ES2216269T3

ES2216269T3 - Proteinas de fusion recombinantes a base de proteinas inactivadoras de ribosomas del muerdago viscum album.

Info

Publication number: ES2216269T3
Application number: ES98905267T
Authority: ES
Inventors: Jurgen Eck; Arno Schmidt; Holger Zinke
Original assignee: Viscum AG
Current assignee: Viscum AG
Priority date: 1997-01-02
Filing date: 1998-01-02
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2018-01-02
Also published as: AU6092498A; EP1012256A2; CA2276534A1; CA2276534C; DE19880004D2; DK1012256T3; ATE263248T1; WO1998029540A2; DE59811111D1; EP1012256B1; WO1998029540A3; PT1012256E; US20020045208A1; US20080227157A1

Abstract

Molécula de ácido nucleico, la cual codifica una proteína de fusión, que presenta los siguientes componentes: (a) un módulo efector, que ejerce su acción citotóxica intracelularmente; (b) un módulo de procesado, el cual está unido covalentemente al módulo efector, y que presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa, en donde el módulo de procesado comprende el propéptido de lectina de muérdago o un fragmento o derivado del mismo, en donde el fragmento o derivado presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa y la liberación intracelular del módulo efector en las células diana mediante las propias proteasas de las células en el curso de la endocitosis inducida por el receptor puede tener lugar en los endosomas y prelisosomas, y en donde el propéptido de la lectina de muérdago es codificado por una molécula de ácido nucleico.

Description

Proteínas de fusión recombinantes a base de proteínas inactivadoras de ribosomas del muérdago viscum album.

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, que codifican proteínas de fusión, las cuales contienen como componentes, por lo menos un módulo efector, un módulo de procesado y un módulo detector de dianas. De preferencia las moléculas de ácido nucleico según la invención codifican además un módulo modulador y/o un módulo de afinidad. La invención se refiere además a vectores que contienen estas moléculas de ácido nucleico, anfitriones que son transformados con vectores según la invención, proteínas de fusión, que codifican a partir de los ácidos nucleicos según la invención o son producidas por los anfitriones según la invención, así como medicamentos que contienen los polipéptidos o vectores según la invención. Estos medicamentos tienen particular significado en aquellas enfermedades que se basan en la multiplicación patológica y/o en el aumento de actividad de poblaciones celulares. En las enfermedades autoinmunológicas y alergias tiene lugar una fuerte proliferación, infiltración e inmunoactividad transitoria, gradual, de las células del sistema inmunológico, en donde la especificidad de estas células inmunológicas se basa siempre en la reacción sobre determinados antígenos o respectivamente alérgenos. Además, dichos medicamentos se emplean también ventajosamente en la terapia de tumores. Los polipéptidos y vectores descritos en esta invención pueden ser empleados para el desarrollo de medicamentos y para los ensayos de los factores que modulan la actividad de las toxinas. Con ello, la invención se refiere además, a los correspondientes procedimientos, empleos y kits. De preferencia los módulos, con excepción del módulo de afinidad y del módulo detector, se codifican a partir de ácidos nucleicos, que proceden de la secuencia codificadora de la proproteína de la lectina de muérdago, o derivan de la misma.

La investigación médica ha descubierto en los últimos años un amplio espectro de enfermedades, que surgen por modificación o degeneración de las células del propio cuerpo, lo cual se refleja p. ej., en el equipo de receptores específicos o modificados de las células. Una estrategia que ha ido generalizándose para el desarrollo de grupos de terapias, se funda en el principio de copular una substancia que aniquila las células, la cual no está en situación de penetrar en el interior celular, con una segunda substancia no tóxica, que está en situación de penetrar en el interior de la célula mediante la unión a una proteína de la superficie. Cuanto más específica para un tipo de célula es la molécula detector, tanto más selectivamente se pueden aniquilar las células patógenas, sin dañar las células sanas. Estas proteínas de fusión tóxicas específicas de tipos celulares, se emplean en forma de las llamadas inmunotoxinas y mitotoxinas (Vitetta y col., 1987; Lambert y col., 1988; Lappi y col., 1990; Pastan y col., 1991; Ramakrishnan y col., 1992; Brinkman, 1996), para el aniquilamiento selectivo de células tumorales.

