI) Actividades Biológicas de la Cadena B de Lectina de Muérdago Recombinante (rMLB) Como marcador para la activación de células inmunocompetentes, se probó la inducción de la proteína de superficie de célula CD69. CD69 aparece como uno de los primeros antígenos de superficie de célula después de la activación de células T, células B y particularmente de células aniquiladoras naturales (células NK). CD69 tiene la función de un marcador de activación de las poblaciones de célula inmunocompetentes antes mencionadas, ya que la proteína de superficie de célula no es expresada en los linfocitos en reposo. Además, se probó que la proteína de superficie CD69 inducible tiene una función conductiva para la actividad citolítíca de las células N K y células TcR?/ células T d [Moretta y otros , 1991 ]. Se empleó citometría de flujo (FACS) utilizando un mAb anti-CD69 para detectar en la escala de concentración de 1 -100 ng/ml de una activación de las mononucleares con respecto tanto a la ocurrencia de CD60 sobre la superficie de la célula a para compartir células positivas CD69. La curva para la dependencia de dosis tuvo la forma de campana, la cual señala la necesidad de interenlace de los receptores celulares vía ambos sitios de unión de ligando de la cadena rMLB. U n efecto citotóxico en PBMC examinado en esta prueba , no pudo ser probado, ni aún a la concentración más alta de 100 ng/ml de rM LB. En una modalidad preferida, el dímero de polipéptido de acuerdo con la invención exhibe, como por lo menos uno de los monómeros, un polipéptido química o enzimáticamente modificado de acuerdo con la invención o u na proteína de fusión de acuerdo con la invención .

Se pueden utilizar modificaciones para optimizar la potencia, pero también para ampliar los usos terapéuticos eliminando ciertas cualidades (por ejemplo, sitios de unión de carbohidrato de la cadena B o actividad de glicosidasa de la cadena A) y así eliminar los posibles efectos laterales. Los polipéptidos que tienen propiedades modificadas también sirven como herramientas para producir los mecanismos de acción . Se hacen necesarias ciertas terapias para reducir la antigeneicidad y la inmunogeneicidad de los polipéptidos y/o para optimizar sus propiedades farmacocinéticas, las cuales podrían ser posibles intercambiando específicamente aminoácidos individuales. La invención además se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos o derivados, los cuales específicamente unen el polipéptido y/o d ímero de polipéptido de acuerdo con la invención . Por lo tanto, no reconocen la lectina de muérdago de existencia natural o sus cadenas individuales. Preferiblemente , los anticuerpos de acuerdo con la invención unen epítopes, los cuales son enmascarados por la g licosilaciones de las lectinas de muérdago de existencia natural . Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales o (semi)sintéticos. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab' , F(ab)2 o Fv. En la técn ica también son conocidos los derivados de anticuerpo. La invención además se refiere a un método para preparar el polipéptido o dímero de polipéptido de ac uerdo con la invención , en donde en el método, el huésped de acuerdo con la invención es cultivado bajo condiciones apropiadas y el polipéptido o dímero de polipéptido así obtenido es aislado. El experto en la técnica está familiarizado con las condiciones apropiadas para cultivar y aislar el huésped. Por ejemplo, el polipéptido o dímero de polipéptido de acuerdo con la invención puede ser exportado del huésped vía un sistema de expresión apropiado y puede ser recogido en el medio. Por otro lado, los polipéptidos o dímeros de polipéptidos pueden permanecer en la célula y pueden ser aislados de ahí. A continuación, se discutirá otra modalidad preferida del método de acuerdo con la invención: Con el fin de aislar rMLA, células E. coli transformadas con un vector de expresión apropiado, fueron divididas y las fracciones de célula solubles e insolubles fueron separadas a través de centrifugación. Un análisis de las fracciones mostró que la cadena A de lectina de muérdago recombinante se acumuló en un 5-50% en forma soluble y en un 50-95% en forma de agregados de proteína insoluble ("cuerpos de inclusión") dependiendo de las condiciones de expresión y la duración de la expresión. La ocurrencia de proteínas solubles o insolubles indica que hay por lo menos dos métodos para aislar rMLA, si es posible la re-felxión o renaturalización de las proteínas rMLA. La rMLA agregada a "cuerpos de inclusión" se disolvió después de lavar los sedimentos para remover las proteínas de E. coli [Babbit y oros, 1990], bajo condiciones de desnaturalización y se volvió a doblar a una dilución de 90 veces en un regulador de pH de doblez (50 mM de Tris-HCl, 2 mM de DTT, 1 mM de EDTA, pH 8.0). Este tratamiento dio como resultado especies de proteína dobladas, las cuales, como se presenta en la figura 9, tuvo una actividad totalmente enzimática justo como las especies rMLA renaturalizadas, originalmente insolubles, desnaturalizadas. La rMLA renaturalizada se puede aislar como la rMLA soluble a través de cromatografía de inmunoafinidad usando el anticuerpo anti-MLA específico TA5 [Tonevitsky y otros, 1995]. La presencia de rMLB en forma soluble, así como en forma de "cuerpos de inclusión" insolubles indica que existen dos métodos para aislar la cadena B de lectina de muérdago recombinante. Con el fin de aislar la cadena rMLB soluble del ambiente fuertemente reductivo del citoplasma de E. coli, ésta se incubó en presencia de un sistema redox que consiste de glutation reducida y oxidada con el fin de establecer los puentes de disulfuro entrecadenas e incubados en presencia de la ß-lactosa de ligando con el fin de estabilizar productos de doblez activos. A partir de la cadena rMLB de unión al carbohidrato, activo a la reacción de doblez se aisló y/o purificó selectivamente en un procedimiento de un paso a través de cromatografía de afinidad sobre lactosil agarosa o N-acetilgalactosamina agarosa. Para poder asilar rMLB de las fracciones del producto de expresión insoluble, las cuales estuvieron presentes como "anticuerpos de inclusión", el sedimento de la ruptura de célula completa de célula E. coli se lavó para remover proteínas de E colt [Babbitt y otros, 1990] y se disolvió bajo condiciones de desnaturalización y de reducción. La renaturalización se realizó mediante dilución en presencia de un sistema redox, consistiendo de glutation reducida y oxidada, así como en presencia de la ß-lactosa de ligando. La cadena rM LB de unión de carbohidrato activa se aisló y se purificó selectivamente de la reacción de renaturalización a través de cromatografía de afinidad sobre N-acetilgalactosamina agarosa o lactosil agarosa. La invención además se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con la presente invención el dímero de polipéptido de acuerdo con la invención y/o la inmunotoxina de acuerdo con la invención, la cual será descrita más adelante, opcionalmente en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos de acuerdo con la invención , sus asociados o modificaciones los conducen a aplicaciones de múltiple en la terapia de cáncer o infecciones en analogía a las propiedades farmacológicas conocidas para la lectina de muérdago de existencia natural. Los efectos inmuestimulantes pueden ser utilizados para terapia de tumores estimulando directa y/o indirectamente la propia defensa inmunológica del cuerpo y permitiendo que efectivamente combata el tumor y posible metástasis. Los mismo se establece para infecciones, en particular, infecciones virales . Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser administrados en combinación con otros agentes inmunoestimulantes tales como interferones , citoquinas o factores de estimulación de colonia, con el fin de obtener efectos sinergísticos o para reducir la dosis necesaria de la preparación de combinación y así reducir sus efectos laterales. En combinación con agentes citoestáticos o terapia de radiación, el efecto lateral de la luecopenia/mielosupresión puede ser mitigado o reducido , de manera que el debilitamiento del sistema inmunológico que surge por los métodos convencionales, es reducido. El efecto citotóxico directo de los polipéptidos que tienen actividad de glicosidasa, da como resultado la apoptosis de células de tumor y también puede ser usado para propósitos terapéuticos. Este principio puede hacer uso más específicamente de la aplicación de inmunutoxinas, si los polipéptidos, de acuerdo con la invención , son acoplados a los anticuerpos apropiados. Por lo tanto, la invención además se refiere a inmunotoxi nas que comprenden por lo menos un polipéptido o dímero de polipéptido de acuerdo con la invención. Por ejemplo, una cadena A activa u holoproteína puede ser acoplada a anticuerpos o fragmentos de la misma a través de métodos de la química de proteína . Dichos procedimientos de acoplamiento son conocidos por los expertos en la técnica, los conjugados correspondientes son útiles para muchos propósitos [Vitetta, 1993]. Alternativamente, pueden ser expresadas construcciones de proteína de fusión correspondientemente construidas que contienen el dominio de unión al antígeno de, por ejemplo, anticuerpos y, además de eso, fragmentos citotóxicos del polipéptido de acuerdo con la invención .

