EA023005B1

EA023005B1 - Слитый белок против злокачественных новообразований

Info

Publication number: EA023005B1
Application number: EA201291362A
Authority: EA
Inventors: Ежи Щепан Печиколан; Себастьян Доминик Павлак; Бартломей Мацей Жерек; Кшиштоф Казимеж Лемке
Original assignee: Адамед Сп. З О.О.
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2016-04-29
Also published as: PL2585480T3; SG186439A1; ES2531288T3; JP2013532972A; DK2585480T3; RS53851B1; EA201291362A1; CA2800841C; US9102759B2; EP2585480B1; DK2585480T5; EP2585480A1; IL223640A; HRP20150241T1; ZA201300677B; CN102958940B; AU2011268876B2; KR101861872B1; MX2012015246A; US20130164254A1

Abstract

Слитый белок, в особенности рекомбинантный, содержащий домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка hTRAIL, начинающийся с аминокислоты в положении ниже чем hTRAIL95, или последовательности, имеющей по меньшей мере 70% гомологичность этому; и домен (b), который представляет собой последовательность проапоптотического эффекторного пептида, где данная последовательность домена (b) присоединена к С-концу или N-концу домена (а). Данный слитый белок обладает противоопухолевой активностью. Нуклеотидная последовательность, кодирующая данный слитый белок, вектор экспрессии и клетка-хозяин для получения данного слитого белка, и применение данного слитого белка для лечения онкологических заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к области терапевтических слитых белков, в частности рекомбинантных слитых белков. Конкретнее, настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагмент последовательности растворимого белка ТКА1Ь человека в сочетании с последовательностью короткого проапоптотического пептида, к фармацевтическим композициям, содержащим их, к их применению в терапии, в частности, в качестве средств против злокачественных новообразований и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим слитые белки, к векторам экспрессии, содержащим полинуклеотидные последовательности, и к клеткам-хозяевам, содержащим эти векторы экспрессии.

Апоптоз (программируемая клеточная гибель) представляет собой процесс, который играет важную роль в профилактике злокачественных новообразований и в лечении злокачественных новообразований в результате применения средств, которые индуцируют апоптоз атипичных опухолевых клеток.

Инициация апоптоза может происходить вне клетки (внешний или сигнальный путь рецептора смерти) и внутри клетки (внутренний или митохондриальный путь).

Для активации внеклеточных путей апоптоза в опухолевых клетках человека требуется, чтобы лиганд связался с рецепторами клеточной гибели для активации рецепторов. После связывания лиганда активированные рецепторы индуцируют сигналы апоптоза.

Запуск внутреннего апоптоза внутри клетки по митохондриальному пути может быть инициирован на различных уровнях апоптотического каскада для того, чтобы в результате вызвать индукцию или восстановление функций проапоптогенных белков (цитохром С, διηαεΩίαόΙο. А1Р, р53, белки семейства Вс12, в том числе семейство домена ВН3), деградацию нуклеиновых кислот или активацию каспаз.

Белок ТКАТЬ, принадлежащий семейству цитокинов (относящийся к фактору некроза опухоли лиганд, индуцирующий апоптоз; Титоиг Иесго818 Рас(ог-Ке1а(еб Αρορΐοδίδ 1пбисшд Пдапб), также известный как Аро2Ь (Аро2-лиганд), представляет собой белок-активатор апоптоза в опухолевых клетках и в клетках, инфицированных вирусами. ТКА1Ь представляет собой естественный для организма лиганд. Белок ТКАТЬ, его аминокислотная последовательность, кодирующие ДНК последовательности и системы экспрессии белка были впервые описаны в ЕР 0835305 А1.

Белок ТКАТЬ оказывает свою активность против злокачественных новообразований, связывая проапоптотические поверхностные рецепторы 1 и 2 ТКА1Ь (ТКА1Ь-К1/К2) и затем активируя эти рецепторы. Эти рецепторы, также известные как ΌΚ4 и ΌΚ5 (рецептор смерти 4 и рецептор смерти 5), принадлежат семейству рецепторов ТИР и сверхэкспрессируются различными типами опухолевых клеток. Активация этих рецепторов может индуцировать внешний путь апоптоза, независимый от гена-супрессора р53, что посредством активированной каспазы-8 приводит к активации исполнительных каспаз и тем самым - к деградации нуклеиновых кислот. Каспаза-8, высвобожденная после активации ТКА1Ь, также может быть причиной высвобождения белка Βίά и, вследствие этого, непрямой активации митохондриального пути, белок Βίά, который перемещается в митохондрии, где стимулирует высвобождение цитохрома С, таким образом, косвенно усиливает апоптотический сигнал рецепторов смерти.

ТКАТЬ действует выборочно в опухолевых клетках, преимущественно не вызывая индукции апоптоза здоровых клеток, которые являются резистентными к этому белку. По этой причине, из-за своего огромного потенциала, ТВАРЬ был признан средством против злокачественных новообразований, действующим на широкий спектр различных типов опухолевых клеток, в том числе, гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей, и в то же время не затрагивающим нормальные клетки и вызывающим относительно небольшое количество побочных эффектов.

Белок ТКА1Ь представляет собой мембранный белок II типа длиной 281 аминокислот, и его внеклеточная область, содержащая аминокислотные остатки 114-281, после расщепления протеазами образует растворимую молекулу 8ТКА1Ь размером 20 кДа, которая тоже является биологически активной. Обе формы, ТКА1Ь и 8ТКА1Ь, способны индуцировать апоптоз в результате взаимодействия с рецепторами ТКА1Ь, присутствующими в клетках-мишенях. Сильная противоопухолевая активность и очень низкая системная токсичность растворимой части молекулы ТКА1Ь были продемонстрированы в результате использования тестовых клеточных линий. Также проведенные на людях клинические испытания рекомбинантного растворимого ТКА1Ь человека (тЕТКАТЬ), имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам 114-281 молекулы ЬТКАШ, известного под международным непатентованным названием Дуланермин (би1апетт1п), показали его хорошую переносимость и отсутствие дозолимитирующей токсичности.

Недавние исследования показали, что белок ТКАТЬ может иметь более короткую форму, чем аминокислоты 114-281, и что в такой форме он способен связываться с мембранными рецепторами семейства ΌΚ (рецепторы смерти, ΌΚ1, ΌΚ2, ЭсКЕ ЭсК2 и ΘΡΟ) и индуцировать апоптоз через эти рецепторы (Р. Рапд, А. \Уапд, 8.Р. Уапд, АпШитог асНуНу οί а поуе1 гесотЫпап! ти(ап( Еитап (итог песго818 Гас(огге1а(еб арор1о818-шбисшд Пдапб, Ас(а РНагтасо1оДса Зниса 2005 Иоу; 26 (11): 1373-1381).

Подтвержденные в настоящее время токсические эффекты рекомбинантного белка ТКА1Ь на клетки печени, по-видимому, связаны с наличием модификации, а именно полигистидиновых меток, немеченный ТКАТЬ не проявляет системную токсичность.

Тем не менее, в ходе дальнейших научных исследований и разработок оказалось, что многие опухолевые клетки также демонстрируют первичную или приобретенную устойчивость к ТКАТЬ (см., на- 1 023005 пример, \νϋ 2007/022214). Несмотря на то что механизм устойчивости к ТКА1Ь до конца неясен, считается, что она может проявляться на различных уровнях пути апоптоза, индуцированного ТКА1Ь, начиная от уровня рецепторов на клеточной поверхности до исполнительных каспаз в пределах сигнального пути. Эта устойчивость ограничивает применимость ТКА1Ь в качестве противоопухолевого средства.

Более того, в клинических испытаниях на пациентах фактическая эффективность монотерапии с помощью ТКАГЬ оказалась низкой. Для того чтобы преодолеть эту низкую эффективность и невосприимчивость опухолей к ТКАГЬ, были разработаны различные комбинированные методы терапии с радиои химиотерапевтическими средствами, что в результате привело к синергическому апоптотическому эффекту (νθ 2009/002947; А. А1та§ап апй А. Л^Нкспа/к Сукокте Сго^кй Раског Ке\ае\\ъ 14 (2003) 337-348; К.К. 8пуа51ауа. №ор1а5к. νοί. 3, Νο 6, 2001, 535-546, 8опа ТС. ек а1., 1. С1ш. Опсо1оду, νοί. 28, Νο 9 (2010), р. 1527-1533). Применение гйТКАГЬ в лечении злокачественных новообразований в сочетании с отобранными стандартными химиотерапевтическими средствами (паклитаксел, карбоплатин) и моноклональными анти-УЕСР антителами описано в νθ 2009/140469. Тем не менее, такое сочетание обязательно включает хорошо известные недостатки стандартной химиотерапии или радиотерапии.

Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности вазостатина, ингибитора ангиогенеза, и ТКАГЬ, соединенные с линкером участка расщепления металлопротеазы, был описан как проявляющий апоптоз-индуцирующее действие в опухолевых клетках (А.1. Сио ек а1. в СЫиеке 1оигпа1 оГ Вюсйетк1гу апй Мо1еси1аг Вю1оду 2008, νο1. 24(10), 925-930).

Сконструированный слитый белок, содержащий последовательности Тит5какш183-230 тумстатина, ингибитора ангиогенеза, и ТКАГШ14-281, был описан как демонстрирующий индукцию апоптоза в опухолевых клетках поджелудочной железы (Ν. Кеп ек а1. в Асайетю 1оигпа1 оГ 8есопй МШкагу Мейюа1 ϋηΐ\егм1\ 2008, то1. 28(5), 676-478).

В И8 2005/244370 и соответствующей νθ 2004/035794 описана конструкция ТКАГЬ95-281 в виде эффекторного домена, связанного пептидным линкером с внеклеточной областью другого представителя семейства лигандов ΊΝΡ СЭ40 в качестве связывающего домена клеточной поверхности. Заявлено, что активация этой конструкции происходит посредством связывания ее СЭ40 области.

Более того, проблемой, связанной с терапией ТКАТЬ, оказалась его низкая стабильность и быстрое выведение из организма после применения.

Несмотря на то что в настоящее время доступны многие клинические способы лечения злокачественных новообразований, они зачастую являются в недостаточной степени эффективными и имеют большое число хорошо известных недостатков, из которых наиболее опасными и ограничивающими лечение являются отсутствие селективности относительно опухолевых клеток, тяжелые побочные эффекты и невосприимчивость - первичная или приобретенная во время лечения. В настоящее время известно ограниченное количество средств против злокачественных новообразований, которые как эффективны, так и селективны в отношении опухолевых клеток. В связи с этим сохраняется огромная актуальная и неудовлетворенная потребность в новых средствах против злокачественных новообразований, которые позволят не только расширить спектр доступных средств, но и найти средства, которые являются более эффективными (цитотоксичными) и селективными. Также существует потребность в новых селективных средствах с повышенной стабильностью и улучшенной фармокинетикой.

Настоящее изобретение предлагает решение этой проблемы и относится к новым слитым белкам, которые содержат домен, полученный из ТКАТЬ, и домен короткого эффекторного пептида, не включающий фрагменты ТКАГЬ, обладающие внутренней (внутриклеточной) или внешней (внеклеточной) проапоптотической активностью, который усиливает или дополняет действие ТКА1Ь. Более того, выяснилось, что во многих случаях слитые белки по настоящему изобретению проявляют более высокую активность, чем растворимый ТКАТЬ и его варианты, в том числе фрагмент этой последовательности, и во многих случаях также преодолевают невосприимчивость к ТКА1Ь. Более того, добавление эффекторного пептида приводит в результате к пролонгированному времени полужизни и увеличенному удержанию белка в опухоли, и, наконец, к повышению его эффективности.

Описание чертежей

Настоящее изобретение ниже описано более подробно со ссылкой на фигуры чертежей.

На фиг. 1 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 1, 2, 3, 4 и 5.

На фиг. 2 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 6, 7, 8, 9 и 10.

На фиг. 3 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 11, 12, 13, 14 и 15.

На фиг. 4 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 16, 17, 18, 19 и 20.

На фиг. 5 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 21, 22, и 23, а также сравнительных слитых белков из примеров 24, 25 и 26.

На фиг. 6 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 27, 28, 29, 30 и 31.

- 2 023005

На фиг. 7 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 32, 33, 34, 35 и 36.

На фиг. 8 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 37, 38, 39, 40 и 41.

На фиг. 9 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 42, 43, 44, 45 и 46.

На фиг. 10 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 47, 48, 49, 50 и 51.

На фиг. 11 изображено схематическое строение слитых белков по настоящему изобретению в соответствии с примерами 52, 53, 54 и 55.

На фиг. 12 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей δΟΙΌ/ΝΘΌ, страдающих раком прямой кишки Со1о205, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с ЬТКА1Ь114-281.

На фиг. 13 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих раком прямой кишки Со1о205, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 29 день эксперимента, по сравнению с ЬТКЛ1Ь114-281.

На фиг. 14 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Ст1:§НО-Рткбс^8С1бНг^Ьг, страдающих раком легких человека Ν0-Η460, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с ЬТКЛ1Ь114-281.

На фиг. 15 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих раком легких человека Ν0-Η460, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 29 день эксперимента, по сравнению с ЬТКЛ1Ь114-281.

На фиг. 16 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Ст1:§НО-Рткбс^8С1бНг^Ьг, страдающих мелкоклеточным раком легких человека А549, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с ЬТКА1Ь114-281.

На фиг. 17 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих мелкоклеточным раком легких человека А549, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 34 день эксперимента, по сравнению с ЬТКА1Ь114-281.

На фиг. 18 изображены изменения объема опухоли во времени у мышей Ст1:§НО-Рткбс^8С1бНг^Ьг, страдающих карциномой поджелудочной железы человека, эпителиоподобная клеточная линия ΡΑΝ01, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, по сравнению с ЬТКА1Ь114-281.

На фиг. 19 представлены значения ингибирования роста опухоли у мышей, страдающих карциномой поджелудочной железы человека, эпителиоподобная клеточная линия РАИС-1, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению, на 43 день эксперимента, по сравнению с ЬТКА1Ь114281.

На фиг. 20 представлены спектральные характеристики слитых белков по примерам 1, 2, 14, 24, 51 и 42 и для тЬТКА1Ь14-281, выраженные в удельной эллиптичности.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка ЬТКА1Ь, где фрагмент начинается с аминокислоты в положении не ниже чем ЬТКА1Ь95, или последовательности, которая по меньшей мере гомологична на 70% ей, и домен (Ь), который представляет собой последовательность проапоптотического эффекторного пептида, который осуществляет свое проапоптотическое действие через внутренний путь апоптоза, где последовательность домена (Ь) присоединена к С-концу и/или Ν-концу домена (а).

Термин функциональный растворимый фрагмент последовательности растворимого ЬТКА1Ь следует понимать как обозначающий любой фрагмент растворимого ЬТКА1Ь, который способен индуцировать апоптотический сигнал.

Также специалист должен оценить, что существование 70% гомологии белка ТКА1Ь известно в данной области.

Под термином пептид согласно настоящему изобретению следует понимать молекулу, сформированную из множества аминокислот, связанных друг с другом посредством пептидной связи. Таким образом, термин пептид в соответствии с настоящим изобретением включает олигонуклеотиды, полипептиды и белки.

Следует понимать, что домен (Ь) эффекторного пептида в слитом белке по настоящему изобретению не является ни белком ЬТКА1Ь, ни частью белка ЬТКА1Ь.

В настоящем изобретении аминокислотные последовательности пептидов будут представлены в общеупотребительном виде, принятом в данной области, в направлении от Ν-конца (Ν-конец) пептида к его С-концу (С-конец). Таким образом, любая последовательность имеет свой Ν-конец слева, а С-конец справа.

Слитый белок по настоящему изобретению может содержать единственный домен (Ь) эффекторного пептида, присоединенный к С-концу или Ν-концу домена (а).

- 3 023005

Слитый белок по настоящему изобретению также может содержать два домена (Ь) эффекторного пептида, в этом случае один из доменов (Ь) присоединен к С-концу домена (а), а второй присоединен к Ы-концу домена (а).

В случае, когда слитый белок по настоящему изобретению содержит два домена (Ь) этого эффекторного пептида, то эти домены могут быть одинаковыми или разными. Предпочтительно в этом случае, чтобы домены (Ь) были разными.

В конкретном варианте осуществления домен (а) представляет собой фрагмент последовательности ЬТРАТО, начинающийся с аминокислоты в диапазоне от ЬТРА1Ь114 до ЬТРА1Ь121 включительно и заканчивающийся на аминокислоте ЬТКА1Ь281, или другие функциональные фрагменты последовательности ЬТРАТО, опубликованной в базе данных СеиВаик под входящим № Р50591.

В частности, домен (а) может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей, соответствующих ЬТРА1Ы14-281 (8ЕО ГО N0:27), ЬТРА1Ь119-281 (8ЕО ГО N0:28) и ЬТРА1Ь121-281 (8ЕО ГО N0:29), ЬТРА1Ь116-281 и МРА1Ы20-281.

В другом варианте осуществления домен (а) может представлять собой последовательность ЬТРА1Ь95-281.

Проапоптотический эффекторный пептид домена (Ь), который проявляет свою апоптотическую активность через внутренний апоптотический путь (внутриклеточно), может индуцировать апоптоз напрямую посредством активации компонентов сигнального каскада митохондриального пути апоптоза или через непосредственную индукцию митохондриального апоптоза в клетках.

В одном из вариантов осуществления слитого белка по настоящему изобретению этот эффекторный пептид представляет собой пептид, действующий через внутренний апоптотический путь, выбранный из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:30, 8ЕО ГО N0:31, 8ЕО ГО N0:32, 8ЕО ГО N0:33, 8ЕО ГО N0:34, 8ЕО ГО N0:35, 8ЕО ГО N0:36, 8ЕО ГО N0:37, 8ЕО ГО N0:38, 8ЕО ГО N0:39, 8ЕО ГО N0:40, 8ЕО ГО N0:41, 8ЕО ГО N0:42, 8ЕО ГО N0:43, 8ЕО ГО N0:44, 8ЕО ГО N0:45, 8ЕО ГО N0:46 и 8ЕО ГО N0:47 или 8ЕО ГО N0:151, 8ЕО ГО N0:152, 8ЕО ГО N0:153, 8ЕО ГО N0:154, 8ЕО ГО N0:155, 8ЕО ГО N0:156, 8ЕО ГО N0:157, 8ЕО ГО N0:158, 8ЕО ГО N0:159, 8ЕО ГО N0:160, 8ЕО ГО N0:161, 8ЕО ГО N0:162, 8ЕО ГО N0:163, 8ЕО ГО N0:164, 8ЕО ГО N0:165 и 8ЕО ГО N0:166.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:30 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из домена ВН3 белка Вах, который ингибирует антиапоптотические факторы, и, в частности, 16-аминокислотный пептид, представленный последовательностью

ККЬ8ЕСЬКР1 СЭЕЕЭ8 (8ЕО ГО N0:30).

Считается, что пептиды, основанные на последовательностях доменов ВН2 белка Вах, способны эффективно связывать антиапоптотические белки Вс1-2 и Вс1-ХЬ. Антиапоптотическая активность белков Вс1-2 и Вс1-ХЬ основана на их взаимодействии с доменами ВН3, присутствующими в факторах, ответственных за инициацию апоптоза (Вах, Вак, Ваб). Связывание домена ВН3 в результате приводит к предотвращению взаимодействия белков Вс1-2 и Ве1-ХЬ с их природными лигандами и ингибированию их активности, и тем самым вносит вклад в инициацию активации апоптоза.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:31 из вышеприведенной группы представляет собой 15-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН3 белка ВЦ, представленный последовательностью

РМАР1ΙΕΆΟΥ СИ8МИ (8ЕО ΙΌ N0:31).

Белок ВЦ принадлежит к семейству Вс1-2 и отвечает, в числе прочего, за активацию проапоптотического фактора Вах. Полагают, что этот 16-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН3 белка ВЦ, встроенный в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптоз.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:32 из вышеприведенной группы представляет собой пептидный гомолог рибонуклеазы А (КИаке А), представленный последовательностью:

КЕТА АКЕЕР0НМИ8 8Τ8ΛΛ888ΧΥ СХОММК8НХЕ ТКИРСКРУЭТ ЕУНЕ8РЛ1)\Г) АУС80ККУАС К\С.ОТ\СУ08 У8ТМ81ТИСР ЕТС88КΥΡNС .•УРТТОЛМК! ПУАСЕСЦРУ УРУНЕИА8У (8ЕО ГО N0:32).

Рибонуклеазы представляют собой малые белки с потенциальными противоопухолевыми свойствами, которые после связывания с отрицательно заряженными клеточными мембранами входят в клетку посредством эндоцитоза и затем протекают в цитозоль, где они действуют как ферменты, вызывая деградацию РНК. Начиная с концентрации 10 нМ, они блокируют клеточный цикл и вызывают апоптоз.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:33 из вышеприведенной группы представляет собой молекулу цитохрома С, представленную последовательностью

СИУЕК СКК1Е1МКС8 ЦСНТУЕКССК НКТС.РХЕНС.Е ЕСРКТСОАРС, Υ8ΥТААNКNК С11\\'С,Е1)ТР\1 ЕУЕЕКРККУ1 РСТКМ1ЕУС1 КККЕЕРАИЫ АТРККАТКЕ (8ЕС) ГО N0:33).

Высвобождение цитохрома С из митохондрии в цитоплазму является одним из главных сигналов, индуцирующих апоптоз через так называемый митохондриальный путь. Этот белок является частью апоптосомного комплекса, который активирует каспазу 9.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:34 из вышеприведенной группы представляет собой гранзим В, представленный последовательностью

- 4 023005

ΠΟΟΗΥΑΚΡΗ δΡΡΥΜΑΥΙΑΙΙ ΑΌΟΚδΙ,ΚΡί'Ο ΟΕΕΙΡΙΙΙΙΕΥΙ, ΤΑΑΙ ΚΑΥΟδδΙΥΥΤΙ ,ΟΑΙ ΙΝΙΚ ΕΟΕΡΤΟΟΡΙΡ ΥΚΚΑΙΡΗΡΑΥ ΝΡΚΝΕδΝΌΙΜ 1,1 ,ΟΙ ,ΕΡΚΑΚΡ ΤΡΑΥΟΡΙ.ΡΙ.Ρ δΝΚΑΟνΚΡΟΟ ΤΟδνΑΟΑ'ΟΟΤ ΑΡΕΟΚΗδΗΤΌ ΟΙΆΚΜΊΛΌΕΙ) ΡΚΟΕδΟΕΡΗΥ ΥΙ)δΤΙΕΙ.(ΆΥ.. ΌΡΕΙΚΚΤδΡΚ ΟΌδΟΟΡΕνΟΝ ΚΥΑΟΟΙ ΥδΥΟ ΡΝΝΟΜΡΡΡΑΟ ΤΚΥδδΙΆΊ Ι\\'Ι ΚΚΤΜΚΡΥ (δΕΟ ΙΌ N0:34).

Гранзимы, также называемые в литературе фрагментины, представляют собой сериновые протеазы, характерные для клеточной зернистости Тс-лимфоцитов и ΝΚ-клеток. В настоящее время у человека идентифицированы 5 различных гранзимов: А, В, Н, Κ (триптаза) и М (метиониназа). Исследования подтвердили, что эти ферменты представляют собой элементы цитотоксической реакции, проявляемой лимфоцитами против клеток-мишеней. Было показано, что эти ферменты активируют перфорин - белок, образующий поры в клеточных мембранах и тем самым опосредующий цитотоксическую реакцию. Более того, полагают, что эти ферменты напрямую вовлечены в индукцию апоптоза в клетках-мишенях. Гранзим В активирует отобранные прокаспазы в их активные формы (например, каспаза 3) и так же высвобождает посредством протеолиза активную форму белка Βίά (белок, принадлежащий к семейству белка Вс1-2), который инициирует внутриклеточный путь апоптоза путем инкорпорирования в митохондриальные мембраны и образования пор в мембранах, с последующим высвобождением факторов, индуцирующих апоптоз (цитохром С, каспаза 9, ΑραΓ). Связываясь с гистонами, гранзим В также может принимать участие в разрыхлении структуры хроматина, что приводит к его разрыхлению и повышенному доступу к ДНК для эндонуклеаз.

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0:35 из вышеприведенной группы представляет собой фрагмент белка Νπγ77, представленный последовательностью

ΕδΡδΙ.Ι ΙδΙ.Ι. (δΕΟ ΙΌ Ν0:35).

Ядерный рецептор Νπγ77 представляет собой очень сильный индуктор апоптоза. Один из механизмов его действия заключается в способности связываться с белком Вс1-2, важным противоапоптотическим фактором. Это взаимодействие вызывает конформационные изменения в структуре Вс1-2, что превращает его в индуктор апоптоза. Фрагмент, представленный выше, является 9-аминокислотным участком последовательности Νιιγ77. распознаваемым как отвечающий за связывание и превращение Вс1-2 и индукцию апоптоза в клетках (1<о11ип с1 а1., Сапсег Се11 14: 285-298, 2008).

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:36 из вышеприведенной группы представляет собой 15-аминокислотный пептид, содержащий домен ВН3 белка Вак, представленный последовательностью

ΟΟΥΟΡΟΕΑΙΙ ΟΌΌΙΝ (δΕΟ ΙΌ Ν0:36).

Полагают, что этот короткий пептид, инкорпорированный в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптотический сигнал.

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:37 из вышеприведенной группы представляет собой домен ВН3 белка ΡυΜΑ/ΒΒС3, представленный последовательностью

ΕΕΟΑΑΡΕΙΟΑ ΟΕΡΡΜΑΟΟΕΥ ΑΟΥΕ (δΕΟ ΙΌ Ν0:37).

ΡυΜΑ/ΒΒС3 (р53 активированный модулятор апоптоза/Вс1-2-связывающий компонент 3) является представителем семейства белков Вс1-2 (подсемейство исключительно ВН3). Он опосредует апоптоз как зависимо, так и независимо от р53.

Непосредственное взаимодействие ΡυΜΑ/ΒΒС3 со всеми известными белками-предшественниками выживаемости Вс1-2 вызывает их инактивацию, митохондриальную дисфункцию и, следовательно, активацию каспаз и клеточную гибель. ΡΌΜΑ также влияет косвенно на восстановление проапоптотической активности молекул, таких как Вак и Вах. Домен ВН3 является ответственным за связывание ΡΌΜΑ с белками-предшественниками выживаемости.

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:38 из вышеприведенной группы представляет собой белок ΡυΜΑ/ΒΒС3, представленный последовательностью

ΑΡΑΡ ΟΕΟδδΡΕΡΥΕ ΟΌΑΡΌΟΡΚΡΡ ΡΙ .ΟΡΙ ΑΤδΑΥ δСΟ^СΕΡΟ^Α ΑΑΡΑΑΡΤΙ.Ι.Ρ ΑΑΥ^СΑΡΤΑΡ ΡΑνΤΑΑΣΟΟδ ΡΑΡΟΟΡΡδΡΡ ΡΟΡΡΡΟΟΡΟΡ δΙ.δΙ.ΑΕΟΙ ΙΙ.Ε δΡΥΡδΑΡΟΑΙ. ΑΟΟΡΤΟΑΑΡΟ ΥΡΟΕΕΕΟ\\'ΑΡ ΕΙΟΑΟΙ.ΡΡΜΑ 1)1)1 ,ΥΑΟΥΕΡΡ ΡΟΕΕΟΟΡΗΡΡ δΡΑΡΥΕΥΝΕΙ ΜΟΕΕΡΕΡΡΟΗ ΡΑΡΕΜΕΡΝ (δΕΟ ΙΌ Ν0:38).

Полагают, что и белок ΡυΜΑ/ΒΒС3, и его домен ВН3, когда встроены в слитый белок по настоящему изобретению, будут эффективно индуцировать апоптотический сигнал.

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:39 из вышеприведенной группы представляет собой 8-аминокислотный фрагмент белка δΜΑί7Όί;Φ1ο. представленный последовательностью

ΑΥΡΙΑΟΚΡ (δΕΟ ΙΌ Ν0:39).

δΜΑС/^IΑΒ^0 (второй митохондриального происхождения активатор каспазы/напрямую связывающий белок ΙΑΡ, с низким ΙΡ) представляет собой активатор каспаз, высвобожденный из митохондрий. Его Ν-концевой мотив конкурентно связывается с белками ΙΑΡ, предотвращая их домены ВГК. 2 и ВГК 3 от инактивации каспаз. Полагают, что короткий пептид, который встроен в слитый белок по настоящему изобретению, будет эффективно индуцировать апоптотический сигнал.

Эффекторный пептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:40 из вышеприведенной группы представляет собой буфорин ПЪ, представленный последовательностью

- 5 023005

КЛОЬфРРУОК ЬЬККЬЬККЬЬ (8Еф ГО N0:40).

Буфорин 1ГЬ представляет собой пептид, полученный из гистона Н2А, который способен к независимой пенетрации в клеточную мембрану и имеет антибактериальные свойства (Рагк е! а1., ВюсНет ВюрНук. Кек. Соттип., 244: 253-257, 1998). Исследования возможности его применения в качестве средства против злокачественных новообразований показали, что он способен выборочно связываться с многочисленными опухолевыми клетками, проникать в клетки и накапливаться в ядрах, индуцируя апоптоз через митохондриальный путь (Ьее е! а1., Сапсег Ьейегк, 271: 47-55, 2008).

Эффекторный пептид с последовательностью 8ЕО ГО N0:41 из вышеприведенной группы представляет собой пептид онконазу, представленный последовательностью

О1Ж1.Т ΡφΚΚΗΓΤΝΤΚ 1Ж1Ж1)\1\18'1' \Ш 1СК1ЖХТ ΡΓΥδΚΡΕΡνΚ АГСК0ГГА8К ΝνΣΤΤδΕРУЕ 51)С\®Г5КРС ΚΥΚΕΚΚ8ΤΝΚ РС®ГСЕ\ОАР VΗΡVΟVΟδС (8Еф ГО N0:41).

Онконаза, или Р-30, представляет собой белок, изначально полученный из лизатов яйцеклеток лягушки Капа р1р1еп8. Это одноцепочечный белок с массой 12 кДа, структурный гомолог К№-15е А. Исследование этого белка показало, что он обладает исключительной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток (Υ. \Уи. 8.М. М1кикк1, АгФеИ, 8.М. КуЬак апф К.1. ΥοιιΚ. Пю 1оигпа1 оГ Вю1одка1 СНетМгу 268, 10686-10693). Исследование механизма действия онконазы показало, что после процесса интернализации она входит в клетку, где осуществляется процесс деградации 288 и 188 рибосомальной рРНК, что приводит к ингибированию синтеза белка и клеточной гибели.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:42 из вышеприведенной группы представляет собой 20-аминокислотный Жконцевой фрагмент белка р14АКР, который является ингибитором белка-предшественника выживаемости МФт2, представленный последовательностью νΚΚΡΕνΤΕΚΓ ККАСОРРКУ (8ЕО ГО N0:42).

