DE10044027A1 - Rekombinant erzeugtes Mistellektin (ML III) - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung und Verwendung eines bestimmten rekombinanten Mistellektins als therapeutisch wirksame Substanz. Aus Extrakten der in Europa verbreiteten Mistelpflanzen (Viscum album spec.) werden Mistel-Präparate hergestellt, die u. a. in der Krebstherapie eingesetzt werden. Als eine der Hauptwirkkomponenten dieser Extrakte wurde eine Gruppe von Proteinen identifiziert, deren Vertreter in der Literatur als Mistellektin I, II und III (ML 1, ML 2 und ML 3) bezeichnet werden. Jedes dieser Proteine setzt sich aus zwei Untereinheiten mit sehr verschiedenen biologischen Aktivitäten zusammen.

Die jeweils kleineren Untereinheiten, die A-Ketten, stellen Glykosidasen dar, die spezifisch bestimmte rRNA Moleküle modifizieren und dadurch die Aktivität von eukaryotischen Ribosomen sehr effektiv hemmen. Aufgrund dieser Aktivität werden die angesprochenen Proteine zu den sog. RIP II Proteinen (ribosome inactivating proteins, type 11) gezählt und sind in geeigneten Zellkultursystemen sehr potente Toxine.

Die B-Ketten dieser Proteine stellen hingegen Lektine (d. h. zuckerbindende Proteine) dar. Die Zuckerspezifität dieser Lektinkomponenten ist unter den drei Mistellektinen nicht einheitlich. Während die B-Kette des ML I sehr hohe Affinitäten zu Galaktose zeigt, ist die Zuckerspezifität der B-Kette des ML III durch eine ausgesprochen hohe N-Acetyl- Galaktosamin-Affinität gekennzeichnet. Die B-Kette des ML II liegt in ihrem Bindungsverhalten zwischen den beiden beschriebenen Aktivitäten, d. h. sie bindet recht stark sowohl an Galaktose wie auch an N-Acetyl-Galaktosamin.

Die Holoproteine vereinen die Aktivitäten ihrer A- und B-Ketten, d. h. sie sind sowohl Lektine (wegen des Vorhandenseins der B-Kette) als auch potentielle Toxine (wegen der Ribosomen inaktivierenden Eigenschaften der A-Kette). Ihre Wirksamkeit in oben erwähnten Präparaten geht offensichtlich auf beide Eigenschaften zurück. Ein einfaches Model, das jedoch keineswegs alle beschriebenen Effekte der Proteine gegenüber humanen Zellen erklären kann, beschreibt die Wirkungsweise dieser Proteine wie folgt: Die Moleküle binden über die Aktion ihrer B-Ketten an die Oberflächen von Zellen, die die geeigneten Zuckerkomponenten tragen. Diese Bindung führt zur Aufnahme der Proteine in die Zellen und ermöglicht der A-Kette (des Toxins) die Ribosomen der Zelle zu blockieren, was zum Absterben der betroffenen Zelle führt.

Dieses Model entspricht der Wirkungsweise eines anderen pflanzlichen Vertreters dieser RIP II-Proteingruppe, des Ricins aus der Rhizinus-Bohne. Ricin stellt eines der giftigsten - wenn nicht das giftigste - pflanzliche Protein dar. Obwohl die Mistellektine strukturell und funktionell dem Ricin sehr ähnlich sind, ist ihre Toxizität gegenüber Organismen dramatisch reduziert. Der Grund ist bis heute nicht verstanden. Diese herabgesetzte Toxizität ermöglicht es jedoch, Mistellektine gefahrlos in der humanen Therapie einzusetzen, wogegen der Einsatz des Ricins sehr problematisch ist.

Neben diesen zytotoxischen-Aktivitäten sind in der Literatur eine Reihe von anderen Effekten der Mistellektine auf humane Zellen beschrieben, die mit oben erwähntem Modell nicht zu erklären sind. So wird ein gegenteiliger Effekt, die Stimulation zur Teilung bestimmter immunkompetenter Zellen (immunstimulierender Effekt) ebenso bekannt, wie z. B. die Freisetzung verschiedener Wachstumsfaktoren durch unterschiedliche Zelltypen.