Además, la formación de metástasis puede ser evitada si la unión de las células tumorales a otras células es inhibida. Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden ser usados para evitar dicha unión, haciendo uso de unión de lectina competitiva. La invención además se refiere a un iniciador y/o un par iniciador que específicamente hibridiza a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o a la estructura complementaria de la misma. La invención además se refiere a composiciones de diagnóstico que contienen por lo menos: a) la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención; b) un iniciador y/o un par iniciador que específicamente hibridiza a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o a la cadena complementaria de la misma; y/o c) el polipéptido de acuerdo con la invención y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con la invención. La composición de diagnóstico de acuerdo con la invención con la invención que contiene el iniciador y/o el par iniciador puede ser utilizada para clasificar organismos para la presencia de un gen de lectina con el fin de encontrar, por ejemplo, nuevos genes de lectina que puedan codificar lectinas farmacológicamente interesantes. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención contenida en la composición de diagnóstico de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada para clasificar organismos para la presencia de dichos genes de lectina a través de, por ejemplo, métodos de tinción Southern o de tinción Northern. Variando la severidad de la hibridación se pueden clasificar genes de lectina relacionados. El polipéptido (dímero) puede ser usado, por ejemplo, para generar anticuerpos o antisueros, los cuales pueden ser utilizados para detectar a través de métodos conocidos per se, lectinas respectivas (muérdago) en varios organismos. Finalmente, la invención se refiere a agentes protectores de plantas que contienen el polipéptido de acuerdo con la invención y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con la invención . Los polipéptidos de acuerdo con la invención , sus asociados o modificaciones pueden ser utilizados como agentes protectores de plantas de acuerdo con la función discutida para lectina de muérdago de planta. La función de la lectina de muérdago como una protección anti-viral es discutida debido a sus propiedades tóxicas como medida de protección de la planta contra ser comida, así como debido a propiedades que tienen un efecto en la permeabilidad y constitución de membranas. Las Figuras muestran : La Figura 1 , la construcción de los oligonucleótidos de amplificación primaria. La Figura 2, el producto de amplificación de ML de Viscum álbum primario. La Figura 3, la estrategia de clonación para obtener el gen M L .

La Figura 4, los insertos de los vectores de expresión para rM LA y rMLB y la secuencia de gen ML.

La Figura 5, el vector de expresión del esquema de construcción para rMLA. La Figura 6 , el vector de expresión del esquema de construcción para rMLB. La Figura 7, la expresión de rM LA, rMLB y detección inmunológica. La Figura 8, cromatoenfoque I EF de rMLA y rM LB contra M L natural. La Figura 9 , la actividad enzimática de rMLA (RI P) . La Figura 10, las características de unión de carbohidrato de rMLB. La Figura 1 1 , la citotoxicidad de MOLT4 de rML La Figura 12 , la inducción de apoptosis a través de rML. La Figura 13, el efecto inmunoestimulante de lectina de muérdago recombinante en el modelo PBMC. La Figura 14 , el efecto inmunoestimulante de lectina de muérdago recombinante en el modelo de piel2. La Figura 15 , la inducción del marcador de la superficie de célula, C D96 en PBMC. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención .

EJEMPLO 1 Construcción de los Oligonucleótidos de Amplificación Primaria La lectina de muérdago (ML) pertenece a la clase de proteínas de inactivación de ribosoma [Stirpe y otros, 1992], la cual representa una familia de proteínas común a plantas de varios orígenes taxonómicos. La ML fue atribuida all grupo de proteínas de inactivación de ribosoma de tipo II debido a las actividades de sus subunidades [Endo y otros, 1988a]. El aspecto obvio de clasificar ADNc de Viscum albumy las colecciones genómicas, sin embargo, es completamente inapropiado para encontrar la secuencia del gen de ML. A pesar de utilizar varias sondas de ADN, no se puede indentificar ningún clon específico de ML en las colecciones del gen de poli-A+ ARN de Viscum álbum. Con base en la suposición de que la secuencia del gen ML no contiene introns, se siguió una estrategia de PCR. Ya que las secuencias de aminoácido N-terminal fueron conocidas tanto para la cadena MLA como para MLB [Dierich y otros, 1992; Gabius y otros, 1992], pareció posible amplificar la región de codificación de MLA usando oligonucleótidos de amplificación de degeneración, los cuales ha sido derivados de péptidos conocidos (Figura 1a). Ya que un oiligonucleótido útil con un bajo grado de degeneración puede ser derivado del término N de la cadena MLA (RMLA, Figura 1b), no es posible construir oligonucleótidos suficientemente específicos, correspondientes, del término N de la cadena MLB (RMLB1, RMLB2, RMLB3, Figura 1b). Por lo tanto, se tuvieron que desarrollar estrategias alternativas que hicieran posible derivar oligonucleótidos de amplificación de regiones de secuencia ML aún desconocidas incluyendo datos de proteína de proteínas relacionadas. Un análisis de secuencia de aminoácido de proteínas de inactivación de ribosoma de tipo I y de tipo II mostró un número de regiones conservadas teniendo una lata homología de secuencia. La Figura 1 c ilustra el alto grado de parentesco de RI P entre el tipo I y el tipo I I para el centro activo de la ricina. Dentro del motivo de secuencia MISEAARF, se discutió con respecto a E177 y R180 que juegan una parte en el mecanismo enzimático [Kim y otros, 1992; Lord y otros , 1994]. Se concluyó que por lo menos estos dos residuos pueden estar presentes en la secuencia ML. Deliberaciones estructurales adicionales con respecto a la presencia de residuos individuales, poniendo atención particular a aquellos que tienen un bajo grado de degeneración del uso de codon, dieron como resultado la construcción del oligonucleótido de amplificación RMLA2. La secuencia de este oligonucleótido está representada en la Figura 1 c.

EJE MPLO 2 Preparación de Fragmentos de ADN Específicos en el Gen ML Se aisló ADN genómico de alto peso molecular de acuerdo con el método de Baur y otros [1993] de hojas de Viscum álbum (árbol huésped Populus wilsonii) . Para la preparación de fragmentos de ADN específicos en el gen ML a través de PCR , se utilizaron 100 ng de ADN genómico para cada reacción de amplificación . La amplificación se llevó a cabo en un volumen total de 50 µl . conteniendo regulador de pH (10mM de Tris-HCl , 1 .5 mM de MgCI2, 50 mM de KCl, 0.25 mM de d NTP, pH 8.3), 78 pmoles del iniciador RMLA 1 y 50 pmoles (reacción 2) o 100 pmoles (reacción 1 ) de RMLA2. La PCR se llevó a cabo con polimerasa de ADN de Taq (1 .5 U/reacción) de Boehringer Mannheim en un termociclizador Biometra. Los parámetros de PCR fueron: 1 min. de desnaturalización a 90°C , 1 min . recociendo a 50°C, 1 min . de elongación a 72°C para un total de 30 ciclos . Los productos de amplificación fueron analizados a través de electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% y mediante tinción con bromuro de etidio (Figura 2) . E?I producto de amplificación específico obtenido en la reacción 2 teniendo un tamaño de aproximadamente 500 bp se aisló mediante elución en gel y s sometió a clonación en vectores A.

EJEMPLO 3 Estrategia de Clonación La derivatización de los oligonucleótidos de amplificación usados para la PCR primaria, se muestra en el Ejemplo 1 (Figura 1 a) , la preparación del fragmento de gen primiario del gen ML de Viscum álbum, denominado en lo siguiente como "a" , se muestra en el Ejemplo 2 (Figura 2) . Empezando de la secuencia del fragmento de gen clonado "a" y de la suposición de que el gen M L no tiene ningún intron , fue posible derivar los oligonucleótidos 5' específicos de secuencia, los cuales permitieron una am pl ificación de los fragmentos "b", "c" , "d" y "e" . Ya que el oligonucleótido 3' para "c" también se derivó de la secuencia de A DN de "a", el iniciador 3' de degeneración para la amplificación de los fragmentos del gen "b", "d", "e" y "g", tuvo que ser construido a través de análisis de regiones homologas de proteínas RIP de tipo I ("b") y de tipo I I ("d" , "e", "g"). Las comparaciones de secuencia dentro de las familias de proteína fueron otra vez usadas para inferir la presencia de residuos individuales, poniendo atención particular a aquellos residuos que tienen un bajo grado de degeneración del uso de codon . Particularmente, el ADNc de ricina y abrina y las secuencias de proteínas derivadas , fueron utilizadas para construir aproximadamente las 50 combinaciones de oligonucleótido específicos en ML. La Figu ra 3 muestra sólo aquellos fragmentos de gen que pueden ser clonados como productos de amplificación específicos y pueden ser sometidos para análisis posterior. Empezando de otras combinaciones de oligonucleótido, no se generó ningún producto de amplificación específico en ML. La preparación de los fragmentos del gen "f" (que codifica la cadena MLA) y "g" (que codifica la cadena B) se describe con detalle en el Ejemplo 5 y Ejemplo 6, respectivamente. Para un análisis de las regiones 5' y 3' de las regiones de secuencia translación y no translación del gen ML, las condiciones para RACE 5' y 3' [Frohma n y otros, 1988] fueron establecida s , las cuales condujeron a la generación de fragmentos "h" , "i" y "j". La ampl ificación del fragmento "j" a través de RACE-PC R es así una alternativa a la preparación de fragmentos del gen MLB. Las reacciones RACE fueron realizadas usando A DNc que se preparó de ARN total de Viscum álbum de hojas de muérdago (árbol huésped Populus wilsonii) a través de transcripción inversa.

EJEMPLO 4 Secuencia de ADN y Productos de Translación rMLA y rMLB Los insertos de vectores de expresión pT7-MLA y pT7-M LB fueron secuenciados a través de procedimientos que emplean la estrategia de "trayectoria del iniciador" (detección de la secuencia completamente traslapante de ambas cadenas) usando varios oligonucleótidos específicos en M L (Figuras 4a , b) . Las regiones de la secuencia subrayada se refieren a sitios de restricción para la clonación a los vectores de expresión pT7. Ambos fragmentos de gen han sido modificados de acuerdo con el esquema de construcción de los vectores de expresión , como se describe en el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6. La Fig ura 4c muestra la secuencia del gen ML completa derivada de los fragmentos anteriores. E sta comprende también las regiones si n translación 5' y 3' , así como regiones que codifican al endopéptido y el péptido de señal .