Ejemplos conocidos de componentes aniquiladores celulares son las toxinas bacterianas, la toxina de la difteria (Collier, 1988), la exotoxina de Pseudomonas (Pastan y col., 1989) y la toxina del tétanos (Brinkmann, 1996) así como las proteínas vegetales activadoras de los ribosomas (RIP) (Barbieri y col., 1993). En las toxinas vegetales se distinguen las RIP del tipo I como p. ej., la gelonina o la saporina, que constan de un único dominio tóxico, y las RIP del tipo II (a las cuales pertenece también la lectina de muérdago), que poseen un segundo dominio con la propiedad de unirse a los azúcares (Stirpe y col., 1992; Barbieri y col., 1993). El representante más conocido del último grupo es la ricina. El desarrollo del efecto tóxico presupone un complejo camino de absorción y procesado: después de la absorción inducida por el receptor, el transporte mediante la vesícula "Clathrin-coated" a los endosomas (Nicolson, 1974) tiene lugar el procesado/liberación del componente toxina de la proteína de fusión como condición indispensable para la translocación en el citoplasma. Allí despliega la toxina su efecto tóxico y aniquila las células. La lectina de muérdago ha sido descrita como un potente inductor de la apoptosis (Janssen y col. 1996). Esta propiedad depende por otra parte del efecto conjunto de la cadena A y la cadena B, en donde la actividad RIP es irrenunciable. La citotoxicidad de la lectina de muérdago es apoptótica o necrótica en función de la concentración y del tiempo. Si se emplean altas concentraciones o respectivamente una alta dosificación, se observa una muerte necrótica de las células. Lo mismo sucede para concentraciones moderadas tóxicas, cuando se aplican durante un período de tiempo mayor de 24 horas. En un período de tiempo de menos horas o en concentraciones pequeñas, el tipo de muerte de las células inducidas por la ML es la apoptosis; esto se comprobó en distintos tipos de células (MOLT-4, THP-1, PBMC) (Möckel y col., 1997).

En los primeros ensayos, para unir una toxina con una molécula diana, se efectuaba una copulación química mediante tioéter (Masuho y col., 1982). Con ello ocurre en parte que, mediante la copulación irreversible tiene lugar una inactivación de la toxina (Vitetta y col., 1993). Por esta razón la mayoría de las veces, se emplean agentes de copulación que conducen a la copulación mediante un puente de disulfuro, como p. ej., el N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson y col., 1978); Jansen y col., 1982). Con ello, sin embargo, hay que aceptar la desventaja de que los componentes puenteados por el disulfuro poseen únicamente in vivo una relativa pequeña estabilidad. Además, con esta modificación química de las proteínas se observó a menudo una mayor pérdida de actividad (Thorpe y col., 1981; Battelli y col., 1990; Bolognesi y col., 1992).

Además, las lectinas del muérdago fueron también copuladas químicamente empleando el SPDP con anticuerpos. Así, p. ej., Tonevitsky y col., (Intern. J. of inmunopharm. (1991), 1037-1041) describe la copulación química de la cadena A de la lectina de muérdago I, con un anticuerpo monoclonal anti-CD5. Paprocka y col., (Arch. Immun. Ther. Exp. (1992), 223-227) copularon químicamente la cadena A de la lectina de muérdago I con el anticuerpo monoclonal anti-Ll210V. Sin embargo, como también ha descrito Paprocka (1992), una alta citotoxicidad inespecífica de las inmunotoxinas puede ser debida al cambio de conformación de la cadena A de la lectina de muérdago mediante la unión del anticuerpo.

Otra importante desventaja de la copulación química consiste en la formación de una mezcla de substancias no homogéneas, que implica el empleo de costosos métodos para el enriquecimiento del producto deseado (Pastan, 1992).

Para soslayar el problema de la copulación química, se ha empezado a estudiar el desarrollo de anticuerpos bifuncionales, los cuales pueden unirse por un sitio de unión a una toxina y por otro, a una célula diana (Milstein y col., 1983; Webb y col., 1985; Glennie y col., 1988). Mientras que debido a esto era posible una fácil liberación de la toxina en el curso de la internalización, durante la circulación en sangre se observó una parcial disociación de los complejos y con ello una parcialmente inespecífica toxicidad mediante la toxina. Además la expresión de los anticuerpos biespecíficos es un procedimiento muy costoso. A causa del alto peso molecular de esta construcción se eleva el potencial inmunológico así como empeora la penetración tumoral (Brinkmann, 1996). Además, la expresión de los anticuerpos biespecíficos es un procedimiento muy costoso.

Mediante modernos métodos de biología molecular, se ha logrado en los últimos tiempos, clonar proteínas tóxicas como p. ej., la toxina de la difteria, la exotoxina de Pseudomonas, la ricina o la saporina (Greenfield y col., 1983; Gary y col., 1984; Lamb y col., 1985; Benatti y col., 1989) y con ello hacer accesibles las fusiones genéticas con dominios diana. Con el empleo de toxinas bacterianas recombinantes pudieron lograrse verdaderos éxitos médicos respecto a su actividad, aunque sin embargo el empleo de estas toxinas es problemático puesto que grandes partes de la población habían sido inmunizadas mediante vacunas preventivas con lo que poseían anticuerpos neutralizantes contra los componentes de la toxina (Brinkmann, 1996). Por esta razón es ventajoso el empleo de toxinas vegetales, como p. ej., de la lectina de muérdago o de la ricina. Para el despliegue del efecto tóxico (de las RIP del tipo II ó respectivamente, proteínas de fusión recombinantes) es decisiva la liberación intracelular de la toxina/componente de la toxina (Barbieri y col., 1993). Por ejemplo, se empleó la cadena A de la ricina (ricina A) para la construcción recombinante de mitotoxinas, en donde se construyeron dos proteínas de fusión IL2-ricina A recombinantes, las cuales se diferencian en la selección de la secuencia de unión. La construcción con el bucle de la toxina de la difteria intracelular sensible a las proteasas, es citotóxica frente a las células CTLL-2, mientras que la segunda variante con una secuencia de unión no intracelular procesable no es citotóxica (Cook y col., 1993). Los autores utilizan a este respecto las secuencias sensibles a la proteasa que se encuentran de forma natural en las toxinas bacterianas. Una extrapolación del descubrimiento a otras toxinas como módulo efector no es posible o solo es posible con limitaciones. Así por lo tanto deben crearse para otras toxinas como las que describe von Cook, nuevas posibilidades de activación/procesado. Naturalmente se sintetizan las RIP tipo II en los vegetales en forma de pre-pro-proteínas inactivas a la RIP, y a continuación se procesan en compartimentos celulares especiales, a toxinas maduras (Lord, 1985). Puede ser mostrada la traducción del ARNm de la pro-ricina en los oocitos de Xenopus (Westby y col., 1992). A este respecto no se ha demostrado ningún punto de apoyo para una activación in vivo de la pro-proteína, lo cual excluye el empleo de una pro-ricina recombinante como toxina (Richardson y col., 1989). En base a este y otros resultados se ha deducido que el procesado de las pro-secuencias de RIP tipo II tiene lugar mediante proteasas vegetales especiales y este principio se ha aceptado también para la lectina del muérdago (Hara-Nishimura y col, 1991).