Р14АКР представляет собой белок, регулирующий активность белка МФт2, который связывается с супрессором опухоли р53 и несет ответственность за его деградацию и, вследствие этого, вероятность выживания трансформированных клеток. Белок Р14АКР, связываясь с МФт2, предотвращает его взаимодействие с р53. Сообщалось, что короткий пептид, полученный из р14АКР, достаточен для блокирования взаимодействия между МФт2 и р53 и предотвращения деградации второго (М1Фд1еу е! а1., 0псодепе 19: 2312-2323, 2000).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:43 из вышеприведенной группы представляет собой 11-аминокислотный пептид, связывающийся с МФт2, представленный последовательностью

РРРМЭТУЕСЕ N (8ЕО ГО N0:43).

Вышеприведенный пептид демонстрирует гомологичность последовательности с последовательностью р53 и значительную эффективность ингибирования взаимодействий МФт2-р53 (Войдег е! а1., 0псодепе 13: 2141-2147, 1996), таким образом, предотвращая деградацию р53.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:44 из вышеприведенной группы представляет собой 17-аминокислотный фрагмент пептида луназин, представленный последовательностью

СЕРН1МЕР1О 0Κ0ΌΌΌΌ (8ЕО ГО N0:44).

Луназин представляет собой 43-аминокислотный пептид, полученный из соевых бобов (О1усше тах), с доказанным потенциалом против злокачественных новообразований. Общий механизм действия этой молекулы включает ингибирование ацетилирования гистона. Известно, что молекулы, обладающие деацетилазной активностью, также действуют как ко-супрессоры транскрипционного процесса (Ьеопд е! а1., Сапсег Ьей, 18: 42-48, 2007).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:45 из вышеприведенной группы представляет собой домен ВН3 белка ВПг представленный последовательностью

ЬАЕКЕАС 1О1ЖМ1Ж8 (8ЕО ГО N0:45).

Белок В1к взаимодействует с клеточными и вирусными факторами, инициирующими сигналы выживания (например, Вс1-2), тем самым стимулируя апоптоз. Подобно многим другим проапоптотическим белкам он содержит домен ВН3, необходимый для взаимодействия с Вс1-2. Пептид, полученный из этого белка, содержащий домен ВН3, может инициировать апоптоз, активируя другие проапоптотические белки или ингибируя противоапоптотические белки (Эе1 Са1/о Мооге, ν., е! а1., В1опф 111: 2300-2309, 2008).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:46 из вышеприведенной группы представляет собой синтетический пептид - ингибитор протеасом, представленный последовательностью

АОАОООАОО АОАОООАООА О (8ЕО ГО N0:46).

Этот пептид состоит из серий повторов остатков О1у и А1а и является ингибитором протеасом, способным к потенциированию ΤΚΑГ^-индуцированного апоптоза, индуцируя сверхэкспрессию рецептора ΌΚ5 данного ΤΚΑГ^.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:47 из вышеприведенной группы представляет собой домен С-концевого фрагмента протеасомы 85а, представленный последовательностью \Г1'180(ЖРС. КТСЕРПЕ88М ТЕЕЕО1АУАМ ОМ8ЕООАЕРС, ОАЕ8АЭГОА8 8АМЭ'Р8ЕРАР

ΕΕ^^Υ^VМ^^ РЕРЕО8\1.Е\ ЕРОУЭРУУЕА 1КУАМО8ЕА8 ^ΑΤΚ^ОΚΚ^Κ РЕЕ1Ж (8ЕО ГО N0:47).

- 6 023005

Этот домен из фрагмента протеасомы §5а содержит мотивы И1М, которые принимают непосредственное участие в связывании убиквитина, и, таким образом, обладает способностью индуцировать апоптоз.

Эффекторный пептид с последовательностью 8ЕО ГО N0:151 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из азурина.

Азурин, медьсодержащий редокс-белок, выделяемый патогенной бактерией Рвеиботопав аетидшова, является высокотоксичным для многих линий опухолевых клеток. Он входит в цитозоль и продвигается к ядру. Его активность строго зависит от присутствия активной формы р53 в опухолевых клетках. Показано, что азурин связывает р53 и посттрансляционно повышает уровень р53 и Вах. Это явное антагонистическое действие относительно функционального взаимодействия Мбт2-р53 указывает на то, что связывание Азурина с р53 может помешать связи Мбт2-р53 и, таким образом, препятствовать деградации р53. После связывания он провоцирует выделение митохондриального цитохрома С в цитозоль. Этот процесс активирует каспазный каскад (в том числе, каспазу-9 и каспазу-7), тем самым инициируя апоптотический процесс (Рин) V., е! а1. Опсодепе. 2004 Маг 25; 23(13): 2367-78, Рипап О. е! а1. 1 Мо1 Кесодт!. 2010 1и1 Аид; 23(4): 343-51). Подробный анализ активности пептидов, полученных из последовательности азурина, выявил область из 28 аминокислот, ответственную за эффективную клеточную пенетрацию и запуск апоптоза (Уатаба ί \увр., Се11 М1стоЫо1, 7: 1418-1431, 2005).

Эффекторный пептид с последовательностью 8ЕО ГО N0:152 из вышеприведенной группы представляет собой полноразмерный пептид азурин.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:153 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, сконструированный из белка аРР и домена ВН3 белка Вах.

Химеры белка аРР и реконструированного проапоптотического белка Вак были описаны в ЕР 1309680 как высоко потенциальные и специфические лиганды для Вс1-2 и Вс1-Х человека (также см. СЫп 1.\ν., 8сйераг1/ А. Эев1дп апб еуойНюп оГ а т1та!ите Вс1-2 Ьшбшд рто!еш Апде\у Сйет 1п! Еб Епд1. 2001 Ос! 15; 40(20): 3806-3809).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:154 из вышеприведенной группы представляет собой другой пептид, сконструированный из белка аРР и домена ВН3 белка Вах.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:155 из вышеприведенной группы представляет собой пептид, полученный из ретикулона КТШ-С.

Белок КТШ-С представляет собой мембранный белок, локализирующийся в ЭР и экспрессируемый в нервной системе, и его биологическая роль понятна не до конца. С-концевая область КТШ-С', соответствующая фрагменту от остатка 186 до остатка 208, способна связывать нуклеиновые кислоты и взаимодействовать с ферментами гистонными дезацетилазами (НЭАС), повышая их активность.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:156 из вышеприведенной группы представляет собой полноразмерный Ретикулон 3 человека (изоформа а). Ретикулоны (КТЫ) формируют группу интегральных белков мембраны, которые не имеют гомологии с другими известными доменами, связанными с апоптозом. Ретикулон 3 изоформа а сверхэкспрессируется в опухолевых клеточных линиях, делая их чувствительными к ТКАТО-опосредованному апоптозу.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:157 из вышеприведенной группы представляет собой модифицированную конститутивно активную каспазу-3 (одиночная цепь) (§птуави1а 8.М., Айтаб М., МасРайаие М. Ьио Ζ., Ниаид Ζ., Регпапбев-А1петп Т., А1иетг1 Е.§. Оепегайоп оГ сопвй!ибуе1у асйуе гесотЫпап! савравев-3 апб -6 Ьу геаггапдетеШ оГ !йе1г виЬипбв. 1 Вю1 СЬет. 1998 Арг 24; 273(17): 10107-11).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:158 из вышеприведенной группы представляет собой домен §АС из белка Раг-4 (белок апоптозного ответа простаты раг-4).

Раг-4 представляет собой белок-супрессор опухолевого роста с проапоптотической функцией. Опухолеспецифическое проапоптотическое действие Раг-4 присуще его, расположенному в центре, домену 8АС. Функция молекулы обеспечивается двумя различными способами: активацией молекулярных компонентов аппарата некроза клеток (перемещение Рав и РавЬ на цитоплазматическую мембрану) и ингибированием фактора-предшественника выживаемости (путь №-кВ) (Уйао Υ., Капдпекаг ММ. Арор!ов1в апб !итог гев1в1апсе сопГеггеб Ьу Раг-4. Сапсег Вю1 ТЬег. 2008 Эес; 7(12): 1867-74. ЕриЬ 2008 Эес 8. Ке\ае\у).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:159 из вышеприведенной группы представляет собой белок №ха. №ха кодирует представителя семейства белков Вс1-2 только с доменом Вс12 гомологичностью 3 (ВН3); этот представитель содержит область ВН3, но не другие домены ВН. №ха является медиатором р53-зависимого апоптоза и подвержен ВН3 мотив-зависимой локализации в митохондриях, и взаимодействует с противоапоптотическими представителями семейства Вс1-2, что в результате приводит к активации каспазы-9.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Е0 ГО N0:160 из вышеприведенной группы представляет собой 10 АА(КЕЕМЕ1§КЬР)-фрагмент белка №ха, необходимый для митохондриальной локализации (МТЭ-митохондриальный нацеливающий домен, или СКР - Се11 КППпд Рерббе). Он был описан в ν0 2006/001582 и у Υоиид-Vоо 8ео е! а1. в ТЬе 1оита1 оГ Вю1одюа1 СЬетгвйу. №1. 278, №. 48, 1ввие оГ

- 7 023005

ЫоуетЬег 28, рр. 48292-48299, 2003.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:161 из вышеприведенной группы представляет собой короткий гибридный пептид Άηΐρ-ΤΡΚ, описанный в \У0 2010055929. АпГр-ΤΡΚ представляет собой сконструированный гибридный пептид, нацеленный на Нър90, который имеет селективную цитотоксическую активность против опухолевых клеток, обусловленную ингибированием взаимодействия №р90 с доменом ΤΡΚ2Ά белка Нор.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:162 из вышеприведенной группы представляет собой пептидный ингибитор домена 8Н2 белка 81а13.

Домен 8Н2 белков 81а1 отвечает за серию событий, которые приводят к ускорению клеточного роста и дифференциации через нормальный сигнальный путь 8ΤΑΤ в ответ на факторы роста и цитокины.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:163 из вышеприведенной группы представляет собой пептид ΟΟνΟΚΟΕΑΙΙΟΌΌΙΝΚ, происходящий из домена ВН3 белка Вак (семейство Вс12) (СайеШ М., Кешеге И, Ке88е1 Ό. Α тесНашзт Гог 1Не ргоарор!ойс асйуйу о£ шьобеохусйойс ааб: е£Гес18 оп Вс1-2 сопГогтайоп. Се11 Эеа1Н ЭйГег. 2004 Аид; 11(8): 906-14). Белок Вак является проапоптотическим представителем семейства Вс1-2, который вовлечен в инициацию апоптоза.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:164 из вышеприведенной группы представляет собой пептид К№^ААОК¥СКЕЬККМ8ПЕЕЕС8ЕКСЬ, происходящий из домена ВН3 белка Ваб (семейство Вс1-2) (\Уапд 1.Ь., 2Ьапд Ζ.Ι., Сйок81 8., 81ап 8., Ьи Ζ., Сгосе С.М., А1петп Е.8., Когпдо1б К., Ниапд Ζ. Се11 регтеаЬ1е Вс1-2 Ьшбшд рерббе8: а сНет1са1 арргоасй Ю арор1о818 шбисйоп ш (итог се118. Сапсег Ке8. 2000 Маг 15; 60(6): 1498-502).

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:165 из вышеприведенной группы представляет собой пептид АТАР из белка В£11.

АТАР (амфипатический пептид с заякоренным хвостом) (остатки 147-175 из ВЙ1, бифункциональный белок семейства Вс1-2) нацелен специфически на митохондрии и индуцирует каспаза-зависимый апоптоз, для которого не требуется Вах или Вак.

Эффекторный пептид с последовательностью 8Еф ГО N0:166 из вышеприведенной группы представляет собой другой пептид АТАР из белка ВГ11. Белок АТАР слит с доменом ΜΤ8 из НСС81 (Ко 1.К., Сйо1 К.Н., Рап Ζ., Ьт Р., \Уе181ебег К, йт СЛУ., Ма 1. Τίκ 1аП-апс1юппд боташ о£ ВГ11 апб НСС81 1агде18 тПос1юпбпа1 тетЬгапе регтеаЬббу 1о шбисе арор1о818. 1 Се11 8сГ 2007 Аид 15; 120 (РГ 16): 2912-23. ЕриЬ 2007 1и1 31).

Как описано выше, первый вариант проапоптотического эффекторного пептида домена (Ь) может представлять собой пептид, проявляющий свою апоптотическую активность через внутренний путь апоптоза (внутриклеточный), который индуцирует апоптоз непосредственно путем активации сигнального каскада компонентов митохондриального пути апоптоза, или непосредственно индуцируя митохондриальный апоптоз в клетках.

В одном из примеров осуществления первого варианта одна группа проапоптотических эффекторных пептидов домена (Ь), проявляющая свою активность через внутренний путь, может представлять собой пептиды, которые ингибируют и/или модулируют внутриклеточные противоапоптотические факторы или факторы-предшественники выживаемости, такие как противоапоптотические белки Вс1-2 и Вс1ХЬ, после их связывания.

Примерами эффекторных пептидов из вышеприведенной группы являются пептиды, представленные последовательностью 8Еф ГО N0:30, описанной в слитых белках по примеру 1, 8Еф ГО N0:37, описанной в слитых белках по примерам 11 и 47, 8Еф ГО N0:45, встроенной в слитый белок по примеру 21, 8Еф ГО N0:158, описанной в слитых белках по примерам 42 и 43, и 8Еф ГО N0:159, встроенной в слитый белок по примеру 44.

В других примерах осуществления этого первого варианта группа проапоптотических эффекторных пептидов домена (Ь), проявляющая свою активность через внутренний путь, может представлять собой пептиды, оказывающие прямой разрушительный эффект внутри клетки для блокировки клеточного цикла.

Указанный прямой разрушительный эффект внутри клетки в митохондриальном внутреннем пути может быть инициирован этим эффекторным пептидом на любом уровне каспазного каскада, приводя к гибели клетки.

Примерами указанного прямого разрушительного действия эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути являются деградация нуклеиновых кислот, в частности целых клеточных РНК или ДНК, и индукция деструкционных нуклеаз. Такой эффект может оказываться, например, рибонуклеазами, такими как рибонуклеазы суперсемейства панкреатической КNΑ8е А, в том числе панкреатической КNΑ8е человека, ангиогенин человека (рибонуклеаза 5, 1Апд), нейротоксин эозинофилов человека (ЕЭЩ и бычья рибонуклеаза, а так же их гомологи и варианты. Примерами гомологов КNΑ8е являются онконаза, рибонуклеазы, выделенные из Капа са1е8Ыапа и Капа ]арошса.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими путем деградации нуклеиновых кислот, являются пептиды, представленные последовательностями 8Еф ГО N0:32, описанной в слитых белках по примерам 3, 4 и 27, 8Еф ГО N0:41, описанной в слитых белках из

- 8 023005 примеров 16, 17 и 46, и 8ЕО ГО N0:157, описанной в слитом белке из примера 41.

Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является активация каспазы. Такой эффект может оказывать, например, цитохром С (8Е0 ГО N0:33), представленный в слитых белках по примерам 5 и 6, гранзим В (8Е0 ГО N0:34), представленный в слитых белках по примерам 7 и 8, или пептид, полученный из белка 8тасГО1АВЬ0 (8Е0 ГО N0:39), представленный в слитых белках по примерам 14, 21, 33, 34 и 35.

Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является ингибирование протеасом, обусловленное влиянием стабилизации проапоптотических белков на восстановление функций р53.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими посредством ингибирования протеасом, являются пептиды, представленные последовательностью 8Е0 ГО N0:4 6, встроенной в слитый белок по примеру 22, и 8Е0 ГО N0:47, встроенной в слитый белок по примеру 23.

Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является модуляция гистоновых белков через усиление влияния экспрессии проапоптотических белков на восстановление функций р53.

Примерами эффекторных пептидов из вышеприведенной группы, действующих через модуляцию гистоновых белков, являются буфорин 1ГЬ, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0:40, встроенной в слитый белок по примеру 15, и луназин, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0:44, встроенной в слитый белок по примеру 20.

Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является восстановление функций р-53, например, посредством ингибирования его деградации. Предотвращение деградации р-53 может быть достигнуто посредством ингибирования негативной регуляции р-53, например, посредством ΜΌΜ2 (тигше боиЬ1е тти1е 2), для прекращения его негативной регуляции. Это может быть достигнуто с помощью пептидов, связывающих ΜΌΜ2, которые конкурируют с ΜΌΜ2 за связывание с р-53, таких как Азурин, медьсодержащий редоксбелок, регулятор клеточного цикла р14АКТ, или ЗирегТГР (белок ТЫогебох1и1и5еп, тбт-2-связывающий пептид с активным петлевым участком бактериального белка тиоредоксин), или их фрагменты.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, действующими посредством восстановления функций р-53, являются пептиды, представленные последовательностью 8Е0 ГО N0:42, встроенной в слитый белок из примера 18, 8Е0 ГО N0:43, встроенной в слитый белок из примера 19, 8Е0 ГО N0:151, представленной в слитом белке из примеров 29, 30 и 31, и 8Е0 ГО N0:152, встроенной в слитый белок из примера 32.

Другим примером указанного прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является влияние, а именно активация, ингибирование или модуляция, семейства белков Вс1-2, таких как белки Вах, Вак, Вок, Βίά, В1т, Ваб, ВтТ, Нгк, №.ха. Рита, В1к, В№Р3 и 8р1ке, конкретнее, семейство белков только ВН3, в том числе В1б, В1т, Ваб, ВтЕ Нгк, №ха, Рита, В1к, ВШР3 и 8р1ке. В частности, фрагменты доменов ВН3 представителей семейства Вс1-2 будут предпочтительными эффекторными пептидами. Другая группа эффекторных пептидов представляет собой фрагменты семейства ядерных рецепторов КХК (рецептор Ке1шо1б X), такой как, например, ядерный рецептор №.1г77.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, оказывающими влияние на белки семейства Вс1-2, являются пептиды, представленные последовательностью 8Е0 ГО N0:30, встроенной в слитый белок из примера 1, 8Е0 ГО N0:31, представленной в слитых белках из примеров 2, 4 и 8, 8Е0 ГО N0:32, встроенной в слитый белок из примера 3, 8Е0 ГО N0:35, встроенной в слитый белок из примера 9, 8Е0 ГО N0:36, встроенной в слитый белок из примера 10, 8Е0 ГО N0:37, представленной в слитых белках из примеров 11 и 47, 8Е0 ГО N0:38, представленной в слитых белках из примеров 12 и 13, 8Е0 ГО N0:159, встроенной в слитый белок из примера 44, 8Е0 ГО N0:160, встроенной в слитый белок из примера 45, 8Е0 ГО N0:163, встроенной в слитый белок из примера 51, 8Е0 ГО N0:164, представленной в слитых белках из примеров 52 и 53, 8Е0 ГО N0:165, встроенной в слитый белок из примера 54, и 8Е0 ГО N0:166, встроенной в слитый белок из примера 55.

Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является конвергирование апоптотического сигнала, индуцированного связыванием ТКАГЬ с рецепторами ТКАГЬ, в частности, посредством активации каспаз.

Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является стимулирование образования апоптосом.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, стимулирующими формирование апоптосом, являются пептиды, представленные последовательностью 8Е0 ГО N0:30, встроенной в слитый белок из примера 1, 8Е0 ГО N0:31, встроенной в слитый белок из примера 2, 8Е0 ГО N0:33, представленной в слитых белках из примеров 5 и 6, 8Е0 ГО N0:35, встроенной в слитый белок из примера 9, 8Е0 ГО N0:36, встроенной в слитый белок из примера 10, 8Е0 ГО N0:37, встроенной в слитый белок из примера 47, 8Е0 ГО N0:39, представленной в слитых белках из примеров 33, 34 и 35, 8Е0 ГО N0:40, встроенной в слитый белок из примера 14, 8Е0 ГО N0:45, встроенной в слитый белок из при- 9 023005 мера 21, 8ЕЦ ΙΌ N0:153, представленной в слитых белках из примеров 36 и 37, 8ЕЦ ГО N0:154, встроенной в слитый белок из примера 38, 8ЕЦ ГО N0:157, встроенной в слитый белок из примера 41, 8ЕЦ ГО N0:158, представленной в слитых белках из примеров 42 и 43, 8Е0 ГО N0:159, встроенной в слитый белок из примера 44, 8Е0 ГО N0:160, встроенной в слитый белок из примера 45, 8Е0 ГО N0:163, встроенной в слитый белок из примера 51, и 8Е0 ГО N0:164, представленной в слитых белках из примеров 52 и 53.

Другим примером прямого разрушительного эффекта эффекторного пептида в митохондриальном внутреннем пути является стимулирование проницаемости наружной мембраны митохондрий (М0МР), вследствие чего белки, выделяемые митохондриями, могут действовать на уровне активации каспазы.

Характерными эффекторными пептидами из вышеприведенной группы, стимулирующими проницаемость МОМР, являются пептиды, представленные последовательностью 8ЕЦ ГО N0:30, встроенной в слитый белок из примера 1, 8Е0 ГО N0:31, представленной в слитых белках из примеров 2 и 48, 8Е0 ГО N0:33, представленной в слитых белках из примеров 5 и 6, 8Е0 ГО N0:39, представленной в слитых белках из примеров 14, 33, 34 и 35, 8ЕЦ ГО N0:40, встроенной в слитый белок из примера 15, 8ЕЦ ГО N0:41, встроенной в слитый белок из примера 46, и 8Е0 ГО N0:45, встроенной в слитый белок из примера 21.

Как описано выше, второй вариант проапоптотического эффекторного пептида домена (Ь) по настоящему изобретению представляет собой группу проапоптотических эффекторных пептидов, действующих через внешний путь (внеклеточно), в котором для их действия требуется связывание с рецепторами, присутствующими на поверхности опухолевой клетки.

Следующие ТИР-лиганды (ТКР - фактор некроза опухоли) или ТКР-аналоги в качестве внеклеточно действующих пептидов использовали как сравнительные эффекторные пептиды:

Декапептид УЛХРОЛРСОР (8ЕЦ ГО N0:48);

Гексапептид ЬЛЯОУЕ (8ЕЦ ГО N0:49), или

Септапептид СР8Е0ЬС (8ΙΤ) ГО N0:50).

Декапептид, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0:48, описан как аналог/агонист ТКР в 1Р 60226816.

Гексапептид, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0:49, происходит из ТКР и описан в ОН 3841768.

Септапептид, представленный последовательностью 8Е0 ГО N0:50, представляет собой пятиаминокислотный пептид, который является частью цитокина ТОТ¹, полученный из поверхности взаимодействия этого цитокина с его клеточными рецепторами: ТКРК55 и Т№К75, который фланкируется с Сконца и N-конца двумя остатками цистеина. Остатки цистеина стабилизируют циклизацию пептида через формирование сульфидного мостика между аминокислотами. Целью циклизации является стабилизация пептида и повышение его активности.

После связывания с рецепторами ТКАГО, представленными на поверхности опухолевых клеток, слитый белок будет проявлять двойное действие. Домен (а), который является функциональным фрагментом ТКАГО, будет проявлять свою известную агонистическую активность, а именно связывание с рецепторами смерти на клеточной поверхности и активация внешнего пути апоптоза. После интернализации путем эндоцитоза слитого белка, содержащего проапоптотический пептид, действующий внутриклеточно, домен (Ь) будет способен потенциально оказывать свое действие внутриклеточно одновременно с действием домена ТКАГО. В этом случае противоопухолевая активность ТКАГО может быть потенциирована посредством активации других элементов и механизмов апоптоза.

Сравнительный слитый белок, включающий проапоптотический пептид, действующий внеклеточно, должен потенциально дополнительно инициировать путь апоптоза посредством связывания с и активации проапоптотических рецепторов, отличных от рецепторов ТКАГО.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домены (а) и (Ь) слитого белка могут быть присоединены непосредственно друг к другу.

В другом варианте осуществления домен (а) и домен (Ь) соединены доменом (с), содержащим последовательность участка расщепления, распознаваемую протеазами, представленными в клеточном окружении, главным образом, в окружении опухолевой клетки.

Участок расщепления протеаз может быть выбран из последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, в частности последовательности РЬОЬАО (81 У) ГО N0:51), РЬ01А0Е (81 У) ГО N0:171) или Р1У.1.УСУ) (8РУ) ГО N0:173), последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, в частности последовательность К\УК (8ЕЦ ГО N0:52), и последовательности, распознаваемой фурином, в частности последовательность КККК (8ЕЦ ГО N0:53) или последовательность ККККУКК (8ЕЦ ГО N0:172), и их сочетаний.

В частности, участок расщепления протеаз представляет собой комбинацию последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, и последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, расположенных рядом друг с другом в любом порядке.

В одном из вариантов осуществления домен (с) представляет собой комбинацию ММР/иРА 8ЕЦ ГО

- 10 023005

ΝΟ:51/8ΕΟ ΙΌ N0:52, которая представляет собой последовательность РЬОЬЛОКАК, или комбинацию иРА/ММР БЕО ΙΌ Ν0:52/8ΕΟ ΙΌ N0:51, которая представляет собой последовательность КАКРЬОЬЛО.

Протеазы металлопротеаза ММР, урокиназа и/или фурин, сверхэкспрессируются в опухолевом окружении. Присутствие последовательности, распознаваемой протеазами, делает возможным отщепление домена (а) от домена (Ь) после интернализации конструкции, то есть высвобождение функционального домена (Ь) и, следовательно, его активацию.

Наличие участка расщепления протеаз, обеспечивая быстрое высвобождение эффекторного пептида, повышает шансы переноса пептида в место его действия, до того, как произойдет случайная деградация слитого белка протеазами, присутствующими в данной клетке.

Кроме того, к домену (Ь) эффекторного пептида слитого белка по настоящему изобретению может быть присоединен транспортирующий домен (б), выбранный из группы, состоящей из:

(61) последовательности, направленной на эндоплазматический ретикулум, (62) полиаргининовой последовательности, переносимой через клеточную мембрану, содержащую 6, 7, 8 или 9 остатков Агд, (63) транслокационного домена Р8еи6отопа8 аегидшока (БЕЦ ГО N0:54), (64) мембранного транспортного домена, (65) ядерного домена локализации, и (66) митохондриального нацеливающего домена, и их сочетаний.

Сочетание доменов (61) (62) и (63) может включать, в частности, сочетание (61)/(62), (61)/(63) или (61)/(62)/(63).

Сочетание доменов (61), (62), (63), (64) и (65) может включать, в частности, также сочетание (61)/(62), (61)/(63), (61)/(64), (61)/(65) и (61)/(62)/(63), (63)/(65), (62)/(65), (61)/(63)/(65), (62)/(63)/(66).

Более того, сочетание доменов (61), (62), (63), (64) и (65) может включать домены, расположенные рядом друг с другом и соединенные с одним концом домена (Ь), и/или домены, присоединенные к разным концам домена (Ь).

Следует понимать, что в случае, когда слитый белок содержит и транспортный домен (6), присоединенный к домену (Ь), и домен (с) участка расщепления между доменами (а) и (Ь), домен (с) расположен таким образом, чтобы после отщепления данной конструкции транспортный домен (6) оставался прикрепленным к домену (Ь). Другими словами, если слитый белок содержит и транспортный домен (6), и домен участка расщепления (с), то домен (6) расположен между доменом (Ь) и доменом (с), или расположен на конце домена (Ь), противоположном месту присоединения домена (6). Настоящее изобретение не включает вариант, в котором домен (6) расположен между доменом (с) и доменом (а), а именно случай, когда после расщепления конструкции транспортный домен остается присоединенным к домену ТКЛГО.

Транспортная последовательность может быть присоединена к Ν-концу или С-концу домена (Ь). В некоторых вариантах осуществления транспортная последовательность может быть также терминальной частью всей конструкции, например С-концевая часть или Ν-концевая часть, в зависимости от способа присоединения доменов (а) и (Ь).

Домен транслокации микроорганизма Р8еи6отопа8 аегидтока способен перемещаться через лизосомальную мембрану в цитоплазму и может быть использован для введения эффекторного пептида в компартменты опухолевых клеток. Последовательность домена транслокации из Р8еи6отопа8 аегидшока хорошо известна и представлена последовательностью

РЕССБЬА ЛЕТЛНОЛСНЕ ΙΤΕΊΤΤΗΙПЮ РНСАЕСЕЕОС СУРСОНЕСЛЕ БТААНЕБАУТ) У1Х)УЕА\АЕА БРСБССИЕСЕ Л1НЕ5РЕОЛН ЕАЕТЕАААЕБ ЕНЕУНОСТСХ 1)ЕЛС.ЛЛ\С.РЛ Ό (БЕЦ ГО N0:54).

Последовательность (61), направленная на эндоплазматический ретикулум, может представлять собой любую сигнальную последовательность, направленную на эндоплазматический ретикулум, известную в данной области, такую как, но ими не ограничиваясь, КИЕВ, НИЕЬ, КИЕЬ, ИИЕЕ, ЛОЕЬ, БИЕЬ, КЕИЬ. Последовательность (61) предпочтительно выбрана из последовательностей КЭЕЬ (БЕЦ ГО N0:55) и КЕИЬ (БЕЦ ГО N0:56).

Предпочтительно направляющая последовательность (61) расположена на С-конце слитого белка по настоящему изобретению и образует его С-концевую область.

Мембранный транспортный домен (64) может представлять собой любую известную в данной области сигнальную последовательность, транспортирующую через плазматическую мембрану, такую как, например, но ими не ограничиваясь, ΕΓΚ^Υ или К РККРУН.

Ядерной последовательностью локализации (65) может быть любая известная в данной области сигнальная последовательность, направленная на ядро, такая как, например, но не ограничивающаяся ими, ЕЕЕААСНКНККНТ' (БЕТ) ГО N0:168), ЕЕЕА7АСНКНККНТ'. \\\ААСНКНККНТ'. ΥΥΥΑΑ(..ΗΚΗΚΚΗΤ. ЛАККК или СК КККККТ.

Митохондриальным направляющим доменом (66) может быть любая известная в области сигнальная последовательность, направленная на митохондрии, такая как, например, но не ограничиваясь ими, НУБЕСНЕСАБАМАНБНЕТ'АТ'БУБОУОЕХСЕУК (БЕС ГО N0:166), фрагмент МЕАТНУЕБЕУСКНА- 11 023005

18Т§УСУК субъединицы IV цитохром оксидазы человека (НСОХ1У1) или лидерный пептид орнитинтранскарбамилазы.

Кроме основных функциональных элементов слитого белка, транспортных доменов и доменов участка расщепления слитые белки по настоящему изобретению могут содержать домен (е), а именно полицистеиновый мотив, облегчающий стабилизацию тримера, как, например, но ими не ограничиваясь, последовательность СААСАААС (81Т) ГО N0:177) или СААЕСАААС (81Т) ГО N0:178).

Более того, данный полицистеиновый домен (е) может быть соединен с одним концом домена (Ь) и/или соединен с разными концами домена (Ь).