EJEMPLO 5 Construcción del Vector de Expresión PT7-MLA Para la expresión heteróloga, la secuencia que codifica la cadena A de lectina de muérdago fue preparada a través de PCR específica, empezando del ADN de muérdago genómico de complejo y fue terminalmente modificado. Los elementos de control de translación así como las secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción fueron añadidas vía las regiones no complementarias de los oligonucleótidos de iniciador usados, permitiendo así la clonación y la expresión separada de la cadena A de lectina de muérdago con base en la lectina de prepromuérdago genómica. La Figura 5b muestra la preparación de los fragmentos de gen que codifican MLA a través de PCR. Para una amplificación de la secuencia del gen que codifica MLA, 200 ng de ADN de Viscum álbum, 1.5 mM (reacción 1) o 2.5 mM (reacción 2) de cloruro de magnesio, 40 pmoles de cada oligonucleótido de iniciador, RML16 y RML17, en regulador de pH de PCR (10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 0.25 mM de cada uno de dNTP, pH 8.3) fueron utilizados en un volumen total de 50 µl. La PCR se llevó a cabo utilizando polimerasa de Taq (1.5 U/reacción, Boehringer Mannheim) por un total de 30 ciclos del perfil de temperatura, 1 min. de desnaturalización a 94°C, 1 min. de recocido a 52°C, 1.5 min. de elongación a 72°C. Los productos de amplificación fueron analizados mediante electroforesis en gel de 1% de agarosa y se realizó la tinción con bromuro de etidio (Figura 5b) y se proveyeron para la clonación en vectores TA a través de elución en gel. La región 5' de la secuencia que codifica rMLA que corresponde a los residuos de aminoácido, tirosina1 - tirosina17 [Dietrich y otros, 1992, Gabius y otros, 1992] se preparó como un fragmento de gen sintético a través de hibridación y clonación de los dos oligonucleótidos y mediante la adición de un codon de inicio de translación. De esta manera, la secuencia de gen fue optimizada con respecto a la elección del codon tal como se describe para genes fuertemente expresados en Escherichia coli [Gribskov y otros, 1984]. En el extremo 3' del fragmento del gen rMLA así como en el extremo 5' del fragmento del gen rMLA obtenido mediante PCR, se introdujo un sitio de restricción Ssp I a través de intercambio específico del codon de tirosina17 de TAC o TAT, dicho sitio de restricción permitió la fusión de los dos fragmentos del gen rMLA, mientras se obtiene el vector pML14-17 (Figura 5). La secuencia generada completa que codifica rMLA se confirmó a través de la secuenciación de ADN (Figura 4a). Para la expresión de rMLA en Eschericha coli, la secuencia del gen se asiló del vector pML14-17 y se colocó bajo el control del promotor de polimerasa T7-ARN y un terminador de transcripción mediante la inserción al vector de expresión pT7-7. El vector de expresión resultante pT7-MLA (Figura 5) se utilizó para trasformar la cepa de E. coli, BL21.

EJEMPLO 6 Construcción del Vector de Expresión pT7-MLB Para la expresión heteróloga de la cadena B de lectina de muérdago, se amplificó la secuencia completa que codifica MLB a partir del ADN de Viscum álbum genómico de complejo a través de PCR específico, introduciendo elementos de control de translación, así como secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción vía regiones no complementarias del oligonucleótido de iniciador usado. La Figura 6b muestra la preparación del fragmento del gen completo que codifica rMLB mediante PCR . La amplificación del fragmento de A DN que codifica rMLB se llevó a cabo en reacciones de PCR en un volumen total de 50 µl de regulador de pH de PCR ( 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1 .5 mM de MgCI2, 0.25 mM de dNTP, pH 8.3) con 200 ng de ADN de Viscum álbum genómico y 50 pmoles de oligonucleótido de iniciador RML25 y 30 pmoles (reacción 1 ) y 10 pmoles (reacción 2) del oligonucleótido de inciador RML26. La PCR se llevó a cabo usando polimerasa de Taq (1 .5 U/reacción , Boehringer Mannheim) durante un total de 30 ciclos de 1 min . de desnaturalización a 94°C, 1 min. de recocido a 52°C y 1 .5 min . de elongación a 72°C. Los productos de PCR fueron analizados a través de electroforesis en gel con 1 % de agarosa y realizando tinción con bromuro de etidio. El resultado fue de un producto de PCR de 0.8 kbp, el cual se aisló a través de elución en gel y proveyó clonación en vectores TA. El fragmento del gen que codifica rMLB se colocó bajo el control de los elementos de transcripción mediante inserción al vector de expresión pT7-7 y la cepa de expresión E. coli BL21 se transformó con el vector de expresión resultante pT7-MLB. La integridad de la secuencia completa, generada por PCR, que codifica rMLB se confirmó a través de secuenciación de ADN (Figura 4b).

EJEMPLO 7 Expresión. Análisis Inmunológico. Re-flexión v Reasociación in vitro de rMLA y rMLB (I) Expresión de rMLA en E. coli Para una expresión de cadena A de lectina de muérdago recombinante, 1000 ml del medio LBAmp se inocularon a matraces de cultivo de tejido, ranurados de 2 I con 5 ml de un pre-cultivo de LBAmp de crecimiento fijo de E. coli BL21/pT7-MLA y se cultivaron a 37°C bajo agitación. Se observó el crecimiento a través de turbidimetría a 578 nm. Se indujo la expresión del gen añadiendo 0.5 mM de IPTG cuando se alcanzó una densidad de célula de ODS78 -0.9 - 1.0. Para la cosecha, las células se sedimentaron 2 horas después de la inducción mediante centrifugación 5,000 rpm durante minutos y 4°C en un rotor GS-3 (Srvall) y el medio de cultivo se decantó. Empezando de un volumen de cultivo de 11, se aisló una masa de célula de 3 - 4 g (peso húmedo).

La ruptura de la célula se realizó usando un French-Press (SML Instruments) . El sedimento de célula se volvió a suspender en 20 ml de regulador de pH de ruptura B (50 mM de Tris-HCl , 100 mM de NaCI , 1 mM de EDTA, 5 M de DTT, 1 mM de PMSF, pH 8.0) y se separó a través de French-Press de dos pasos a 105.45 kgcm/2. Las fracciones de célula y los posibles "cuerpos de inclusión" se sedimentaron a través de centrifugación subsecuente a 10,000 rpm durante 30 minutos y a 4°C en un rotor SS-34 (Sorvall) y se separaron de las proteínas de £. coli soluble o producto de expresión soluble permaneciendo en el sobrenadante . Para un análisis de la vulúmina igual de expresión de célula , las fracciones de ruptura fueron examinadas a través de electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS , 12.5% , y realizando la tinción con Azul Brillante de Coomassie, a sí como a través de tinción Western usando TA5 de antisuero específico en MLA (Figura 7a) . Los anticuerpos monoclonales TA5 [Tonevitsky y otros, 1995] fueron provistos por el autor. Como los otros anticuerpos usados en la presente invención , estos pueden ser preparados a través de técnicas normales usando el inmunogen respectivo (en el caso de TA5 es M L- 1 o MLA) . Para la detección de la volúmina igual de expresión de las fracciones solubles (carril 2 , 4 , 6 , 8) así como de la fracción de "anticuerpos de inclusión" insolubles (carril 1 , 3, 5, 7) de la ruptura de £. coli fueron examinados para su contenido de rMLA . Con el fin de ilustrar el curso de la expresión , se utilizaron muestras anteriores (carril 7 + 8) después de la expresión del gen . La expresión se caracterizó ya 1 hora antes de la inducción a través de la ocurrencia de un producto de expresión de 25 kDa imnunorreactivo que corresponde a rMLA, cuya máxima expresión es alcanzada después de 2 horas después de la inducción. La distribución de rMLA sobre las fracciones de ruptura de célula soluble o insoluble, 2 horas después de la inducción , es de ~ 50% cada una, con una duración de expresión más larga dando como resultado un incremento en la formación de "cuerpos de inclusión" insolubles.

(II) Aislamiento de rMLA de "Anticuerpos de Inclusión" Insolubles El sedimento de la ruptura de célula completa de £. coli se lavó dos veces con 20 ml de regulador de pH STET (50 mM de Tris-H Cl . 8% (p/v) de sacarosa , 50 mM de EDTA; 1 .5% (v/v) de tritón x- 100, pH 7.4) de acuerdo con Babit y otros [1990] para remover las proteínas de £. coli. El sedimento restante con los "cuerpos de inclusión" contenidos en el mismo, se disolvió en 20 ml de regulador de pH de desnaturalización(6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM de DTT, 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0) a través de incubación durante 16 horas a temperatura ambiente bajo agitación constante. Para la renaturalización de rMLA, la solución de proteína presente en el regulador de pH de desnaturalización se añadió lentamente gota a gota al volumen de 90 veces del regulador de pH de doblez (50 mM de Tris-HCl , 2 mM de DTT, 1 mM de EDTA, pH 8.0) y se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente mientras se agitaba. La proteína precipitada se separó a través de centrifugación a 6,000 rpm durante 30 minutos y 4°C en un rotor GS-3 (Sorvall). El sobrenadante que contiene rMLA se ajustó para almacenamiento 20% (v/v) de glicerol y se almacenó a 4°C.

(III) Purificación de rMLA a través de Inmunoafinidad Para una purificación de un paso de rMLA (fracción de producto de expresión soluble o proteína doblada) a través de cromatografía de inmunoafinidad , 260 µg del IgG anti-nM LA de anticuerpo monoclonal (TA5, Tonevitsky y otros, 1995) dirigidos contra la cadena A de lectina de muérdago , fueron covalentemente inmovilizados en C L4B de sefarosa de proteína A (Sigma , Deisenhofen) de acuerdo con el método de Harlow & Spur [1988] . Después de la incubación de la matriz de inmunoafinidad con la muestra de rMLA y después de lavar la matriz con 10 volúmenes de lecho de columna de regulador de pH de lavado (1 M de NaCI, 10 mM de regulador de pH de fosfato, pH 7.0) y 10 volúmenes de lecho de colum na de regulador de pH 2 de lavado (10 mM de regulador de pH de fosfato, pH 7.0) para remover proteínas no específicamente unidas, específicamente unidas a rMLA, se eluyó con un regulador de pH de elución (0.1 M de glicina, pH 2.5) . La elución se realizó para ajustar el pH en un receptáculo conteniendo 1 M de regulador de pH de fosfato, pH 8.0.

