CN101392262B - 一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用。该分离多肽的编码序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是，首先是提取杨树菇的总RNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，得到PCR产物；其次是酶切得到PCR产物和原核表达载体，构建重组表达载体；第三是将得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，得到表达杨树菇泛素交联酶的重组细胞；第四是将得到的重组细胞诱导培养过夜获得饱和培养物；等五是利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化在重组细胞中表达的多肽。多肽作为制备治疗或预防肿瘤疾病药中的应用。涉及的蛋白质具有抗肿瘤活性。在开发抗肿瘤药物方面有很大的应用价值。

Description

一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及真菌杨树菇(Agrocybeaegerita)泛素交联酶基因序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽及其制备方法，同时还涉及多肽在医药、抗肿瘤中的应用。

背景技术

杨树菇(Agrocybe aegerita)隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柳松茸等。富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达1.75％，其营养价值超过香菇、金针菇等其他食用菌，同时又具有独特的药用价值，民间常用于抗癌、降压，治疗胃冷、肾炎、水肿等有独特疗效，有＂中华神菇＂之美誉，但其中的药理成分并不明确，本发明中涉及的杨树菇泛素交联酶是我们首次发现的重要药理成分。

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，UPP通路包括泛素、泛素激活酶(Ub-activating enzyme，E1)、泛素交联酶(Ub-conjugating enzymes，E2)、泛素连接酶(Ub-proteinligases，E3)、蛋白酶体(proteasome)复合体等。2004年诺贝尔化学奖授予了在“泛素介导的蛋白质降解过程研究”中做出开创性贡献的三位科学家。泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，比如细胞凋亡、MHCI类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号传导等，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。当泛素-蛋白酶体系统对靶蛋白的降解功能失常时，可以引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白异常降解、突变细胞凋亡受阻和增殖加速，从而导致肿瘤的发生。UPP的异常改变不仅与恶性肿瘤的病因学有着直接关素，并且与恶性肿瘤的发展和预后有着密切的关系。

在UPP通路中，蛋白酶体已经作为抗肿瘤药物的设计靶点，蛋白酶体抑制剂Bortezomib(Bz)已经实验和临床证明是一种有效的新的抗癌治疗药物，它抑制26S蛋白酶体活性，阻断UPP和诱导胱冬肽酶(caspase)活化，可以作为UPP研究的有利工具和具有潜在的抗肿瘤和抗炎作用。而UPP通路中的其他成分还没有作为抗肿瘤药物设计靶点的报道。

本发明中提供一种真菌来源的泛素交联酶，具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性，是UPP通路中针对E2组分的抗肿瘤活性蛋白。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种多肽核苷酸序列，该序列能编码上述杨树菇泛素交联酶多肽序列。该序列与SEQ ID NO.1中1-456位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中1-456位的核苷酸序列杂交。70％的同源基因可以通过突变试剂盒进行突变，或者通过插入，缺失等基因操作获得。较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中1-456位核苷酸序列编码具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列。该序列是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列，连接于表达载体，生产杨树菇泛素交联酶。

本发明的另一个目的在于提供一种真菌泛素交联酶活性的多肽(SEQIDNO.2)所示的氨基酸序列，该多肽具有多种活性：抗肿瘤活性，在医药上具有广泛的应用价值。该泛素交联酶是报道的第一个具有抗肿瘤活性的泛素交联酶。

本发明还涉及一种杨树菇泛素交联酶多肽的制备方法，该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化杨树菇泛素交联酶，该方法简便，成本低廉。

本发明还涉及一种真菌泛素交联酶活性的多肽(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列在作为制备治疗或预防宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤疾病药中的应用。它可以抑制多种肿瘤细胞的生长，杀死肿瘤细胞，对肿瘤细胞的抑制作用优于或类似于临床应用的化疗药物阿霉素效果，该泛素交联酶有开发成抗肿瘤药物的潜力。