Следует понимать, что в случае, когда слитый белок имеет и полицистеиновый домен (е), прикрепленный к домену (Ь), и домен (с) участка расщепления между доменами (а) и (Ь), домен (с) расположен таким образом, что после расщепления конструкции полицистеиновый домен (е) остается прикрепленным к домену (а). Другими словами, если слитый белок содержит и полицистеиновый домен (е), и домен (с) участка расщепления, то домен (е) расположен между доменом (а) и доменом (с) или расположен на конце домена (а), противоположном месту прикрепления домена (ά). Настоящее изобретение не включает такой вариант, при котором домен (е) будет расположен между доменом (с) и доменом (Ь), то есть в случае, когда после расщепления конструкции полицистеиновый домен оставался прикрепленным к домену эффекторного пептида.

Кроме основных функциональных элементов слитого белка, транспортных доменов и домена (доменов) участка расщепления слитый белок по настоящему изобретению может содержать нейтральную последовательность/последовательности гибкого стерического линкера (спейсера), содержащего остатки аланина, глицина, глутамина, цистеина, гистидина и серина. Такие линкеры/спейсеры хорошо известны и описаны в литературе. Их включение в последовательность слитого белка предназначено для обеспечения корректного сворачивания белков, продуцируемых в процессе сверхэкспрессии в клетках-хозяевах.

В частности, гибкий стерический линкер может быть выбран из группы, состоящей из 0080 (8ЕЦ ГО N0:57), 0008 (81Т) ГО N0:58), 00008 (81Т) ΙΌ N0:59), 00800 (81Т) ΙΌ N0:60), 000800 (81Т) ΙΌ N0:61), 0008000 (81Т) ГО N0:62), 00080008 (81Т) ΙΌ N0:63), 000800008 (81Т) ΙΌ N0:64), А800 (81Т) ΙΌ N0:65), 0008А800 (81Т) ΙΌ N0:66), 80С08 (81Т) ΙΌ N0:169), 000080000 (81Т) ΙΌ N0:180), 008Н0 (81Т) ГО N0:182), 800С008 (81Т) ГО N0:183) и ААСАА (81Т) ГО N0:184).

В одном из вариантов осуществления между доменом (а) и доменом (Ь) находится дополнительный домен (ί) с последовательностью, подходящей для прикрепления к слитому белку по настоящему изобретению молекулы РЕ0 (РЕ0-линкер).

Такой линкер может быть известной последовательностью А1а8ег01уСу801уРго01и (в однобуквенной кодировке А80С0РЕ), указанной в прикрепленном списке последовательностей как 8ЕЦ ГО N0:170. РЕ0-линкер также может быть выбран среди последовательностей А1аА1аСу§А1аА1а (ААСАА), 8ег01у01уСу§01у01у8ег (800С008) и (80С08), указанных в прикрепленном списке последовательностей соответственно 81Т) ГО N0:178, 81Т) ГО N0:177 и 81Т) ГО N0:179.

В другом варианте осуществления домены (а), (Ь), (с), (ά), (е) и (ί) могут быть дополнительно отделены с помощью до трех аминокислотных остатков, образованных из аминокислотных остатков, выбранных из группы, содержащей Г лицин и Г лутамин.

Более того, в некоторых вариантах осуществления слитый белок может содержать в качестве Сконцевой области цельную конструкцию нефункционального фрагмента ΙιΤΒΛΙΕ такую как последовательность ΗΤΡΛΙΡ95-121. с предшествующей последовательностью, обеспечивающей ее отщепление от конструкции, выигрышным является участок расщепления протеаз, предпочтительна последовательность, распознаваемая тромбином. Включение такого небольшого нефункционального фрагмента НТКАТО наделяет более высокой гидрофильностью всю конструкцию, таким образом, повышая растворимость белка в процессе экспрессии. После этапов очистки фрагмент НТКА1Е95-121 будет отщеплен тромбином. В таком случае, НТКАГОТЗ-Ш не будет присутствовать в слитом белке, используемом для приготовления фармацевтической композиции.

Можно использовать любую известную последовательность, распознаваемую тромбином, в частности последовательность ^РК08 (8ЕЦ ГО N0:174).

Такая дополнительная последовательность НТКА1Е95-121 является особенно эффективной в случае липофильных эффекторных пептидов и когда домен (а) начинается с аминокислоты 114 и выше в последовательности цельного ТКАТО.

Конкретными вариантами осуществления слитого белка по настоящему изобретению являются слитые белки, содержащие проапоптотические пептиды, действующие внутриклеточно, выбранные из группы, состоящей из белков, представленных последовательностями: 8ЕЦ ГО N0:1, 8ЕЦ ГО N0:2, 8ЕЦ ГО N0:3, 81Т) ГО N0:4, 81Т) ГО N0:5, 81Т) ГО N0:6, 81Т) ГО N0:7, 81Т) ГО N0:8, 81Т) ГО N0:9, 81Т) ГО N0:10, 81Т) ГО N0:11, 81Т) ГО N0:12, 81Т) ГО N0:13, 81Т) ГО N0:14, 81Т) ГО N0:15, 81Т) ГО N0:16, 81Т) ГО N0:17, 81Т) ГО N0:18, 81Т) ГО N0:19, 81Т) ГО N0:20, 81Т) ГО N0:21, 81Т) ГО N0:22, 81Т) ГО N0:23, 81Т) ГО N0:93, 81Т) ГО N0:94, 81Т) ГО N0:95, 81Т) ГО N0:96, 81Т) ГО N0:97, 81Т) ГО N0:98, 81Т) ГО N0:99, 81Т) ГО N0:100, 81Т) ГО N0:101, 81Т) ГО N0:102, 81Т) ГО N0:103, 81Т) ГО N0:104, 81Т) ГО N0:105, 81Т) ГО N0:106, 81Т) ГО N0:107, 81Т) ГО N0:108, 81Т) ГО N0:109, 81Т) ГО N0:110, 81Т) ГО

- 12 023005

N0:111, 8ΕΟ ΙΌ N0:112, 8ΕΟ ΙΌ N0:113, 8ΕΟ ΙΌ N0:114, 8ΕΟ ΙΌ N0:115, 8ΕΟ ΙΌ N0:116, 8ΕΟ ΙΌ N0:117, 8ΕΟ ΙΌ N0:118, 8ΕΟ ΙΌ N0:119, 8ΕΟ ΙΌ N0:120 и 8ΕΟ ΙΌ N0:121.

Другие специфические варианты осуществления слитого белка по настоящему изобретению представляют собой слитые белки, содержащие проапоптотические пептиды, действующие внеклеточно, выбранные из группы, состоящей из белков, представленных последовательностями 8Ε0 ΙΌ N0:24, 8Ε0 ΙΌ N0:25 и 8ΕΟ ΙΌ N0:26.

Подробное описание структуры характерных слитых белков, упомянутых выше, показано на фиг. 15 и 9-13 и в примерах, представленных ниже.

В соответствии с настоящим изобретением под слитым белком понимают одну белковую молекулу, содержащую два или несколько белков или их фрагментов, ковалентно связанных посредством пептидных связей между их соответствующими пептидными цепями, без дополнительных химических линкеров.

Слитый белок также альтернативно может быть описан как белковая конструкция или химерный белок. В соответствии с настоящим изобретением термины конструкция или химерный белок, если используются, должны пониматься как относящиеся к слитому белку, как определено выше.

Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что слитый белок, определенный таким образом, может быть синтезирован с помощью известных способов химического синтеза пептидов и белков.

Слитый белок может быть синтезирован способами химического синтеза пептидов, в частности, с помощью технологий пептидного синтеза на твердой фазе с использованием подходящих смол и носителей. Такие технологии общеупотребимы и известны в уровне техники, и описаны среди прочего в монографиях (см., например, Вобат/ку апб Вобап5/ку. ТНс Ргасйсе о£ Рерйбе 8уп1йс515. 1984, 8рппдсг-Усг1ад. №\ν Уогк, 81е\уаг1 е! а1., 8ойб РНазе Рерйбе 8уи1йе818, 2пб Εάίΐίοιτ 1984, Р1егсе Сйетюа1 Сотрапу).

Слитый белок может быть синтезирован способами химического синтеза пептидов в виде непрерывного белка (неразрезанного белка). Альтернативно, отдельные фрагменты (домены) белка могут быть синтезированы по отдельности и затем соединены друг с другом в один непрерывный белок с помощью пептидной связи, посредством конденсации аминоконца одного пептидного фрагмента карбоксильным концом второго пептида. Такие технологии являются повсеместно принятыми и хорошо известными.

Для подтверждения правильности структуры полученного пептида можно использовать известные способы анализа аминокислотного состава пептидов, такие как технология масс-спектрометрии с высоким разрешением для определения молекулярного веса пептида. Для подтверждения пептидной последовательности белка также можно использовать секвенаторы, в которых пептид последовательно разрушается для выявления последовательности аминокислот.

Тем не менее предпочтительно слитый белок по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный белок, созданный способами генной экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок в клетках-хозяевах.

Следующий аспект настоящего изобретения представляет собой полинуклеотидную последовательность, в частности последовательность ДНК, кодирующую слитый белок, как определено выше.

Предпочтительно полинуклеотидная последовательность, в частности ДНК, в соответствии с настоящим изобретением кодирующая слитый белок, как определено выше, представляет собой последовательность, оптимизированную для экспрессии в Е. сой.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой также вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, в частности последовательность ДНК по настоящему изобретению, как определено выше.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой также клетку-хозяина, содержащую вектор экспрессии, как определено выше.

Предпочтительной клеткой-хозяином для экспрессии слитых белков по настоящему изобретению является клетка Е. Сой.

Способы создания рекомбинантных белков, в том числе слитых белков, хорошо известны. Вкратце, эта технология включает генерирование полинуклеотидной молекулы, например молекулы ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка-мишени, и контроль экспрессии белка-мишени в данном хозяине. Затем данную полинуклеотидную молекулу, кодирующую белок-мишень, встраивают в соответствующий вектор экспрессии, который обеспечивает эффективную экспрессию полипептида. Рекомбинантный вектор экспрессии затем встраивают в клетки-хозяев для трансфекции/трансформации и в результате получают трансформированную клетку-хозяина. Затем следует культивирование трансформированных клеток для сверхэкспрессии белка-мишени, очистка полученных белков и, необязательно, отрезание посредством расщепления маркерных последовательностей, использовавшихся для экспрессии или очистки белка.

Пригодные способы экспрессии и очистки описаны (см., например, в монографии Соеббек Оепе Εxр^еδδ^οи Тесйпокду, Ме1йоб8 ш Εпζутο1ο§у 185, Асабетю Рге88, 8ап В1едо, СА (1990), апб А. 81агоп е! а1., Абуапсез М1кгоЪю1., 2008, 47, 2, 1983-1995).

В качестве векторов экспрессии для введения и репликации последовательностей ДНК в клетках- 13 023005 хозяевах можно использовать космиды, плазмиды или модифицированные вирусы. Обычно плазмиды применяются в качестве векторов экспрессии. Подходящие плазмиды хорошо известны и доступны на коммерческой основе.

Вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, и необходимые регуляторные последовательности для транскрипции и трансляции данной кодирующей последовательности, встроенной в соответствующую клетку-хозяина. Выбор регуляторных последовательностей зависит от типа клеток-хозяев и может быть без труда осуществлен специалистом в данной области. Примерами таких регуляторных последовательностей являются транскрипционный протомер и энхансер или последовательность связывания РНКполимеразы, последовательность связывания рибосом, содержащая сигнал инициации транскрипции, встроенный перед кодирующей последовательностью, и последовательность терминации транскрипции, встроенная после кодирующей последовательности. Более того, в зависимости от применяемой клеткихозяина и вектора экспрессии другие последовательности могут быть встроены в вектор экспрессии, такие как ориджин репликации, дополнительные сайты рестрикции ДНК, энхансеры и последовательности, обеспечивающие индукцию транскрипции.

Вектор экспрессии также будет содержать последовательность гена-маркера, который наделяет определенным фенотипом трансформированную клетку и делает возможной специфическую селекцию трансформированных клеток. Кроме того, вектор может также содержать вторую маркерную последовательность, которая обеспечивает отличие клеток, трансформированных рекомбинантной плазмидой, содержащей встроенную кодирующую последовательность белка-мишени, от тех клеток, которые поглотили плазмиду без вставки. Чаще всего используют характерные маркеры устойчивости к антибиотикам, однако могут быть использованы любые другие репортерные гены, известные в данной области, чье присутствие в клетке (ίη νίνο) может быть без труда определено с использованием технологий авторадиографии, спектрометрии или био- и хемилюминесценции. Например, в зависимости от клетки-хозяина могут быть использованы такие репортерные гены, как ген β-галактозидазы, β-глюкуронидазы, люциферазы, хлорамфеникол ацетилтрансферазы или зеленого флуоресцентного белка.

Кроме того, вектор экспрессии может содержать сигнальную последовательность, транспортирующую белки в соответствующий клеточный компартмент, например периплазму, где сворачивание облегчено. Дополнительно, может присутствовать последовательность, кодирующая маркер/метку, такую как ШкТад, присоединенная к Ν-концу, или СЗТ, присоединенная к С-концу, которая облегчает последующую очистку полученного белка, с использованием принципа аффинности, с помощью аффинной хроматографии на никелевой колонке. Также могут присутствовать дополнительные последовательности, которые защищают белок от протеолитической деградации в клетках-хозяевах, а так же последовательности, которые повышают его растворимость.

Вспомогательный элемент, прикрепленный к последовательности белка-мишени, может блокировать его активность, или быть вредным по другой причине, например вследствие токсичности. Такой элемент должен быть удален, что может быть осуществлено посредством ферментативного или химического расщепления.

В частности, шестигистидиновая метка ШкТад, или другие маркеры такого типа, прикрепленные для обеспечения очистки белка путем аффинной хроматографии, должны быть удалены по причине описанного эффекта растворимого белка ТКАТЬ на печеночную токсичность.

Можно использовать гетерологичные экспрессирующие системы, основанные на различных хорошо известных клетках-хозяевах, включающие прокариотические клетки: бактериальные, такие как ЕксЬепсЫа сой или ВасШик киЪЬЬк, дрожжевые, такие как ЗассЬаготусек сеМыае или Р1сЫа рак1опк, эукариотические клеточные линии (насекомых, млекопитающих, растений).

Предпочтительно использовать экспрессирующую систему Е. сой в связи с простотой культивирования и генетического манипулирования с ней и большого количества получаемого продукта. Соответственно полинуклеотидная последовательность, содержащая мишеневую последовательность, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, будет оптимизирована для экспрессии в Е. сой, а именно она будет содержать в кодирующей последовательности кодоны, оптимальные для экспрессии в Е. соЬ, выбранные из возможных вариантов последовательностей, известных в данной области. Кроме того, вектор экспрессии будет содержать вышеописанные элементы, подходящие для Е. сой, прикрепленные к данной кодирующей последовательности.

Соответственно предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, полинуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок по настоящему изобретению, оптимизированную для экспрессии в Е. сой, выбран из группы полинуклеотидных последовательностей, состоящей из 8ЕЦ ГО N0:67, 8ЕЦ ГО N0:68, 8ЕЦ ГО N0:69, 8ЕЦ ГО N0:70, 8ЕЦ ГО N0:71, 8ЕЦ ГО N0:72, ЗЕО ГО N0:73, 8ЕЦ ГО N0:74, 8ЕЦ ГО N0:75, 8ЕЦ ГО N0:76, 8ЕЦ ГО N0:77, 8ЕЦ ГО N0:78, 8ЕЦ ГО N0:79, 8ЕЦ ГО N0:80, 8ЕЦ ГО N0:81, 8ЕЦ ГО N0:82, 8ЕЦ ГО N0:83, 8ЕЦ ГО N0:84, 8ЕЦ ГО N0:85, 8ЕЦ ГО N0:86, 8ЕЦ ГО N0:87, 8ЕЦ ГО N0:88, 8ЕЦ ГО N0:89, 8ЕЦ ГО N0:90, 8ЕЦ ГО N0:91, 8ЕЦ ГО N0:92, 8ЕЦ ГО N0:122, 8ЕЦ ГО N0:123, 8ЕЦ ГО N0:124, 8ЕЦ ГО N0:125, 8ЕЦ ГО N0:126, 8ЕЦ ГО N0:127, 8ЕЦ ГО N0:128, 8ЕЦ ГО N0:129, 8ЕЦ ГО N0:130, 8ЕЦ ГО N0:131, 8ЕЦ ГО

- 14 023005

ΝΟ:132, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:133, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:134, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:135, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:136, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:137, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:138, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:139, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:140, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:141, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:142, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:143, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:144, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:145, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:146, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:147; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:148, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:149 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:150; которая кодирует слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей аминокислотные последовательности соответственно: 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:1, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:3, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:4, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:5, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:6, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:7, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:8, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:9, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:10, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:11, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:12, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:13, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:14, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:15, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:16, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:17, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:18, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:19, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:20, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:21, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:22, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:23, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:24, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:25, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:26, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:93, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:94, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:95, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:96, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:97, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:98, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:99, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:100, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:101, 8ЕЦ ΙΌ

ΝΟ:102, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:103, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:104, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:105, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:106, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:107, 8ЕЦ ΙΌ

ΝΟ:108, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:109, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:110, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:111, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:112, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:113, 8ЕЦ ΙΌ

ΝΟ:114, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:115, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:116, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:117 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:118, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:119, 8ЕЦ ΙΌ

ΝΟ:120 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:121.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, подходящему для трансформации Е. сой. содержащему полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы полинуклеотидных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:67 - 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:92 и 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 122 - 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:150, указанных выше, а также клетки Е. сой трансформированы с использованием такого вектора экспрессии.

Трансформацию, то есть внедрение последовательности ДНК в бактериальные клетки-хозяева, в частности Е. соН, обычно осуществляют в компетентных клетках, подготовленных для поглощения ДНК, например, посредством обработки ионами кальция при низкой температуре (4°С), и затем подвергающихся хит-шоку (при 37-42°С), или посредством электропорации. Такие способы хорошо известны и обычно определены производителем данной экспрессирующей системы.

Процедура сверхэкспрессии слитых белков по настоящему изобретению в экспрессионной системе Е. сой будет дополнительно описана ниже.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую слитый белок по настоящему изобретению, как определено выше, в качестве активного вещества, и подходящий фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и стандартные дополнительные компоненты.

Данная фармацевтическая композиция будет содержать эффективное количество слитого белка по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемые дополнительные компоненты, растворенные или диспергированные в носителе или разбавителе, и предпочтительно будет в форме фармацевтической композиции, сформулированной в виде стандартной лекарственной формы или композиции, содержащей многократные дозы.

Фармацевтические препараты и способы их приготовления, так же как и другие компоненты, носители и разбавители, известны специалисту в данной области и описаны в литературе (см., например, в монографии РснйпдЮпХ РЬаттасеийса1 Заепсек, еб. 20, 2000, Маск РиЫЫйпд Сотрапу, ЕаЧои И8А).

Термины фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и дополнительный ингредиент включают любые растворители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, стабилизаторы, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические средства, известные в данной области. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать различные типы носителей, разбавителей и инертных наполнителей в зависимости от выбранного пути введения и необходимой лекарственной формы, такой как жидкость, твердые и аэрозольные формы для перорального, парентерального, ингаляционного, местного применения, и того, должна ли эта лекарственная форма быть стерильной для пути введения, такого как инъекция.

Предпочтительным путем введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению является парентеральный, в том числе такие пути инъекции, как внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутриопухолевый, или путем единичного или продолжительного внутривенного вливания.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена путем инъекции непосредственно в опухоль. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена внутривенно. В еще одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена подкожно или внутрибрюшинно.

Фармацевтическая композиция для парентерального введения может представлять собой раствор или дисперсию в фармацевтически приемлемой водной или неводной среде, забуференный до соответствующего значения рН и изоосмотическую с жидкостями организма, если необходимо, и также может содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворимые вещества, которые делают композицию совместимой с тканями или кровью реципиента. Другими компонентами, которые могут быть включены в данную композицию, являются, например, вода, спирты, такие как этанол, полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль, липиды, такие как триглицериды, растительные масла, липосомы. Соответствующая текучесть и размер частиц данного вещества

- 15 023005 могут быть обеспечены посредством покрывающих веществ, таких как лецитин, и поверхностноактивных веществ, таких как полисорбаты гидроксипропилцеллюлозы, и тому подобного. Подходящими изотонирующими веществами для жидких парентеральных композиций являются, например, сахара, такие как глюкоза, и хлорид натрия, и их сочетания.

Альтернативно, данная фармацевтическая композиция, предназначенная для введения посредством инъекции или вливания, может быть в порошкообразной форме, такой как, например, лиофилизированный порошок для разведения непосредственно перед использованием в соответствующем носителе, таком как, например, стерильная апирогенная вода.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, предназначенная для парентерального введения, также может иметь форму для назального применения, в том числе, растворы, спреи или аэрозоли. Предпочтительно данная форма, предназначенная для назального применения, будет представлять собой водный раствор и будет изотоничной или забуференной с поддержанием значения рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,5, с тем, чтобы поддерживать характеристики, аналогичные назальной секреции. Более того, она будет содержать консерванты или стабилизаторы, например, как в хорошо известных интраназальных препаратах.

Данная композиция может содержать различные антиоксиданты, которые замедляют окисление одного или нескольких компонентов. Кроме того, с целью предотвращения действия микроорганизмов композиция может содержать различные антибактериальные и противогрибковые средства, в том числе, например, но ими не ограничиваясь, парабены, хлорбутанол, тимеросал, сорбиновая кислота, и аналогичные известные вещества этого типа.

В основном, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать, например, по меньшей мере приблизительно 0,01 мас.% активного вещества. Более конкретно, композиция может содержать данное активное вещество в количестве приблизительно от 1 до 75 мас.% данной композиционной единицы, или, например, от 25 до 60 мас.%, но без ограничения указанными значениями.

Фактическая величина дозы композиции в соответствии с настоящим изобретением, вводимой пациентам, в том числе человеку, будет определена с учетом физических и физиологических факторов, таких как масса тела, тяжесть состояния, тип заболевания, подвергающегося лечению, предшествующие или сопутствующие терапевтические мероприятия, конкретный пациент и путь введения. Подходящая однократная доза, общая доза и концентрация активного вещества в данной композиции должны быть определены лечащим врачом.

Данная композиция, например, может быть введена в дозе от приблизительно 1 мг/кг массы тела до приблизительно 1000 мг/кг массы тела пациента, например, в диапазоне от 5 до 100 мг/кг массы тела или в диапазоне от 5 до 500 мг/кг массы тела.

Слитый белок и содержащая его композиция проявляет противораковую или противоопухолевую активность и может применяться при лечении онкологических заболеваний.

Настоящее изобретение также относится к применению слитого белка по настоящему изобретению, как определено выше, для лечения онкологических заболеваний у млекопитающих, в том числе, человека.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения онкологического заболевания у млекопитающих, включая человека, предусматривающему введение в организм индивида, при необходимости, количества, эффективного против злокачественных новообразований, слитого белка по настоящему изобретению, как определено выше, при желании в форме, соответствующей фармацевтической композиции.

Слитый белок по настоящему изобретению можно использовать для лечения гематологических злокачественных новообразований, таких как лейкемия, грануломатоз, миелома и другие гематологические злокачественные новообразования. Слитый белок также можно использовать для лечения солидных опухолей, таких как рак молочной железы, рак легких, в том числе немелкоклеточный рак легких, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак мозга и т.п.

Подходящим путем введения слитого белка при лечении злокачественных новообразований может быть, в особенности, парентеральный путь, который включает введение слитого белка по настоящему изобретению в форме инъекций или вливаний, в данной композиции и в форме, подходящей для данного пути введения.

Настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью последующих общих процедур и примеров специфических слитых белков.

Общие процедуры для сверхэкспрессии слитого белка

Получение плазмиды

Аминокислотную последовательность мишеневого слитого белка использовали в качестве матрицы для создания последовательности ДНК, кодирующей ее, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в ЕксйепсЫа сой. Такая процедура позволяет повысить эффективность следующего этапа синтеза мишеневого белка в ЕксйепсЫа сой.

Полученную нуклеотидную последовательность затем синтезировали автоматически. Кроме того, в

- 16 023005 полученный ген, кодирующий мишеневый белок, были добавлены сайты расщепления для рестрикционных ферментов Ыйе1 (на 5'-конце лидирующей нити) и Х1о1 (на 3'-конце лидирующей нити). Их использовали для клонирования гена в вектор рЕТ28а (Иоуадеп). Их также можно использовать для клонирования гена, кодирующего белок, в другие векторы. У мишеневого белка, экспрессируемого из конструкции, на Ν-конце присутствовала полигистидиновая метка (шесть гистидинов), которой предшествовал участок, распознаваемый тромбином, который, в свою очередь, способствует его очистке путем аффинной хроматографии. Точность полученной конструкции подтверждали сначала посредством рестрикционного анализа изолированных плазмид с использованием ферментов И0е1 и Х1ю1, с последующим автоматическим секвенированием всей рамки считывания мишеневого белка. Праймеры, использованные для секвенирования, были комплементарны последовательностям промотора Т7 (5'-ТААТАСОАСТСАСТАТАОО-3') и терминатора Т7 (5'-ОСТАОТТАТТОСТСАОСОО-3'), представленных в векторе.

Полученную плазмиду использовали для сверхэкспрессии мишеневого слитого белка в коммерческом штамме Е. соЬ, который был трансформирован с учетом рекомендаций изготовителя. Колонии, полученные на селекционной среде (агар ЬВ, канамицин 50 мкг/мл, глюкоза 1%), использовали для подготовки к культивированию в течение ночи в жидкой питательной среде ЬВ, дополненной канамицином (50 мкг/мл) и 1% глюкозой. После приблизительно 15 ч роста в инкубаторе-шейкере данные культуры использовали для инокуляции соответствующей культуры.

Сперхэкспрессия и очистка слитых белков - общая процедура А

Среда ЬВ с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфата цинка была инокулирована культурой, культивированной в течение ночи. Культуру инкубировали при 37°С до достижения значения оптической плотности (ΘΌ) 0,60-0,80 при 600 нм. Затем добавляли 1РТО до конечной концентрации в диапазоне 0,25-1 мМ. После инкубирования (3,5-20 ч) со встряхиванием при 25°С культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 д.

Бактериальные осадки ресуспендировали в буфере, содержащем КН₂РО₄ 50 мМ, ИаС1 0,5 М, имидазол 10 мМ, рН 7,4. Суспензию разрушали с помощью ультразвука на льду в течение 8 мин (амплитуда 40%, импульс 15 с, интервал 10 с). Полученный экстракт очищали от примесей с помощью центрифугирования в течение 40 мин при 20000 д, 4°С. Смола Νί-Сефароза (ОБ НеаЬЬсаге) была предварительно обработана посредством уравновешивания буфером, который использовали для получения экстракта бактериальных клеток. Смолу затем инкубировали в течение ночи при 4°С с супернатантом, полученным после центрифугирования экстракта. Затем нагружали на колонку и отмывали с использованием 15-50 объемов буфера 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М ИаС1, 20 мМ имидазол, рН 7,4. Полученный белок элюировали с колонки, используя имидазольный градиент в буфере 50 мМ КН₂РО₄ с 0,5 М ИаС1, рН 7,4. Полученные фракции анализировали посредством электрофореза в δΌδ-ПТААГ. Соответствующие фракции объединяли и проводили диализ в течение ночи при 4°С против 50 мМ буфера Тг18, рН 7,2, 150 мМ ИаС1, 500 мМ Ь-аргинин, 0,1 мМ 2п§О₄, 0,01% Т\уееп 20, и в то же самое время метку Н181ад отщепляли с помощью тромбина (1:50). После отщепления тромбин отделяли от мишеневого слитого белка, используя смолу Веп/апиФпе §ерЬаго8е™. Чистоту данного продукта анализировали посредством электрофореза в δΌδ-ПААГ (МашаШ е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд. СоИ 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1982).

Сперхэкспрессия и очистка слитых белков - общая процедура В

Среда ЬВ с канамицином (30 мкг/мл) и 100 мкМ сульфата цинка была инокулирована культурой, культивированной в течение ночи. Культуры инкубировали при 37°С до достижения значения оптической плотности (ОЬ) 0,60-0,80 при 600 нм. Затем добавляли 1РТО до конечной концентрации в диапазоне 0,5-1 мМ. После 20 ч инкубирования со встряхиванием при 25 °С данную культуру центрифугировали в течение 25 мин при 6000 д.

Бактериальные клетки после сверхэкспрессии были разрушены при помощи Френч-пресса в буфере, содержащем 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М ИаС1, 10 мМ имидазола, 5 мМ бета-меркаптоэтанола, 0,5 мМ РМ8Р (фенилметилсульфонилфторид), рН 7,8. Полученный экстракт очищали от примесей посредством центрифугирования в течение 50 мин при 8000 д. Смолу Νί-Сефароза инкубировали в течение ночи с полученным супернатантом. Затем смолу с присоединенным белком загружали в хроматографическую колонку. Для вымывания фракций, содержащих несвязанные белки, данную колонку отмывали с использованием 15-50 объемов буфера, содержащего 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М ИаС1, 10 мМ имидазола, 5 мМ бетамеркаптоэтанола, 0,5 мМ РМ8Р (фенилметилсульфонил фторид), рН 7,8. Затем для вымывания большинства белков, специфически связанных с носителем, колонку отмывали с помощью буфера, содержащего 50 мМ КН₂РО₄, 0,5 М ИаС1, 500 мМ имидазола, 10% глицерина, 0,5 мМ РМ8Р, рН 7,5.

Полученные фракции анализировали посредством электрофореза в δΌδ-ПААГ (МашаЬ8 е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд. СоИ 5рг1пд НагЬог, ΝΥ, 1982). Фракции, содержащие мишеневый белок, объединяли и расщепляли тромбином (1 Ед на 4 мг белка, 8 ч при 16°С) для удаления полигистидиновой метки. Затем проводили диализ фракций против буферной смеси (500 мМ Ь-аргинина, 50 мМ Тг18, 2,5 мМ 2^О₄, рН 7,4).

- 17 023005

Определение характеристик слитых белков посредством двухмерного (2-Ό) электрофореза

Для получения дополнительных характеристик полученных белков и для выбора точных хроматографических условий были определены изоэлектрические точки белков. С этой целью использовали способ двухмерного (2-Ό) электрофореза в два этапа в соответствии со следующей схемой.

Этап 1. Изоэлектрофокусирование белков в градиенте рН и денатурирующих условиях.

Препараты белков в концентрациях 1-2 мг/мл осаждали посредством смешивания в соотношении

1:1 с осаждающим раствором, содержащим 10% трихлоруксусную кислоту и 0,07% бета-меркаптоэтанол в ацетоне. Данную смесь инкубировали в течение 30 мин при -20°С, а затем центрифугировали в течение 25 мин при 15000 д и 4°С. Супернатант удаляли и полученный осадок отмывали два раза с помощью холодного ацетона с 0,07% бета-меркаптоэтанолом. Затем остатки ацетона испаряли до отсутствия обнаруживаемого запаха. Белковый осадок суспендировали в 250 мл регидратационного буфера, содержащего 8 М мочевину, 1% СНАР8, 15 мМ ЭТТ, 0,5% амфолита (ОЕ НеаИЬсаге) с профилем значений рН 3-11 или 6-11, в зависимости от используемого в дальнейшем стрипа. Белковый раствор помещали в керамическую камеру для изоэлектрофокусирования с последующим 13 см Пгу81пр (ОЕ НеаИйсаге) с соответствующим профилем (3-11 или 6-11). Все было покрыто слоем минерального масла. Все камеры были помещены в аппарат Ейап 1РОрйог III, в котором проводили изоэлектрофокусирование в соответствии со следующей программой, предназначенной для размеров данного стрипа и данного профиля рН: 16 ч дегидрирования при 20°С.