(IV) Expresión de rMLB en £. coli Para una expresión de cadena B de lectina de muérdago recombinante, se inocularon 1000 ml del medio LBAmP a matraces de cultivo de tejido ranurados de 2 I, con 5 ml de pre-cultivo de LBAmP de crecimiento estable de £. coli BL21/pT7-MLB y se cultivó a 37°C bajo agitación. El crecimiento se observó a través de turbidimetría a 578 nm. La expresión del gen se indujo añadiendo 0.5 mM de IPG cuando se alcanzó una densidad de célula de OD578 ~ 0.9 a 1.0. Para la cosecha, las células fueron sedimentadas 4 horas después de la inducción mediante centrifugación a 5,000 rpm durante 20 minutos a 4°C en un rotor GS-3 (Sorvall) y el medio de cultivo se decantó. La ruptura de la célula se realizó usando un French-Press (SML Instruments). El sedimento de célula se volvió a suspender en 20 ml de regulador de pH de ruptura B (20 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, pH 8.0) y se separó a través de French-Press de dos pasos a 105.45 kgcm/2. Las fracciones de célula y los posibles "cuerpos de inclusión" se sedimentaron a través de centrifugación subsecuente a 10,000 rpm durante 30 minutos y a 4°C en un rotor SS-34 (Sorvall) y se separaron de las proteínas de £. coli soluble o producto de expresión soluble permaneciendo en el sobrenadante. Para un análisis de la volúmina igual de expresión de célula, las fracciones de ruptura fueron examinadas a través de electroforesis en gel de poliacrilamida de SDS, 12.5%, y realizando la tinción con Azul Brillante de Coomassie, a sí como a través de tinción Western usando TB33 de antisuero específico en MLB (Figura 7b) . Los anticuerpos monoclonales TB33 [Tonevitsky y otros , 1995] fueron provistos por el autor. Estos fueron preparados usando técnicas normales. Los anticuerpos correspondientes pueden ser preparados por algún experto en la técnica a través de técnicas normales empleando ML- 1 o MLB como inmunogen. Para la detección de la volúmina igual de expresión de las f racciones solubles (carril 2 , 4, 6, 8) así como de la fracción de "anticuerpos de inclusión" insolubles (carril 1 , 3, 5, 7) de £. coli fueron examinados para su contenido de rMLB. Con el fin de ilustrar el curso de la expresión , se utilizaron muestras anteriores (carril 1 +2) , 2 horas (carril 3 + 4) , 4 horas (carril 5+6) y 6 horas (carril 7+8) después de la inducción de la expresión del gen . La expresión se caracterizó ya 1 hora antes de la inducción a través de la ocurrencia de un producto de expresión de 31 kDa imnunorreactivo que corresponde a rMLB, cuya máxima expresión es alcanzada después de 4 horas después de la inducción . La distribución de rMLB sobre las fracciones de ruptura de célula soluble o insoluble, 4 horas después de la inducción , es de ~ 50% cada una, con una duración de expresión más larga dando como resultado un incremento en la formación de "cuerpos de inclusión" insolubles.

(V) Aislamiento de rMLB de "Anticuerpos de Inclusión" Insolubles El sedimento de la ruptura de célula completa de £. coli se lavó dos veces con 20 ml de regulador de pH STET (50 mM de Tris-HCl . 8% (p/v) de sacarosa, 50 mM de EDTA; 1 .5% (v/v) de tritón x- 100, pH 7.4) de acuerdo con Babitt y otros [1990] para remover las proteínas de £. coli. El sedimento restante con los "cuerpos de inclusión" contenidos en el mismo, se disolvió en 20 ml de regulador de pH de desnaturalización (6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM de DTT, 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0) a través de incubación durante 16 horas a temperatura ambiente bajo agitación constante. Para la renaturalización de rMLB , la solución de proteína presente en el regulador de pH de desnaturalización se añadió lentamente gota a gota al volumen de 90 veces del regulador de pH de doblez (20 mM de tris-HCI, 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 100 m M de glucosa 10% (v/v) de glicerol, 10 mM de ß-lactosa , pH 5.5) y se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente mientras se agitaba. La proteína precipitada se separó de la fracción de rMLG doblado, soluble, a través de centrifugación a 6, 000 rpm durante 30 min utos y 4°C en un rotor GS-3 (Sorvall).

(VI) Aislamiento de rMLB a través de Cromatografía de Afinidad en N-acetil-D-galtosamina agarosa Con el fin de aislar rM LB de unión de carbohidrato activo, u na matriz de afinidad de N-acetil-galactosamina agarosa (PI ERCE , EUA) se equilibró con regulador de pH de cromatografía de vol úmina de lecho de 10 columnas (50 mM de regulador de pH de fosfato, 300 mM de NaCI , 1 mM de EDTA , 10% (v/v) de glicerol , 0.05% (v/v) Tween®, pH 7.0). La aplicación de las muestras se llevó a cabo a través de incubación de la matriz de afinidad en una solución de muestra conteniendo rMLB durante por lo menos 2 horas a 4°C. Después de lavar la matriz de afinidad con regulador de pH de cromatografía para remover las proteínas no específicamente unidas, rMLB unido se eluyó a través de desplazamiento competitivo con 0.3 M de N-acetil-galactosamina en regulador de pH de cromatografía , pH 4.0.

(Vil) Reasociación In Vitro de Cadenas de Lectina de Muérdago para preparar la Holoproteína La holoproteína de lectina de muérdago recombinante (rM L) puede ser preparada empezando de las cadenas A de lectina de muérdago doblada, aislada y B de lectina de muérdago, o empezando de las desnaturalizadas, las cuales fueron renaturalizadas a través de co-doblez. Para la reasociación de cadenas individuales dobladas, aisladas, la cadena B de lectina de muérdago aislada (nMBL o rM LB) se incubó con un exceso molar de rMLA en 20 mM de regulador de pH , 50 mM de NaCI, 1 mM de EDTA ; pH 7.2 a 4°C durante 16 -48 horas. Para que se formen los puentes de disulfuro intercadena, la reacción se incubó en presencia de un sistema redox de 6 mM de glutationa (relación de reducida a oxidada 5 : 1 ) o 10 mM de glutatio na (relación de reducida a oxidada 2: 1 ) + 1 µM de isomerasa de disulfuro de prote ína (Boehringer Mannheim) . Para la reasociación , empezando de cadenas individuales desnaturalizadas a través de co- doblez, la cadena rMLA se disolvió en 6 M de cloruro de guanidinio, 2 mM de DTT, 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 a una concentración de 2 mg/ml. Para reducir completamente los residuos de cisteína , la cadena rMLB se disolvió en 6 M de cloruro de guanidinio, 100 mM de DTT; 50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 y se volvió a regular en su pH después de la incubación a temperatura a mbiente durante 20 minutos en 6 M de cloruro de guanidinio, 50 mM de Tris-HCl , pH 8.0 a través de penetración en gel sobre PD- 10 (Pharmacia, Suecia) y se ajustó a una concentración de 200 µg/ml. La reasociación se llevó a cabo co-doblando rM LB con un exceso molar de rM LA diluyendo lentamente la solución de guanidinio por 1 : 30 en regulador de pH de acoplamiento (50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA; 10% (v/v) de glicerol, 100 mM de glucosa, 20 mM de lactosa, pH 8.0) y una incubación a 4°C durante 16 horas. Para que se formen los puentes de disulfuro intercadena, la reacción se incubó en presencia de un sistema redox de 2 mM de glutationa (relación de reducida a oxidada 1 : 1 ). Las reacciones de acoplamiento fueron Usadas con regulador de pH de almacenamiento (50 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 300 mM de NaCI, 1 mM de EDTA, 10% (v/v) de glicerol, 0.05% (v/v) de Tween®-20, pH 8.0) . El análisis y la identificación del heterodímero formado, se llevó a cabo a través de SDS-PAGE bajo condiciones sin reducción y subsecuente análisis de tinción Western usando anticuerpos monoclonales, específicos contra la cadena A de lectina de muérdago (TA5) o la cadena B de lectina de muérdago (TB33). El aislamiento de la holoproteína formado o la separación de los agregados de rMLA y rMLB libres, se realizó a través de cromatografía de afinidad sobre sefarosa de N-acetil-galactosamina o lactosil-agarosa, como se describió en (VI).