为实现上述任务，本发明采用以下技术措施：

本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该序列编码一种新的杨树菇泛素交联酶。在本发明中，真菌杨树菇泛素交联酶的cDNA核苷酸序列是以杨树菇总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR方法得到的。具体方法如下：杨树菇菌种为福建省三明真菌研究所提供的栽培种Ag21(食用菌学报，1999，6(3)：1-7，取杨树菇的新鲜菌丝或子实体，提取总RNA或mRNA为模板(市售的提取RNA和mRNA试剂盒，如Clontech，Promega，Stratagene等公司产品，按照说明书操作)，合成逆转录引物5’gac cac gcg tat cga tgt cga ct16(a/c/g)3’，进行逆转录得到cDNA第一链。根据杨树菇泛素交联酶cDNA序列，设计引物5’atggggtctgtatccgcaagac3’为正向引物，以5’gac cac gcg tat cga tgt cga c3’为反向引物，以上述cDNA第一链为模板，进行PCR，获得600bp的目的片段，将此片段克隆测序，得到SEQ ID NO.1的cDNA序列。

本发明所要求保护的与上述cDNA序列至少有70％的同源性的基因可以通插入，缺失、突变等基因操作获得。如可以在设计PCR引物时，在SEQ ID NO.1提供的序列基础上，可以任意进行插入，缺失和突变的引物合成，用该引物进行PCR，则可以得到至少有70％同源性的基因。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中1-456位的核苷酸序列。根据SEQ ID NO.11-456位的核苷酸序列，设计引物，引物通常为包含1-20位核苷酸序列，和与436—456位互补的核苷酸序列，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列。

本发明要求保护的杨树菇泛素交联酶活性的多肽可用如下方法生产。该方法包括：以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行。

一种杨树菇泛素交联酶多肽的制备方法，它包括下列步骤：

1)提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

2)酶切步骤1得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体，获得与cDNA至少有70％同源性的基因序列：在SEQ ID NO.1的1-456序列基础上，根据需要，以其中的任意一段序列(一般为20-40bp，也可以长达100bp)为PCR引物，有目的的在引物合成时引入碱基的插入，缺失和突变，用该引物与SEQ ID NO.1中设计酶切位点的两端序列(436—456序列，或436—456互补序列，或1—20序列，或1—20互补序列)为一对引物，进行PCR扩增可以在原序列中有目的的引入碱基的插入，缺失和突变，得到与cDNA至少有70％同源性的基因序列，获得重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞。

3)将步骤2中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树菇泛素交联酶的重组细胞，酶切原核表达载体pET28b(市售，Novagen公司，也可以用市售的其他的各种表达载体)，连接酶切后的cDNA序列和表达载体pET28b，构建重组表达载体pET28—杨树菇泛素交联酶；

4)将步骤3中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞BL21(市售，Novagen公司，可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞)，形成表达杨树菇泛素交联酶的重组细胞；

5)将步骤4中得到的重组细胞在37℃培养过夜获得饱和培养物；将50μL饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100μg/mL的培养基中，于37℃培养2小时。取1mL培养物转移至微量离心管中。加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为1m mol/L，对培养物进行诱导，诱导10小时。

6)利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤5中在重组细胞中诱导表达具有所示的氨基酸序列的多肽。该多肽为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。

本发明要求保护的杨树菇泛素交联酶活性的多肽可以抑制宫颈癌、胃癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌肿瘤细胞的生长，杀死肿瘤细胞。基本纯的该泛素交联酶多肽或其变异形式可以单独、或以不同的比例加入其他抗肿瘤药物形成口服的、静脉注射或瘤内注射的抗肿瘤药物。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与细胞中伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“杨树菇泛素交联酶(或多肽)编码序列”指编码具有杨树菇泛素交联酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQID NO.1中1-456位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQID NO.1序列的编码框1-456位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-456位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下能与SEQID NO.1中核苷酸1-456位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQID NO.1中从核苷酸1-456位核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有杨树菇泛素交联酶功能蛋白的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常以120个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。如实施例3中，构建的表达载体转录的核苷酸序列在SEQ ID NO.1核苷酸5’端缺失90个核苷酸，3’端缺失63个核苷酸，表达产物保持原蛋白的85％抗肿瘤活性。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC方法测量多肽的纯度。