Фокусирование в электрическом поле при фиксированном градиенте рН

Время	Напряжение
1 ч	500 V
1 ч	градиент 500-1000 V
2 ч 30 мин	градиент 1000-8000 V
30 мин	8000 V

Затем данный стрип, содержащий сконцентрированные белки, отмывали в течение 1 мин в деионизированной воде, окрашивали с помощью кумасси бриллиантового и затем обесцвечивали и архивировали в виде изображения для маркировки положения белков. Обесцвеченный стрип уравновешивали 2 х 15 мин с помощью буфера со следующим составом: 50 мМ Тпв-НС1 рН 8,8, 6 М мочевина, 1% ЭТТ, 2% 8Ό8, 30% глицерин.

Этап 2. Разделение во втором направлении посредством 8Э8-ПААГ.

Данный стрип помещали на 12,5% полиакриламидный гель, содержащий одну лунку на стандартный размер, и затем разделение осуществляли в аппарате для 8Э8-ПААГ, при напряжении 200 V в течение 3 ч. Гель окрашивали с использованием кумасси бриллиантового, затем архивировали с использованием применяемой шкалы. Белки были идентифицированы посредством определения их веса, исходя из стандарта размеров, и их 1Р1 была прочитана в шкале 6-11, на основании кривых, предоставленных изготовителем (ОЕ НеаИйсаге) (соотношение рН к % длины стрипа от конца, обозначенного как анод) или в шкале 3-11, на основании кривой, полученной экспериментально с помощью калибровочного набора для изоэлектрофокусирования (ОЕ НеаИЬсаге).

Характерные примеры слитых белков по настоящему изобретению описаны ниже.

Пример 1. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:1

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:1 представляет собой слитый белок, имеющий длину 194 аминокислоты и массу 22,7 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен 16-аминокислотный белок, происходящий из домена ВН3 белка Вах (8ЕР ГО N0:30). На С-конце данной 16-аминокислотной последовательности эффекторного пептида прикреплена полиаргининовая последовательность, состоящая из 7 остатков Агд/К. Полиаргининовая последовательность содействует пенетрации клеточной мембраны и транспорту слитого белка внутрь данной клетки. Между полиаргининовой последовательностью и доменом ТКАГО встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые урокиназой иРА (8ЕР ГО N0:52) и металлопротеазой ММР (8ЕР ГО N0:51), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:1 и 8ЕР ГО N0:67, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:1

ККЬЗЕСЬКК1 СОЕЬОЗКККК КНККУУКРЪС ЬАСВЛ/ААН1Т СТКСНЗЫТЬБ 51 3ΡΝ3ΚΝΕΚΑΣ ΟΗΚΙΝ3ΝΕ33 ВЗеНЗЕЬЗЫЬ НЫШСЕЪУ1Н ΕΚ6ΕΥΥΙΥ5Ω 101 ΤΥΕΚΕΟΕΕΙΚ ΕΝΤΚΝΌΚζ)Μν 0ΥΙΥΚΥΤ3ΥΡ РР1ЬЪМКЗАК ЫЗСИЗКБАЕУ 151 СЬУ51У<2СС1 ΕΕΕΚΕΝΏΚΙΓ УЗУТЫЕНЬЮ ΜΌΗΕΑδΓΕΟΑ ЕЬУС

- 18 023005

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:67

ССССАССАСА ААТССАССАА ААААССТССС ТТСАТСАТСС АТАТСААТСА САТСТТСАТТ ССТСАСССТС АСАААААТСС САТСАТТТТС ТТТСАСТТСА

101 ААААТСССАС ССТСАТАААТ ССТАТАСАСС ССАТАТТСТС САТСТТТССТ ССААСАССТА ТТАССТСССС ТТТТСАТСАС САСААТСССА ТССЕ6АТА6С

201 ТССТАТАТТТ АТАААТСТАС ТССАССАТТТ СТТТАТСАТТ ТТТССТАТТТ ТСТТТААТТТ СТТССТСААА СССААААТАС СТСТСССТАТ АААТАТААТА

301 АААСССТТТТ ТСАТ6ААТСА ССАСТТСАСС АТТАСССАСА ТССАСАТТСС ТСАСАААССТ АТСАССССТА ССССТССТТТ СССАССТАТТ ААТТТТСССА

401 СССАССССТТ ТТТСАТТТТТ ССТАТТСССС СТССТСАССС ТАТТССТАСС АССАССССТС ССССТААТАТ СТССТССААС АССАССТССС АСАСССАССС

501 САССААСААС АССАССАССС ССАССАССАС САССССТАТС САСТТСАТСА

ССААТАССТТ ТСАСССАТТС ССТСАСТТТТ ТТ

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы Е. сой ВЙ21 (ОЕ3) и 'Гипек (ОЕ3) рйу88, оба приобретены в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 2. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:2

Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:2 представляет собой белок, имеющий длину 193 аминокислоты и массу 22,5 кДа, в котором на Оконце последовательности ΤΕΛΙΕ^^ 81 в качестве эффекторного пептида прикреплен 16-аминокислотный пептид, происходящий из белка В1б (8ЕР ГО N0:31). Дополнительно, к С-концу эффекторного белка прикреплена полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Агд. Полиаргининовая последовательность содействует пенетрации клеточной мембраны и транспорту слитого белка внутрь клетки. Между полиаргининовой последовательностью и последовательностью ΤКΑI^ встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (8ЕР ГО N0:51) и урокиназой иРА (8ЕР ГО N0:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:2 и 8ЕР ГО N0:68, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:2

ΡΝΙΑΡΗΓ,ΆΟν СОЗМОККРКВ НКВУУКРЪСЬ АСКУААН1ТС ΤΒ.ΘΡ5ΝΤΕ33

ΡΝ3ΚΝΕΚΑΙΌ ΡΚΙΝ3ΜΕ33Ρ ЗСНЗЕЬЗЫЪН ЫШСЕЪУШЕ ΚΕΕΥΥΙΥ30Τ 101 ΥΕΡΕβΕΕΙΚΕ ΝΤΚΝϋΚΟΜνΟ ΥΙΥΚΥΤ3ΥΡβ РТЪЬМКЗАРЫ ЗСИЗКОАЕУС 151 ΕΥ3ΙΥ0ΕΕΙΕ ΕΕΚΕΝΌΡΙΒΎ ЗУТЫЕНЬЮМ ΌΗΕΑ3ΕΕΕΑΕ ЬУС

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:68

1	ССТААТАТТС	САССТСАТСТ	СССАСАССТТ	ССТСАТАССА	ТССАСССТСС
	ТССТССТССС	сстсстсстс	ттеттсстсс сстесстстс ссасстсстс
101	ТТССАССАСА	ТАТТАССССС	АССССТССТС	СТАССААТАС	ССТСАССАСС
	СССААТАССА	ААААТСАААА	АССССТСССТ СССААААТТА АТАССТСССА
201	ААССАСССОТ	АССССТСАТА	ССТТТСТСАС	СААТСТССАТ	стссетААте
	СТСААСТССТ	САТТСАТСАА	АААСССТТТТ АТТАТАТТТА ТАСССАСАСС
301	ТАТТТТСССТ	ТТСАССААСА	ААТТАААСАА	ААТАССАААА	АТСАТАААСА
	ААТООТССАС	ТАСАТТТАТА	ААТАТАССАС СТАТССССАТ СССАТТСТСС
401	ТСАТСААААС	СССАССТААТ	АССТСТТССА	ССАААСАТСС	АСААТАТССС
	СТСТАТАССА	ТТТАТСАССС	ТСССАТТТТТ СААСТСАААС ААААТСАТСС
501	сатттттстс	АСССТСАССА	АТСААСАТСТ	САТ Т САТ АТ С	САТСАТСААС
	ССАССТТТТТ	ТССТССАТТТ	СТССТСССС

Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой ВЙ21 (ЭЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 3. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:3

Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:3 представляет собой белок, имеющий длину 303 аминокислоты и массу 34,2 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤКΑI^121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен гомолог рибонуклеазы К№8е А (8ЕР ГО N0:32). Между полиаргининовой последовательностью и последовательностью ΤКΑI^ встроены последовательно друг за другом

- 19 023005 последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (БЕр ГО N0:51) и урокиназой иРА (БЕр ГО N0:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении.

Белок также содержит между последовательностью домена ТНАГО и последовательностью участков расщепления гибкий глицин-сериновый линкер ССБС (БЕр ГО N0:57). Более того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность КЕБЬ (БЕр ГО N0:56), нацеленную на эндоплазматический ретикулум, будучи также С-концевой областью всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями БЕр ГО N0:3 и БЕр ГО N0:69, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность БЕр ГО N0:3

КУААН1ТСТК СКЗЫТЪЗЗРЦ ЗКЫЕКАЬСКК ΙΝ3ΜΕ33Κ3Θ НЗЕЬЗЫЬНЬК 51 ЦСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ5<2ΤΥΕ ΚΕζ)ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚ<2Μν<2ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡϋΡΙ 101 ЬЬМКЗАКЫЗС ИЗКРАЕУеЬУ 51У<2СС1ЕЕЬ ΚΕΝϋΕΙΡΎΕν ΤΝΕΗΣΙϋΜΟΗ 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ СССЗСРЬСЬА СКУУККЕТАА ΑΚΕΕΚζ)ΗΜϋ3 3Τ3ΑΑ333ΝΥ 201 0Ν0ΜΜΚ3ΚΝΕ ΤΚϋΕΟΚΡνΝΤ ЕУНЕЗЬАЕУО АУСЗОКЫУАС ΚΝΟ<2ΤΝΟΥ05 251 Υ3ΤΜ3ΙΤΌ0Ρ ЕТСЗЗКУРЬГС ΑΥΚΤΤ<2ΑΝΚΗ ЫУАСЕСЫРУ УРУНГОАЗУК 301 Εϋΐι

Последовательность ДНК БЕр ГО N0:69

ССТСТТССАС САСАТАТТАС ССССАССССТ ССТССТАССА АТАСССТСАС

САСССССААТ АССАААААТС АААААССССТ СССТСССААА АТТААТАССТ

101 СССАААССАС СССТАССССТ САТАССТТТС ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ ААТССТСААС ТССТСАТТСА ТСАААААССС ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА

201 САССТАТТТТ СССТТТСАСС ААСАААТТАА АСААААТАСС АААААТСАСА ААСАААТССТ ССАСТАТАТС ТАСАААТАСА ССАССТАТСС ССАТСССАТТ

301 СТССТСАТСА АААССССАСС ТААТАССТСТ ТССАССАААС АТССАСААТА ТССССТСТАТ АССАТТТАТС АСССТСССАТ ТТТТСААСТС АААСААААТС

401 АТСССАТТТТ ТСТСАСССТС АССААТСААС АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ СААСССАССТ ТТТТТССТСС АТТТСТССТТ ССТССТССТА ССССТССССТ

501 ссстстссса сстсстсттс ттсстаааса аассссасса сссааатттс ААССТСАССА САТССАТАСС АССАССАССС САССААССАС САССААТТАТ

601 ТССААТСАСА ТСАТСААААС ССССААТСТС АССАААСАТС СТТСТАААСС

ССТСААТАСС ТТТСТТСАТС АААСССТССС АСАТСТТСАС ССАСТТТССА

701 СССАСААААА ТСТССССТСТ АААААТССТС АСАССААТТС СТАТСАСАСС ТАТАССАССА ТСАССАТТАС ССАТТСТССТ САААССССТА ССАССАААТА

801 ТСССААТТСС СССТАТАААА ССАСССАССС СААТАААСАТ АТТАТТСТСС

ССТСТСААСС СААТСССТАТ СТТССССТТС АТТТТСАТСС САСССТСААА

901 СААСАТСТС

Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штамм Е. сой ВЙ21 (БЕ3), приобретенный в ^уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 4. Слитый белок с последовательностью БЕр ГО N0:4

Белок с последовательностью БЕр ГО N0:4 представляет собой слитый белок, имеющий длину 293 аминокислоты и массу 33,2 кДа, в котором на С-конце последовательности ТНАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен гомолог рибонуклеазы НШке А (БЕр ГО N0:32). Между эффекторным пептидом и последовательностью ТНАГО присутствует гибкий глицин-сериновый линкер ОССБОСОБ (БЕр ГО N0:63).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями БЕр ГО N0:4 и БЕр ГО N0:70, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность БЕр ГО N0:4

ЕУААН1ТСТЕ СКЗЫТЬЗЗРЫ ЗКЫЕКАЬСКК 1Ы5ГОЕ55К5С НЗЕЬЗЫЬНЬК 51 ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ3ΏΤΥΕ ΚΕζ)ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝΟΚΟΜνβΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΌΡΙ 101 ЬЬМКЗАКЫЗС ЮЗКОАЕУСЬУ 31У0СС1ЕЕЬ КЕЫОРЛЕУЗУ ТЫЕНЫШОН

151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ ССССЗСССЗК ΕΤΑΑΑΚΕΕΚ,ζ) НМБЗЗТЗААЗ 53ΝΥ0ΝςΜΜΚ 201 ЗКЫЬТКБЕСК РУЫТЕУНЕЗЬ АБУ<2АУС50К ΝνΑ0ΚΝ0ζ)ΤΝ 0ΥΩ3Υ3ΤΜ3Ι 251 ТБСЕЕТСЗЗК ΥΡΝΟΑΥΚΤΤΟ АЛКНЫУАСЕ СЫРУУРУНЕБ АЗУ

- 20 023005

Последовательность ДНК 8ЕС) Ιϋ N0:70

САСССССААТ АССАААААТС АААААССАСТ СССТСССААА АТТААТАССТ

101 СССАААССАС СССТАССССТ САТАССТТТС ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ

ААТССТСААС ТССТСАТТСА ТСАААААССС ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА

201 САССТАТТТТ СССТТТСААС ААСАААТТАА АСААААТАСС АААААТСАТА

АССАСАТССТ ССАСТАТАТС ТАТАААТАТА ССАССТАТСС ССАТСССАТТ

301 СТССТСАТСА АААССССАСС ТААТАССТСТ ТССАССАААС АТССАСААТА

ТССТСТСТАТ АССАТТТАТС АСССТСССАТ ТТТТСААСТС АААСААААТС

401 АТСССАТТТТ ТСТСАСССТС АССААТСААС АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ

СААСССАССТ ТТТТТССТСС АТТТСТССТТ ССТССТССТС СТАССССТСС

501 ТССТАСТААА САААССССАС САССААААТТ ТСААССТСАС САСАТССАТА

ССАССАССАС СССАССААСС АССАССААТТ АТТСТААТСА САТСАТСААА

601 АСССССААТС ТСАССАААСА ТССТТСТААА ССССТСААТА ССТТТСТТСА

ТСАААСССТС ССАСАТСТТС АСССАСТТТС ТАСССАСААА ААТСТТСССТ

701 СТАААААТСС ТСАСАССААТ ТССТАТСАСА ССТАТАССАС САТСАССАТТ

АСССАТТСТС СТСАААСССС ТАССАССААА ТАТСССААТТ СТССАТАТАА

801 ААССАСССАС СССААТАААС АТАТТАТТСТ ТСССТСТСАА СССААТСССТ

АТСТТССССТ ТСАТТТТСАТ ССААСССТТ

Аминокислотную последовательность структуры, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. соН ВЕ2ГОЕ3р1лъ8К1Е. приобретенный в 81га1адепе, и Тигпег (ΌΕ3), приобретенный в Шуауеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 5. Слитый белок с последовательностью 8Ер ГО N0:5

Белок с последовательностью 8Ер ГО N0:5 представляет собой слитый белок, имеющий длину 283 аминокислоты и массу 31 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКА1Ы21-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность цитохрома С (8ЕО ГО N0:33). Между последовательностью домена ТКАГО и последовательностью эффекторного белка встроены последовательно друг за другом последовательности, распознаваемые металлопротеазой ММР (8Ер ГО N0:51) и урокиназой иРА (8Ер ГО N0:52), вследствие чего эффекторный пептид после интернализации слитого белка будет отщеплен в опухолевом окружении. Белок также содержит между последовательностью домена ТКАГО и последовательностью участков расщепления гибкий глицин-сериновый линкер СС8С (8Ер ГО N0:57). Более того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность КЕЭЬ (8Е0 ГО N0:56), нацеленную на эндоплазматический ретикулум, будучи также С-концевой областью всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 1 и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Ер ГО N0:5 и 8Ер ГО N0:71, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Ер ГО N0:5

КУААН1ТСТК СКЗИТЬЗЗРЫ ЗКЫЕКАЪСРК ΙΝ5ν?Ε35Ρ3Θ НЗЕЬЗЫЬНЬК 51 ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ50ΤΥΕ ΚΕζ)ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚ<2Μν0ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΏΡΙ 101 ЬЬМКЗАРЫЗС Ν5ΚϋΑΕΥ0ΣΥ 3ΙΥ<266ΙΕΕΕ КЕЫРР1ЕУЗУ ТЫЕНЫРМРН 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ СССЗСРЬСЬА СРУУРСРУЕК СКК1Е1МКСЗ ОСНТУЕКССК 201 НКТСРЫЬНСЬ ГСККТСОАРС Υ3ΥΤΑΑΝΚΝΚ СИКСЕРТЬМ ΕΥΣΕΝΡΚΚΥΙ 251 РСТКМ1ЕУС1 КККЕЕРАРЫ ΑΥΕΚΚΑΤΝΕΚ ЕЭЬ

Последовательность ДНК 8Ер ГО N0:71

САСАТСТТСТ ТТТТСАТТСС ТСССТТТТТТ САСАТАСССА АТСАСАТСТС ССССТТСТТС ТТТТТТТТТА АТССССАСАА АААТСАТТТТ ССТАСССССА

101 АТАТАТТТТТ ТСССАТТТТС САСАТАТТСС АТСАСССТАТ СТТСАССССА ААТААТОССТ ТТСТТТТТАТ ТСССТССССТ АТАССТАТАА СССССТСССТ

201 САССССТТТТ АССАССАААС АСАССАТССА САТТСССАСС ССТТТТАТСТ ТТСССАССТТ ТТТСААСССТ АТСАСАСТСС СТССАТТТСА ТААТАААААТ

301 ТТТТТТСССТ ТТТТССАСАТ САССАССААС ААСАССАССТ СССАСАСССА

ССССАССССТ АССАССАССА АССАСАААТС САССАААААА ССТСССТТСА

01 ТСАТССАТАТ СААТСАСАТС ТТСАТТСОТС АСССТСАСАА АААТСССАТС

АТТТТСТТТС АСТТСААААА ТСССАСССТС АТАААТССТА ТАСАССССАТ

501 АТТСТССАТС ТТТССТССАА САССТАТТАС СТССССТТТТ САТСАССАСА

АТСССАТССС САТАССТССТ АТАТТТАТАА АТСТАСТССА ССАТТТСТТТ

601 АТССТТТТТС СТАТТТТСТТ ТААТТТСТТС СТСАААСССА АААТАССТСТ

СССТАТАААТ АТААТААААС ССТТТТТСАТ СААТСАССАС ТТСАССАТТА

701 СССАСАТССА САТТССТСАС АААССТАТСА ССССТАСССС ТССТТТСССА

ССТАТТААТТ ТТСССАСССА ССССТТТТТС АТТТТТССТА ТТСССССТСС

801 ТСАСССТАТТ ССТАССАССА ССССТССССС ТААТАТСТСС ТССААСАССС

АТ

Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы

- 21 023005 для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше.

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Τητ^γ (ОЕ3), приобретенный в М)уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 6. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:6

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:6 представляет собой слитый белок, имеющий длину 407 аминокислоты и массу 45,2 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤΚΑГ^121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность цитохрома С (8ЕР ГО N0:33). Между последовательностью домена ΤΚΑГ^ и последовательностью эффекторного белка присутствует последовательность, распознаваемая фурином (8ЕР ГО N0:53), и домен транслокации из РзеиФотоиаз аегидтоза (8ЕР ГО N0:54). Белок также содержит гибкие линкеры: между последовательностью ΤРΑГ^ и последовательностью участка расщепления, распознаваемого фурином, присутствует гибкий глицин-сериновый линкер ООО8 (8ЕР ГО N0:58), между последовательностью участка расщепления, распознаваемого фурином, и транслокационным доменом из РзеиФотоиаз аегидтоза присутствует гибкий серин-глициновый линкер А8ОО (8ЕР ГО N0:65) и между последовательностью транслокационного домена и последовательностью цитохрома С присутствует гибкий глицин-сериновый линкер ООО8ООО (8ЕР ГО N0:62). Кроме того, на С-конце домена эффекторного пептида белок содержит последовательность ΚΙ-ГОЕ (8ЕР ГО N0:56), направленную на эндоплазматический ретикулум, которая представляет собой С-концевую область всей целой конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:6 и 8ЕР ГО N0:72, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:6

ЕУААН1ТСТЕ СЕЗИТЬЗЗРЫ ЗККЕКАЬСЕК ΙΝ3№Ε33Ε33 НЗЕЪЗЫЬНЬЕ 51 ЫСЕЬУТНЕКС ΕΥΥΙΥ5£>ΤΥΕ ΕΕζΙΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚΟΜΥΟΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡϋΡΙ

101	ЪЬМКЗАЕИЗС	Μ5ΚϋΑΕΥ0ΣΥ	ΒΙΥΟΟΟΙΕΕΣ	ΚΕΝϋΒΙΕΥβν	ΤΝΕΗΣΙΌΜΌΗ
151	ЕАЗЕЕСАЕЬУ	ССССЗЕККЕА	ЗССРЕССЗЪА	АЬТАН<2АСНЪ	РЪЕТЕТЕНЕО
201	РКСМЕ(2ЬЕ<2С	СУРУОЕЬУАЬ	УЬААЕЬ5ЮИ<2	νΟΩνίΑΝΑΙΑ.	ЗРСЗССОЪСЕ
251	ΑΙΕΕ3ΡΕ0ΑΚ	ЪАЪТЪАААЕЗ	ЕЕЕУЕОСТСИ	ЕЕАСААЫСРА	ОСССЗСССМС
301	ϋνΕΚΟΚΚΙΕΙ	МКС5<2СНТУЕ	КССКНКТСРЫ	ЪНСЪЕСЕКТС	ζ)ΑΡΟΥ5ΥΤΑΑ
351	ΝΚΝΚΟΙΙΜΟΕ	ΟΙΈΜΕΥΣΕΝΡ	ΚΚΥΙΡΟΤΚΜΙ	ЕУС1КККЕЕЕ	ΑϋΙΤΑΥΕΚΚΑ
401	ΤΝΕΚΏΕΙ,

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:72

101 СССАААССАС СССТАССССТ САТА6СТТТС ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ ААТССТСААС ТССТСАТТСА ТСАААААССС ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА

201 САССТАТТТТ СССТТТСААС ААСАААТТАА АСААААТАСС АААААТСАСА ААСАААТССТ ССАСТАТАТС ТАТАААТАТА ССАССТАТСС ССАТСССАТТ

301 СТССТСАТСА АААССССАСС ТААТАССТСТ ТССАССАААС АТССАСААТА ТССТСТСТАТ АССАТТТАТС АСССТСССАТ ТТТТСААСТС АААСААААТС

401 АТСССАТТТТ ТСТСАСССТС АССААТСААС АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ саасссасст тттттсстсс АТТТСТССТТ сстсстсстс СТАССССТАА

501 ААААССТССА АССССТССТС СССААССТСС ТАСССТСССА ССАСТСАССС

САСАТСАССС АТСТСАТСТС ССССТССААА ССТТТАСССС ТСАТССТСАС

601 ССТССТССТТ СССААСАССТ ССААСАСТСТ ССТТАТСССС ТТСАСССТСТ

ССТТССАСТС ТАТСТСССАС САССТСТСАС СТССААТСАС СТТСАТСАСС

701 ТТАТТССААА ТССАСТСССА АСТСССССТА ССССТССТСА ТСТСССТСАА

ССААТТССТС АААСТССССА АСАСССАССТ СТСССАСТСА СССТСССАСС

Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Τητ^γ (ОЕ3), приобретенный в Мзуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 7. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:7

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:7 представляет собой слитый белок, имеющий длину 409 аминокислот и массу 46,1 кДа, в котором на Оконце последовательности ΤРΑГ^114-281 в качестве эф- 22 023005 фекторного пептида прикреплена последовательность гранзима В (8ΕΡ ГО N0:34). Между последовательностью домена ТКАТЬ и последовательностью эффекторного пептида гранзима В присутствует последовательность участка расщепления фурина (8ΕΡ ГО N0:53), дополнительно фланкированная гибкими глицин-сериновыми линкерами СССС8 (8ΕΡ ГО N0:59).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями 8ΕΡ ГО N0:7 и 8ΕΡ ГО N0:73, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ΕΡ ГО N0:7

ΙΙΘΟΗΥΑΚΡΗ 5ΚΡΥΜΑΥΣΜΙ ВДКЗЬККСС СРЫШЭРГУЪ ТААНСГСС551

ΝνΤΙιΟΑΗΝΙΚ ΕΟΕΡΤζ&ΕΙΡ νΚΚΑΙΡΗΡΑΥ ΝΡΚΝΕ5ΝΡΙΜ ЪЬОЪЕЕКАКЕ 101 ТЕАУОРЬРЬР 5ΝΚΑ0νΚΡ00 ТСЗУАСЙГСОТ АРЬСКНЗНТЬ «ЭЕУКМТУОЕЬ 151 ККСЕЗЬЬЕНУ УЬЗТ1ЕЬСУС БРЕ1ККТЗЕК СОЗССРЬУСЧ КУАОСЬУЗУС 201 КЫЫСМРРЕАС ΤΚν33ΕνΗ№Ι ККТМККУССС СЗЕКККСССС 5νΚΕΚ5Ρ<2Ρν 251 ААН1ТСТНСК 3ΝΤΣ33ΡΝ3Κ ЫЕКАЬСКК1Ы ЗИЕЗЗЕЗСНЗ ЕЬ5ЫЬНЫШС 301 ЕЬУ1НЕКСЕУ ΥΙΥ30ΤΥΕΕΕ ζ)ΕΕΙΚΕΝΤΚΝ ϋΚζΜνΟΥΙΥΚ УТЗУРЬР1ЬЬ 351 МКЗАКНЗСКЗ КЬАЕУСЬУ31 У(26С1ЕЕЬКЕ ΝΌΚΙΕν3νΤΝ ЕНЫЬМЬНЕА 401 ЗЕЕСАЕЬУС

Последовательность ДНК 8ΕΡ ГО N0:73

1	ССТСТТССАС	САС АТ АТТ АС	ССССАССССТ	ССТССТАССА	АТАСССТСАС
	САСССССААТ	АССАААААТС	АААААССССТ	СССТССТААА АТТААТАССТ
101	СССАААССАС	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ	ССАТСТСССТ
	ААТССССААС	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА
201	САССТАТТТТ	СССТТТСАСС	ААСАААТТАА	АСААААТАСС	АААААТСАТА
	ААСАААТССТ	ССАСТАТАТС	Т АТ АААТ АТ А	ССАССТАТСС ССАТСССАТТ
301	СТССТСАТСА	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС	АТССССААТА
	ТССТСТСТАТ	АССАТТТАТС	АСССТСССАТ	ТТТТСААСТС АААСААААТС
401	АТСССАТТТТ	ТСТСАСССТС	АССААТСААС	АТСТСАТТСА	ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	ТТТТТССТСС	АТТТСТССТТ	ССТССТССТС СТАССССТАА
501	ААААССТССТ	сстсссестт	СТАТТАТТСС	ТССТСАТСТТ	ССААААСССС
	АТАССССТСС	СТАТАТСССА	ТАТСТСАТСА	ТТТСССАТСА СААААСССТС
601	АААССТТСТС	СТСССТТТСТ	САТТССТСАТ	САТТТТСТТС	ТСАССССАСС
	АСАТТСТТСС	ССТАССАССА	ТТААТСТТАС	ССТСССТССС САТААТАТТА
701	ААСААСАССА	АСССАСССАС	САСТТТАТТС	СССТТАААСС	ТССААТТССС

САТСССССАТ АТААТСССАА АААТТТТАСС ААТСАТАТСА ТССТССТССА 801 ССТССААССТ АААССААААС СТАССССТСС АСТТСАСССС СТСССТСТСС

ССАССААТАА АССАСАССТТ АААСССССТС АСАССТСТАС ССТТССАССТ 901 ТССССТСАСА ССССАССССТ СССТАААСАТ ТСТСАТАССС ТССААСАССТ

ТААААТСАСС СТССААСАСС АТССТАААТС ССАААСССАТ СТСССССАТТ 1001 АТТАТСАТАС САССАТТСАА СТСТСТСТСС СССАТССССА ААТСАААААА

АССАССТТТА ААССТСАТАС СССТССТССС СТССТТТСТА АТАААСТТСС 1101 ССАСССТАТТ СТТАССТАТС СТССТААТАА ТССТАТСССС СССССТССАТ

СТАССАААСТ ТАССАССТТТ СТССАТТССА ТТАААААААС САТСАААССС 1201 ТАТАААСАТС ЛАСТС

Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую данную кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Ε. сой Тигпег (ΌΕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 8. Слитый белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:8

Белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:8 представляет собой слитый белок, имеющий длину 405 аминокислот и массу 45,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО114-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность гранзима В (8ΕΡ ГО N0:34). Между последовательностью домена ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида присутствует последовательность участка расщепления фурина (8ΕΡ ГО N0:53), дополнительно отделенная от последовательностей гранзима В и ТКАГО с помощью гибких глицин-сериновых линкеров ССС8 (8ΕΡ ГО N0:58) и СССС8 (8ΕΡ ГО N0:59) соответственно. Кроме того, на С-конце эффекторного пептида белок содержит последовательность ΚΌΕΕ, направленную на эндоплазматический ретикулум, которая представляет собой Сконцевую область всей цельной конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экс- 23 023005 прессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:8 и 8ЕР ГО N0:74, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:8

ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ30ΤΥΕ ΕΕζΈΕΙΚΕΝΤ ΚΝΟΚΟΜνΟΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡϋΡΙ 101 ЬЪМКЗАКЧЗС ИЗКОАЕУСЬУ 51У<2СС1ЕЕЪ ΚΕΝϋΡΙΕν3ν ΤΝΕΗΣΙΟΜϋΗ 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ СССС5ККККС СССЗИССНУ ΑΚΡΗ5ΚΡΥΜΑ УЬМ1ИР0КЗЬ 201 КРССбЕЫРР ОЕУЬТААНСИ С331ЫУТЬСА ΗΝΙΚΕζ)ΕΡΤζ) ζ)ΕΙΡνΚΡΑΙΡ 251 ΗΡΑΥΝΡΚΝΕ3 ΝϋΙΜΠΟΕΕΚ ΚΑΚΡΤΚΑνζ)Ρ ЬИЬРЗЫКАСУ КРСОТСЗУАС 301 ВДСОТАРЬСКН ЗНТЬОЕУКМТ ν£)ΕΏΕΚ0Ε3ϋ ΕΗΗΥΥϋ3ΤΙΕ ЬСУСРРЕИЖ

351 ТЗЕКСРЗССР ЬУСЧКУА0С1 УЗУСКЫЫСМР РКАСТКУЗЗЕ УН№1ККТМКК 401 УКРЕЬ

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:74

1	ССТСТТССАС	САСАТАТТАС	ССССАССССТ	ССТССТАССА АТАСССТСАС
	САСССССААТ	АССАААААТС	АААААССАСТ	СССТСССААА АТТААТАССТ
101	СССАААССАС	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ
	ААТССТСААС	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА
201	САССТАТТТТ	СССТТТСААС	ААСАААТТАА	АСААААСАСС АААААТСАТА
	ААСАААТССТ	ССАСТАТАТТ	ТАСАААТАТА	ССАССТАТСС ССАТСССАТТ
301	СТССТСАТСА	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС АТССАСААТА
	ТССТСТСТАТ	АССАТТТАТС	АСССТСССАТ	ТТТТСААСТС АААСААААТС
401	АТСССАТТТТ	ТСТСАСССТС	АССААТСААС	АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	тттттсстсс	АТТТСТССТТ	ССТССТССТС СТАССССТАА
501	ААААССТССТ	ССТСССССТА	СТАТТАТТСС	ТССТСАТСТТ ССААААСССС
	АТАССССТСС	СТАТАТСССА	ТАТСТСАТСА	ТТТСССАТСА СААААСССТС
601	АААССТТСТС	стссттттст	САТТССТСАТ	САТТТТСТТС ТСАССССАСС
	АСАТТСТТСС	ССТАССАССА	ТТААТСТТАС	ССТСССТССС САТААТАТТА
701	ААСААСААСА	АСССАСССАС	САСТТТАТТС	СССТТАААСС ТССААТТССС
	САТСССССАТ	АТААТСССАА	АААТТТТАСС	ААТСАТАТТА ТССТССТССА
801	ССТССААССС	АААССААААС	СТАССССТСС	АСТТСАСССС СТСССТСТСС
	ССАССААТАА	АССАСАССТТ	АААСССССТС	АСАССТСТАС ССТТССАССТ
901	ТССССТСАСА	ССССАССССТ	СССТАААСАТ	ТСАСАТАССС ТССААСАССТ
	СААААТСАСС	СТТСААСАСС	АТССТАААТС	ССАААСССАТ СТСССССАТТ
1001	АТТАТСАТАС	САССАТТСАА	стстстстте	СТСАТССССА ААТТАААААА
	АССАССТТТА	ААССССАТАС	ссстсетссе	СТССТТТСТА АТАААСТТСС
1101	АСАСССТАТТ	СТСАССТАТС	СТССТААТАА	ТССТАТСССТ СССССТССАТ
1201	СТАС САЛАС Т ТАТАААСАТС	ТАССАССТТТ ААСТС	СТССАТТССА	ТТАААААААС САТСАААССС

Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше.