EJEMPLO 8 Homogeneidad Isoeléctrica de rMLA y rMLB Se enfocaron 1 -2 µg de rMLA, MLA de existencia natural , rM LB, MLB de existencia natural o la holoproteína ML, junto con normas de proteína I EF (BioRad , EUA) sobre geles Servalyt PreNets I EF (pH 3-10, 125 x 125 mm, 150 µm , Serva Heidelberg) . Para análisis, Las proteínas fueron inmovilizadas a través de electrotinción semi-seca en membranas de nitrocelulosa (0.2 µm, Schleider & Schüll, Dassel) . La tinción inmunológica se realizó usando un anticuerpo específico en MLA monoclonal (TA5, Tonevitsky y otros, 1995) para rMLA y nMLA o usando un anticuerpo específico en MLB monoclonal (TB33, Tonevitsky y otros, 1995) para rMLB, nMLB y holoproteínas ML. Los complejos inmunes fueron teñidos usando un IgG-lgG anti-ratón (Sigma , Deisenhofen) conjugado con fosfatasa alcalina y haciendo reaccionar los substratos, NTB y BCIP (Figura 8) . Ya que la cadena A de lectina de muérdago de planta altamente purificada, así como la cadena B de lecti na de m uérdago altamente purificada son proteínas isoeléctricamente inhomogéneas con puntos isoeléctricos de nMLA de 5.2 : 5.4: 5.5:6.2 y de nMLB de 7.1 : 7.3, la cadena rMLA recombinante teniendo un punto isoeléctrico de 6.8 y la cadena rMLB recombinante teniendo un punto isoeléctrico de 5.1 es una proteína homogénea (figura 8) . De esta manera, existe un número grande heterogéneo de variantes de molécula para la holoproteína ML de existencia natural (Figura 8, fondo), mientras la movilidad uniforme de las proteínas de lectina de muérdago recombinante revela la homogeneidad de la rML vis á vis, la microheterogeneicidad de las lectinas de muérdago .

EJEMPLO 9 Detección de la Actividad Enzimática, de Inactivación de Ribosoma de rMLA La concentración de proteína de rMLA (redoblado) y rMLA (soluble) purificado a través de cromatografía de inmunoafinidad as í como de la cadena de MLA de existencia natural (nMLA) se determinó de acuerdo con Bradford [1976] usando una norma BSA. Para la detección y cuantificación de la actividad de AR N r-N-glicosidasa de MLA, se estabilizó un sistema de prueba no radioactivo usando el "sistema de reticulocito acoplado a TNT" (Promega , EUA). Por reacción , se preincubaron cantidades igua les (20 µl) del sistema TNT a 30°C durante 15 minutos . Para la cuantificación de la inhibición de translación , se añadieron 2 µl del regulador de pH correspondiente a las reacciones de control y 2 µl de diluciones de MLA de gradiente (escala de concentración 350 - 0 pM) a las reacciones de prueba. De cada reacción, se tomaron 2 muestras a intervalos de 8 minutos y se congelaron en nitrógeno líquido para detener la reacción . Como una medida de la actividad de translación , la cantidad de luciferasa relativa (sqrt-cpm) se determinó en una prueba bioluminiscente a través de un contador de scintilación. Para cada reacción, la diferencia de los sqrt-cpms medidos de las muestras, los cuales fueron tomados a tiempos diferentes , se determinó como una medida de la actividad de translación relativa. La actividad en la reacción de control sin RI P se fijó a 0% de inactivación (IA). Aplicando el régimen de inactivación de translación relativa contra las concentraciones de rMLA usadas , la concentración de proteína se determinó a través de regresión no lineal que da como resu ltado 50% de inhibición de la actividad de translación segú n comparado a la reacción de control . Este valor de ICso es un valor dependiente del sistema , que permite la detección y la cuantificación de la actividad enzimática de rM LA (soluble) , rM LB (redoblado) vis á vis nMLA (Figura 9) . La Figura 9 muestra la detección de la actividad de inactivación de ribosoma , enzimática de la cadena de MLA recombinante. Tanto a través del aislamiento del contenido del producto de expresión soluble (rMLA soluble) como a través de redoblar la proteína (rM LA redoblada) aislado de "cuerpos de incl usión", se puede obtener un producto de expresión enzimáticamente activo. RM LA (soluble) y rM LA (redoblado) exhiben actividades correspond ientes con valores de IC50 de 10.7 + 1.3 pM o de 15.6 + 6.6 de pM. Así, exhiben una actividad tóxica más baja que la cadena de MLA de existencia natural (IC50 1.1 + 0.7 pM), EJEMPLO 10 Actividad de Carbohidrato de la Cadena B de Lectina de Muérdago La detección de la actividad de unión de carbohidrato de la cadena B de lectina de muérdago recombinante así como la comparación de las actividades de carbohidrato y caracteres específicos de la cadena B de lectina de muérdago de planta se realiza a través del Ensayo de Lectina Enlazada a la Enzima (ELLA) en presencia de carbohidratos competitivos. El enlace de las cadenas nMLB y rMLB se estableció usando una matriz de asiolofetuina inmovilizada a los residuos de galactosa y N-acetil-galatosamina, así como usando una matriz de fetuina inmovilizada a residuos de ácido siálico, prepoderantemente. Para una inmovilización de la matriz de carbohidrato, se transfirió una solución de 100 µl de 1.1 mg de asiolofetuina (Sigma, Deisenhofen) o 1.1 de fetuina (Sigma, Deisenhofen) en 11 ml de PBS, a las cavidades de placas de microtitulación MaxiSorp C96 (Nunc, Wiesbaden) y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de lavar las placas de microtitulación 3 veces con 150 µl/cavidad con PBS-T (10 mM de regulador de pH de fosfato, 130 mM de NaCI, 0.1 % (v/v) de Tween®-20, pH 7.2) las placas de microtitulación fueron incubadas a 36°C durante 1 hora con 200 µl/cavidad PBS-T- 1 % BSA (10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 130 mM de NaCI, 0.1 % (v/v) de Tween®-20, 1 % (p/v) de BSA, pH 7.2) para bloquear lo sitios de unión no específicos y después fueron lavados como se describió anteriormente. Para probar, se utilizaron 100 µl de cadena B conteniendo preparaciones, en una concentración de 100 - 50 ng/ml, de referencia de 400 ng/ml . Las concentraciones de prueba fueron sometidas a través de diluciones de las muestras en PBS-0, 05% BSA (10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 130 mM de NaCI, 0.05% (p/v) de BSA , pH 7.2) . Por cada concentración de prueba se prepararon 2-3 réplicas de control . La determinación del control se realiza con PBS-0.05% BSA o el regulador de pH de preparación respectiva. Con el fin de determinar los caracteres específicos de unión , las muestras fueron incubadas en presencia de azúcares libres, competitivos. Para un desplazamiento de rM LB, nMLB u holoproteínas ML a partir de la unión a la matriz de asiafetuina o fetuina , galactosa preferiblemente en la escala de concentración de 0 - 280 mM , N-acetil-galactosamina en la escala de concentración de 0 - 280 mM, lactosa en la escala de concentración de 0 - 140 mM o ácido siálico en la escala de concentración de 0 - 140 mM , se usó. Las placas se incubaron a 36°C durante 2 horas , después de la carga , y se lavaron después como se describió anteriormente. A la cavidad cargada, se le añadieron 100 µl/cavidad de suero de lectina de anti-muérdago (1 : 19800 de dilución del depósito de suero en PBS-T-0.1 % BSA-Tx (10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 130 mM de NaCI, 0.1 % (v/v) de Tween®-20, 0.1 % (p/v) de BSA, 1 % (v/v) de Tritón ® X100, pH 7.2) , se incubaron a 36°C durante 2 horas y después de lavaron como se describió anteriormente. Para un análisis de los complejos inmunes por cavidad cargada , se añadieron 100 µl de IgG-lgG anti-cabra, conjugado con peroxidasa de rábano (Sigma , Deisenhofen) a una dilución de 1 :3500 en PBS-1 % BSA (10 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, 1 30 mM de NaCI , 1 % (p/v) de BSA; pH 7.2) y se incubaron a 36°C durante 1 hora. Las cavidades después se lavaron 6 veces con 150 µl/cavidad de PBS-T. Para desarrollo , se añadieron 100 µl/solución de substrato de cavidad (1 tableta de o-fenilen diamina (Sigma, Deisenhofen) en 25 ml de 65 mM de ácido cítrico, pH 5.0 + 10 µl de 30% de peróxido de hidrógeno) y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos en la obscuridad . La reacción se detuvo añadiendo 100 µ 1/1 M de ácido sulfúrico/cavidad . La evaluación se hizo a través de fotometría de absorción a 450 nm con una longitud de referencia de 690 nm y cálculo del valor de IC50 a través de la descripción de los datos medidos por el Equipo de 4-Parameter. La Figura 10 m uestra los valores del desplazamiento de rM LB y nM LB del ligando de asiolofetuina inmovilizada i ncrementando las cantidades de D-galactosa (Figura 10a), ß-lactosa (Figura 10b) o N-acetil-galactosamina (Figura 10c) así como del desplazamiento de los ligandos de fetuina inmovilizada incrementando las cantidades del ácido siálico (Figura 10d), las cuales se observaron en el sistema ELLA . Las características de unión de nMLB y rMLB son descritas por el valor de IC50 con relación al desplazamiento semi-máximo. Ya que la unión de carbohidrato de la cadena nMLB de planta puede ser principalmente competida por galactosa (IC50 = 4.5 mM) y ß-lactosa (IC50 = 4.9 mM) , la cadena rMLB recombinante sorprendentemente tiene un carácter específico de carbohidrato claramente alterado. En contraste al nMLB, la actividad de unión de carbohidrato de rMLB no puede ser competida por galactosa (IC50 no determinable) y sólo a un grado restringido por ß-lactosa (IC50 > 70 mM). Además de la afinidad dramáticamente reducida vis á vis y la ß-lactosa, la cadena rMLB recombinante tiene un carácter específico marcado para N-acetil-galactosamina (IC50 = 109 mM) . Otra actividad de la unión a ligandos de ácido siálico, la cual se describe para nMLB, puede ser detectada para la cadena MLB recombinante (Figura 10d) . Para la cadena nM LB de planta (IC50 = 49.8 mM) y la cadena rM LB recombinante (IC50 = 47.1 mM) se detectaron afinidades de unión idénticas. Vis á vis, la planta, pri ncipalmente la cadena nM LB específica en galactosa/ß-lactosa , la cadena rMLB recombinantemente preparada tiene claramente un carácter específico diferente de carbohidrato, que es desplazado a la dirección de unión de N-acetil-galactosamina/ácido siálico.