在本发明中，术语“杨树菇泛素交联酶多肽”指具有杨树菇泛素交联酶活性的SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该术语还包括具有与杨树菇泛素交联酶相同功能的、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为40个以内，较佳地为20个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。如实施例3中，构建的表达载体表达的重组蛋白在SEQ ID NO.2序列的N端缺失了30个氨基酸，C端缺失21个氨基酸，表达产物保持原蛋白的抗肿瘤活性。该术语还包括杨树菇泛素交联酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与杨树菇泛素交联酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗杨树菇泛素交联酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含杨树菇泛素交联酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有杨树菇泛素交联酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供杨树菇泛素交联酶或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇泛素交联酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L—氨基酸的残基(如D—氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ—氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，如那些在多肽的合成和加工中和进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括杨树菇泛素交联酶多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可以用于抑制细胞内杨树菇泛素交联酶的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有杨树菇泛素交联酶多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码杨树菇泛素交联酶的核酸分子。

本发明还包括检测杨树菇泛素交联酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于杨树菇泛素交联酶多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为20-50个核苷酸。

另一方面，本发明还包括对杨树菇泛素交联酶或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于杨树菇泛素交联酶基因产物或片段。较佳地，指那些能与杨树菇泛素交联酶基因产物或片段结合但不识别和结合与其他非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制杨树菇泛素交联酶的分子，也包括那些并不影响杨树菇泛素交联酶的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的杨树菇泛素交联酶基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传过程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的杨树菇泛素交联酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达杨树菇泛素交联酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断杨树菇泛素交联酶功能的抗体以及不影响杨树菇泛素交联酶功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用杨树菇泛素交联酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与杨树菇泛素交联酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的优点和效果：

本发明中提供的杨树菇泛素交联酶核苷酸序列和蛋白质序列是一种新的泛素交联酶的基因和蛋白质序列，未见报道，尤其第一个从药用真菌中报道的泛素交联酶。到目前为止，已发现的泛素交联酶都仅报道了在泛素—蛋白酶体通路中的作用等，没有报道抗肿瘤活性。因此，本发明的优点是“新”——本发明是一种新的，第一个报道具有抗肿瘤活性的泛素交联酶，可以应用在医药领域。

本发明中涉及的杨树菇泛素交联酶蛋白具有很强的抗肿瘤活性。在相同的浓度下，对HeLa(宫颈癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、SGC-7901(胃癌细胞)的抑制效果优于临床使用的化疗药物阿霉素，对Colo320(直肠癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞)和MCF-7(乳腺癌细胞)的抑制效果与阿霉素相当。对荷S180骨肉瘤的小鼠进行治疗，可以延长小鼠的生存时间，对肿瘤生长的抑制率为41.3％。因此，该蛋白及其基因在开发抗肿瘤药物方面将有很大的应用价值。

附图说明

图1为一种pET28-杨树菇泛素交联酶的构建示意图。图中UBC为杨树菇泛素交联酶的基因，pGEM-UBC为UBc的保存质粒。首先设计含有Nco I和Xho I酶切位点的上下游引物，以质粒pGEM-杨树菇泛素交联酶为模板，进行PCR，得到两端含有Nco I和Xho I酶切位点的PCR产物，用Nco I和Xho I酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，根据回收的量进行连接反应，使UBC插入pET28b的多克隆位点，完成pET28—杨树菇泛素交联酶(pET28b-UBC)表达载体的构建。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。