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Тигпег (ΌΕ3) рЬуз8, приобретенный в Жтадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 9. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:9

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:9 представляет собой слитый белок, имеющий длину 187 аминокислот и массу 21,9 кДа, в котором на Жконце последовательности ТКАГО121-281 9-аминокислотный пептид, полученный из белка Жп’77 (8ЕР ГО N0:35), прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Агд, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАГЬ присутствует последовательность участков расщепления металлопротеазы ММР (8ЕР ГО N0:51) и урокиназы иРА (8Ер ГО N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:9 и 8ЕР ГО N0:75, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:9

ЕЗЕЗЬНЗЬЬЕ ВЕЕЕЕЕЕУУВ РЬСЬАСЕУАА ΗΙΊΌΤΕ0Ε5Ν ΤΣ33ΡΝ3ΚΝΕ 51 КАЬСЕК1Ы5И ЕЗЗЕЗСНЗЕЬ ЗЫЬНЬЕИСЕЬ У1НЕКСЕУУ1 Υ5<2ΤΥΕΕΕζ)Ε 101 ΕΙΚΕΝΤΚΝϋΚ ΟΜνΰΥΙΥΚΥΤ ЗУРИПЬЬМК 5ΑΚΝ50Ρ\ί5ΚΏ АЕУСЬУ51У<2 151 ΟΟίΙΕΕΙιΚΕΝϋ Е1ЕУЗУТИЕН ЬЮМИНЕАЗГ ЕСАЕЪУС

- 24 023005

Последовательность ДНК: 8ЕР ΙΌ N0:75

ТТТАССССТА СССТССАТАС сстсстссст сстсстсстс сссстсстсс тсттсттсст сссстесстс тсссасстсс тсттссасса сататтассс ιοί ссасссстсс тсстассаат ассстсасса сссссаатас сааааатсаа АААССССТСС СТСССААААТ ТААТАССТСС САААССАССС СТАССССТСА

201 ТАССТТТСТС АССААТСТСС АТСТСССТАА ТССТСААСТС СТСАТТСАТС АААААСССТТ ТТАТТАТАТТ ТАТАСССАСА ССТАТТТТСС СТТТСАССАА

301 САААТТАААС ААААТАССАА АААТСАТААА САААТССТСС АСТАСАТТТА ТАААТАТАСС АССТАТСССС АТСССАТТСТ ССТСАТСААА АССССАССТА

401 АТАССТОТТС САССААА6АТ ССАСААТАТС СССТСТАТАС САТТТАТСАС

ССТСССАТТТ ТТСААСТСАА АСААААТСАТ СССАТТТТТС ТСАСССТСАС

501 СААТСААСАТ СТСАТТСАТА ТССАТСАТСА АСССАССТТТ ТТТССТССАТ

ТТСТССТССС С

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Козейа (ОЕ3), приобретенный в Хоуадсп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 10. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0:10

Белок с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0:10 представляет собой слитый белок, имеющий длину 193 аминокислоты и массу 22,4 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКА1Б121-281 16аминокислотный пептид, содержащий домен ВН3 белка Вак (8ЕР ΙΌ N0:36), прикреплен в качестве эффекторного пептида, проникающая через мембрану полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Агд, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ΕΚΛΙΕ присутствуют последовательности участков расщепления для металлопротеазы ММР (8ЕР ΙΌ N0:51) и урокиназы иРА (8ЕР ΙΌ N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 2, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ΙΌ N0:10 и 8ЕР ΙΌ N0:76, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ΙΌ N0:10

СОУСВОЪАИ СОШЫВКККР. Р.Р.НУУКРЬСЬ АСРУААН1ТС тксвзытъзз 51 ΡΝ3ΚΝΕΚΑΣ3 ΚΚΙΝ3ΜΕ33Κ ЗСНЗЕЪЗИЬН ЫШСЕЬУШЕ Κ3ΕΥΥΙΥ30Τ 101 ΥΕΚΕζ)ΕΕΙΚΕ ΝΤΚΝΌΚΟΜνΟ ΥΙΥΚΥΤ5ΥΡΏ Р1ЬЬМКЗАКЫ ЗСИЗКЭАЕУС

151 1ιΥ5ΙΥ<2ΟΟΙΕ ΕΣΚΕΝϋΗΙΚν ЗУТЫЕНЬЮМ ΌΗΕΑ3ΕΕ3ΑΕ ЬУС

Последовательность ДНК 8ЕР ΙΌ N0:76

1	ССТСАССТТС	стсстсасст	СССААТТАТТ	ССТСАТСАТА	ТТААСССТСС
	ТССТССТССС	сстсстсстс	ТТСТТССТСС	ССТСССТСТС ССАССТССТС
101	ТТССАССАСА	ТАТ ТАСС ССС	АССССТССТС	СТАССААТАС	ССТСАССАСС
	СССААТАССА	ААААТСАААА	АССССТСССТ	СССААААТТА АТАССТСССА
201	ААССАССССТ	АССССТСАТА	ССТТТСТСАС	СААТСТССАТ	СТСССТААТС
	СТСААСТССТ	САТТСАТСАА	АААСССТТТТ	АТТАТАТТТА ТАСССАСАСС
301	ТАТТТТСССТ	ТТСАССААСА	ААТТАААСАА	ААТАССАААА	АТСАТАААСА
	ААТССТССАС	ТАСАТТТАТА	ААТАТАССАС	СТАТССССАТ СССАТТСТСС
401	ТСАТСААААС	СССАССТААТ	АССТСТТССА	ССАААСАТСС	АСААТАТССС
	СТСТАТАССА	ТТТАТСАССС	ТСССАТТТТТ	СААСТСАААС ААААТСАТСС
501	САТТТТТСТС	АСССТСАССА	АТСААСАТСТ	САТТСАТАТС	САТСАТСААС
	ССАССТТТТТ	ТССТССАТТТ	СТССТСССС

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы Е. сой ВБ21 (ОЕ3) и Типег (ОЕ3) рйуз8, приобретенные в ^уадеп. Белок отделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 11. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0:11

Белок с последовательностью 8ЕР ΙΌ N0:11 представляет собой слитый белок, имеющий длину 204 аминокислоты и массу 24,3 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАШ 121-281 домен

- 25 023005

ВН3 молекулы ΡϋΜΑ/ВВСЗ (8Ε^ ΙΌ N0:37) прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из 9 остатков Агд, присоединена к С-концу эффекторного пептида. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ΤΚΑΙΕ конструкция содержит также последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Ε^ ΙΌ N0:52) и ММР (^ ΙΌ N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. еоЕ, представлены соответственно последовательностями 8Ε^ ΙΌ N0:11 и 8Ε^ ΙΌ N0:77, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е^ ΙΌ N0:11

ЕЕ0ИАЕЕ1СА ОЬЕВМАББЬЫ ΑΟΥΕΕΕΕΕΕΕ ЕЕЕЕУУЕРЬО ЬАСЕУААН1Т 51 СТЕСЕЗИТЬЗ 5ΡΝ3ΚΝΕΚΑΕ 0ΕΚΙΝ3ΜΕ33 ЕЗСНЗЕЬЗЫЬ ΗΙιΕΝΘΕΙΛ/ΙΗ 101 ΕΚΟΕΥΥΙΥδζ) ΤΥΕΕΕζ)ΕΕΙΚ ΕΝΤΚΝϋΚβΜν £>ΥΙΥΚΥΤ5ΥΡ БР1ЬЬМКЗАЕ 151 Ν30Μ5ΚϋΑΕΥ С1ЕГ51У<2ОС1 ЕЕЬКЕЫБЕ1Е УЗУТИЕНЬЮ МЬНЕАЗЕЕОА 201 ЕЬУС

Последовательность ДНК 8Е^ ΙΌ N0:77

1	САА6ААСАСТ	ССССАССТСА	ААТТССТССА	САССТСССТС	СТАТСССАСА
	ТСАТСТСААТ	ССАСАСТАТС	ААССТССТСС	ТССТСССССТ СССССТССТС
101	СТСТТСТТСС	тсссстссет	СТСССАССТС	СТСТТССАСС	АСАТАТТАСС
	СССАССССТС	СТССТАССАА	ТАСССТСАСС	АСССССААТА ССАААААТСА
201	ААААССАСТС	ССТСССАААА	ТСААТАОСТС	ССАААССАСС	ССТАСССОТС
	АТАССТТТСТ	САССААТСТС	САТСТСССТА	АТССТСААСТ ССТСАТТСАТ
301	САААААСССТ	ТТ ТАТ ТАТ АТ	ТТАТАСССАО	АССТАТТТТС	ССТТТСААОА

АСАСАТТААА СААААТАССА ААААТСАТАА АСАААТССТС САСТАТАТТТ

401 АСАААТАСАС САССТАТССС САССССАТТС ТССТСАТСАА ААССССАССТ ААТАССТСТТ ССАССАААСА ТССАСААТАТ ССТСТСТАТА ССАТТТАТСА

501 СССТСССАТС ТТТСАССТСА ААСААААТСА ТСССАТСТТТ СТТАСССТСА ССААССААСА ТСТСАТССАТ АТССАТСАТС ААСССАССТТ ТТТТССТССА

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штаммы Е. сой ВЕ21 (ΌΕ3) и Типег (ΌΕ3) рБу§8, приобретенные в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 12. Слитый белок с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0:12

Белок с последовательностью 8Ε^ ΙΌ N0:12 представляет собой слитый белок, имеющий длину 372 аминокислоты и массу 41 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤΚΑΙΕ121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен белок ΡϋΜΑ (8Ε^ ΙΌ N0:38). Между последовательностью ТКАЗЕ и последовательностью эффекторного пептида присутствует последовательность участков расщепления, распознаваемая металлопротеазой ММР (8Ε^ ΙΌ N0:51) и урокиназой иРА (8Ε^ ΙΌ N0:52), которые дополнительно отделены от последовательности ΤΚΑΙΕ гибким глицин-сериновым линкером 00800 (8Ε^ ΙΌ N0:60). Кроме того, на С-конце эффекторный пептид содержит последовательность ΚΕΌΕ (8Ε^ ΙΌ N0:56), направленную на эндоплазматический ретикулум и образующую С-концевую область всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Ε^ ΙΌ N0:12 и 8Ε^ ΙΌ N0:78, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:12

ЕУААН1ТСТЕ СЕЗЫТЬЗЗРЫ 3ΚΝΕΚΑΣΟΕΚ ΙΝ3ΜΕ33Ε3Ο НЗЕЬЗЫЬНЬЕ 51 ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ30ΤΥΕ ΕΕΟΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝΌΚ<2Μνζ)ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡ0ΡΙ

101	ЬЬМКЗАЕЫЗС	ИЗКБАЕУСЬУ	51У<2СС1ЕЕЬ	КЕЫБЕ1ЕУЗУ	ТИЕНЫЕМБН
151	ЕАЗЕЕСАЕЬУ	СССЗССРЬСЬ	АСЕУУЕАЕАЕ	ОЕСЗЗРЕРУЕ	СЬАЕБСРЕРЕ
201	РЬСЕЬУРЗАУ	ЗССЬСЕРСЬА	ААРААРТЬЬР	ААУЬСАРТАР	РАУТААЬССЗ
251	ЕИРССРЕЗЕР	ЕСРЕРБСРОР	ЗЬЗЬАЕОНЬЕ	ЗРУРЗАРСАЬ	АССРТОААРС
301	УЕСЕЕЕОИАЕ	ЕЮАОЬЕЕМА	ББЬЫАОУЕЕЕ	Е<2ЕЕ<2<2ЕНЕР	ЗРИЕУЬУЫЫ
351	МСЬЬРЬРЕСН	ΕΑΡΕΜΕΡΝΚΕ	БЬ

- 26 023005

Последовательность ДНК δΕρ ΙΌ Ν0:78

С6Т6ТТ6САС САСАТАТТАС САСССССААТ АССАААААТС

101 СССАААССАС СССТАССССТ

ААТССТСААС ТССТСАТТСА

201 САССТАТТТТ СССТТТСААС

ААСАААТССТ ССАСТАСАТТ

301 СТССТСАТСА АААССССАСС

ТССТСТСТАТ АССАТТТАТС

401 АТСССАТСТТ ТСТТАСССТС саасссасст тттттсстсс

501 сстссстстс ссасстсстс

ССАСТССССА АССССТТСАА

601 сссстссстс стстссттсс

СССТСТСССА СССССАСССС

701 ТСТСТССАСС САССССАССС ссттсссстс стсстссссс

801 ТССССАСССС АСССТСАССС

ССАССССАСС СССТССАСТС

901 сттсстсстс ААСАССААСА

ТССТАТСССА САТСАТСТСА

1001 ААСАССАССС ТСАТССТССС

АТСССТСТСС тссссстссс

1101 ΰΆΆ,ΎΆΆΆΰΆΑ САТСТС

ССССАССССТ ССТССТАССА АТАСССТСАС АААААССАСТ СССТСССААА АТСААТАССТ

САТАССТТТС ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ

ТСАААААССС ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА

ААСАСАТТАА АСААААТАСС АААААТСАТА

ТАСАААТАТА ССАССТАТСС ССАССССАТТ

ТААТАССТСТ ТССАССАААС АТССАСААТА

АСССТСССАТ СТТТСАССТС АААСААААТС

АССААССААС АТСТСАТССА ТАТССАТСАТ атттстсстт сстсстсста сссстсстсс ттсттсстсс СССТСССССТ СААСААССТА

ССТСТСССАС СТСАТССТСС ссстсссттт

САССССАСТТ АССТСТССТС ТСТСТСААСС

САССАСССАС АСТССТСССТ ССАССАТАТС

ССТССАСТТА ССССАССАСТ СССТССТАСС тастсстссс сстсстсстс стссссатсс

ТСССАСААСА ССАТСТССАА АСТССССТСС

ССАСССССТС СТАСАСАССС АССАСССССТ

СТССССАССТ САААТТССТС САСАССТССС

АТбСАСАбТА ТСААССТССТ 66Т6АА6АА6

АббСббТСбб 6Т6ТТСТ6ТА ТААТСТбАТТ

ТСбТббТСАТ ббТбСАССбб АААТббААбС

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. сой В.21 (ΌΕ3), приобретенный в №уа§еп, и Β^21^Ε3ρ^уδδΡI^, приобретенный в δ^ΐπ^^. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 13. Слитый белок с последовательностью δΕρ ΙΌ Ν0:13

Белок с последовательностью δΕρ ΙΌ Ν0:13 представляет собой слитый белок, имеющий длину 493 аминокислоты и массу 53,4 кДа, в котором на С-конце последовательности 121-281 ΤΡΑΙΌ последовательность белка ΡϋΜΑ (δΕρ ΙΌ Ν0:38) прикреплена в качестве эффекторного пептида. Кроме того, между последовательностью ΤΡΑΙΕ и последовательностью белка ΡϋΜΑ присутствует последовательность домена транслокации из Ρδеиάотоηаδ ае^и§^поδа (δΕρ ΙΌ Ν0:54), который дополнительно отделен от последовательности ΤΡΑΙΕ идущими подряд последовательностями: гибкого глицин-серинового линкера ΘΘΘΘδ (δΕρ ΙΌ Ν0:59), участка расщепления фурина (δΕρ ΙΌ Ν0:53) и гибкого аланин-глицинсеринового линкера ΑδΘΘ (δΕρ ΙΌ Ν0:65), а от белка ΡϋΜΑ - гибким глицин-сериновым линкером ΘΘδΘΘ (δΕρ ΙΌ Ν0:60). Кроме того, на С-конце эффекторного пептида слитый белок содержит последовательность ΚΕΌΌ (δΕρ ΙΌ Ν0:56), направленную на эндоплазматический ретикулум, которая является С-концевой областью всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями δΕρ ΙΌ Ν0:13 и δΕρ ΙΌ Ν0:79, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность δΕρ ΙΌ Ν0:13

РУААН1ТСТР бРЗЫТЬЗЗРЫ ЗКЫЕКАЬСРК ΙΝ3ΜΕ33Ρ3Ο НЗЕЬЗЫЬНЬР 51 Ν6ΕΣνΐΗΕΚ6 ΕΥΥΙΥ5ζ)ΤΥΕ ΡΕ<2ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝΟΚ<2Μνζ)ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΡΡΙ

101	ЬЬМКЗАРИЗС	№5ΚΌΑΕΥ6ΕΥ	51У<2О61ЕЕЪ	КЕЫЬР1ЕУЗУ	ΤΝΕΗΕΙϋΜϋΗ
151	ЕАЗЕЕСАЕЬУ	СССС5РККРА	ЗССРЕббЗЬА	АЬТАНОАСНЬ	РЬЕТЕТРНРО
201	РНбИЕОЬЕОС	СУРУОРЬУАЬ	УЬААРЬЗИЫО	νΌΟνίΑΝΑΣΑ	ЗРСЗССБЬСЕ
251	ΑΙ РЕЗ ΡΕ ζ)ΑΡ	ЬАЬТЬАААЕЗ	ЕРЕУРОСТбЫ	ΟΕΑ6ΑΑΝ6ΡΑ	ЬССЗСССАРА
301	РОЕ653РЕРУ	ЕСЬАРРСРРР	ЕРЬСРЬУРЗА	УЗССЬСЕРСЬ	АААРААРТЬЬ
351	РААУЬСАРТА	РРАУТААЬСС	ЗРДОРССРРЗР	РРСРРРОСРО	РЗЬЗЬАЕОНЬ
401	Е5РУР5АРСА	ЬАССРТОААР	СУРСЕЕЕОИА	РЕ1СА0ЬРРМ	АЬЬЬИАОУЕР
451	РРОЕЕООРНР	РЗРМРУЪУИЬ	ТМСЬЬРЬРРС	ΗΡΑΡΕΜΕΡΝΚ	ЬЕЬ

- 27 023005

Последовательность ДНК 8Е^ ΙΌ N0:79

САСССССААТ АССАААААТС ААААА6САСТ СССТСССААА АТТААТАССТ

АССАСАТССТ ССАСТАТАТС ТАТАААТАТА ССАССТАТСС ССАТСССАТТ 301 СТССТСАТСА АААССССАСС ТААТАССТСТ ТССАССАААС АТССАСААТА

401	АТСССАТТТТ	ТСТСАСССТС	АССААТСААС	АТСТСАТТСА	ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	тттттсстес	АТТТСТССТТ	ССТССТССТС СТАССССТАА
501	ААААССТССА	асссстсстс	СССААССТСС	ТАСССТСССА	ССАСТСАССС
	САСАТСАССС	АТСТСАТСТС	сссстссааа	ССТТТАСССС ТСАТССТСАС
601	ССТССТССТТ	СССААСАССТ	ССААСАСТСТ	ссттатсссс	ТТСАСССТСТ
	ССТТССАСТС	ТАТСТСССАС	САССТСТСАС	СТССААТСАС СТТСАТСАСС
701	ТТАТТССААА	ТССАСТСССА	АСТСССССТА	ССССТССТСА	ТСТСССТСАА

801 АССАСАААСС СААССТТТТС ТТССТСАССС САССССТААТ САТСААСССС

СТССАССААА ТССТСССССА САТССТССТА СТССТССТСС ТССАССТССТ

901 ССТСААСААС СТАССАСТСС ССААССССТТ СААССТСТСС САССТСАССС ТСССССТССС ТТТССССТСС СТССТСТССТ ТСССАССССА СТТАССТСТС

1001 стстстстса ассссстстс ССАСССССАС ССССАССАСС САСАСТССТС

ССТССАССАТ АТСТСТСТСС АСССАССССА СССССТССАС ТТАССССАСС

1101 СТСТСТСТСА АСССССТСТС ССАСССССАС ССССАССАСС САСАСТССТС

1201 САААСТССТС ТССССАСССС АСССССТССА СТСССАСССС СТСССАСАСА

СССАССАССТ ССТСТТССТС СТСААСААСА АСАСТССССА ССССАААТТС

1301 СТССАСАССТ СССТССТАТС ССАСАТСАТС ТСААТССАСА СТАТСААССТ

ССТССТСААС ААСААСАССА СССТСАТССТ СССАСССССТ ССССТСТТСТ

1401 СТАТААТСТС АТТАТСССТС ТССТСССССТ СССТССТССТ САТССТССАС

СССАААТССА АСССААТААА САТСААСТС

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. соН В.21 (БЕ3), приобретенный в Ноуадеп, и ВЕ2ШЕ3рЕу§8Р1Е, приобретенный в 81га1адепе. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 14. Слитый белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:14

Белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:14 представляет собой слитый белок, имеющий длину 186 аминокислот и массу 21,5 кДа, в котором на Оконце последовательности ТРАП. 121-281 8аминокислотный фрагмент белка 8МАС/О1аЬ1о (8Е^ ΙΌ N0:39) прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Агд, дополнительно присоединена к С-концу эффекторного пептида. Кроме того, между полиаргининовой последовательностью и последовательностью ТРАП, белок содержит последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е^ ΙΌ N0:52) и ММР (8Е^ ΙΌ N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Е^ ΙΌ N0:14 и 8Е^ ΙΌ N0:80, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е^ ΙΌ N0:14

АУР1А0КРНН НКРКВКУУРР ЪСЬАСКУААН ΙΤ0ΤΡ0Ρ3ΝΤ Σ33ΡΝ3ΚΝΕΚ 51 АЬСКК1Ч5ЭДЕ ЗЗКЗСНЗЕЬЗ ЦЬНЫШСЕЬУ ΙΗΕΚΟΕΥΥΙΥ 5ζ)ΤΥΕΕΕζ)ΕΕ 101 ΙΚΕΝΤΚΝϋΚΟ ΜνθΥΙΥΚΥΤ3 УРОР1ЪЬМКЗ АКЫЗСМЗКИА ΕΥΟΣΥβΙΥΏΟ 151 ΘΪΕΕΙιΚΕΝΟΚ ТЕУЗУТИЕНЬ ЮМИНЕАЗЕЕ САЕЬУС

- 28 023005

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:80

ССАСТТСССА ТТССАСАСАА АСССССТССТ ССТССТСССС СТССТССТСТ

ТСТТССТССС СТСССТСТСС САССТССТСТ ТССАССАСАТ АТТАСССССА

101 сссстсстсс ТАССААТАСС стсассассс ссаатассаа ааатсааааа ССССТСССТС ССААААТСАА ТАССТОССАА АССАССССТА ССССТСАТАС

201 СТТТСТСАСС ААТСТССАТС ТСССТААТСС ТСААСТССТС АТТСАТОААА ААСССТТТТА СТАТАТСТАТ АСССАСАССТ АСТТССССТТ ТСАССААСАА

301 АТТАААСААА АТАССААААА ТСАТАААСАА АТССТССАСТ АТАТСТАТАА АТАТАССАСС ТАТССССАТС ССАТТСТССТ САТСААААСС ССАССТААТА

401 ССТСТТССАС САААСАТССА СААТАТСССС ТСТАТАССАТ ТТАТСАСССТ СССАТТТТТС ААСТСАААСА АААТСАТССС АТТТТТСТСА СССТСАССАА

501 ТСААСАТСТС АТТСАТАТСС АТСАТСААСС САССТТТТТТ ССТССАТТТС

ТССТСССТ

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. сой ВБ21 (ЭЕ3) или Типег (ЭЕ3), приобретенные в Nονаβеη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 15. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:15

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:15 представляет собой слитый белок, имеющий длину 191 аминокислоту и массу 22,2 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен буфорин 11Ъ (8ЕР ГО N0:40). Кроме того, между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАГО белок содержит последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8ЕР ГО N0:52) и ММР (8ЕР ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 3, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО N0:15 и 8ЕР ГО N0:81, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО N0:15

ЕАСЬОЕРУСЕ ЬЬЕЕЬЪЕЕЬЬ ЕУУЕРЪСЬАе ВУААШТСТЕ СЕЗЫТЬЗЗРЫ 51 ЗКИЕКАЬСЕК 1И5МЕ55Е5С НЗЕЪЗЫЬНЬЕ ИСЕЫЛНЕКС ΕΥΥΙΥ5ζ)ΤΥΕ 101 ΕΕζ)ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚΰΜν<2ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΌΡΙ ЬЬМКЗАЕЫЗС Μ3ΚϋΑΕΥΟΕΥ 151 3ΙΥΟΟΟΙΕΕΕ КЕЫЬЕ1ЕУЗУ ТЫЕНЫЬМЬН ЕАЗЕЕСАЕЬУ С

Последовательность ДНК 8ЕР ГО N0:81

1	ССТССАССТС	ТССАСТТТСС	ССТТССАССТ	СТСТТАССТС	СССТССТССС
	тсстстсстс	ссссттсттс	СТССССТССС	ТСТСССАССТ ССТСТТССАС
101	САС АТ АТ ТАС	ССССАССССТ	ССТССТАССА	АТАСССТСАС	САСССССААТ
	АССАААААТС	АААААССАСТ	СССТСССААА	АТСААТАССТ СССАААССАС
201	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ	ССАТСТСССТ	ААТССТСААС
	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА	ТТТАТАСССА САССТАТТТТ
301	СССТТТСААС	ААСАСАТТАА	АСААААТАСС	АААААТСАТА	ААСАААТССТ
	ССАС ТАС АТТ	ТАСАААТАТА	ССАССТАТСС	ССАССССАТТ СТССТСАТСА
401	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС	АТССАСААТА	ТССТСТСТАТ
	АССАТТТАТС	АСССТСССАТ	СТТТСАССТС	АААСААААТС АТСССАТСТТ
501	ТСТТАСССТС	АССААССААС	АТСТСАТССА	ТАТССАТСАТ	СААСССАССТ
	ТТТТТССТСС	АТТТСТССТС	ССТСТССТТС	ССССТССТАС СССТАССАСС
601	САТ САТ САТ С	АТ САС САТ АС	САССССТ

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (ЭЕ3), приобретенный в Nονаβеη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 16. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:16

Белок с последовательностью 8ЕР ГО N0:16 представляет собой слитый белок, имеющий длину 279 аминокислот и массу 31,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен белок онконаза (8ЕР ГО N0:41). Между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида присутствуют последовательности участков расщепления,

- 29 023005 распознаваемые протеазами ММР (8ЕР ГО NО:51) и иРА (8ЕР ГО NО:52), дополнительно отделенные от последовательности ТКАГО гибким глицин-сериновым линкером ООО8 (8ЕР ГО NО:58).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО NО:16 и 8ЕР ГО NО:82, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО NО:16

ЕУААН1ТСТК σΚ5ΝΤΣ55ΡΝ ЗКЫЕКАЪСЕК ΙΝ5№Ε55Κ3Ο НЗЕЬЗЫЬНЬЕ 51 ΝΟΕΙ,νΐΗΕΚΟ ΕΥΥΙΥ30ΤΥΕ ΕΕΟΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚΟΜνΰΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΌΡΙ 101 ЬЬМКЗАЕЫЗС №5ΚϋΑΕΥΟΕΥ 51У<2СС1ЕЕЪ КЕЫОЕ1ЕУЗУ ТЫЕНЬЮМОН 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ СССЗСРЬСЬА СКУУКОШЬТ ΕςΚΚΗΙΤΝΤΕ ΡνΌΟϋΝΙΜ3Τ 201 ЫЬЕНСКРКЫТ ПУЗРРЕРУК А1СКС11А5К ЫУЬТТЗЕЕУЬ ЗРСЧУТЗЕРС 251 ΚΥΚΣΚΚ3ΤΝΚ ЕСУТСЕЫОАР УНЕУСУСЗС

Последовательность ДНК 8ЕР ГО NО:82

1	ССТСТТССАС	САСАТАТТАС	ССССАССССТ	ССТССТАССА АТАСССТСАС
	САСССССААТ	АССАААААТС	АААААССАСТ	СССТСССААА АТТААТАССТ
101	СССАААССАС	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ
	ААТССТСААС	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА
201	САССТАТТТТ	СССТТТСААС	ААСАААТТАА	АСААААТАСС АААААТСАТА
	АССАСАТССТ	ССАСТАТАТС	ТАТАААТАТА	ССАССТАТСС ССАТСССАТТ
301	СТССТСАТСА	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС АТССАСААТА

