CN108619494B

CN108619494B - 促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用

Info

Publication number: CN108619494B
Application number: CN201810454228.6A
Authority: CN
Inventors: 柳溪林; 崔树森; 胡盼; 柳增善; 卢士英; 任洪林; 张嵩; 李萌; 常江
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2018-05-13
Filing date: 2018-05-13
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2038-05-13
Also published as: CN108619494A

Abstract

本发明涉及一种促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用，属于医药领域。促黑激素重组毒素的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，促黑激素重组毒素能够以黑素皮质激素受体‑1为靶标，特异性捕获和杀死高表达该受体的结肠癌细胞，所述结肠癌细胞包括HT29结肠癌细胞系、HCT‑116结肠癌细胞系。经细胞水平和动物水平的毒性和药效测试，证明促黑激素重组毒素对人结直肠癌细胞系HT‑29、HCT‑116等MC1R高表达的肿瘤细胞有特异性致凋亡作用，这两种肿瘤存在MC1R高表达，具有新的肿瘤靶向作用，是一种很有潜力的结直肠癌治疗或辅助治疗药物，具有良好的应用前景。

Description

促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，尤其是指促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用。

背景技术

结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，世界范围内新增结肠癌患者102万，并有约53万人死于结肠癌。在我国，结直肠癌发病率在恶性肿瘤中位列第5，并且以4.2％的增速持续增长，远远高于2％的国际水平。

目前，结肠癌的治疗首选是手术治疗，通过外科手术将肿瘤组织切除，但由于可能存在微转移灶，肿瘤组织切除后仍有很高的复发和转移几率，所以大多数结肠癌患者还需要进行化疗和放疗，以减少复发。

黑色素细胞刺激素(melanocyte-stimulating hormone，MSH),亦称〔垂体〕中叶激素，促和激素。有α-促黑激素(α-MSH)和β-促黑激素(β-MSH)两种，α-MSH是由13个氨基酸残基组成的多肽。产生MSH的细胞分散在垂体前叶，人类垂体中间叶退化只留痕迹。人垂体中黑素细胞刺激素的绝大部分为β，α-MSH不到3％，半衰期为30分钟。MSH主要作用于黑色素细胞。黑素皮质激素受体-1(MC1R)在人类正常黑色素细胞和黑色素瘤细胞中均有表达，在肤色和发色形成中起主要作用。此外，MC1R在培养的正常角质形成细胞、毛细血管内皮细胞中也有表达。MC1R被认为是决定人类毛发和皮肤颜色的主要基因之一。黑色素瘤病人的MC1R高含量表达且存在某些变异，同时发现Asp84Glu的变异与人黑色素瘤有关，约66％恶性黑色素瘤中BRAF存在错义突变。进一步研究表明同时存在MC1R和BRAF两种基因突变与黑色素瘤形成的相关性更高。在一项针对意大利人和美国人总体做的研究表明MC1R变异会使BRAF基因变异的黑色素瘤发生恶变的可能性增加。

重组免疫毒素(RIT)是一种新型的分子靶向药物，由靶向因子和毒素组合而成，能够对特定类型的肿瘤起治疗作用的基因工程表达蛋白。其中，靶向因子可以是抗体衍生物，一般是抗肿瘤细胞或被感染细胞上特异抗原的抗体Fv片段，也可以是具有肿瘤靶向功能的某种天然蛋白。毒素部分包括植物毒素(如蓖麻毒素)和细菌毒素(如绿脓杆菌外毒素)以及动物毒素(如蜂毒)。现阶段的免疫毒素是将靶向分子和毒素分子两者利用基因工程技术连接在一起，而毒素部分的原受体结构域被靶向分子替代，两者由一小段氨基酸序列连接，毒素的毒性部分会被去除，通过点突变进一步加强毒性和降低免疫原性。合成的重组免疫毒素会由靶向因子子携带毒素部分到达特定的肿瘤细胞，然后毒素会进入并杀死该细胞。