编码杨树菇泛素交联酶核苷酸序列的制备方法，杨树菇泛素交联酶多肽制备方法，杨树菇泛素交联酶多肽截短体制备方法及活性实施例，抗体制备实施例，抗肿瘤实施例。

实施例1

杨树菇泛素交联酶的cDNA克隆和测序：本实施例中得到一新的cDNA序列，是前人未报道过的。

1.引物扩增

以杨树菇总RNA为模板，用寡核苷酸A：5’gac cac gcg tat cga tgt cga ct16(a/c/g)3’为逆转录引物进行逆转录，得到cDNA的第一链，以寡核苷酸B：5’atggggtctgtatccgcaagac3’为正向引物，寡核苷酸C：5’gac cac gcg tat cga tgt cga c3’为反向引物，进行PCR，PCR条件为95℃起始10min，进入三步循环(95℃1min，53℃1min，72℃2min共30个循环)，最后72℃延伸10min。20μL反应体系包含：1μg cDNA，0.2mM dNTP，20pM正向引物和反向引物，2μL10×buffer，1μL Taq酶和1.5mM MgCl₂。PCR产物为一600bp目的片段。

2.克隆测序

根据该pGEM-T easy载体(Promega公司产品)的操作手册，将该扩增片段克隆到pGEM-T easy载体上，构建质粒pGEM-杨树菇泛素交联酶(pGEM-UBC)，进行测序，共600bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中1-456为编码氨基酸序列的开放阅读框序列。

根据得到的cDNA序列翻译出杨树菇泛素交联酶的氨基酸序列，共152个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

杨树菇泛素交联酶在大肠杆菌中的表达、纯化：本实施例中可以得到大量表达、纯化的蛋白质样品。

首先设计含有Nco I和Xho I酶切位点的上下游引物，以质粒pGEM-杨树菇泛素交联酶为模板，进行PCR，得到两端含有Nco I和Xho I酶切位点的PCR产物，用Nco I和Xho I酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，回收杨树菇泛素交联酶片段和目的质粒，根据回收的量进行连接反应，构建原核表达载体pET28b—杨树菇泛素交联酶(Pet28b-UBC)，如图1所示。

按照前述的原核表达方法，根据不同时间诱导表达重组杨树菇泛素交联酶的结果，选择优化时间，大量表达。利用Ni柱纯化重组杨树菇泛素交联酶，表达量约为3—4mg/L。

实施例3

杨树菇泛素交联酶截短体(ΔUBC)的制备及活性测定：本实施例中得到大量表达、纯化的杨树菇泛素交联酶截短体(ΔUBC)(N端截短30个氨基酸，C端截短21个氨基酸)的样品，该样品保留了大部分的抗肿瘤活性和酶活性。

以编码核酸序列的第63—84位核酸设计含有Nco I酶切位点的3’引物，以编码核酸序列的第406—423位核酸设计含有终止密码子和Xho I酶切位点的5’引物，以质粒pGEM-杨树菇泛素交联酶(pGEM-UBC)为模板，PCR扩增，得到两端含有Nco I和Xho I酶切位点的PCR产物，用Nco I和Xho I酶分别消化PCR产物和pET28b质粒，回收杨树菇泛素交联酶片段和目的质粒，根据回收的量进行连接反应，构建原核表达载体pET28b—截短杨树菇泛素交联酶(Pet28b-ΔUBC)，该表达载体的编码序列为原编码序列的63—423位核甘酸序列，表达产物ΔUBC为原蛋白序列的21—141位氨基酸序列。ΔUBC的氨基酸序列和编码核苷酸序列为UBC的氨基酸序列和编码核苷酸序列的79.6％。

对ΔUBC和UBC酶活性和抑制HeLa细胞生长活性测定比较如图1所示，ΔUBC保留了UBC82.3％的酶活性，保留了UBC85.6％的抑制HeLa细胞生长的活性。因此，本实施例说明UBC的氨基酸序列同源性为80％的ΔUBC氨基酸序列保留了大部分的抗肿瘤活性。