401	АТСССАТТТТ	тстсассстс	АССААТСААС	АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	тттттсстсс	АТТТСТССТТ	ССТССТССТА ССССТССССТ
501	СССТСТСССА	сстсстсттс	ТТССТСАССА	ТТСССТСАСС ТТТСАСАААА
	ААСАТАТТАС	СААТАССССТ	САТСТССАТТ	СССАТААТАТ ТАТСАССАСС
601	ААССТСТТТС	АТТССАААСА	ТАААААТАСС	ТТТАТТТАТА ССССТССССА

АССССТТААА ССААТТТСТА ААССТАТТАТ ТСССАССААА ААТСТССТСА 7 01 ССАССАСССА АТТСТАТСТС АСССАТТСТА АТСТТАССАС СССТСССТСТ

АААТАТАААС ТСАААААААС САССААТААА ТТТТСССТСА ССТСССАААА 801 ТСАСССАССС СТТСАТТТТС ТТССТСТТСС ТАССТСТ

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой. Типег (ЭЕ3), приобретенный в ^маде^ Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 17. Слитый белок с последовательностью 8ЕР ГО NО:17

Белок с последовательностью 8ЕР ГО NО:17 представляет собой слитый белок, имеющий длину 27 4 аминокислоты и массу 31 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен белок онконаза (8ЕР ГО NО:41), последовательность эффекторного пептида дополнительно отделена от последовательности ТКАГО гибким глицин-сериновым линкером

ОООО8ОООО8 (8Ер ГО ^:64).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕР ГО NО:17 и 8ЕР ГО NО:83, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ЕР ГО NО:17

ЕУААН1ТСТЕ ΟΕ3ΝΤΕ33ΡΝ ЗКЦЕКАЬСЕК 1№ЮЕ55К5С НЗЕЬЗЫЬНЬЕ 51 ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ5ζ)ΤΥΕ ΕΕζ)ΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚ<2Μν<2ΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡΟΡΙ 101 ЬЬМКЗАЕЦЗС ИЗКОАЕУСЪУ 51У<2СС1ЕЕЬ ΚΕΝϋΕΙΕνΒν ТЫЕНЫШРН 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ ССССЗССССЗ <2Р№ЬТЕ<2ККН ΙΤΝΤΕϋνϋΟϋ ΝΙΜ5ΤΝΙιΕΗ0 201 ΚΏΚΝΤΕΙΥ3Ε РЕРУКА1СКС НАЗКЫУЪТТ ЗЕЕУЬЗБСЦУ ТЗЕРСКУКЬК 251 КЗТЫКЕСУТС ЕЫОАРУНЕУС УСЗС

Последовательность ДНК 8ЕР ГО NО:83

201 САССТАТТТТ СССТТТСААС ААСАААТТАА АСААААТАСС АААААТСАТА АССАСАТССТ ССАСТАТАТС ТАТАААТАТА ССАССТАТСС ССАТСССАТТ

- 30 023005

401 АТСССАТТТТ ТСТСАСССТС АССААТСААС АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ саасссасст тттттестсс атттстсстт сстсстсстс стасссстсс

501 ТССТСССАСС САССАТТССС ТСАССТТТСА СААААААСАТ АТТАССААТА

ССССТСАТСТ ССАТТСССАТ ААТАТТАТСА ССАССААССТ СТТТСАТТСС

601 АААСАТАААА АТАССТТТАТ ТТАТАССССТ ССССААСССС ТТАААССААТ

ТТСТАААССТ АТТАТТСССА ССАААААТСТ ССТСАССАСС АСССААТТСТ

701 АТСТСАСССА ТТСТААТСТТ АССАССССТС ССТСТАААТА ТАААСТСААА

ААААССАССА АТАААТТТТС ССТСАССТСС СААААТСАСС САССССТТСА

801 ттттсттсст сттсстасст ст

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (ЭЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 18. Слитый белок с последовательностью БЕр ΙΌ ΝΟ:18

Белок с последовательностью БЕр ГО ΝΟ:18 представляет собой слитый белок, имеющий длину 197 аминокислот и массу 23,2 кДа, в котором на Ν-конце последовательности ТКАГО121-281 20аминокислотный пептид, содержащий Ν-концевой домен белка р14АКЕ (БЕр ГО ΝΟ:42), прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из шести остатков Агд, дополнительно прикреплена к С-концу эффекторного пептида. Кроме того, между полиаргининовой последовательностью и последовательностью ТКАГО присутствует последовательность участков расщепления протеаз иРА (БЕр ГО ΝΟ:52) и ММР (БЕр ГО ΝΟ:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями БЕр ГО ΝΟ:18 и БЕр ГО ΝΟ:84, как представлено ниже.

Аминокислотная последовательность БЕр ГО ΝΟ:18

УККЕЬУТЫН ВКАССРРКУВ ΗΡΚΚΚΚΡννΚ РЬСЬАСКУАА ΗΙΤΟΤΕΟΚδΝ

ΊΈ55ΡΝ5ΚΝΕ ΚΑΏΟΗΚΙΝδΝ ЕЗЗКЗСНЗЕЬ ЗЫЬНЫШОЕЬ νΐΗΕΚΟΕΥΥΙ 101 Υ30ΤΥΕΗΕ0Ε ΕΙΚΕΝΤΚΝϋΚ ζ)Μν<2ΥΙΥΚΥΤ 5ΥΡϋΡΙϋϋΜΚ 3ΑΚΝ50Ν5Κϋ 151 ΑΕΥΟΣΥ3ΙΥ<2 ΟΰΙΕΕϋΚΕΝϋ ЮЕУЗУТЫЕН ϋΙϋΜϋΗΕΑ5Ε ЕСАЕЬУС

Последовательность ДНК БЕР ΙΌ ΝΟ:84

СТТССТССТТ ТТСТССТТАС ССТСССТАТТ ССТССТССАТ стсстсстсс ссстстссст сстсстсстс сссстсстсс ТСТТСТТССТ сстстссстс

101 ТСССАССТСС ССТТССАССА САТАТТАССС ССАССССТСС ТССТАССААТ

АСССТСАССА СССССААТАС САААААТСАА АААССССТСС СТСССААААТ

201 ТААТАССТСС САААССАССС СТАССССТСА ТАССТТТСТС АССААТСТСС

АТСТСССТАА ТССТСААСТС СТСАТТСАТС АААААСССТТ ТТАТТАТАТТ

301 ТАТАСССАСА ССТАТТТТСС СТТТСАССАА САААТТАААС ААААТАССАА

АААТСАТААА САААТССТСС АСТАТАТСТА ТАААТАТАСС АССТАТСССС

401 АТСССАТТСТ ССТСАТСААА АССССАССТА АТАССТСТТС САССАААСАТ

ССАСААТАТС СССТСТАТАС САТТТАТСАС ССТСССАТТТ ТТСААСТСАА

501 АСААААТСАТ СССАТТТТТС ТСАСССТСАС СААТСААСАТ СТСАТТСАТА

ТССАТСАТСА АСССАССТТТ ТТТССТССАТ ТТСТССТТСС Т

Пример 19. Слитый белок с последовательностью БЕр ГО ΝΟ:19

Белок с последовательностью БЕр ГО ΝΟ:19 представляет собой слитый белок, имеющий длину 189 аминокислот и массу 22,3 кДа, в котором на Ν-конце последовательности ТКАГО121-281 11-аминокислотный пептид, связывающийся с Мбт2 (БЕр ГО ΝΟ:43), прикреплен в качестве эффекторного пептида, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Агд, дополнительно прикреплена к С-концу эффекторного пептида. Кроме того, между полиаргининовой последовательностью и ТКАГО присутствуют последовательности участков расщепления протеаз иРА (БЕр ГО ΝΟ:52) и ММР (БЕр ГО ΝΟ:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последова- 31 023005 тельность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. еоЕ, представлены соответственно последовательностями 8Е^ ΙΌ N0:19 и 8Е^ ΙΌ N0:85, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е^ ΙΌ N0:19

ΡΕΕΜϋΤΜΕΟΕ ΝΕΕΕΕΕΕΕΕν УЕРЪСЪАСЕУ ААН1ТСТЕСЕ 3ΝΊΈ53ΡΝ5Κ 51 ΝΕΚΑΕΟΕΚΙΝ З^ЕЗЗЕЗСНЗ ЕЪЗЫЬНЬЕЫС ЕЬУ1НЕКСГУ ΥΙΥ5ζ)ΤΥΕΕΕ 101 ΟΕΕΙΚΕΝΤΚΝ ΏΚΟΜνΟΥΙΥΚ УТЗУРОРЫЛ МКЗАЕЫЗСМЗ КБАЕУСЬУ31 151 У03С1ЕЕЬКЕ ΝϋΕΙΕν3νΤΝ ЕНЬЮМОНЕА ЗЕЕСАЕЬУС

Последовательность ДНК 8Е^ ΙΌ N0:85

1	ССТССТТТТА	ТССАТАССТС	ССААССТСТС	ААТСССССТС	ССССТССТСС
	ссстсетстт	сттсстсссс	тссстстссс	АССТССТСТТ ССАССАСАТА
101	ТТАСССССАС	ссстсстсет	АССААТАССС	ТСАССАСССС	ОААТАССААА
	ААТСАААААС	састссстсс	СААААТТААТ	АССТСССААА ССАССССТАС
201	СССТСАТАСС	ТТТСТСАССА	АТСТССАТСТ	СССТААТССТ	СААСТССТСА
	ТТСАТСАААА	АСССТТТТАТ	ТАТАТТТАТА	СССАСАССТА ТТТТСОСТТТ
301	САССААСААА	ТТАААСАААА	ТАССАААААТ	САТАААСААА	ТССТССАСТА
	САТТТАСААА	ТАТАССАССТ	АТССССАТСС	САТТСТССТС АТСААААОСС
401	САССТААТАС	СТСТТССАСС	АААСАТССАС	ААТАТССТСТ	СТАТАССАТТ
	ТАТСАСССТС	ССАТТТТТСА	АСТСАААСАА	ААТСАТСССА ТТТТТСТСАС
501	ССТСАССААТ	СААСАТСТСА	ТТСАТАТССА	ТСАТСААССС	АССТТТТТТС
	СТССАТТТСТ	ссттсет

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. еоЕ ВЕ21 (БЕ3) или Типег (БЕ3) , приобретенные в Иоуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 20. Слитый белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:20

Белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:20 представляет собой слитый белок, имеющий длину 195 аминокислот и массу 22,9 кДа, в котором на И-копце последовательности ТКАЕ121-281 пептид, полученный из лунасина (8Е^ ΙΌ N0:44), прикреплен в качестве эффекторного пептида. Между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАН. присутствует, в заданном порядке, полиаргининовая последовательность, состоящая из семи остатков Аг§, и последовательности участков расщепления протеаз иРА (8Е^ ΙΌ N0:52) и ММР (8Е^ ΙΌ N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. еоЕ, представлены соответственно последовательностями 8Е^ ΙΌ N0:20 и 8Е^ ΙΌ N0:86. как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е^ ΙΌ N0:20

СЕКН1МЕКК2 ΟΕΟϋϋΌΟΕΕΕ ЕЕЕЕЕУУЕРЬ СЬАСКУААН1 ТСТЕОЕЗИТЬ 51 33ΡΝ3ΚΝΕΚΑ Σ0ΕΚΙΝ3№Ε3 ЗЕЗСНЗЕЪЗЫ ЬНЬЕЫСЕЬУ1 НЕКСЕУУ1У5 101 <2ΤΥΕΕΕ<2ΕΕΙ ΚΕΝΤΚΝϋΚΟΜ νζ)ΥΙΥΚΥΤ5Υ Р0Р1ЬЬМКЗА ΕΝ50№3ΚϋΑΕ 151 У0ЬУ51У<2СС ΙΕΕΕΚΕΝϋΕΙ ЕУЗУТИЕНЫ ΌΜϋΗΕΑ3ΕΕΟ АЕЬУС

Последовательность ДНК 8Е^ ΙΌ N0:86

1	ТСТСАААААС АТАТТАТССА АААААТТСАС ССТСССССТС АТСАТСАТСА ТСССССТССС ССТССТСССС СТССТСТТСТ ТССТССССТС ССТСТСССАС
101	СТССТСТТСС АССАСАТАТТ АСССССАССС СТССТССТАС СААТАСССТС АССАСССССА АТАССААААА ТСАААААССА СТСССТСССА АААТТААТАС
201	СТСССАААСС АССССТАССС СТСАТАССТТ ТСТСАССААТ СТССАТСТСС СТААТССТСА АСТССТСАТТ сатсааааас ссттттатта татттатасс
301	САСАССТАТТ ТТСССТТТСА ССААСАААТТ АААСААААТА ССАААААТ6А ТАААСАААТС СТССАСТАСА ТТТАСАААТА ТАССАССТАТ ССССАТСССА
401	ТТСТССТСАТ СААААССССА ССТААТАССТ СТТССАССАА АСАТССАСАА

ТАтестстет атассаттта тсассстссс атттттсаас тсааасаааа

501 ТСАТСССАТТ ТТТСТ6АСС0 ТСАССААТ6А АСАТСТСАТТ САТАТС6АТС

АТСААСССАС СТТТТТТССТ ССАТТТСТСС ТТССТ

Аминокислотную последовательность, представленную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК, представленной выше. Создавали плазмиду, со- 32 023005 держащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше.

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. сой ВЬ21 (ОЕ3) или Типег (ЭЕ3), приобретенные в Хо\тшеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 21. Слитый белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:21

Белок с последовательностью 8Е^ ΙΌ N0:21 представляет собой слитый белок, имеющий длину 218 аминокислот и массу 25,5 кДа, в котором на ГОконце последовательности ТКА1Ы21-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен 8-аминокислотный фрагмент белка 8тас/О1аЬ1о (8Е^ ΙΌ N0:39), с прикрепленной к его С-концу полиаргининовой последовательностью, состоящей из семи остатков Агд. Кроме того, к С-концу последовательности ТКАГО121-281 присоединен второй эффекторный пептид, содержащий домен ВН3 белка В1к (8Е^ ΙΌ N0:45), второй эффекторный пептид на своем ГОконце содержит прикрепленную полиаргининовую последовательность, состоящую из семи остатков Агд. Между последовательностью ТКАГО и обоими эффекторными пептидами присутствуют последовательности участков расщепления, распознаваемые металлопротеазой ММР (8Е^ ΙΌ N0:51) и урокиназой иРА (8Е^ Ιϋ N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е^ Ιϋ N0:21 и 8Е^ Ιϋ N0:87, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е^ Ιϋ N0:21

ΑνΡΙΑΟΚΡΚΚ κκκκκκννρρ ЬСЬАСВУААН 1ТСТНСКЗИТ Σ33ΡΝ3ΚΝΕΚ 51 АЬСЕК1ЫЗИЕ ЗЗКЗСНЗЕЪЗ ЫЪНЫШСЕЬУ ΙΗΕΚΟΕΥΥΙΥ 3ΩΤΥΕΕΕ0ΕΕ 101 ΙΚΕΝΤΚΝϋΚζ) ΜνΟΥΙΥΚΥΤδ УРПР1ЬЬМКЗ АКЫЗСИЗКРА ΕΥΟΣΥδΙΥΩΟ 151 С1ГЕЪКЕИ0Е 1ЕУЗУТЫЕНЪ ΙΌΜΏΗΕΑ3ΕΕ САЕЬУСРЪСЪ АСЮАЖРКНК

201 КККЬАЬКЬАС КЗОЕМБУЗ

Последовательность ДНК 8Е^ Ιϋ N0:87

ТСТТССТССТ СТСССТСТСС САССТССССТ ТССАССАСАТ АТТАСССССА

101 ССССТССТСС ТАССААТАСС СТСАССАССС ССААТАССАА АААТСААААА

ССССТСССТС ССААААТТАА ТАССТСССАА АССАССССТА ССССТСАТАС

01 СТТТСТСАСС ААТСТССАТС ТСССТААТСС ТСААСТССТС АТ ТСАТ6ААА

ААСССТТТТА ТТАТАТТТАТ АСССАСАССТ АТТТТСССТТ ТСАССААСАА

301 АТТАААСААА АТАССААААА ТСАТАААСАА АТССТССАСТ АТАТСТАТАА

АТАТАССАСС ТАТССССАТС ССАТТСТССТ САТСААААСС ССАССТААТА

401 ССТСТТССАС САААСАТССА СААТАТСССС ТСТАТАССАТ ТТАТСАСССТ

СССАТТТТТС ААСТСАААСА АААТСАТССС АТТТТТСТСА СССТСАССАА

501 ТСААСАТСТС АТТСАТАТСС АТСАТСААСС САССТТТТТТ ССТССАТТТС тссттсстсс сстессссте сстесссетс тссттссссс ссессстсес 601 ССТССССССС ТСССАСТССС ТСТСССАТСТ АТТССТСАТС АААТССАТСТ

САСС

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Ковейа (ЭЕ3), приобретенный в Хоуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 22. Слитый белок с последовательностью 8Е^ Ιϋ N0:22

Белок с последовательностью 8Е^ Ιϋ N0:22 представляет собой слитый белок, имеющий длину 199 аминокислоты и массу 22,3 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена последовательность синтетического пептида, состоящего из повторов О1у, А1а (8Е^ Ιϋ N0:46), к С-концу которого также присоединена полиаргининовая последовательность, состоящая из восьми остатков Агд, последняя также формирует С-концевую область всей конструкции. Кроме того, между эффекторным пептидом и последовательностью ТКАГО присутствует последовательность участков расщепления, распознаваемых металлопротеазой ММР (8Е^ Ιϋ N0:51) и урокиназой иРА (8Е^ Ιϋ N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 4, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е^ ΙΌ N0:22 и 8Е^ ΙΌ N0:88,

- 33 023005 как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Ер ГО N0:22

ЕУААН1Т6ТЕ СЕЗЫТЬЗЗРЫ ЗКЫЕКАЬСЕК 1Ы5ЫЕ35ЕЗС НЗЕЬЗЫЬНЬЕ 51 ЫСЕЬУ1НЕКС ΕΥΥΙΥ5ζ)ΤΥΕ ΕΕΟΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝϋΚΩΜνΟΥΙ ΥΚΥΤ5ΥΡΌΡΙ 101 ЬЬМКЗАЕЫЗС №5ΚϋΑΕΥΰΣΥ 51У<2СС1ЕЕЬ КЕЫРЕ1ЕУЗУ ΤΝΕΗΣΙϋΜϋΗ 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ СЕУУЕРЬСЬА САСАСССАСС АСАСССАССА СЕЕЕЕЕЕЕЕ

Последовательность ДНК 8Ер ГО N0:88

1	ССТСТТССАС	САСАТАТТАС	ССССАССССТ	ССТССТАССА	АТАСССТСАС
	САСССССААТ	АССАААААТС	АААААССАСТ	СССТСССААА АТТААТАССТ
101	еССАААССАС	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ	ССАТСТСССТ
	ААТССТСААС	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА
201	САССТАТТТТ	СССТТТСААС	ААСАААТТАА	АСААААСАСС	АААААТСАТА
	ААСАААТССТ	ССАСТАТАТТ	ТАСАААТАТА	ССАССТАТСС ССАТСССАТТ
301	СТССТСАТСА	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС	АТССАСААТА

401	АТСССАТТТТ	ТСТСАСССТС	АССААТСААС	АТСТСАТТСА	ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	тттттсстсс	АТТТСТССТТ	ССТССТССТС СТАССССТСС
501	ТССТССТСТТ	сттсстсссс	тссстстссс	ТССТСССССТ	СССССТССТС
	стссассссс	ТССТССТССС	ССТСССССАС	ССССТССТСС АССТССТССТ
601	сстссссстс	етссссст

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. сой ВБ21 (ЭЕ3) или Τιιικογ (ЭЕ3), приобретенные в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 23. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:23

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:23 представляет собой слитый белок, имеющий длину 289 аминокислот и массу 32,6 кДа, в которой на С-конце последовательности 121-281 ΤКΑI^ в качестве эффекторного пептида прикреплен С-концевой домен компонента протеасомы 85а, содержащий мотивы ШМ (8Е0 ГО N0:46). Кроме того, между эффекторным пептидом и последовательностью ΤΗ^Ε присутствует последовательность участка расщепления фурина (8Е0 ГО N0:53), дополнительно отделенная от последовательности 'ЕКАИ. гибким глицин-сериновым линкером ССС8СС (8Е0 ГО N0:61), и на С-конце эффекторного пептида расположена последовательность КЕЭБ, направленная на эндоплазматический ретикулум (8Ер ГО N0:56), последняя представляет собой С-концевую область всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 5, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:23 и 8Е0 ГО N0:89, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Ер ГО N0:23

ΚνΑΑΗΙΤΟΤΕ СЕЗЫТЬЗЗРЫ ЗКЫЕКАЬСКК 1Ы5ИЕ55Е5С НЗЕЬЗЫЬНЬР 51 ЫСЕЬУТНЕКС ΕΥΥΙΥ30ΤΥΕ ΕΓΟΕΕΙΚΕΝΤ ΚΝΟΚΟΜνΟΥΙ ΥΚΥΤ3ΥΡϋΡΙ 101 ЬЬМКЗАЕЫЗС МЗКОАЕУСЬУ 51У<2СС1ЕЕЬ КЕЫБЕ1ЕУЗУ ТЫЕНЬЮМОН 151 ЕАЗЕЕСАЕЬУ ССССЗССЕКК КМТ15<2<2ЕЕС ЕТСЬРЬЬЗЗМ ΤΕΕΕζ)ΙΑΥΑΜ

01 ОМЗЬОСАЕГС 0ΑΕ3ΑΌΙΌΑ3 ЗАРГОТЗЕРАК ΕΕΟϋΥϋνΜζ)ϋ РЕЕЬ<25УЬЕЫ

251 ЬРбУОРЫЫЕА 1ЕЫАМСЗЬАЗ ΟΑΤΚϋΘΚΚϋΚ ΚΕΕϋΚΚΕΌΕ

Последовательность ДНК 8Ер ГО N0:89

1	сстеттесАС	САСАТАТТАС	ССССАССССТ	ССТССТАССА АТАСССТСАС
	САСССССААТ	АССАААААТС	АААААССАСТ	СССТСССААА АТТААТАССТ
101	СССАААССАС	СССТАССССТ	САТАССТТТС	ТСАССААТСТ ССАТСТСССТ
	ААТССТСААС	ТССТСАТТСА	ТСАААААССС	ТТТТАТТАТА ТТТАТАСССА
201	САССТАТТТТ	СССТТТСААС	ААСАААТТАА	АСААААСАСС АААААТСАТА
	ААСАААТССТ	ССАСТАТАТТ	ТАСАААТАТА	ССАССТАТСС ССАТСССАТТ
301	СТССТСАТСА	АААССССАСС	ТААТАССТСТ	ТССАССАААС АТССАСААТА
	ТССТСТСТАТ	АССАТТТАТС	АСССТСССАТ	ТТТТСААСТС АААСААААТС
401	АТСССАТТТТ	ТСТСАСССТС	АССААТСААС	АТСТСАТТСА ТАТССАТСАТ
	СААСССАССТ	ТТТТТССТСС	АТТТСТССТТ	ССТССТССТС СТАССССТСС
501	ТССТАААААА	ССТАТСАССА	ТТАСССАССА	АСААТТТССТ ССТАССССТС
	ТСССССАТСТ	САССАССАТС	АСССААСААС	ААСАААТТСС СТАСССААТС
601	САСАТСАССС	ТССАСССТСС	АСААТТТССТ	САСССАСААА ССССАСАТАТ
	ТСАТССААСС	АССССААТСС	АТАССАСССА	АСССССАААА СААСААСАСС
701	АТТАССАССТ	ТАТССАССАТ	ССССААТТТС	ТССАСАСССТ ТСТССААААТ
	СТССССССТС	ТТСАТСССАА	ТААТСААССА	АТТССТААТС СААТСССТАС
801	ССТСССААСС	СААССААССА	ААСАТСССАА	ААААСАТААА АААСАССААС
	АСААААААСА	АСАТСТС

- 34 023005

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой В, используя штаммы Е. сой ВБ21 (ЭЕ3) или Типег (ЭЕ3), приобретенные в Nονа§сη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 24. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:24 (сравнительный)

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:24 представляет собой слитый белок длиной 183 аминокислоты и массой 21 кДа, в котором на Оконце последовательности 119-281 ТКАГО в качестве эффекторного пептида прикреплен декапептид, полученный из лиганда ТОТ (8Е0 ГО N0:48). Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГО присутствуют последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е0 ГО N0:52) и ММР (8Е0 ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 5, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:24 и 8Е0 ГО N0:90, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е0 ГО N0:24

УАЛР0АЕС<2Ь ЕУУЕРЬСЪАС Р<2ЕУААН1ТС ТЕСЕЗМТЬЗЗ РЫЗКЫЕКАЬС 51 ΚΚΙΝ5ΜΕ55Ε ЗСНЗГЬЗЫЪН ЫШСЕЬУ1НЕ Κ3ΓΥΥΙΥ50Τ ΥΓΚΓΩΕΕΙΚΕ 101 ΝΤΚΝϋΚΟΜνΟ ΥΙΥΚΥΤδΥΡϋ РГЪЬМКЗАКЫ ЗСМЗЕБАЕУС Ш51У<ЭСС1Е 151 ЕЬКЕЫОИЕУ ЗУТИЕНЬЮМ ϋΗΕΑ3ΕΕ5ΑΕ ЬУС

Последовательность ДНК 8Е0 ГО N0:90

СТТССАААТС СССАСССАСА АССТСАССТС ССССТТСТТС СТССССТССС

ТСТСССАССТ ССССАСССТС ТТССАССАСА таттассссс АССССТССТС

101 СТАССААТАС ССТСАССАОС СССААТАССА ААААТСАААА АССССТСССТ

ССТААААТТА АТАССТСССА ААССАССССТ АСССОТСАТА ССТТТСТСАС

201 СААТСТССАТ СТСССТААТС СССААСТССТ САТТСАТСАА АААСССТТТТ

АТТАТАТТТА ТАСССАСАСС ТАТТТТСССТ ТТСАССААСА ААТТАААСАА

301 ААТАССАААА АТСАТАААСА ААТССТССАС ТАТАТСТАТА ААТАТАССАС

СТАТССССАТ СССАТТСТСС ТСАТСААААС СССАССТААТ АССТСТТССА

401 ССАААСАТСС ССААТАТССТ СТСТАТАССА ТТТАТСАССС ТСССАТТТТТ 6ААСТСАААС ААААТСАТСС САТТТТТСТС АСССТСАССА АТСААСАТСТ

501 САТТСАТАТС САТСАТСААС ССАССТТТТТ ТССТССАТТТ СТССТТССТ

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой ВБ21 (ОЕ3), приобретенный в Nονа§сη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 25. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:25 (сравнительный)

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:25 представляет собой слитый белок, имеющий длину 179 аминокислот и массу 20,7 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГО119-281 6-аминокислотный пептид, полученный из ТОТ (8Е0 ГО N0:49), прикреплен в качестве эффекторного пептида. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГО присутствуют последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е0 ГО N0:52) и ММР (8Е0 ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 5, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:25 и 8Е0 ГО N0:91, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8Е0 ГО N0:25

ЬАЛСУЕКУУЕ РЬСЬАСР(2ЕУ ААН1ТСТЕСЕ ЗЫТЬЗЗРЫЗК ΝΕΚΑΣ6ΕΚΙΝ 51 ЗМЕ55ЕЗСН5 ЕЬЗЫЬНЬЕЫС ΕίνΐΗΕΚΟΕΥ ΥΙΥ3ζ)ΤΥΕΒΕ ζ)ΕΕΙΚΕΝΤΚΝ 101 ϋΚβΜνΟΥΙΥΚ ΥΤδΥΡϋΡΙΙΦ МКЗАНЫЗСИЗ КОАЕУСЬУ31 ΥβΟΟΙΕΕΣΚΕ 151 ΝΏΕΙΕΥδΥΤΝ ЕНЬЮМЭНЕА ЗЕГСАЕЬУС

- 35 023005

Последовательность ДНК 8ΕΡ ΙΌ N0:91

1	СТСССАААТС	стсттсаасс
	ССАСССТСТТ	ССАССАСАТА
101	ТСАССАСССС	СААТАССААА
	АССТСССААА	ССАССССТАС
201	СССТААТССС	СААСТССТСА
	СССАСАССТА	ттттсссттт
301	САТАААСААА	ТССТССАСТА
	САТТСТССТС	АТСААААССС

тсттсттсст сссстссстс тсссасстсс ТТАСССССАС СССТССТССТ АССААТАССС ААТСАААААС СССТСССТСС ТААААТТААТ СССТСАТАСС ТТТСТСАССА АТСТССАТСТ

ТТСАТСАААА АСССТТТТАТ ТАТАТТТАТА

САССААСААА ТТАААСАААА ТАССАААААТ

ТАТСТАТААА ТАТАССАССТ АТССССАТСС

САССТААТАС СТЕТТССАСС АААСАТСССС

401 ААТАТССТСТ СТАТАССАТТ ТАТСАСССТС ССАТТТТТСА АСТСАААСАА

ААТСАТСССА ТТТТТСТСАС ССТСАССААТ СААСАТСТСА ТТСАТАТССА

501 ТСАТСААССС АССТТТТТТС СТССАТТТСТ ССТТССТ

Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Ε. сой Типег (ΏΕ3), приобретенный в ОТуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 26. Слитый белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:26 (сравнительный)

Белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:26 представляет собой слитый белок, имеющий длину 180 аминокислот и массу 20,8 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГО119-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен 5-аминокислотный фрагмент цитокина ТОТ (8ΕΡ ГО N0:50) с дополнительным одним остатком Суз на его С-конце и ОТсопце. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГО присутствуют последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8ΕΡ ГО N0:52) и ММР (8ΕΡ ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 5, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями 8ΕΡ ГО N0:26 и 8ΕΡ ГО N0:92, как показано ниже.