发明内容

本发明提供一种促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用。

本发明采取的技术方案是：促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用。

所述促黑激素重组毒素的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

所述促黑激素重组毒素的氨基酸序如SEQ ID No.2所述。

促黑激素重组毒素能够以黑素皮质激素受体-1(MC1R)为靶标，特异性捕获和杀死高表达该受体的结肠癌细胞。

所述结肠癌细胞包括HT29结肠癌细胞系、HCT-116结肠癌细胞系。

本发明利用部分胃肠道肿瘤细胞高表达黑素皮质激素受体-1(MC1R)的特点，正向翻译的13肽α-黑色素细胞刺激素的导向单元可与细胞表面的黑素皮质激素受体-1特异结合，在重组毒素内化肽段导引下内化进入细胞后，在高尔基体、内质网内经由一系列的蛋白酶加工，具有ADP-核糖基化酶活性的毒素片段进入胞质，失去真核生物的延长因子-2、抑制蛋白合成，最终杀死结合α-MSH-PE38_KDEL后的细胞。制成的促黑激素重组毒素能够特异性靶向杀伤该类型的肿瘤细胞，达到治愈肿瘤的目的。

经细胞水平和动物水平的毒性和药效测试，证明促黑激素重组毒素对人结直肠癌细胞系HT-29、HCT-116等MC1R高表达的肿瘤细胞有特异性致凋亡作用，这两种肿瘤存在MC1R高表达，具有新的肿瘤靶向作用，是一种很有潜力的结直肠癌治疗或辅助治疗药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是MC1R在细胞中的表达水平图；

图2是不同细胞中MC1R mRNA的相对表达量图；

图3是400ng/mLa-MSH-PE38_KDEL36h后对HT29、EAC-109、HCT-116细胞的48h作用效果观察(10×10)图。

具体实施方式

促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用。

所述促黑激素重组毒素的氨基酸序如SEQ ID No.2所述。

下边通过细胞MC1R含量分析与细胞杀伤活性检测来进一步说明本发明。

利用原核表达系统，筛选得到高效表达α-MSH-PE38_KDEL的重组菌株，扩大培养体积至1L，SOB培养基，37℃摇培2h后加入0.5mM诱导剂IPTG，180rpm/min 16℃摇培6h，所表达蛋白65％以上为可溶状态，获得的可溶性蛋白经超声破碎法获得后，通过三步层析方法得到较高纯度与活性的促黑激素重组毒素。

本实验在促黑激素重组毒素a-MSH-PE38_KDEL针对黑色素瘤细胞B16-F10特异杀伤及动物实验的基础上，以黑素皮质激素受体-1MC1R作为检测靶标通过qRT-PCR和Western-blotting方法分别对12种细胞(见图1和图2)中MC1R进行检测，分析MC1R的表达量与a-MSH-PE38_KDEL有效性之间的关系，MC1R广泛存在于很多肿瘤细胞的表面，尤其是恶性黑色素瘤的表面过量表达，通过实验发现结肠癌细胞HT29和HCT116具有高表达MC1R，a-MSH-PE38_KDEL对其杀伤作用甚至强于黑色素瘤细胞，是一种非常有希望的新靶向。

1.细胞MC1R含量分析

Trizol法提取各实验细胞的RNA；按照试剂盒[FastQuant RT Kit(With gDNase)及SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)]说明书合成cDNA。

以MC1R受体基因设计引物，以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为对照设计引物，qRT-PCR和Western-blotting方法对细胞MC1R表达量分析检测，通过realtimequantitative PCR方法测定MC1R的mRNA相对表达水平，结果见图2。

HT29细胞MC1R mRNA的表达量最高，依次是EAC-109、B16-F10、HCT-116、PIG1、SW480、PC-3、A549、HuH7、SGC7901、MDA-MB-231、GBC-SD细胞，与MC1R蛋白的相对表达水平结果相符。而且，HT29、eca-109、B16-F10及HCT-116细胞中MC1R mRNA的上调表达量与PIG1细胞比，具有统计学差异(*p﹤0.05,**p﹤0.01,***p﹤0.001)。