EJEMPLO 11 Detección de la Citotoxicidad de Holoproteínas rML Reasociadas In Vitro en Células de Leucemia linfático humanas La integridad de la holoproteína de lectina de muérdago se detectó a través de análisis cuantitativo de citotoxicidad vis á vis, la línea de célula de leucemia (linfático) mononuclear, MOLT-4 (Eurpoean Collection of Animal Cell Cultures No. 85011413). Las células MOLT-4 fueron cultivadas en un medio libre de suero de MDC-1 (PAN SYSTEMS, Aidenbach) y se ajustó para la prueba a una densidad de célula de 1.5 x 105 de células MOLT-4/ml a una viabilidad de > 98%. Con el fin de determinar la citotoxicidad, por cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades, se añadieron 90 µl de una suspensión de célula MOLT-4 a 18000 células/cavidad, y se mezclaron con 10 µl de la solución de muestra.

Para la prueba, preparaciones de holoproteína de lectina de muérdago (lotes #220793 (Madaus) y BRAIN 12/94, los cuales fueron aislados de hojas de muérdago o te de muérdago a través de técnicas normales usando sefarosa de lactosilo [Franz y otros, 1977]) así como holoproteína rML reasociada in vitro en una escala de concentración de 1-100 pg/ml, fueron correspondientemente usadas (1.6 fM-1.66 pM), con la serie de dilución siendo preparada en el medio de cultivo de célula MDC-1. Por cada concentración muestra se prepararon 6 réplicas de control. Las células fueron incubadas en un incubador a 37°C y 5% de CO2 durnate 72 horas. La cuantificación del efecto citotóxico se llevó a cabo determinando la viabilidad de las células usando un colorante de formazan soluble de acuerdo con el método de WST-1 [Scudiero y oros, 1988] utilizando el reactivo de proliferación de célula WST-1 (Boehringer Mannheim) . La holoproteína recombinante, así como la holoproteína quimérica rMLB/nMLB muestran actividad biológica vis á vis la proteína de existencia natural con valores de IC50 de alrededor de 10-30 pg/ml con respecto a la citotoxicidad de MOLT-4. En la escala de concentración probada (rMLB hasta 1 ng/ml) , sin embargo, rMLB no mostró actividad citotóxica .

EJEMPLO 12 Inducción de Apoptosis Mostrada para el Ejemplo de Línea de Célula de Monocito U937 a través de Lectina de muérdago recombinante (rML) La detección de la inducción de procedimientos de apoptóticos a través de lectina de muérdago recombinante (rMLA/rMLB) se realizó mediante la tinción del núcleo con un colorante fluorescente, DAPI [Hoz y otros , 1992] . Los cambios típicos apoptóticos en la morfología del núcleo pueden hacerse visibles bajo el microscopio y pueden ser cuantificados contando 500- 100 células por muestra . Es esencial para la sensibilidad del ensayo, utilizar un medio libre de suero , ya que la presencia de proteínas de suero dramáticamente reduce la cantidad disponible de lectina (aproximadamente el factor de 40 a 10% de FCS, Ribereau-Gayon y otros, 1995). El tiempo de inducción de 24 horas permite sólo parcialmente una correlación directa con el ensayo de MOLT, ya que el efecto citotóxico es claramente visible en el ensayo de viabilidad después de 72 horas, la apoptosis, sin embargo, es un efecto que puede ser detectado en forma temprana. Si los tiempos de incubación son demasiado largos, la apoptosis es pigmentada a través de necrosis secundaria. La Figura 12 muestra un incremento marcado en el régimen de células U937 apoptóticas, después del tratamiento con la holoproteína ML recombinante. A 70 pg/ml, el número de células apoptóticas, después de 24 horas, en dos diferentes cultivos en medios libres de suero, se incrementó por un factor de 3. Por lo tanto, la lectina de muérdago recombinante como la proteína de existencia natural [Janseen y otros, 1993] es capaz de inducir la muerte de célula apoptótica.

EJEMPLO 13 Efecto Inmunoestimulante de Lectina de Muérdago Recombinante en el modelo PBMC El TNF-a (monocitos, macrófagos) e IFN-? (células auxiliares T) de citoquinas, son mediadores centrales dentro de la red de complejo del sistema inmunológico humano. Las células humanas, mononucleares (PBMC, contienen monocitos y linfocitos) de donadores de sangra sanos, fueron aislados a través de centrifugación de gradiente de densidad FICOLL-PAQU E® de acuerdo con las instrucciones del productor (Pharmacia , Suecia) . Para la inducción de la liberación de TNF-a, las células (4 x 106 células mononucleares/ml) fueron incubadas en un medio RPM I 1640 conteniendo 10% (v/v) de suero de cabra fetal , 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina , primero durante 18 horas con las proteínas de lectina de muérdago recombinante sólo y después durante 24 horas más con 1 µg/ml de lipopolisacáridos de Salmonella abortus equi como el factor coestimulante a 37°C, 5% de CO2 y > 95% de humedad relativa en placas de cultivo de célula de microtitulación con forma de U en un incubador provisto con gas . Después, la concentración de TN F-a fue cuantificada en los sobrenadantes a través de cualquiera de ELISA (Genzyme Duagnostics, Rüsseisheim) . Para la inducción de la liberación de INF-?, las células fueron incubadas en el medio antes mencionado durante 1 hora con las proteínas de lectina de muérdago recombinante solas , y después durante 65 horas más con 0.5 µg/ml de fitohemaglutinina-L como el factor co-esimulante como se describió anteriormente. Después, la concentración respectiva de I FN-? se cuantificó en los sobrenadantes libres de célula a través de ELISA (EN DOGEN I NC. , Cambridge, EUA) .

EJEMPLO 14 Efecto Inmunoestimulante de Lectina de Muérdago Recombinante en el Modelo de Piel2 ZK1200 El modelo de piel2 establecido como bioensayo, consiste de piel conteniendo fibroblasto tridimensional y una epidermis estructurada de los queratinocitos no queratinizados en su propia matriz de existencia natural [Joller y otros, 1996]. Las piezas del tejido de la piel (11 x 11 mm2, preparadas de células primarias humanas; Advanced Tissue Sciences Inc. (ATS), La Jolla, EUA) fueron provistas sobre una reja de nylon en agarosa y se transfirieron a un medios especial A. (ATS, La Jolla, EUA) inmediatamente después de la recepción. Tanto IL-1a como IL-6 son relevantes, estimulando las citoquinas del sistema inmunológico humano. Para la inducción de la liberación de IL-1a o IL-6, las piezas de tejido de piel2 fueron incubadas junto con la substancia de prueba en 2 ml de medio B especial (ATS; La Jolla, EUA) durante 24 horas a 37°C, 5% de CO2 en aire y > 95% de humedad relativa en placas de cultivo de 12 copas (Corning Glass Works, Corning, EUA). Después, la concentraciones de IL-1a (Quantikine human IL-1a Assay, R&D Systems, Inc., Minneapolis, EUA) e IL-6 (h-interleucina 6 ELISA, Boehringer Mannheim GmbH) fueron cuantificadas en los sobrenadantes libres de célula a través de ELISA. El modelo de piel2 se caracterizó por una liberación dependiente de dosis de IL-1a inducida por 0.25 - 8 ng/ml y por una liberación de IL-6 inducida por 05 - 8 ng rML/ml (Figura 14). Sorprendentemente, ninguna de las liberaciones de citoquina antes mencionadas pudieron ser logradas sólo con la cadena rMLB recombinante. Este hallazgo absolutamente contradice el conocimiento de la técnica anterior de acuerdo a la cual la actividad inmunoestimulante se atribuyó principalmente a la actividad de la lectina de la cadena B [Hajto y otros, 1990].

EJEMPLO 15 Activación de las Células Inmunocompetentes Mediante la Cadena B de Lectina de Muérdago Recombinante La activación de células inmunucompetentes se examinó utilizando la inducción de la proteína de superficie de célula CD69.

CD69 parece como uno de los primeros antígenos de superficie de célula después de la activación de células T, células B y particularmente de células aniquiladoras naturales (células NK) la cuales, debido a su capacidad de reconocer y Usar las células neoplásticas, juegan una parte central en la defensa natural contra tumores. CD69 es un marcador de activación de las poblaciones de célula inmunocompetentes antes mencionadas, ya que la proteína de la superficie de célula no es expresada en linfocitos en reposo.

Además, para la proteína de superficie CD96 inducible, se pudo detectar una función conductiva para la actividad citolítica de las células NK y las células TcR?/células T d [Moretta y otros, 1991 ]. Para la detección del marcador de superficie en células mononucleares humanas a través de Citometría de Flujo (FACS) , PBMC fueron aislados mediante el gradiente en un Hypaque (Sigma) similar al Ejemplo 13. Después de disolver las células en un medio RPMI 160 con 5% de FCS y sembrando aproximadamente 250000 células/copa de una placa de microtitulación , la solución se incubó durante 4 horas con 1 , 10, 30, y 100 ng de Mab de anti-DC69 marcado con fluorescencia , en un baño de hielo , seguido por el lavado con la solución de Hamk con 5% de FCS. Las células marcadas sedimentadas se añadieron a 200 µl de fluido de Sheah Fluid y se midieron en FACScan (Becto Dickinson). La fluorescencia media es aplicada correspondiendo al número del marcador de superficie de célula CD96 por célula así como la división de las células positivas CD69 en toda la población de célula . En la escala de concentración de 1 -100 ng/ml, una activación de las células mononucleares tanto con respecto a la ocurrencia de C D96 en la superficie de la célula así como con respecto a la división de las cél ulas positivas CD96, puede ser detectada . U na curva de dependencia de dosis con forma de cam pana puede ser observada. U n efecto citotóxico en los PBMC examinados en el ejemplo de la presente , no pudo ser detectado, n i aú n a la concentración más alta de 100 ng/ml de rM LB.