Аминокислотная последовательность 8ΕΡ ГО N0:26

СРЗЕСЬСЕУУ ЕРЬСЬАСРОЕ УААН1ТСТКС Ε3ΝΤΕ33ΡΝ3 КЫЕКАЬСЕК1 51 Ν5№Ε85Η50Η ЗЕЬЗЫЪНЫШ СЕЬУШЕКСГ ΥΥΙΥ3ΩΤΥΕΚ ΕζΈΕΙΚΕΝΤΚ 101 ΝΌΚΟΜνΩΥΙΥ ΚΥΤΒΥΡϋΡΙΣ ЬМКЗАКИЗСИ ЗКБАЕУСЬУЗ 1У0СС1ЕЕЬК

151 ΕΝυΚΙΓνδνΤ ΝΕΗΕΙОМОНЕ АЗЕЕСАЕЪУС

Последовательность ДНК 8ΕΡ ГО N0:92

1	ТСТСССАССС	ААССТСТСТС	тсстсттстт	ССТССССТСС	СТСТСССАСС
	ТССССАСССТ	СТТССАССАС	АТАТТАСССС	САССССТССТ ССТАССААТА
101	СССТСАССАС	ССССААТАСС	АААААТСААА	ААССССТССС	ТССТААААТТ
	ААТАССТССС	АААССАСССС	тасссстсат	АССТТТСТСА ССААТСТССА
201	ТСТСССТААТ	ссссаастсс	ТСАТТСАТСА	ААААСССТТТ	ТАТТАТАТТТ
	АТАСССАСАС	СТАТТТТССС	ТТТСАССААС	аааттаааса АААТАССААА
301	ААТСАТАААС	АААТССТССА	СТАТАТСТАТ	АААТАТАССА	ССТАТССССА

ТСССАТТСТС СТСАТСАААА ССССАССТАА ТАССТСТТСС АССАААСАТС

401 СССААТАТСС ТСТСТАТАСС АТТТАТСАСС СТСССАТТТТ ТСААСТСААА

СААААТСАТС ССАТТТТТСТ САСССТСАСС ААТСААСАТС ТСАТТСАТАТ

501 ССАТСАТСАА СССАССТТТТ ТТССТССАТТ ТСТССТТССТ

Пример 27. Слитый белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:93

Белок с последовательностью 8ΕΡ ГО N0:93 представляет собой слитый белок, имеющий длину 459 аминокислот и массу 50,4 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплена полноразмерная 1^Азе А человека (8ΕΡ ГО N0:32), фланкированная с ее С-конца последовательностью, нацеленной на эндоплазматический ретикулум (ΚΏΕΕ), и с ее N конца гибким глицин-сериновым линкером (8ΕΡ ГО N0:175). Дополнительно, для того, чтобы стабилизировать его тримерную структуру, последовательность ТКАГО содержит на своем Оконце полицистеи- 36 023005 новый линкер (8ЕО ΙΌ N0:179), фланкированный на его Жконце остатком глицина. Кроме того, между последовательностью ТКА1Ь и последовательностью эффекторного пептида присутствуют в данном порядке гибкий глицин-сериновый линкер (8Е0 ГО N0:59), линкер для пегилирования (8Е0 ГО N0:170), последовательность участка расщепления, распознаваемая фурином (8Е0 ГО N0:53), гибкий глицинсериновый линкер (8Е0 ГО N0:65) и модифицированный домен транслокации Ркеийотопак аегидшока (делеция спирали Р) (8Е0 ГО N0:176).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 6, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:93 и 8Е0 ГО N0:122.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее последовательности кодирующей ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (ЭЕ3). приобретенный в Nονадеη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 28. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:94

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:94 представляет собой слитый белок, имеющий длину 213 аминокислот и массу 24,7 кДа, в котором на Жконце последовательности ТКАГО95-281 пептид, полученный из №и77 (8Е0 ГО N0:35), прикреплен в качестве эффекторного пептида. Последовательность эффекторного пептида содержит на своем Жконце прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГЬ присутствуют последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами ММР (8ЕТ) ГО N0:51) и иРА (81Т) ГО N0:52).

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (ЭЕ3), приобретенный в Nονадеη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 29. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:95

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:95 представляет собой слитый белок, имеющий длину

204 аминокислоты и массу 23,1 кДа, в котором на Жконце последовательности ТКА1Ы16-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из азурина (8Е0 ГО N0:151). Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГЬ расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами ММР (8Е0 ГО N0:51) и иРА (8Е0 ГО N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 6, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:95 и 8Е0 ГО N0:124.

Пример 30. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:96

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:96 представляет собой слитый белок, имеющий длину

205 аминокислот и массу 23,3 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКА1Ы20-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из азурина (8Е0 ГО N0:151). Кроме того, между последовательностью ТКАГЬ и последовательностью эффекторного пептида присутствует последовательность участка расщепления, распознаваемая протеазой фурин (8Е0 ГО N0:172), дополнительно отделенная от последовательности ТКАГЬ гибким глицин-сериновым линкером ССС8 (8Е0 ГО N0:58). Сконец эффекторного пептида фланкируется последовательностью КЕЭЬ, направленной на эндоплазматический ретикулум (8Е0 ГО N0:56), которая образует С-концевую область всей конструкции.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 6, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:96 и 8Е0 ГО N0:125.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с

- 37 023005 общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соП Типег (ЭЕ3). приобретенный в Ноуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 31. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:97

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:97 представляет собой слитый белок, имеющий длину 207 аминокислот и массу 23,1 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО120-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид, полученный из азурина (8ЕЦ ГО N0:151). Кроме того, между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами ММР (8ЕЦ ГО N0:51) и иРА (8ЕЦ ГО N0:52), дополнительно отделенные от последовательности ТКАТЬ гибким глицин-сериновым линкером 0008000 (81 У) ΙΌ N0:62).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 6, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:97 и 8ЕЦ ГО N0:126.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е.соН Типег (ЭЕ3), приобретенный в Nоνадеη. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 32. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:98

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:97 представляет собой слитый белок, имеющий длину 327 аминокислот и массу 36,2 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО120-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен полноразмерный пептид азурин (8ЕЦ ГО N0:152). Кроме того, между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами ММР (8ЕЦ ГО N0:51) и иРА (8ЕЦ ГО N0:52), дополнительно отделенные от последовательности ТКАГО гибким глицин-сериновым линкером 0008000 (81 У) ΙΌ N0:62).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 7, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:98 и 8ЕЦ ГО N0:127.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соН Типег (ЭЕ3), приобретенный в Шуг-щеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 33. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:99

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:99 представляет собой слитый белок, имеющий длину 199 аминокислот и массу 22,9 кДа, в котором на Юконце последовательности ТКАГО114-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен октамерный пептид, полученный из 8тас/^IΛВ^0 (8ЕЦ ГО N0:39). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида присутствуют последовательности участков расщепления протеаз иРА (81 У) ГО N0:52) и ММР (81 У) ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 7, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:99 и 8ЕЦ ГО N0:128.

Пример 34. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:100

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:100 представляет собой слитый белок, имеющий длину 221 аминокислот и массу 25,2 кДа, в котором на Юконце последовательности ^^095-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен октамерный пептид, полученный из 8тас/^IΛВ^0 (8ЕЦ ГО N0:39). Последовательность ТКАГО на своем Юконце имеет присоединенный полицистеиновый линкер (8ЕЦ ГО N0:177) для стабилизации ее тримерной стуктуры. Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГО распо- 38 023005 ложены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е® ГО N0:52) и ММР (8ЕО ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 7, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Е® ГО N0:100 и 8Е® ГО N0:129.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соН Типег (ОЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 35. Слитый белок с последовательностью 8Е® ГО N0:101

Белок с последовательностью 8Е® ГО N0:101 представляет собой слитый белок, имеющий длину 212 аминокислот и массу 24,5 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГЬ95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен октамерный пептид, полученный из 8тасГО1АВЬ0 (8Е® ГО N0:39). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГЬ расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е® ГО N0:52) и ММР (8Е® ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 7, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Е® ГО N0:101 и 8Е® ГО N0:130.

Пример 36. Слитый белок с последовательностью 8Е® ГО N0:102

Белок с последовательностью 8Е® ГО N0:102 представляет собой слитый белок, имеющий длину 212 аминокислот и массу 24,5 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГЬ121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, сконструированный из белка аРР и домена ВН3 белка Вах (8Е® ГО N0:153). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 6 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью ТКАГЬ и последовательностью эффекторного пептида расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е® ГО N0:52) и ММР (8Е® ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 7, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Е® ГО N0:102 и 8Е® ГО N0:131.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е.соН Типег (ОЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 37. Слитый белок с последовательностью 8Е® ГО N0:103

Белок с последовательностью 8Е® ГО N0:103 представляет собой слитый белок, имеющий длину 247 аминокислот и массу 28,1 кДа, в котором на Оконце последовательности ТКАГО95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, сконструированный из белка аРР и домена ВН3 белка Вах (8Е® ГО N0:153). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 6 остатков Агд. Последовательность ТКАГЬ на своем Оконце имеет прикрепленный полицистеиновый линкер (8Е® ГО N0:177) для стабилизации ее тримерной труктуры. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГЬ расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8Е® ГО N0:52) и ММР (8ЕО ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 8, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями 8Е® ГО N0:103 и 8Е® ГО N0:132.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей про- 39 023005 цедурой А, используя штамм Е.соП Типег (ЭЕ3). приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 38. Слитый белок с последовательностью БЕЦ ΙΌ N0:104

Белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:104 представляет собой слитый белок, имеющий длину 212 аминокислот и массу 24,4 кДа, в котором на С-конце последовательности ТНА1Ы14-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид, сконструированный из белка аРР и домена ВН3 белка Вах (БЕЦ ГО N0:153). Кроме того, между последовательностью ТНАГО и последовательностью эффекторного пептида расположены последовательности участков расщепления протеаз ММР (БЕЦ ГО N0:51) и иРА (БЕЦ ГО N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 8, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями БЕЦ ГО N0:104 и БЕЦ ГО N0:133.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соН Типег (ЮЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 39. Слитый белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:105

Белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:105 представляет собой слитый белок, имеющий длину 221 аминокислоту и массу 24,8 кДа, в котором на Юконце последовательности ТНАГО120-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из Ретикулона НТШ-С (БЕЦ ГО N0:155). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет последовательность локализации ядра (БЕО ГО N0:168). Дополнительно, для стабилизации ее тримерной структуры последовательность ТНАГО на своем Юконце имеет прикрепленный полицистеиновый линкер (БЕЦ ГО N0:179), фланкированный двумя и тремя остатками глицина, соответственно на своем Ю и С-конце. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТНАГО расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (БЕЦ ГО N0:52) и ММР (БЕЦ ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 8, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями БЕЦ ГО N0:105 и БЕЦ ГО N0:134.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соН Типег (ЭЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 40. Слитый белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:106

Белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:106 представляет собой слитый белок, имеющий длину 435 аминокислот и массу 48 кДа, в котором на Юконце последовательности ТНА1Е119-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из Ретикулона НТЮ-С (БЕЦ ГО N0:156). На Сконце последовательности эффекторного пептида прикреплен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 8 остатков Агд. Дополнительно, для стабилизации тримерной структуры на Юконце последовательности ТНАГО прикреплен полицистеиновый линкер (БЕЦ ГО N0:178). Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТНАГО расположены последовательности участков расщепления протеаз иРА (БЕЦ ГО N0:52) и ММР (БЕЦ ГО N0:51), эта последовательность участков расщепления фланкирована линкерной последовательностью ССБСС (БЕЦ ГО N0:60) соответственно на N и С-концах.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 8, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соН, представлены соответственно последовательностями БЕЦ ГО N0:106 и БЕЦ ГО N0:135.

Пример 41. Слитый белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:107

Белок с последовательностью БЕЦ ГО N0:107 представляет собой слитый белок, имеющий длину 580 аминокислот и массу 65 кДа, в котором на С-конце последовательности ТНАГО121-281 в качестве эффекторного пептида присоединена конститутивно активная каспаза-3 (одиночная цепь) (БЕЦ ГО N0:157). Кроме того, между последовательностью ТНАГО и последовательностью эффекторного пептида

- 40 023005 расположен транспортный домен, полученный из Ркеиботопак (8ЕЦ ГО N0:176). Транспортный домен и последовательность эффекторного пептида соединены посредством гибкого линкера ССС8ССС (8ЕЦ ГО N0:62). Транспортный домен отделен от последовательности ТРАГО последовательностью участка расщепления фурина (8ЕЦ ГО N0:53), эта последовательность участка расщепления фланкирована на своих N и С-концах двумя линкерными последовательностями СССС8 (8ЕЦ ГО N0:59) и А8СС (8ЕЦ ГО N0:65) соответственно.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 8, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:107 и 8ЕЦ ГО N0:136.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (ИЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 42. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:108

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:108 представляет собой слитый белок, имеющий длину 247 аминокислот и массу 28,5 кДа, в котором на №конце последовательности ТРАГО119-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен домен 8АС из Раг-4 (8ЕЦ ГО N0:158). На своем С-конце последовательность эффекторного пептида имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Дополнительно, на №конце последовательности ТРАГО прикреплен гибкий глицин-сериновый линкер СС8СС (8ЕЦ ГО N0:60). Кроме того, между последовательностью ТРАГО и последовательностью эффекторного пептида расположены последовательности участков расщепления, распознаваемые протеазами иРА (8ЕЦ ГО N0:52) и ММР (8ЕЦ ГО N0:173).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 9, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:108 и 8ЕЦ ГО N0:137.

Пример 43. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:109

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:109 представляет собой слитый белок, имеющий длину 247 аминокислот и массу 28,5 кДа, в котором на №конце последовательности ТРАГО119-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен домен 8АС из Раг-4 (8ЕЦ ГО N0:158). На С-конце последовательности эффекторного пептида присоединен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд, и на его №конце последовательность (ядерный сигнал локализации) из транскрипционного фактора 0с16 (8ЕЦ ГО N0:168). На №конце последовательности ТРАГО присоединен гибкий глицинсериновый линкер СС8СС (8ЕЦ ГО N0:60). Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТРАГО расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (8ЕЦ ГО N0:52) и ММР (8ЕЦ ГО N0:173).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 9, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8ЕЦ ГО N0:109 и 8ЕЦ ГО N0:138.

Пример 44. Слитый белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:110

Белок с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:110 представляет собой слитый белок, имеющий длину 270 аминокислот и массу 30,8 кДа, в котором на С-конце последовательности ТРАГО95-281 в качестве эффекторного пептида присоединен белок №\а (8ЕЦ ГО N0:159). На №конце последовательности эффекторного пептида прикреплен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Дополнительно, для стабилизации тримерной структуры последовательность ТРАГО на своем С-конце имеет прикрепленный полицистеиновый линкер (8ЕЦ ГО N0:177), отделенный от последовательности ТРАГО гибким глицин-сериновым линкером СС8С (8ЕЦ ГО N0:57). Кроме того, между последовательностью ТРАГО и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (8ЕЦ ГО N0:51) и иРА (8ЕЦ ГО N0:52).

- 41 023005

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 9, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соб, представлены соответственно последовательностями 8ЕО ГО N0:110 и 8Е0 ГО N0:139.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соб Типег (ЭЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 45. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:111

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:111 представляет собой слитый белок, имеющий длину 207 аминокислот и массу 23,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ТКАГО114-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид МТЭ/СКР, полученный из белка №ха (8Е0 ГО N0:160). На №конце последовательности эффекторного пептида присоединен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Для стабилизации ее тримерной структуры последовательность ТКАГО на своем С-конце имеет присоединенный полицистеиновый линкер (8Е0 ГО N0:177), этот линкер отделен от последовательности ТКАГО гибким глицин-сериновым линкером ОО8О (8Е0 ГО N0:57). Кроме того, между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (8Е0 ГО N0:51) и иРА (81 ГО) ГО N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 9, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соб, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:111 и 8Е0 ГО N0:140.

Пример 46. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:112

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:112 представляет собой слитый белок, имеющий длину 311 аминокислот и массу 35 кДа, в котором на №конце последовательности ТКАГО95-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид онконаза (8Е0 ГО N0:41). Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАГО расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (8Е0 ГО N0:52) и ММР (8Е0 ГО N0:51), дополнительно отделенная от последовательности ТКАГО двумя гибкими глицин-сериновыми линкерами ОООО8 (8Е0 ГО N0:59).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 9, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соб, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:112 и 8Е0 ГО N0:141.

Пример 47. Слитый белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:113

Белок с последовательностью 8Е0 ГО N0:113 представляет собой слитый белок, имеющий длину 230 аминокислот и массу 27 кДа, в котором на №конце последовательности ТКАГО95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен домен ВН3 белка РИМА (8Е0 ГО N0:37). Последовательность эффекторного пептида на своем С-конце имеет прикрепленный полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 9 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью ТКАГО и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (81 ГО) ГО N0:52) и ММР (8ЕО ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 10, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. соб, представлены соответственно последовательностями 8Е0 ГО N0:113 и 8Е0 ГО N0:142.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. соб Типег (ЭЕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли посредст- 42 023005 вом электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 48. Слитый белок с последовательностью 8Еф ГО N0:114

Белок с последовательностью 8Еф ГО N0:114 представляет собой слитый белок, имеющий длину 225 аминокислот и массу 25,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤРΑI^95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен короткий пептид, полученный из белка ВМ (8Еф ГО N0:31). На Сконце последовательности эффекторного пептида прикреплен транспортный домен ΚΕΚΚΕΥ (8Еф ГО N0:167). Для стабилизации тримерной структуры на С-конце последовательности теАГО прикреплен полицистеиновый линкер (8Еф ГО N0:177). Кроме того, между последовательностью теАГО и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (8Еф ГО N0:51) и иРА (8Еф ГО N0:52).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 10, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Еф ГО N0:114 и 8Еф ГО N0:143.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е.сой Τιπκγ (ОЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли посредством электрофореза в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 49. Слитый белок с последовательностью 8Еф ГО N0:115

Белок с последовательностью 8Еф ГО N0:115 представляет собой слитый белок, имеющий длину 234 аминокислоты и массу 26,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤРΑI^95-281 в качестве эффекторного пептида присоединен короткий гибридный пептид АйрМРК (8Еф ГО N0:161). Кроме того, между последовательностью УКАГО и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (8Еф ГО N0:51) и иРА (8Еф ГО N0:52), дополнительно отделенная от последовательности ΈΚ^υ полицистеиновым линкером (8Еф ГО N0:177) для стабилизации ее тримерной структуры, за которым следуют два остатка глицина.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 10, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Еф ГО N0:115 и 8Еф ГО N0:144.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Τιπκγ (ЮЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли электрофорезом в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 50. Слитый белок с последовательностью 8Еф ГО N0:116

Белок с последовательностью 8Еф ГО N0:116 представляет собой слитый белок, имеющий длину 216 аминокислот и массу 24,3 кДа, в котором на Жконце последовательности ΤΚΑГ^120-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептидный ингибитор домена 8Η2 белка 8!а!3 (8Еф ГО N0:162). Дополнительно, для стабилизации тримерной структуры на Жконце последовательности ΤΕΜΕ присоединен полицистеиновый линкер (8Еф ГО N0:179), линкер фланкирован на его N и С-концах тремя остатками глицина и мотивом О8О соответственно. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ЕКАГЕ расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (8Еф ГО N0:52) и ММР (8Еф ГО N0:51).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 10, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 8Еф ГО N0:116 и 8Еф ГО N0:145.

Пример 51. Слитый белок с последовательностью 8Еф ГО N0:117

Белок с последовательностью 8Еф ГО N0:117 представляет собой слитый белок, имеющий длину 194 аминокислоты и массу 22,8 кДа, в котором на Жконце последовательности ΤΚΑГ^121-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из домена ВН3 белка Вак (8Еф ГО N0:163). На С-конце последовательности эффекторного пептида прикреплен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 7 остатков Агд. Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ЕКАГЬ расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (8ЕС) ГО N0:52) и ММР (8ЕО ГО N0:51).

- 43 023005

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 10, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. соП, представлены соответственно последовательностями δΕΟ ΙΌ Ν0:117 и δΕΟ ΙΌ Ν0:146.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Ε. соП Τιιικγ (ΌΕ3), приобретенный в коуадеп. Белок выделяли электрофорезом в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 52. Слитый белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:118

Белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:118 представляет собой слитый белок, имеющий длину 257 аминокислот и массу 30 кДа, в котором на Ν-конце последовательности ΤΡΑΙΌ121-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид, полученный из домена ВН3 белка Ваб (δΕΟ ΙΌ Ν0:164). На С-конце последовательности эффекторного пептида присоединен полиаргининовый транспортный домен, состоящий из 8 остатков Лгд. Между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ΤΚΑΙΌ расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами πΡΑ (δΕΟ ΙΌ Ν0:52) и ММР (δΕΟ ΙΌ Ν0:51). На С-конце последовательности ΤΚΑΙΕ121-281 расположен гибкий линкер ΟΟδΗΟ (δΕΟ ΙΌ Ν0:182), за которым следует последовательность участка расщепления, распознаваемая протеазой тромбин (δΕΟ ΙΌ Ν0:174) и, как С-концевая область всей конструкции, последовательность ΤΚΑΙΕ95-121.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 11, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями δΕΟ ΙΌ Ν0:118 и δΕΟ ΙΌ Ν0:147.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Ε. сой Τιιικγ (ΌΕ3), приобретенный в №уадеп. Белок выделяли электрофорезом в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 53. Слитый белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:119

Белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:119 представляет собой слитый белок, имеющий длину 236 аминокислот и массу 27,5 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤΚΑΙΕ95-281 в качестве эффекторного пептида прикреплен пептид, полученный из домена ВН3 белка Ваб (δΕΟ ΙΌ Ν0:164). На Ν-конце последовательности эффекторного пептида присоединен транспортный полиаргининовый домен, состоящий из 7 остатков Лгд. Кроме того, между последовательностью ΤΚΑΙΌ и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (δΕΟ ΙΌ Ν0:51) и πΡΑ (δΕΟ ΙΌ Ν0:52), С-конец последовательности ΤΚΑΙΌ95-281 дополнительно отделен от последовательности участков расщепления линкером, состоящим из остатков ΟΟδ.

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 11, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями δΕΟ ΙΌ Ν0:119 и δΕΟ ΙΌ Ν0:148.

Пример 54. Слитый белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:120

Белок с последовательностью δΕΟ ΙΌ Ν0:120 представляет собой слитый белок, имеющий длину 216 аминокислот и массу 24,7 кДа, в котором на С-конце последовательности ΤΚΑΙΕ121-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид АТАР из белка ВГ11 (δΕΟ ΙΌ Ν0:165). На Ν-конце последовательности эффекторного пептида присоединен мембранный транспортный домен ΚΡΡΡΡΥΡ (δΕΟ ΙΌ Ν0:181). Кроме того, между последовательностью ΤΚΑΙΌ и последовательностью эффекторного пептида расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами ММР (δΕΟ ΙΌ Ν0:51) и πΡΑ (δΕΟ ΙΌ Ν0:52), дополнительно отделенная от последовательности ΤΚΑΙΌ гибким глицинсериновым линкером ΟΟΟΟδΟΟΟΟ (δΕΟ ΙΌ Ν0:180).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 11, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Ε. сой, представлены соответственно последовательностями δΕΟ ΙΌ Ν0:120 и δΕΟ ΙΌ Ν0:149.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую коди- 44 023005 рующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е.сой Типег (ΌΕ3), приобретенный в Ноеадеп. Белок выделяли электрофорезом в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Пример 55. Слитый белок с последовательностью 3ЕЦ ГО N0:121

Белок с последовательностью 3Е0 ГО N0:120 представляет собой слитый белок, имеющий длину 237 аминокислот и массу 27 кДа, в котором на №конце последовательности ТКАГО121-281 в качестве эффекторного пептида присоединен пептид АТАР из белка ВЙ1 (3ЕЦ ГО N0:165). На №конце последовательности эффекторного пептида присоединена митохондриальная направляющая последовательность (8Е0 ГО N0:166). Кроме того, между последовательностью эффекторного пептида и последовательностью ТКАТО расположена последовательность участков расщепления, распознаваемая протеазами иРА (8Е0 ГО N0:52) и ММР (3ЕЦ ГО N0:51), дополнительно отделенная от последовательности ТКАТО гибким глицин-сериновым линкером 00300 (3ЕЦ ГО N0:60).

Структура слитого белка представлена схематически на фиг. 11, и его аминокислотная последовательность и кодирующая последовательность ДНК, содержащая кодоны, оптимизированные для экспрессии в Е. сой, представлены соответственно последовательностями 3Е0 ГО N0:121 и 3Е0 ГО N0:150.

Аминокислотную последовательность структуры, описанную выше, использовали в качестве матрицы для создания ее кодирующей последовательности ДНК. Создавали плазмиду, содержащую кодирующую последовательность ДНК, и осуществляли сверхэкспрессию слитого белка в соответствии с общими процедурами, описанными выше. Сверхэкспрессию осуществляли в соответствии с общей процедурой А, используя штамм Е. сой Типег (БЕ3), приобретенный в Шуадеп. Белок выделяли электрофорезом в соответствии с общей процедурой, описанной выше.

Изучение активности против злокачественных новообразований слитых белков

Изучение активности против злокачественных новообразований слитых белков проводили ш уйго в реакции цитотоксичности на опухолевых клеточных линиях и ш νί\Ό на мышах. Для сравнения использовали белок ЙТКАТО114-281 (здесь и далее так же обозначенный как просто ТКАТО).

1. Испытания на клеточных линиях ш уйго

Клеточные линии

Клетки рака ободочной и прямой кишки человека Со1о205 (АТСС № ССЬ-222), мелкоклеточного рака легких А549 (АТСС № ССЬ-185), рака поджелудочной железы ВхРС3 (АТСС № СКЬ-1687), рака предстательной железы Όυ145 (АТСС № НТВ-81) и РС3 (АТСС № СКЬ-1435), крупноклеточного рака легких человека N0-4460-6^2 (Сайрег № 124316) поддерживали в среде ΚΡΜΙ 1640 (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки рака яичников человека 0УСАК-3 (АТСС № НТВ-161) поддерживали в среде ΚΡΜΙ 1640 (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 20% фетальной телячьей сывороткой и инсулином 0,01 мг/мл. Клетки рака мочевого пузыря иМ-иС-3 (АТСС № СКЬ-1749), клетки рака легких ЗК-МЕЗ-1 (АТСС № НТВ-58), клетки рака молочной железы МСР-7 (АТСС № НТВ-22), клетки рака соединительной ткани НТ1080 (АТСС № ССЬ-121), клетки гепатомы печения Нер02 (АТСС № НВ-8065) поддерживали в среде для культивирования МЕМ (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А). Клетки опухоли соединительной ткани НТ1080 поддерживали также в течение эксперимента в кондиционированной среде, собранной из 2-дневной нормальной культуры этих клеток. Клетки рака ободочной и прямой кишки человека НСТ-116 (АТСС № ССЬ-247) и НТ-29 (НТВ-38), рака яичников 3К-0У-3 (АТСС № НТВ-77), рака матки МЕ3-3А (АТСС № СКЬ-197 6) и их клон, устойчивый к доксорубицину, МЕ3-3АГОх5 (АТСС № СКЬ-1977), поддерживали в среде Мак-Коя (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки рака мочевого пузыря 3\У780 (АТСС № СКЬ-2169), клетки рака молочной железы МОА-МВ-231 (АТСС № НТВ-26) и эпителиоподобную клеточную линию карциномы поджелудочной железы человека РАИС-1, СЬ3 (Се11 Ьшек 3егу1се № 300228) поддерживали в БМЕМ (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Клетки НиУЕС пупочной вены (АТСС № СКЬ-1730) поддерживали в среде М199 (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А), дополненной 20% фетальной телячьей сывороткой, факторами роста 0,02 мг/мл ЕС03 (31дта), гепарином 0,1 мг/мл (31дта), эти клетки выращивали на среде, покрытой 0,1% желатина. Клетки молочной железы МСР10А (АТСС № СКЬ-10317) поддерживали в ОМЕМ:Р12 (1:1) (31дта, и3А), дополненной 5% лошадиной сывороткой, гидрокортизоном 0,5 мг/мл, инсулином 10 мкг/мл, фактором роста Е0Р 20 нг/мл (все производства 31дта, и3А). Кроме того, все среды были дополнены 2 мМ Ь-глутамином и антибиотиками (100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Нус1опе, Ьодап, иТ, и3А)). Клетки поддерживали при 37°С при 5% СО₂/воздух в случае использования среды для культивирования КРМф МЕМ, МсСоу и БМЕМЫ2 и при 10% С0₂/воздух в случае использования среды БМЕМ. Клетки, по стандартной методике, проверяли на наличие микоплазмы посредством ПЦР, используя набор для выявления микоплазмы Уепог®0еМ Мусор1а§та РСК Бе1есйоп Κίΐ (Мшегуа Вю1аЪ8, Вегйп, Оегтапу).

МТТ тест на цитотоксичность

МТТ-тест представляет собой колориметрический метод, используемый для оценки клеточной пролиферации, жизнеспособности и цитотоксичности. Метод основан на реакции разложения желтой тетра- 45 023005 золиевой соли МТТ (4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до водорастворимого пурпурного красителя формазан посредством фермента сукцинат-тетразолий редуктаза, присутствующего в митохондриях. Восстановление МТТ происходит только в живых клетках. Анализ полученных данных заключается в определении Ιί'.'₅₀ концентрации белка (в нг/мл), при которой происходит 50% уменьшение числа клеток в обработанной популяции по сравнению с контрольными клетками. Проводили анализ результатов, используя СгарЬРаб РгЬт 5.0.

Данный тест осуществляли в соответствии с описаниями в литературных источниках (СеШ ЬЕ., (1998). Се11 Вк1оду, а ЬаЬогаТогу НапбЬоок, кесопб ебкоп, Асабетк Рге§8, Бап Ь1едо; Уапд Υ., КоЬ Ь.^., Т8Ш ЬН., (2004); куоктепТ оГ У1га1 апб сЬетка1 ГасТогк \νί11ι ога1 сапсег т Такай, 1рп 1 СЬп Οпсо1, 34 (4), 176-183).

Среду клеточной культуры разбавляли до определенной плотности (10⁴-10⁵ клеток на 100 мкл). Затем 100 мкл клеточной суспензии, разбавленной соответствующим образом, наносили в 96-луночный планшет в трех повторах. Подготовленные таким образом клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С в условиях 5% или 10% СО₂, затем к этим клеткам (в 100 мкл среды) добавляли дополнительные 100 мкл среды, содержащей различные концентрации тестируемых белков. Клетки инкубировали с тестируемыми белками в течение следующих 72 ч, что эквивалентно 3-4 периодам клеточного деления, после чего в среду с тестируемым белком добавляли 20 мл рабочего раствора МТТ (5 мг/мл) и инкубировали в течение 3 ч при 37°С в условиях 5% СО₂. Затем данную среду с раствором МТТ удаляли, и растворяли кристаллы формазана путем добавления 100 мкл ^МБΟ. После перемешивания измеряли оптическую плотность при 570 нм (контрольный фильтр 690 нм).

Результаты исследований цитотоксичности ш уЬго суммированы в табл. 1, 1а, 1Ь и 2 в виде значений к, (нг/мл), что соответствует концентрации белка, при которой цитотоксическое действие слитых белков наблюдается на уровне 50% относительно контрольных клеток, инкубированных только с растворителем. Каждый эксперимент представляет собой среднее значение двух независимых экспериментов, проведенных в трех повторах. В качестве критерия потери активности белковых препаратов было принято предельное значение Ιί'.'₅₀ 2000 нг/мл. Слитые белки со значением Ιί'.'₅₀ больше 2000 расценивались как неактивные.