图1ΔUBC和UBC酶活性和抑制HeLa细胞生长活性比较

实施例4

杨树菇泛素交联酶抗体的制备：该实施例可以获得杨树菇泛素交联酶的多克隆抗体，用于检测杨树菇泛素交联酶。

将天然蛋白和实施例2中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用，也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100ug/0.2mL乳化过的蛋白，对小鼠进行皮下注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化同样抗原，对小鼠以50-100ug/0.2mL的剂量进行皮下注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行3次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外结合杨树菇泛素交联酶基因翻译产物的能力加以评估(Western方法)。

实施例5

杨树菇泛素交联酶对肿瘤细胞和荷瘤小鼠肿瘤组织的抑制作用：本实施例中杨树菇泛素交联酶抑制检测的7种肿瘤细胞株，证实杨树菇泛素交联酶具有广普抗肿瘤作用；抑制荷S—180肉瘤小鼠的肿瘤组织生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，证实杨树菇泛素交联酶对荷瘤动物的肿瘤组织有抑制生长作用。

1.杨树菇泛素交联酶在体外对肿瘤细胞株的抑制作用

本实施例检测了杨树菇泛素交联酶对7种肿瘤细胞株(SW480，HeLa，SGC-7901，MGC80-3，BGC-823，HL-60and S-180)生长的抑制活性。所有的肿瘤细胞株在RPMI1640培养基(其中包含10％的胎牛血清，100mg/mL链霉素和100U/mL的青霉素)中培养。将不同浓度的杨树菇泛素交联酶(以培养基配制成5，10，50，100ug/mL)加入肿瘤细胞中，温育24小时后，用MTT方法检测杨树菇泛素交联酶对肿瘤细胞生长的抑制作用。检测结果如表2中所示。杨树菇泛素交联酶对所检测的肿瘤细胞株有很好的抑制作用，对HeLa，Colo320和SGC-7901细胞的抑制效果优于化疗药物阿霉素，在PC-3，MCF-7，HepG2等多种肿瘤细胞中表现出与化疗药物阿霉素在相同的浓度下具有相似的抑制率。

表2杨树菇泛素交联酶(UBC)在体外对肿瘤细胞的抑制作用

2.杨树菇泛素交联酶对荷瘤小鼠肿瘤组织生长的抑制作用

在本实施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窝皮下接种0.1mL小鼠骨肉瘤细胞S-180(1.18×10⁸cells/mL)，接种3天后，瘤内注射杨树菇泛素交联酶(以生理盐水溶解1.67mg/mL，注射0.06mL)0.1mg/只小鼠，对照注射生理盐水。此后，隔天注射。在接种肿瘤20天后处死小鼠。切下肿瘤称重，计算抑制率。抑制率(％)＝[(C-T)/C]×100％(C是对照组平均肿瘤重量，T为治疗组肿瘤的平均重量)。结果如表3所示。杨树菇泛素交联酶对处理的小鼠的肿瘤的抑制率可达36.36％，并且延长了荷瘤小鼠的寿命。

表3杨树菇泛素交联酶对荷S—180瘤小鼠肿瘤的抑制作用

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明分上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

<130>一种真菌泛素交联酶活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>456

<212>DNA

<213>杨树菇

<400>1

<210>2

<211>152

<212>PRT

<213>杨树菇

<400>2

Claims (9)

1.一种分离的编码真菌泛素交联酶的核酸，其序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

2.一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种真菌泛素交联酶活性的多肽制备方法，它包括下列步骤：

A、提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

B.酶切步骤A得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体；

C、将步骤B中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树菇泛素交联酶的重组细胞；

D、将步骤C中得到的重组细胞在37℃培养过夜获得饱和培养物，将50μL饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100μg/mL的培养基中，于37℃培养2小时，取1mL培养物转移至微量离心管中，加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为1mmol/L，对培养物进行诱导，诱导10小时；

E、利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤D中在重组细胞中表达的多肽。

4.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防宫颈癌药物中的应用。

5.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防胃癌药物中的应用。

6.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防乳腺癌药物中的应用。

7.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防直肠癌药物中的应用。

8.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防前列腺癌药物中的应用。

9.权利要求2所述的一种分离的多肽在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。

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