实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)：

检测和比较不同细胞中MC1R mRNA的相对表达水平，进行Real-timequantitativePCR，具体步骤如下：

(1)配制cDNA的量：在无RNA酶的1.5mL离心管中加入培养细胞经处理后的1μLcDNA模板和无核酸酶水7.8μL。

(2)配制MIX：在无RNA酶的1.5mL离心管中加入10μLSYBR Premix EX Tap(ZX)、0.4μLPCR Forwand Primer(10μM)、PCR Rererse Primer10μM(引物见表1)和ROXreferenceDye II(50×)10μM。

(3)加样：取实时荧光定量PCR反应96孔板，根据预设cDNA和MIX的量分别加入，总体积为20μL。然后用膜将反应板封闭，3000rpm离心6min。

(4)上机：打开7500型Real-time quantitative PCR仪，按预实验摸索的条件设置目的基因反应条件：Stage 1：预变性95℃35秒；Stage 2：热循环38Cycle，95℃5秒、60℃38秒；Stage 3：溶解曲线95℃10秒、60℃50秒、95℃10秒。

表1用于RT-PCR的MC1R和对照GAPDH的引物

(5)数据分析：样品中各RNA和内参分别进行Realtime PCR反应，每个样品重复3次，使用2-ΔΔCT法计算RNA在细胞中的表达量。依据计算公式得出相对于对照样品的mRNA量。

待测样品(test，T)ΔCtT＝CtT(目的片段)-CtT(对照片段)

对照样品(control，C)ΔCtC＝CtC(目的片段)-CtC(对照片段)

ΔΔCT＝CtT-CtC

相对定量＝2-ΔΔCt

为了从蛋白水平分析MC1R蛋白在不同细胞中的表达情况，我们进行了Western-blotting检测。以细胞MC1R为样本，进行常规Western Blotting分析，经相应处理后再经SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后经转膜将分离蛋白转移至PVDF膜上，以MC1R鼠单抗为一抗、羊抗鼠二抗与之反应后，再经ECL发光检测MC1R表达情况，结果见图1。

在α-MSH-PE38_KDEL对黑色素瘤靶向细胞分析实验中，发现结肠癌细胞系HCT-116、HT29具有高含量MC1R受体基因和蛋白表达，实验结果如下。

Western-blotting分析以GAPDH为内参进行比较，所选取不同细胞中MC1R蛋白的相对表达水平，结果如图1。发现HT29细胞的MC1R蛋白表达量最高，依次是EAC-109、B16-F10、HCT-116、PIG1、SW480、PC-3、A549、HuH7、SGC7901、MDA-MB-231、GBC-SD。由结果可看出，B16-F10的MC1R表达量很高，而HT29和eca-109细胞与B16-F10相比表达量要高一些，HCT-116与B16-F10的表达量也相近。

2.细胞杀伤活性检测

将生长状态良好的HT29细胞、HCT-116细胞、EAC-109细胞为阳性细胞及LO2(正常干细胞)为阴性对照，经胰酶消化后，细胞计数，约10³个/孔铺96孔细胞板，4h后加入终浓度为200ng/ml的纯化a-MSH-PE3_8KDEL重组蛋白，37℃CO₂培养箱中继续培养，48h后定时观察细胞形态变化及死亡情况。

结果a-MSH-PE38_KDEL蛋白对HT29细胞、HCT-116细胞、EAC-109细胞呈现比黑色素瘤细胞B16-F10更强的杀伤能力，对黑色素瘤细胞系A375、A875呈现较强杀伤能力，对人正常肝细胞LO2为阴性的细胞等其他正常细胞、肿瘤细胞没有明显的杀伤力。作为实验的其他细胞包括人胃癌细胞系MKN-45、MKN-1、SWWC、MGC-803、SGC-7901、BGC-823，人胰腺癌细胞系PANC-1，人乳腺癌细胞系ZR-75-1、MCF-7、MDA-MB-231，人肺癌细胞系A549，人黑色素瘤细胞系A375、A875，鼠骨髓瘤细胞系SP2/0，人白血病细胞系K562、U597、Jurkat，人肝癌细胞系HepG2，人结肠癌细胞系SW480、Colo320，食管癌细胞EAC-109、胚肾细胞293-T，正常人胃黏膜上皮细胞系GES-1。