Die entsprechenden Experimente wurden überwiegend mit dem ML I durchgeführt. Dieses Protein ist der Vertreter der Mistellektine, der in Mistelpflanzen, die auf Laubbäumen wachsen, bei weitem überwiegt. Die anderen zwei Vertreter (ML II und ML III) treten dagegen in den Hintergrund und sind sehr viel schwieriger in hinreichenden Mengen zu isolieren, was zum fast ausschließlichem Einsatz des ML I in oben genannten Studien geführt hat.

Obwohl sich die drei Vertreter der RIP II-Mistellektine ähnlich sind, besitzen sie z. B. unterschiedliche molekulare Massen und verschiedene Zuckerbindungseigenschaften. Die "verwandtschaftlichen" Beziehungen dieser drei Proteine zueinander war bis vor kurzem nicht klar. Die bis dahin vorliegenden biochemischen und strukturellen Daten ließen zwei prinzipielle Möglichkeiten zu:

• - Jedes Protein wird von einem eigenen Gen kodiert und abgelesen, die zu beobachtenden Unterschiede zwischen den Proteinen gehen letztendlich auf Unterschiede in diesen Genen zurück.
• - Die unterschiedlichen Proteine entstehen durch unterschiedliche Modifizierungsschritte aus einem gemeinsamen Proteinvorläufer (oder auch Nukleinsäurevorläufers). Dieser wird durch ein Gen kodiert.

Im ersten Fall liegen mindestens so viele für Mistellektine kodierende Gene in Genom der Mistelpflanze vor, wie Protein-Typen zu beobachten sind, im zweiten Fall existiert nur ein Gen.

In dem Patent Nr. EP 0 751 221 A1 über ein rekombinantes Mistellektin wird ausdrücklich von diesem zweiten Fall ausgegangen: Es wird angenommen, daß es nur ein Gen gibt und die Nutzung des von diesem Gen kodierten Proteins wird unter Schutz gestellt. Die Antragsteller umgingen damit das Problem, dass sie das Produkt (das kodierte Protein; ML I, ML II oder ML III) nicht eindeutig benennen konnten.

Das hier beantragte Patent betrifft das N-Acetyl-Galaktosamin erkennende Mistellektin ML III. Es wird von einem eigenen Gen kodiert und das exprimierte Protein unterscheidet sich u. a. in seiner Aminosäurezusammensetzung, der Anzahl der Aminosäuren, seiner Masse, der Art der posttranslationalen Veränderungen und seiner biologischen Aktivität von dem in oben genanntem Patent unter Schutz gestellten Protein (aus heutiger Kenntnis ML I) und weicht damit in wesentlichen biophysikalischen Eigenschaften erheblich von diesem Protein ab. Zudem wurde das Gen aus einer anderen Mistel-Unterart/Varietät isoliert (Kiefern-Mistel), als es in dem Patent Nr. EP 0 751 221 geschehen ist (Pappel-Mistel). Die Verwendung dieses anderen Pflanzenmaterials zur Isolierung der hier beschriebenen Nukleinsäure und des von ihr codierten Proteins muß als wesentliche Voraussetzung für die erfolgreiche Isolierung angesehen werden. In Kiefern- Misteln dominiert das ML III im Gegensatz zu oben beschriebenen Verteilungsverhältnissen bei weitem über die anderen RIP II-Proteine. In Abhängigkeit von anderen - nicht verstandenen - Standortfaktoren der Wirtspflanzen ist das ML III häufig der einzige Vertreter dieser Proteingruppe in der Kiefern-Mistel. Derartiges Material wurde für die Isolierung der hier beschriebenen Nukleinsäure benutzt.