Клетки для этого теста отбирали таким образом, чтобы включали опухолевые клеточные линии, естественным образом устойчивые к белку ТКАГЬ (критерий естественной устойчивости к ТКАГЬ: Ιί'.'₅₀ для белка ТКАбЬ > 2000), опухолевые клеточные линии, чувствительные к белку ТКАГЬ, и устойчивую к доксорубицину линию МЕБ-БА/ОХ5 в качестве опуховой линии, устойчивой к обычно применяемым лекарственным средствам против злокачественных новообразований.

Недифференцированную клеточную линию НИУЕС использовали в качестве здоровой контрольной клеточной линии для оценки эффекта/токсичности данных слитых белков для неопухолевых клеток.

Полученные результаты подтвердили возможность преодоления устойчивости клеточных линий к ТКАТЬ в результате применения некоторых слитых белков по настоящему изобретению на клетках, имеющих природную устойчивость к ТКАТЬ. Когда слитые белки по настоящему изобретению применяли в клетках, чувствительных к ТКАГЬ, в некоторых случаях наблюдали отчетливое и интенсивное потенциирование эффективности действия ТКАТЬ, проявляющееся сниженными значениями Ιί'.'₅₀ слитого белка по сравнению с Ιί'.'₅₀ ТКАТЬ самого по себе. Кроме того, цитотоксическая активность слитого белка по настоящему изобретению была получена в клетках, устойчивых к классическому средству против злокачественных новообразований доксорубицин, в некоторых случаях, будучи более сильной, чем действие ТКАГЬ.

Значения Ш больше 2000, полученные для неопухолевых клеточных линий, показали отсутствие цитотоксических эффектов, связанных с применением белков по настоящему изобретению на здоровых клетках, что свидетельствует о потенциально низкой системной токсичности белка.

- 46 023005

Таблица 1. Цитотоксическая активность слитых белков по настоящему изобретению и белков сравнения

	Непрерывное инкубирование	препаратов с клетками	в течение 72 ч	(тест МТТ, нг/мл)
Белок	МЕЗ-ЗА	ΜΕ3-3Α/ϋχ5	НСТ116	ЗК-МЕЗ-1	А549	МСЕ10А
	1С₅₀	±3ϋ	1С_Ь0	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ
ΤΚΑΙΓι 114-281	>2000		32,2	2,40	173	31,3	12,2	2,33	>2000		>2000
Пример 1	6, 98	1, 01	7, 05	0,63	39, 2	11,00	2,79	0,70	>2000		386	52,5
Пример 2	3,19	0, 41	2, 62	1,61	35,1	23,70	6,43	1,22	>2000		>2000
Пример 5	646	166,9	378	94,3	757	446, 3	1114	108,2	719	91,7	912	2,4
Пример 9	>2000		1720	312,7	>2000		791, 9	95, 8	>2000		>2000
Пример 14	8,99	8, 73	0, 53	0,265	7,73	5,45	0,45	0,091	>2000		>2000
Пример 18	312	110, 6	326	56,1	937	144, 6	184	30, 5	>2000		>2000
Пример 19	24, 9	21,2	19, 9	1,98	23, 9	2,31	87, 6	32, 4	87,2	45,8	83,1	19,33
Пример 20	259	60,0	172	20,9	223	110, 4	123	25, 6	296	3, 4	282	39, 9
Пример 2 4 (не по
настоящему
изобретению)	>2000		1760	3 67,7	85,6	19, 96	36, 8	7,44	>2000		>2000
Пример 25 (не по
настоящему
изобретению)	>2000		157	40, 0	991	119, 0	117,4	4,24	>2000		>2000
Пример 2 6 (не по
настоящему
изобретению)	>2000		>2000		1895	70,0	245	19, 2	>2000		>2000

Таблица 1а. Цитотоксическая активность слитых белков по настоящему изобретению

Белок	Непрерывное инкубирование препаратов с клетками в течение 72 ч (тест МТТ, нг/мл)
А549	НСТ116	МСЕ10А	МЕЗ-ЗА	ΜΕ3-3Α/ϋχ5	ЗК-МЕЗ-1
1С₅₀	±3ϋ	1С₅о	±30	1С_Ь0	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ	1С₅₀	±3ϋ
ТКА1Ь 95-281	10000		7558		10000		10000		29, 15	12,66	33, 60

Пример 16	2632,50	219,91	132,65	37,69	1890,00	894,03	65,63	4,41	32,24	7,86	20,31	2632,50
Пример 23	10000		223,55	105,29	10000		1280,00	304,06	292,50	86, 97	82,46	1, 48
Пример 4 2	31, 70	11,74	15,32	12, 85	53,33	12, 40	5,18	2,20	0, 40	0, 10	2, 53	2,15
Пример 3 6	142,05	32,46	5, 66	2,26	79,16	3,33	2392,50	2,12	0,58	0, 10	3, 95
Пример 3	3,10		9,43		4573		57,14		10, 67		6,83
Пример 35	889,55	276,41	14,10		1273,50		57,14		1, 18	0, 82	3, 93	0,32
Пример 51	307,95	72,05	1,29	1, 41	4, 97	1, 50	0, 64	0,34	0, 08	0, 11	0, 62

Таблица 1Ь. Цитотоксическая активность слитых белков по настоящему изобретению

Белок	Непрерывное инкубирование препаратов с клетками в	течение 72 ч (тест МТТ, нг/мл)
НТ29	Н460	РЬС/РКЕ/5	НерС2	РАЫС1
1С₅₀	±3Ό	1С₅₀	±3ϋ	1С₅0	+ 3Ό	1С₅₀	±3Ό	1С₅₀	±3ϋ
ΤΕΑΙΠ 95-281	10000		9000		10000		10000		10000
Пример 3	108		2,852	3, 10
Пример 3 5	3289,50		900,15
Пример 51					9, 66		10,49		22,91

2. Анализ цитотоксической активности отобранных белковых препаратов против расширенной панели опухолевых клеточных линий

В табл. 2 представлены результаты исследования цитотоксической активности т уйго для отобранных слитых белков по настоящему изобретению в отношении широкой панели опухолевых клеток из 5 различных органов, что соответствует широкому спектру наиболее распространенных видов злокачественных новообразований. Полученные значения 1С₅₀ подтверждают высокую цитотоксическую активность слитых белков и, тем самым, их потенциальную пригодность в лечении злокачественных новообразований.

- 47 023005

Таблица 2. Анализ цитотоксической активности отобранных белковых препаратов в отношении расширенной панели опухолевых клеточных линий

3. Противоопухолевая эффективность слитых белков т у1уо на ксенотрансплантатах

Противоопухолевое действие белковых препаратов проверяли на мышиной модели рака толстой кишки человека Со1о205, крупноклеточного рака легких человека N0^4 60-Ьис2, рака легких человека А549 и рака поджелудочной железы человека РΑNС-1.

Клетки

Клетки Со1о205 (АТСС № ССЬ-222) поддерживали в среде НРМ1 1640 (Нус1опе, Ьодап, ИТ, ИБА), смешанной в соотношении 1:1 со средой 0рй-МЕМ (1пукгодеп, Са!.22600-134), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином. В день подсаживания культур мышам клетки отделяли от подложки путем отмывания клеток трипсином (1пукгодеп), затем клетки центрифугировали при 1300 об/мин, 4°С, 8 мин, суспендировали в буфере НВББ (среда Напкк), производили подсчет и разбавляли до концентрации 28,57 х 10⁶ клеток/мл. Затем к клеткам был добавлен Ма!пде1 (ВБ Вюс81епсе8, Са!. 354248) до конечной концентрации 25 х 10⁶ клеток/мл.

Клетки Н460-Ьис2 поддерживали в среде НРМ1 1640 (Нус1опе, Бодап, ИТ, ИБА), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином. В день подсаживания культур мышам клетки отделяли от подложки путем отмывания клеток трипсином (1пу1!годеп), затем клетки центрифугировали при 1300 об/мин, 4°С, 8 мин, суспендировали в буфере НВББ (среда Напкк), производили подсчет и разбавляли до концентрации 50 х 10⁶ клеток/мл.

Клетки А549 поддерживали в среде НРМ1 1640 (Нус1опе, Бодап, ИТ, ИБА), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином. В день пересаживания ткани мышам клетки отделяли от подложки путем отмывания клеток трипсином (1пукгодеп), затем клетки центрифугировали при 1300 об/мин, 4°С, 8 мин, суспендировали в буфере НВББ (среда Напкк).

Клетки рака поджелудочной железы человека РΑNС-1 поддерживали в среде БМЕМ (Нус1опе, Бодап, ИТ, ИБА), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мМ глутамином. В день подсаживания культур мышам клетки отделяли от подложки путем отмывания клеток трипсином (1пукгодеп), затем клетки центрифугировали при 1300 об/мин, 4°С, 8 мин, суспендировали в буфере НВББ (среда Напк8).

Мыши

Противоопухолевую активность белков по настоящему изобретению изучали на 7-9-недельных мышах N00 БСГБ, приобретенных в Наг1ап ИК П6., БИа\У8 Еагт, В1се8!ег, ИК. В случае с клетками А549, N0^460-0402 и РΑNС-1 противоопухолевую активность белков по настоящему изобретению изучали на 4-5-недельных мышах Сг1:БН0-Ргк6с^8с16Нг^Ьг, приобретенных в Сйаг1е8 Н1уег Сегтапу. Мышей содержали в специальных безмикробных условиях со свободным доступом к пище и деионизованной воде (неограниченно). Все эксперименты на животных проводили в соответствии с методическими рекомендациями 1п!ег618с1р1тагу Рппс1р1е8 ап6 Сш6е1те8 £ог Ше И8е о£ Ашта18 т Не8еагсй, Магкейпд ап6 Е6исайоп, принятыми Уогк Аса6ету о£ Бс1епсе8' А6 Нос Сотт^ее оп Ашта1 Не8еагсй и утвержденными в Варшаве IV Боса1 Е!Ыс8 СоттШее оп Ашта1 Ехрептеп!а!юп (№. 71/2009).

Ход и анализ эксперимента

В день 0 мышам подкожно (п/к) в правый бок с помощью шприца с иглой 0,5 х 25 мм (Водтагк) подсаживали 5 х 10⁶ клеток Со1о205, суспендированных в 0,15 мл буфера НВББ и 0,05 мл Ма!пде1. Когда опухоли достигали размеров ~90-140 мм³ (день 11), мышей рандомизировали, чтобы получить средний размер опухоли ~115 мм³, и распределяли по группам обработки. Группам обработки вводили препараты слитых белков по настоящему изобретению и ТНА1П14-281 в качестве сравнения. Данные препараты

- 48 023005 вводили внутрибрюшинно (в/б) ежедневно в течение десяти дней (с|й/10) в дни 11-20. Когда в терапевтической группе средний размер опухоли достиг ~2000 мм³, мышей безболезненно умерщвляли посредством повреждения позвоночника. Контрольная группа получала ТКАГЬ114-281.

В случае Н460 в день 0 мышам подкожно (п/к) в правый бок с помощью шприца с иглой 0,5 / 25 мм (Водтагк) подсаживали 5 / 10⁶ клеток N0-4460-0^2, суспендированных в 0,1 мл буфера НВ88 и 0,05 мл Майгдек Когда опухоли достигали размеров ~100-120 мм³ (день 11), мышей рандомизировали и распределяли по группам обработки. Группам обработки вводили препараты слитых белков по настоящему изобретению и ТКА1Ы14-281 в качестве сравнения. Данные препараты вводили внутривенно (в/в) 6 раз в день через день. В экспериментальный день 29 мышей безболезненно умерщвляли посредством повреждения позвоночника. Контрольная группа получала ТКА1Ы14-281.

В случае А549 в день 0 мышам подкожно (п/к) в правый бок с помощью шприца с иглой 0,5 / 25 мм (Водтагк) подсаживали 7 / 10⁶ клеток А549, суспендированных в 0,1 мл смеси буфер НВ88:Майгде1 в соотношении 3:1. Когда опухоли достигали размеров ~100-120 мм³ (день 17), мышей рандомизировали и распределяли по группам обработки. Группам обработки вводили препараты слитых белков по настоящему изобретению и ТКА1Ы14-281 в качестве сравнения. Данные препараты вводили внутривенно (в/в) 6 раз в день через день. В экпериментальный день 34 мышей безболезненно умерщвляли посредством повреждения позвоночника. Контрольная группа получала ТКАГЬ114-281.

В случае РЛNС1 в день 0 мышам подкожно (п/к) в правый бок с помощью шприца с иглой 0,5 / 25 мм (Водтагк) подсаживали 7 / 10⁶ клеток РЛNС1, суспендированных в 0,1 мл смеси буфер НВ88:Макпде1 в соотношении 3:1. Когда опухоли достигали размеров ~95 мм³ (день 27), мышей рандомизировали и распределяли по группам обработки. Группам обработки вводили препараты слитых белков по настоящему изобретению и ^^014-281 в качестве сравнения. Данные препараты вводили внутривенно (в/в) 6 раз в день через день. В экспериментальный день 43 мышей безболезненно умерщвляли посредством повреждения позвоночника. Контрольная группа получала ТКАГЬ114-281.

Размер опухоли измеряли посредством электронного циркуля, объем опухоли рассчитывали, используя формулу: (а² / Ь)/2, где а = более короткое диагональное сечение данной опухоли (мм) и Ь = более длинное диагональное сечение данной опухоли (мм). Ингибирование роста опухоли рассчитывали по формуле

ТС1 [%] (Ингибирование роста опухоли) = (ν^νΟ) / 10-100%, где VΊ означает средний объем опухоли в группе обработки, VС означает средний объем опухоли в контрольной группе.

Результаты эксперимента представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (80). Все расчеты и графики были получены с помощью программного обеспечения СгарйРай Ргкт 5.0.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 12 и 13 в виде графиков изменения объема опухоли у мышей 8СГО^0И, обремененных раком толстой кишки Со1о205, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению и для сравнения с помощью ТКА1Ы14-281. Результаты эксперимента, представленные на графиках на фиг. 12 и 13, демонстрируют, что применение слитых белков по настоящему изобретению из примера 1 и примера 14 вызывает ингибирование роста опухоли Со1о205 с ТС1 соответственно 39 и 32% по сравнению с контролем на день 29 эксперимента. Для ТКА1Ь114-281, который использовали в качестве эталонного препарата, был получен незначительный ингибирующий эффект по сравнению с контролем, с ТС1 на уровне 9%. Таким образом, слитые белки по настоящему изобретению проявляют более сильное действие по сравнению с ТКАГЬ.

Проверенные слитые белки не вызывали значительных побочных эффектов, проявляющихся снижением массы тела мыши (а именно менее чем 10% от начальной массы тела). Это свидетельствует о низкой системной токсичности белка.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 14 и 15 в виде графиков изменения объема опухоли у мышей Сг1:8Н0-Ргкйс^8с1йНг^Ьг, обремененных крупноклеточным раком легких человека N0-460, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению и для сравнения с помощью ТКА1Ы14281. Видно, что в результате применения слитых белков по настоящему изобретению из примера 14 и примера 2 было достигнуто ингибирование роста опухоли N00460 с ТС1 соответственно 82 и 81% по сравнению с контролем, на экспериментальный день 29. Для ТКА1Ы14-281, который использовали в качестве эталонного препарата, был получен незначительный ингибирующий эффект по сравнению с контролем с ТС1 на уровне 75%. Таким образом, слитые белки по настоящему изобретению проявляют более сильное действие против этих раковых клеток по сравнению с ТКАГЬ.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 16 и 17 в виде графиков изменения объема опухоли у мышей Сг1:8Н0-Ргкйс^8с1йНг^Ьг, обремененных раком легких человека А549, получавших лечение слитыми белками по настоящему изобретению и для сравнения с помощью ТКАГЬ114-281. Видно, что в результате применения слитых белков по настоящему изобретению из примера 14 и примера 2 было дос- 49 023005 тигнуто ингибирование роста опухоли А549 с ТОI соответственно 48 и 45,5% по сравнению с контролем, на экспериментальный день 29. Для ТКА1Ы14-281, который использовали в качестве эталонного препарата, был получен незначительный ингибирующий эффект на рост опухолевых клеток по сравнению с контролем с ТОI на уровне 20,7%. Таким образом, слитые белки по настоящему изобретению проявляют более сильное действие по сравнению с ТКАН..

Результаты эксперимента представлены на фиг. 18 и 19 в виде графиков изменения объема опухоли у мышей Сг1:8Н0-Ргкбе^вс1бНг^Ьг, обремененных карциномой поджелудочной железы человека РАЛС-1, эпителиоподобные клетки, обработанные слитыми белками и для сравнения с помощью ТКА1Ы14-28Т Видно, что в результате применения слитых белков по настоящему изобретению из примера 14 и примера 2 было достигнуто ингибирование роста опухоли РАNС-1 с ТОI соответственно 41,5 и 49,8% по сравнению с контролем, на экспериментальный день 43. Для ТКАЮ14-281, который использовали в качестве эталонного препарата, был получен незначительный ингибирующий эффект на рост опухолевых клеток по сравнению с контролем, с ТОI на уровне 32%. Таким образом, слитые белки по настоящему изобретению проявляют более сильное действие против этих раковых клеток по сравнению с ТКАН..

Определение с помощью циркулярного дихроизма содержания вторичных структур в препаратах слитых белков по настоящему изобретению

Качество структуры препаратов слитых белков в отношении их структуры было определено посредством анализа вторичных структур, используя метод циркулярного дихроизма (СБ). В данном методе СБ используется оптическая активность белковых структур, проявляющаяся в ротации плоскости поляризации света и появлении эллиптической поляризации. СБ-спектр белков в дальней области ультрафиолетового излучения (υν) обеспечивает точные данные о главной полипептидной цепи.

В диализных мешках (81§та-А1бпсЬ) с точкой отсечки молекулярной массы 12 кДа проводили диализ образцов белков, полученных в примере 1, примере 2, примере 14, примере 24, примере 51 и примере 42 и сформулированных с буфером, состоящим из 50 мМ Тпв-НС1 рН 8,0, 100 мМ ЫаС1, 10% глицерина, 0,1 мМ ΖиС1₂, 80 мМ сахарозы, 5мМ БТТ. Диализ осуществляли при встряхивании против 100-кратного избытка (об/об) буфера по сравнению с белковыми препаратами, в течение нескольких часов при 4°С. После завершения диализа каждый препарат центрифугировали (25000 об/мин, 10 мин, 4°С) и собирали соответствующие супернатанты. Концентрацию белка в образцах, полученных таким образом, определяли методом Брэдфорд.

Определение циркулярного дихроизма для белков в концентрации в диапазоне 0,1-2,7 мг/мл осуществляли на спектрополяриметре 1авсо 1-710, в кварцевой кювете с оптическим путем 0,2 или 1 мм. Измерение проводили в потоке азота 7 л/мин, что позволяет осуществить измерение при диапазоне длины волны 195-250 нм.

Параметры измерения: спектральное разрешение - 1 нм; полуширина светового луча 1 нм; чувствительность 20 тбед, время усреднения для одной длины волны - 8 с, скорость сканирования 10 нм/мин.

Результаты представлены в виде среднего значения трех экспериментов. Циркулярный дихроизм спектра для белков по примеру 1, примеру 2, примеру 14, примеру 24, примеру 51 и примеру 42 представлен на фиг. 20.

Проводили анализ полученных спектров в числовом виде в диапазоне 193-250 нм, используя пакет программ СБРго. Точками, для которых напряжение на фотоумножителе превышало 700 V, пренебрегали по причине слишком низкого сигнала к коэффициенту шума при этой длине волны. Полученные результаты использовали для расчета конкретной доли вторичной структуры в анализируемых белках с использованием пакета программ СБРго (табл. 4).

Таблица 4. Доля вторичных структур в проанализированных белках

Белок	ΝΚΜ3ϋ (Ехр-Са1)	сх- спираль (%)	β- складка (%)	Шифф (%)	Нарушение (%)
Пример 24	0, 720	4,1%	46, 7%	26, 4%	22, 8%
Пример 42	0, 100	18,4%	28,7%	22, 0%	30, 8%
Пример 1	0, 105	20, 3%	27,4%	22, 9%	29, 3%
Пример 2	0, 035	14,8%	32,2%	21,3%	31, 6%
Пример 51	0, 302	4,5%	38, 6%	22,5%	34,4%
Пример 14	0, 220	3, 5%	39, 0%	21, 1%	36,3%
ЫТЕА1Ь*		1,94%	50,97%	7,74%	39,35%
НгТКА1Ъ114- 281	0, 389	4,9%	33, 7%	23, 1%	38,3%

* Значения, полученные на основе кристаллической структуры 1Ώ4ν

- 50 023005

Контроли (гНТКА1Ь114-281) раскрыли характерный спектр СО для белков с преобладающим типом β-складчатой структуры (резко очерченный минимум эллиптичности при длине волны 220 нм). Это подтверждает расчет вторичной структуры компонентов, которая предполагает незначительное количество элементов α-спирали. Полученный результат также согласуется с данными о кристаллической структуре белка ТКАГО, в соответствии с чем бета-элементы составляют более половины этой композиции. В случае слитых белков по примеру 1 и примеру 42 для спектров дихроизма характерны два минимума при длинах волн 208 и 220 нм, что является характерным для белков со смешанной вторичной структурой альфа/бета-типа. Это, вероятно, объясняется присоединением домена (например, ВН из Вах) к ТКАГО, что формирует альфа-спиральные структуры, так что смешанная природа вторичных структур в данных проанализированных слитых белках может подтвердить их присутствие (для примера 42 вследствие низкого качества спектра это менее ясно).

Для препаратов из примера 2, примера 51, примера 14 и примера 24, а так же для белка ТКАГО, была выявлена значительная доля структур бета-типа. Это, возможно, объясняется тем фактом, что прикрепленные короткие пептиды изначально имеют бета-структуру или являются неструктуризированными и, следовательно, не оказывают значительного влияния на их композиции. В случае белка по примеру 2 наблюдали также незначительное повышение доли альфа-структур. Так же как и в случае с белком по примеру 1, это может быть объяснено наличием домена ВН3, что образует схожие формы, или вследствие узкого спектра длин волн (высокий уровень шума в дальней области υν не допускает прочтение). Отсутствие четко очерченного диапазона 180-200 нм в проанализированной области спектра может быть причиной избыточного содержания α-спиральных структур.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Слитый белок, содержащий:

домен (а), который представляет собой функциональный фрагмент последовательности растворимого белка НТКАЗЬ, где фрагмент начинается с аминокислоты в положении ниже чем НТКАТГО, или последовательности, которая по меньшей мере на 70% гомологична ей; и домен (Ь), который представляет собой последовательность проапоптотического эффекторного пептида, который проявляет свое проапоптотическое действие через внутренний апоптотический путь, где последовательность домена (Ь) присоединена к С-концу и/или Б-концу домена (а).
2. Слитый белок по п.1, где домен (а) представляет собой фрагмент последовательности растворимого белка НТКАГО где фрагмент начинается с аминокислоты в положении в диапазоне от НТКАТГО до НТКАГО121 включительно и заканчивается аминокислотой НТКАГО281.
3. Слитый белок по п.1 или 2, где домен (а) выбран из группы, состоящей из НТКАГО114-281 (8ЕЦ ГО N0:27), НТКАГОШ^ (81Т) ГО N0:28), НТКАГО121-281 (81Т) ГО N0:29), НТКАГО116-281 и НТКАГО120-281.
4. Слитый белок по п.1, где домен (а) представляет собой последовательность НТКАГО95-281.
5. Слитый белок по пп.1-4, где домен (Ь) выбран из группы, состоящей из: фрагмента домена ВН3 белка Вах с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:30; фрагмента белка Βίά с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:31;

рибонуклеазы А с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:32;

цитохрома С с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:33;

гранзима В с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:34;

фрагмента белка №.1г77 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:35;

домена ВН3 белка Вак с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:36;

домена ВН3 белка РиМА/ВВС3 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:37;

белка РиМА/ВВС3 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:38;

фрагмента белка 8МАСГО1аЬ1о с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:39;

буфорина А с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:40;

онконазы с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:41;

фрагмента белка М4ш2 с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:42;

пептида, связывающегося с М4ш2, с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:43;

фрагмента луназина с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:44;

домена ВН3 белка ВП< с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:45;

пептидного ингибитора протеасомы с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:46;

домена, содержащего протеасому связывающие мотивы иГМ с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:47;

пептида, полученного из азурина, с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:151; пептида полноразмерного азурина с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:152;

пептида, сконструированного из белка аРР и домена ВН3 белка Вах, с последовательностью 8ЕЦ ГО N0:153;

пептида, сконструированного из белка аРР и домена ВН3 белка Вах, с последовательностью 8ЕЦ ГО

- 51 023005

N0:154;

пептида, полученного из ретикулона КТШ-С, с последовательностью 8Е® ГО N0:155; полноразмерного белка ретикулона 3 человека с последовательностью 8Е® ГО N0:156; модифицированной конститутивно активной каспазы-3 с последовательностью 8Е® ГО N0:157; домена 8АС из белка Раг-4 с последовательностью 8Е® ГО N0:158;

белка №ха с последовательностью 8Е® ГО N0:159; фрагмента ΜΎΩ/ΕΧΕ белка №ха с последовательностью 8Е® ГО N0:160; короткого гибридного пептида Ап1р-ТРК с последовательностью 8Е® ГО N0:161; пептидного ингибитора домена 8Н2 белка 81а13 с последовательностью 8Е® ГО N0:162; пептида, полученного из домена ВН3 белка Вак, с последовательностью 8Е® ГО N0:163; пептида, полученного из домена ВН3 белка Ваб, с последовательностью 8Е® ГО N0:164; и пептида АТАР из белка ВЙ1 с последовательностью 8Е® ГО N0:165.
6. Слитый белок по любому из пп.1-5, который между доменом (а) и доменом (Ь) содержит домен (с), содержащий участок расщепления протеазы, распознаваемый протеазами, присутствующими в окружении опухолевой клетки, выбранный из последовательности, распознаваемой металлопротеазой ММР, последовательности, распознаваемой урокиназой иРА, последовательности, распознаваемой фурином и их сочетанием.
7. Слитый белок по п.6, где последовательность, распознаваемая металлопротеазой ММР, представляет собой последовательность 8Е® ГО N0:51, 8Е® ГО N0:171 или 8Е® ГО N0:173, последовательность, распознаваемая урокиназой иРА, представляет собой 8Е® ГО N0:52, и последовательность, распознаваемая фурином, представляет собой 8Е® ГО N0:53 или 8Е® ГО N0:172.
8. Слитый белок по п.6 или 7, где домен (с) представляет собой сочетание последовательностей, распознаваемых металлопротеазой ММР и урокиназой иРА, расположенных рядом друг с другом.
9. Слитый белок по п.6 или 7, где домен (с) представляет собой последовательность, распознаваемую фурином.
10. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где домен (Ь) дополнительно связан с транспортным доменом (б), выбранным из группы, состоящей из:

(61) последовательности, направленной на эндоплазматический ретикулум, (62) полиаргининовой последовательности, транспортирующей через клеточную мембрану, состоящую из 6, 7, 8 или 9 остатков Агд, (63) домена транслокации Ркеиботопак аегидшока, выбранного из 8Е® ГО N0:54 или 8Е® ГО N0:176;

(64) мембранного транспортного домена, (65) ядерного домена локализации и (66) митохондриального направляющего домена, и их сочетаний.
11. Слитый белок по п.10, где последовательность (б1), направленная на эндоплазматический ретикулум, представляет собой КЕОЬ (8Е® ГО N0:55) или КОЕЬ (8Е® ГО N0:56).
12. Слитый белок по п.10 или 11, где последовательность (б1), направленная на эндоплазматический ретикулум, расположена на С-конце слитого белка.
13. Слитый белок по п.10, где полиаргининовая последовательность (б2) расположена на С-конце слитого белка.
14. Слитый белок по п.10, где полиаргининовая последовательность (б2) расположена между доменами (Ь) и (с).
15. Слитый белок по п.10, где домен транслокации Ркеиботопак аетидшока (б3) расположен между доменами (а) и (с).
16. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно содержит домен (е) гибкого глицин-серинового линкера между доменами (а), (Ь), (с) и/или (б), где глицин-сериновый линкер выбран из группы, состоящей из 0080 (8Е® ГО N0:57), ΟΟθ8 (8Е® ГО N0:58), 00008 (8Е® ГО N0:59), 00800 (8ЕО ГО N0:60), 000800 (8ЕО ГО N0:61), 0008000 (8ЕО ГО N0:62), 00080008 (8ЕО ГО N0:63), 000800008 (8ЕО ГО N0:64), А800 (8ЕО ГО N0:65), 0008А800 (8ЕО ГО N0:66), 008Н0 (8ЕО ГО N0:182), 80С08 (8ЕО ГО N0:169), 000080000 (8ЕО ГО N0:180), 800С008 (8ЕО ГО N0:183) и ААСАА (8ЕО ГО N0:184).
17. Слитый белок по п.1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0:1, 8ЕО ГО N0:2, 8ЕО ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:4, 8ЕО ГО N0:5, 8ЕО ГО N0:6, 8ЕО ГО N0:7, 8ЕО ГО N0:8, 8ЕО ГО N0:9, 8ЕО ГО N0:10, 8ЕО ГО N0:11, 8ЕО ГО N0:12, 8ЕО ГО N0:13, 8ЕО ГО N0:14, 8ЕО ГО N0:15, 8ЕО ГО N0:16, 8ЕО ГО N0:17, 8ЕО ГО N0:18, 8ЕО ГО N0:19, 8ЕО ГО N0:20, 8ЕО ГО N0:21, 8ЕО ГО N0:22, 8ЕО ГО N0:23, 8ЕО ГО N0:24, 8ЕО ГО N0:25, 8ЕО ГО N0:26, 8ЕО ГО N0:93, 8ЕО ГО N0:94, 8ЕО ГО N0:95, 8ЕО ГО N0:96, 8ЕО ГО N0:97, 8ЕО ГО N0:98, 8ЕО ГО N0:99, 8ЕО ГО N0:100, 8ЕО ГО N0:101, 8ЕО ГО N0:102, 8ЕО ГО N0:103, 8ЕО ГО N0:104, 8ЕО ГО N0:105, 8ЕО ГО N0:106, 8ЕО ГО N0:107, 8ЕО ГО N0:108, 8ЕО ГО N0:109, 8ЕО ГО N0:110, 8ЕО ГО N0:111, 8ЕО ГО N0:112, 8ЕО ГО N0:113, 8ЕО ГО N0:114, 8ЕО ГО N0:115, 8ЕО ГО N0:116, 8ЕО ГО N0:117, 8ЕО ГО

- 52 023005

Ν0:118, δΕ ^;.(_χ) ΙΌ Ν0:119, δΕρ ΙΌ Ν0:120 и δΕρ ΙΌ Ν0:121.
18. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно содержит в Сконцевой области последовательность ΗΤΚΑΙΌ95-121, перед которой расположена последовательность участка расщепления протеаз, обеспечивающая ее отщепление от конструкции.
19. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных новообразований у млекопитающего, содержащая в качестве активного вещества слитый белок по любому из пп.1-18, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
20. Способ лечения онкологического заболевания у млекопитающего, включая человека, предусматривающий введение индивиду эффективного количества слитого белка по пп.1-18 или фармацевтической композиции по п.19.