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LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: MADAUS AG (B) CALLE: Ostmerheimer Strasse 198 (C) CIUDAD: Koeln (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL (ZONA): D-51109 (G) TELEFONO: 0221-8998-1 (H) TELEFAX: 0221-8998-305 (I) TELEX: 8873441 drma d (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Lectina de Muérdago Recombinante (rML) (iii) NUMERO DE SECUENCIAS 2: (IV) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE:Patentln Reléase #1.0, versión #1.30 (EPO) (v) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NUMERO DE SOLICITUD: PCT/EP96/02773 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1923 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: ambas (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Viscum álbum (F) TIPO DE TEJIDO: hoja (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 55 .. 1749 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto = "Lectina de Prepro-muérdago" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: sig-péptido (B) LOCALIZACION: 55 .. 153 (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 154 ..900 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto = "Una Cadena" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION : 901 .. 957 (D) OTRA I N FORMACIÓN: /producto = "Propéptido" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION: 958 .. 1746 (D) OTRA I N FORMACIÓN : /producto = "Cadena B" (x) I NFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN : (A) AUTORES : Eck, Juergen Baur Axel Langer, Martin Rohe, Markus Moeckel, Babette Lentzen , Hans Zinke, Holger (B) TITU LO: Clonación del Gen de Lectina de Muérdago y Caracterización de la Cadena A Recombinante (K) RES I DUOS RELEVANTES EN SEC I D NO: 1 : DE 1 A 1923 (ix) DESC RI PCIÓN DE SECU ENC IA : SEC I D NO: 1 : TTTTATCTCC TGCCATCTTC CATCGGGGAG TCGCCGTGAC ACCATTCAGG AACA ATG 57 Met -33 AAT GCG GTT ATG GAC TCA AGA AGG GCA TGG GCT TCG TGT TTT TTA ATG 105 Asn Ala Val Met Asp Ser Arg Arg Ala Trp Ala Ser Cys Phe Leu Met -30 -25 -20 CTG GGC CTA GTT TTT GGT GCG ACG GTC AAA GCG GAA ACC AAA TTC AGC 153 Leu Gly Leu Val Phe Gly Ala Thr Val Lys Ala Glu Thr Lys Phe Ser -15 -10 -5 TAC GAG AGG CTA AGA CTC AGA GTT ACG CAT CAÁ ACC ACG GGC GAC GAA 201 Tyr Glu Arg Leu Arg Leu Arg Val Thr His Gln Thr Thr Gly Asp Glu 1 5 10 15 TAT TTC CGG TTC ATC ACG CTT CTC CGA GAT TAT GTC TCA AGC GGA AGC 249 Tyr Phe Arg Phe lie Thr Leu Leu Arg Asp Tyr Val Ser Ser Gly Ser 20 25 30 TTT TCC AAT GAG ATA CCA CTC TTG CGT CAG TCT ACG ATC CCC GTC TCC 297 Phe Ser Asn Glu lie Pro Leu Leu Arg Gln Ser Thr lie Pro Val Ser 35 40 45 GAT GCG CAÁ AGA TTT GTC TTG GTG GAG CTC ACC AAC CAG GGG GGA GAC 345 Asp Ala Gln Arg Phe Val Leu Val Glu Leu Thr Asn Gln Gly Gly Asp 50 55 60 TCG ATC ACG GCC GCC ATC GAC GTT ACC AAT CTG TAC GTC GTG GCT TAC 3 3 Ser lie Thr Ala Ala lie Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr 65 70 75 80 CAÁ GCA GGC GAC CAÁ TCC TAC TTT TTG CGC GAC GCA CCA CGC GGC GCG 441 Gln Ala Gly Asp Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Arg Gly Ala 85 90 95 GAA ACG CAT CTC TTC ACC GGC ACC ACC CGA TCC TCT CTC CCA TTC AAC 489 Glu Thr His Leu Phe Thr Gly Thr Thr Arg Ser Ser Leu Pro Phe Asn 100 105 110 GGA AGC TAC CCT GAT CTG GAG CGA TAC GCC GGA CAT AGG GAC CAG ATC 537 Gly Ser Tyr Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Ala Gly His Arg Asp Gln lie 115 120 125 CCT CTC GGT ATA GAC CAÁ CTC ATT CAÁ TCC GTC ACG GCG CTT CGT TTT 585 Pro Leu Gly lie Asp Gln Leu He Gln Ser Val Thr Ala Leu Arg Phe 130 135 140 CCG GGC GGC AGC ACG CGT ACC CAÁ GCT CGT TCG ATT TTA ATC CTC ATT 633 Pro Gly Gly Ser Thr Arg Thr Gln Ala Arg Ser He Leu He Leu He 145 150 • 155 160 CAG ATG ATC TCC GAG GCC GCC AGA TTC AAT CCC ATC TTA TGG AGG GCT 681 Gln Met He Ser Glu Ala Ala Arg Phe Asn Pro He Leu Trp Arg Ala 165 170 175 CGC CAÁ TAC ATT AAC AGT GGG GCG TCA TTT CTG CCA GAC GTG TAC ATG 729 Arg Gln Tyr He Asn Ser Gly Ala Ser Phe Leu Pro Asp Val Tyr Met 180 185 190 CTG GAG CTG GAG ACG AGT TGG GGC CAÁ CAÁ TCC ACG CAÁ GTC CAG CAT 777 Leu Glu Leu Glu Thr Ser Trp Gly Gln Gln Ser Thr Gln Val Gln His 195 200 205 TCA ACC GAT GGC GTT TTT AAT AAC CCA ATT CGG TTG GCT ATA CCC CCC 825 Ser Thr Asp Gly Val Phe Asn Asn Pro He Arg Leu Ala He Pro Pro 210 215 220 GGT AAC TTC GTG ACG TTG ACC AAT GTT CGC GAC GTG ATC GCC AGC TTG 873 Gly Asn Phe Val Thr Leu Thr Asn Val Arg Asp Val He Ala Ser Leu 225 230 235 240 GCG ATC ATG TTG TTT GTA TGC GGA GAG CGG CCA TCT TCC TCT GAG GTG 921 Ala He Met Leu Phe Val Cys Gly Glu Arg Pro Ser Ser Ser Glu Val 245 250 255 CGC TAT TGG CCG CTG GTC ATA CGA CCC GTG ATA GCC GAT GAT GTT ACC 969 Arg Tyr Trp Pro Leu Val He Arg Pro Val He Ala Asp Asp Val Thr 260 265 270 TGC AGT GCT TCG GAA CCT ACG GTG CGG ATT GTG GGT CGA AAT GGC ATG 1017 Cys Ser Ala Ser Glu Pro Thr Val Arg He Val Gly Arg Asn Gly Met 275 280 285 TGC GTG GAC GTC CGA GAT GAC GAT TTC CGC GAT GGA AAT CAG ATA CAG 1065 Cys Val Asp Val Arg Asp Asp Asp Phe Arg Asp Gly Asn Gln He Gln 290 295 300 TTG TGG CCC TCC AAG TCC AAC AAT GAT CCG AAT CAG TTG TGG ACG ATC 1113 Leu Trp Pro Ser Lys Ser Asn Asn Asp Pro Asn Gln Leu Trp Thr He 305 310 315 320 AAA AGG GAT GGA ACC ATT CGA TCC AAT GGC AGC TGC TTG ACC ACG TAT 1161 Lys Arg Asp Gly Thr He Arg Ser Asn Gly Ser Cys Leu Thr Thr Tyr 325 330 335 GGC TAT ACT GCT GGC GTC TAT GTG ATG ATC TTC GAC TGT AAT ACT GCT 1209 Gly Tyr Thr Ala Gly Val Tyr Val Met He Phe Asp Cys Asn Thr Ala 340 345 350 GTG CGG GAG GCC ACT CTT TGG CAG ATA TGG GGC AAT GGG ACC ATC ATC 1257 Val Arg Glu Ala Thr Leu Trp-Gln He Trp Gly Asn Gly Thr He He 355 360 365 AAT CCA AGA TCC AAT CTG GTT TTG GCA GCA TCA TCT GGA ATC AAA GGC 1305 Asn Pro Arg Ser Asn Leu Val Leu Ala Ala Ser Ser Gly He Lys Gly 370 375 380 ACT ACG CTT ACG GTG CAÁ ACÁ CTG GAT TAC ACG TTG GGA CAG GGC TGG 1353 Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Leu Asp Tyr Thr Leu Gly Gln Gly Trp 385 390 395 400 CTT GCC GGT AAT GAT ACC GCC CCA CGC GAG GTG ACC ATA TAT GGG TTC 1401 Leu Ala Gly Asn Asp Thr Ala Pro Arg Glu Val Thr He Tyr Gly Phe 405 410 415 AGG GAC CTT TGC ATG GAA TCA AAT GGA GGG AGT GTG TGG GTG GAG ACG 1449 Arg Asp Leu Cys Met Glu Ser Asn Gly Gly Ser val Trp Val Glu Thr 420 425 430 TGC GTG AGT AGC CAÁ AAG AAC CAÁ AGA TGG GCT TTG TAC GGG GAT GGT 1497 Cys Val Ser Ser Gln Lys Asn Gln Arg Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Gly 435 440 445 TCT ATA CGC CCC AAA CAÁ AAC CAÁ GAC CAÁ TGC CTC ACC TGT GGG AGA 1545 Ser He Arg Pro Lys Gln Asn Gln Asp Gln Cys Leu Thr Cys Gly Arg 450 455 460 GAC TCC GTT TCA ACÁ GTA ATC AAT ATA GTT AGC TGC AGC GCT GGA TCG 1593 Asp Ser Val Ser Thr Val He Asn He Val Ser Cys Ser Ala Gly Ser 465 470 475 480 TCT GGG CAG CGA TGG GTG TTT ACC AAT GAA GGG GCC ATT TTG AAT TTA 1641 Ser Gly Gln Arg Trp Val Phe Thr Asn Glu Gly Ala He Leu Asn Leu 485 490 495 AAG AAT GGG TTG GCC ATG GAT GTG GCG CAÁ GCA AAT CCA AAG CTC CGC 16B9 Lys Asn Gly Leu Ala Met Asp Val Ala Gln Ala Asn Pro Lys Leu Arg 500 505 510 CGA ATA ATC ATC TAT CCT GCC ACÁ GGA AAA CCA AAT CAÁ ATG TGG CTT 1737 Arg He He He Tyr Pro Ala Thr Gly Lys Pro Asn Gln Met Trp Leu 515 520 525 CCC GTG CCA TGA TTTAGGTTCA TGGCTCGAAG ATTGCTTGCA TGCGACCATC 1789 Pro Val Pro * 530 CTTTCTATTT TCTCTTTTCT ACCrpTGAA ATAATGTCTG TGAATAATGT GGCACGTTGA l849 GGCCCGCCGA AAGAAGCCTT AGCCACCTTG TGTTTGAGAA TAAATGAGTT AATGCAAGCA 1909 ATCAACTTCT CCTT - 1923 (2) I N FORMACIÓN PARA SEC I D NO: 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE SECU ENCIA: (A) LO NG ITU D: 565 aminoácidos (B) TI PO: aminoácido (D) TOPOLOG ÍA: lineal (ii) TI PO DE MO LÉCU LA : prote ína (xi) DESCRI PCIÓN DE SECU ENCIA: SEC I D NO: 2 : Met Asn Ala Val Met Asp Ser Arg Arg Ala Trp Ala Ser Cys Phe Leu -33 -30 -25 -20 Met Leu Gly Leu Val Phe Gly Ala Thr Val Lys Ala Glu Thr Lys Phe -15 -10 -5 Ser Tyr Glu Arg Leu Arg Leu Arg Val Thr His Gln Thr Thr Gly Asp 1 5 10 15 Glu Tyr Phe Arg Phe He Thr Leu Leu Arg Asp Tyr Val Ser Ser Gly 20 25 30 Ser Phe Ser Asn Glu He Pro Leu Leu Arg Gln Ser Thr He Pro Val 35 40 45 Ser Asp Ala Gln Arg Phe Val Leu Val Glu Leu Thr Asn Gln Gly Gly 50 55 60 Asp Ser He Thr Ala Ala He Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala 65 70 75 Tyr Gln Ala Gly Asp Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Arg Gly 80 85 90 95 Ala Glu Thr His Leu Phe Thr Gly Thr Thr Arg Ser Ser Leu Pro Phe 100 105 110 Asn Gly Ser Tyr Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Ala Gly His Arg Asp Gln H5 120 125 He Pro Leu Gly He Asp Gln Leu He Gln Ser Val Thr Ala Leu Arg 130 135 140 Phe Pro Gly Gly Ser Thr Arg Thr Gln Ala Arg Ser He Leu He Leu 145 150 155 He Gln Met He Ser Glu Ala Ala Arg Phe Asn Pro He Leu Trp Arg 160 165 170 175 Ala Arg Gln Tyr He Asn Ser Gly Ala Ser Phe Leu Pro Asp Val Tyr 180 185 190 Met Leu Glu Leu Glu Thr Ser Trp Gly Gln Gln Ser Thr Gln Val Gln 195 200 205 His Ser Thr Asp Gly Val Phe Asn Asn Pro He Arg Leu Ala He Pro 210 215 220 Pro Gly Asn Phe Val Thr Leu Thr Asn Val Arg Asp Val He Ala Ser 225 230 235 Leu Ala He Met Leu Phe Val Cys Gly Glu Arg Pro Ser Ser Ser Glu 240 245 250 255 Val Arg Tyr Trp Pro Leu Val He Arg Pro Val He Ala Asp Aap Val 260 265 270 Thr Cys Ser Ala Ser Glu Pro Thr Val Arg lie Val Gly Arg Asn Gly 275 280 285 Met Cys Val Asp Val Arg Asp Asp Asp Phe Arg Asp Gly Asn Gln He 290 295 300 Gln Leu Trp Pro Ser Lys Ser Asn Asn Asp Pro Asn Gln Leu Trp Thr 305 310 315 He Lys Arg Asp Gly Thr He Arg Ser Asn Gly Ser Cys Leu Thr Thr 320 325 330 335 Tyr Gly Tyr Thr Ala Gly Val Tyr Val Met He Phe Asp Cys Asn Thr 340 345 350 Ala Val Arg Glu Ala Thr Leu Trp Gln He Trp Gly Asn Gly Thr He 355 360 365 He Asn Pro Arg Ser Asn Leu Val Leu Ala Ala Ser Ser Gly He Lys 370 375 380 Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Leu Asp Tyr Thr Leu Gly Gln Gly 385 390 395 Trp Leu Ala Gly Asn Asp Thr Ala Pro Arg Glu Val Thr He Tyr Gly 400 405 410 415 Phe Arg Asp Leu Cys Met Glu Ser Asn Gly Gly Ser Val Trp Val Glu 420 425 430 Thr Cys Val Ser Ser Gln Lys Asn Gln Arg Trp Ala Leu Tyr Gly Asp 435 440 445 Gly Ser He Arg Pro Lys Gln Asn Gln Asp Gln Cys Leu Thr Cys Gly 450 455 460 Arg Asp Ser Val Ser Thr Val He Asn He Val Ser Cys Ser Ala Gly 465 470 475 Ser Ser Gly Gln Arg Trp Val Phe Thr Asn Glu Gly Ala He Leu Asn 480 485 490 495 Leu Lys Asn Gly Leu Ala Met Asp Val Ala Gln Ala Asn Pro Lys Leu 500 505 510 Arg Arg He He He Tyr Pro Ala Thr Gly Lys Pro Asn Gln Met Trp 515 520 525 Leu Pro Val Pro 530