Die Abb. 1 zeigt die Gesamtsequenz des Präpro-ML III Leserahmens. Die aus diesem Leserahmen im Zuge der Biogenese des Präproproteins entstehenden A- bzw. B- Ketten sind in dem Dreibuchstaben-Code für Aminosäuren dargestellt, das Targetingpeptid für den Eintransport in das Lumen des Endoplasmatischen Reticulums sowie das Linkerpeptid, welches die A- und B-Kette während der frühen Biogeneseschritte verbindet und am Ende der Reifung des Proteins proteolytisch entfernt wird, sind dagegen im Einbuchstaben-Code wiedergegeben.

Abb. 1

Sequenz des ML III (mit Prepeptid und Linkerpeptid)

Beispiel rekombinante Expression des ML III in Escherichia coli

Das galaktoseerkennende Mistellektin (ML III) kann unter geeigneten Bedingungen in homologen oder heterologen Expressionssystemen dargestellt werden. Die zu verwendenden Vektoren müssen die für den jeweiligen Wirt passenden Regulationssequenzen aufweisen. Als Beispiel sei hier die Expression in Escherichia coli unter Kontrolle eines Bakteriophagen-Promoters (T7 Gen 10 Promotor) dargestellt.

Von dem dargestellten Plasmid kann eine Untereinheit des Mistellektins rekombinant in E. coli erzeugt werden. Die Darstellung des Gesamt-Mistellektins (ML III) erfolgt nach der getrennten Expression der beiden Untereinheiten durch Vereinigung der beiden Ketten in vitro.

Zur Vermeidung der Ausbildung von nicht löslichen Proteinaggregaten wird das exprimierte Protein in diesem Beispiel als Fusionsprotein mit einer E. coli Leadersequenz des Enterotoxins II gebildet. Dieses Leaderpeptid wird von E. coli eigenen Leaderpeptidasen erkannt und nach der Passage des Fusionsproteins in den Periplasmatischen Raum der Zellen entfernt. Die entscheidende Sequenz um den Promotor ist dargestellt. Bis auf die für das zu exprimierende Protein codierende Nukleinsäuresequenz können die beiden Plasmide zur Expression der A- bzw. B-Kette gleich aufgebaut sein.

Claims (10)

1. Nukleinsäuremolekül, das

• a) ein Präproprotein codiert, das nach Reifung die biologische Funktion des Galaktose-erkennenden Mistellektindimers aufweist und die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz aufweist;
• b) ein Fragment des Präproproteins gemäß (a) codiert;
• c) sich durch Degeneration des genetischen Codes vom Nukleinsäuremolekül gemäß (a) oder (b) unterscheidet und ein Polypeptid mit der in (a) oder (b) angegebenen biologischen Funktion codiert.

2. Vektor, der mindestens ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

3. Wirt, der mindestens einen Vector nach Anspruch 2 enthält und pro- oder eukaryotischer Natur ist.

4. Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 kodiert wird oder von einem Vector nach Anspruch 2 in einem Wirt nach Anspruch 3 produziert wird.

5. Polypeptid nach Anspruch 4 das ein Fusionsprotein ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5, das mindestens eine chemische oder enzymatische Modifikation enthält.

7. Polypeptid mach Anspruch 4, 5 oder 6, das durch chemische oder enzymatische Kopplung an beliebige andere Moleküle gebunden ist.

8. Oligomere Polypeptide in denen mindestens ein Monomer ein Polypeptid nach Anspruch 4, 5, 6 oder 7 ist.

9. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach den Ansprüchen 4, 5, 6, 7 oder 8, bei denen man einen Wirt nach Anspruch 3 züchtet und ein Polypeptid nach den Ansprüchen 4, 5, 6, 7 oder 8 isoliert.

10. Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die

• a) ein Nukeinsäuremolekül nach Anspruch 1,
• b) einen Primer und/oder ein Primerpaar der/das spezifisch an das Nukleinsäuremolekül nach (a) oder an seinen Komplementärstrang bindet, und/oder
• c) ein Polypeptid nach den Ansprüchen 4, 5, 6, 7 oder 8 enthalten.