以CCK-8试剂盒分别检测重组毒素对HT29、EAC-109、HCT-116细胞的杀伤作用，同时测定IC₅₀值。结果见表2和图3。

表2 a-MSH-PE38_KDEL对3种细胞的杀伤活性(IC₅₀值)

序列表

<110> 吉林大学

<120> 促黑激素重组毒素在制备治疗结肠癌药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgtcttact ctatggaaca cttccgttgg ggtaaaccaa tttctcatat ggccgaagag 60

ggcggcagcc tggccgcgct gaccgcgcac caggcttgcc acctgccgct ggagactttc 120

acccgtcatc gccagccgcg cggctgggaa caactggagc agtgcggcta tccggtgcag 180

cggctggtcg ccctctacct ggcggcgcgg ctgtcgtgca accaggtcga ccaggtgatc 240

cgcaacgccc tggccagccc tggcagcggc ggcgacctgg gcgaagcgat ccgcgagcag 300

ccggagcagg cccgtctggc cctgaccctg gccgccgccg agagcgagcg cttcgtccgg 360

cagggcaccg gcaacgacga ggccggcgcg gccaacggcc cggcggacag cggcgacgcc 420

ctgctggagc gcaactatcc cactggcgcg gagttcctcg gcgacggcgg cgacgtcagc 480

ttcagcaccc gcggcacgca gaactggacg gtggagcggc tgctccaggc gcaccgccaa 540

ctggaggagc gcggctatgt gttcgtcggc taccacagca ccttcctcga agcggcgcaa 600

agcatcgtct tcggcggggt gcgcgcgcgc agccaggacc tcgacgcgat ctggcgcggt 660

ttctatatcg ccggcgatcc ggcgctggcc tacggctacg cccaggacca ggaacccgac 720

gcacgcggcc ggatccgcaa cggtgccctg ctgcgggtct atgtgccgcg ctcgagcctg 780

ccgggcttct accgcaccag cctgaccctg gccgcgccgg aggcggcggg cgaggtcgaa 840

cggctgatcg gccatccgct gccgctgcgc ctggacgcca tcaccggccc cgaggaggaa 900

ggcgggcgcc tggagaccat tctcggctgg ccgctggccg agcgcaccgt ggtggttccc 960

tcggcgatcc ccaccgaccc gcgcaacgtc ggcggcgacc tcgacccgtc cagcatcccc 1020

gacaaggaac aggcgatcag cgccctgccg gactacgcca gccagcccgg caaaccgccg 1080

aaggacgagc tgtaa 1095

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Ile Ser His

1 5 10 15

Met Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala

20 25 30

Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly

35 40 45

Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala

50 55 60

Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Cys Asn Gln Val Asp Gln Val Ile

65 70 75 80

Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala

85 90 95

Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala

100 105 110

Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala

115 120 125

Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg

130 135 140

Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser

145 150 155 160

Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln

165 170 175

Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His

180 185 190

Ser Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg

195 200 205

Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala

210 215 220

Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp

225 230 235 240

Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro

245 250 255

Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala

260 265 270

Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro

275 280 285

Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu

290 295 300

Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Val Pro

305 310 315 320

Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro

325 330 335

Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr

340 345 350

Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

355 360

Claims

1.一种促黑激素重组毒素α-MSH-PE38_KDEL通过靶向黑素皮质激素受体-1(MC1R)在制备治疗结肠癌药物中的应用；

所述促黑激素重组毒素α-MSH-PE38_KDEL的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1；

所述结肠癌细胞包括HT29结肠癌细胞系、HCT-116结肠癌细胞系；

促黑激素重组毒素α-MSH-PE3_8KDEL能够以黑素皮质激素受体-1为靶标，特异性捕获和杀死高表达该受体的结肠癌细胞。

2.如权利要求1所述的一种促黑激素重组毒素α-MSH-PE38_KDEL通过靶向黑素皮质激素受体-1(MC1R)在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：所述促黑激素重组毒素α-MSH-PE38_KDEL的氨基酸序如SEQIDNo.2所述。