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES 1 .- Una molécula de ácido nucleico: (a) que codifica una preproteína que exhibe después de la maduración, la función biológica del dímero de lectina de muérdago y la cual tiene la secuencia de ácido nucleico representada en la Figura 4c; (b) que codifica un fragmento de una preproteína de acuerdo con (a) , el fragmento siendo una parte biológicamente activa del dímero de lectina de muérdago; (c) que difiere de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) o (b) debido a la degeneración del código genético; o (d) que se hibridiza bajo condiciones severas a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) , (b) , o (c) , y que codifica un polipéptido que tiene la función o actividad biológica indicada en (a) o (b) . 2 - La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el fragmento es la cadena A de la lectina de muérdago, que se codifica por la secuencia de nucleótido presentada en la Figura 4a. 3.- La molécu la de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el fragmento es la cadena B de la lectina de muérdago , que se codifica por la secuencia de nucleótido presentada en la Figura 4b. 4.- La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde es una molécula de ADN . 5.- La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde es una molécula de ARN. 6.- U na molécula de ácido nucleico, la cual es una estructura de cadena antisentido a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 7.- Un vector, el cual contiene por lo menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 8.- El vector de acuerdo con la reivindicación 7, el cual contiene tanto una molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones o 4, como una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4. 9.- En vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, el cual es un vector de expresión . 10.- Un huésped, el cual es transformado con por lo menos un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9. 11 .- El huésped de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es una célula de planta o una planta transgénica . 12 - El huésped de acuerdo con la reivindicación 10 , el cual es una célula de mam ífero, una célula de bacteria, de hongo, de levadura, o una célula de insecto. 13.- El huésped de acuerdo con la reivindicación 12 , en donde la bacteria es E. coli , la célula de hongo es una célula Aspergillus y la célula de insecto es una célula de Spodoptera, preferiblemente una célula de Spodoptera frugiperda. 14.- Una polipéptido, el cual es codificado mediante la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y es producido a través del huésped de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13. 15.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, el cual exhibe por lo menos una modificación química o enzimática, la modificación siendo una glicosilación, la cual normalmente no ocurre en Viscum álbum. 16.- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, el cual es una proteína de fusión. 17 - Un dímero de polipéptido que tiene la función biológica de la lectina de muérdago, en donde un monómero es codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, o 5, y el segundo monómero a través de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, y en donde el dímero de polipéptido es producido por el huésped de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13. 18.- El dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17, en donde por lo menos uno de los monómeros es un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15 o 16. 19.- Un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo, el cual específicamente une el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 17 o 18. 20.- Un procedimiento para producir el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, o el dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en donde el huésped de acuerdo con la reivindicación 12 p 13 es cultivado bajo condiciones apropiadas y el polipéptido o dímero de polipéptido así obtenido, es aislado. 21 .- Una inmunotoxina que comprende por lo menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 o un dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 o 18. 22.- Una composición farmacéutica q ue comprende el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 , y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, y/o la inmunotoxina de acuerdo con la reivindicación 21 , opcionalmente en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 23.- Un iniciador o par iniciador, el cual específicamente se hibridiza a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o a su estructura de base complementaria . 24.- Una composición de diagnóstico que contiene por lo menos: (a) la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; (b) un iniciador y/o un par iniciador de acuerdo con la reivindicación 23; y/o (c) el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 o 18. 25.- Un agente de protección de plantas que contiene el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, y/o el dímero de polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17 o 18.