En la búsqueda de una toxina apropiada como substancia activa de las inmunotoxinas, se investigó principalmente la ricina. Tomando como base el dominio A de la RIP tipo II de la ricina (ricina A), se obtuvieron toda una serie de inmunotoxinas y se ensayaron para la terapia del cáncer (Spitler y col., 1987; Shen y col., 1988; Byers y col., 1989; Vitetta y col., 1991). Sin embargo, una propiedad desfavorable de la ricina A consiste en que puede penetrar también inespecíficamente en las células, de forma que en la mayoría de pacientes aparecen demasiados fuertes efectos secundarios, como p. ej., el "síndrome de derrame vascular" (Gould y col., 1989; Soer-Rodriguez y col., 1993). Además, se han descrito en otro estudio, trabajos para el empleo de la saporina como componente de inmunotoxinas. Este estudio se ocupa de la comparación de métodos de expresión bioquímica y recombinante de inmunotoxinas o mitotoxinas, en donde la saporina tipo I-RIP fue copulada tanto químicamente como también por fusión génica con el mitogen "bFGF" (Lappi y col., 1994). Las substancias obtenidas por diferentes medios muestran la misma actividad antitumoral tanto en estudios in vitro como in vivo, en los cuales la expresión de la substancia recombinante es posible prácticamente sin problemas. De todas maneras la liberación intracelular de la toxina fue posible solamente por la circunstancia no generalizada, de que en la molécula diana bFGF empleada, existe un sitio de escisión sensible a las proteasas. No parece por ello posible una amplia aplicación de los datos revelados por los autores sobre un amplio abanico de células diana de interés.

Sun y col., (1997) describen un conjugado covalente químico que consta de la subunidad toxina B del cólera (CTB) y de la proteína básica de la mielina (MBP), con el cual mediante la aplicación oral de 50 \mug de proteína, se puede suprimir con eficacia la EAE, el modelo animal de la MS. El conjugado con la toxina es de 50 a 100 veces más tóxica que el antígeno MBP solo. Los dos componentes MBP y CTB se aislaron cada vez de la fuente natural. Esta preparación muestra que en principio una toxina puede ser llevada al lugar de acción o sea a las células diana mediante el reconocimiento del antígeno. Sin embargo, la forma de obtención de los conjugados comprende las dificultades ya descritas de la copulación química y de la limitación de la disponibilidad y pureza invariable de los componentes.

Las proteínas de fusión fueron descritas para la aplicación como vacunas (Price, 1996). Para ello, se copularon en el antígeno del sistema de expresión de levaduras con GM-CSF para estimular la respuesta inmunológica, en donde el antígeno correspondiente está siempre copulado al terminal C del GM-CSF, opcionalmente mediante la introducción de un engarce. Las proteínas de fusión descritas son de aplicación limitada a la estimulación de células presentadoras de antígenos mediante el factor de crecimiento GM-CSF y su obtención en la expresión en levaduras.

Better y col., (1995) describen las proteínas de fusión a partir de anticuerpos humanizados y la gelonina RIP. Con ello, los autores pudieron detectar las células T y B CD5 positivas. Las toxicidades fueron a este respecto, muy marcadamente distintas según la orientación y clase de los componentes. Los PBMC de 2 diferentes donantes fueron insensibles contra los anticuerpos de las proteínas de fusión de la cadena A de la ricina pero sin embargo fueron sensibles contra dichas proteínas de fusión con gelonina como toxina. Esto demuestra que la selección de una toxina apropiada puede ser decisiva para la efectividad de una proteína de fusión inmunológica. La preparación de Better y col., plantea sin embargo la disponibilidad de los genes de los anticuerpos que codifican tales anticuerpos, que identifican un determinante específico de las células diana. Sin embargo, estas premisas no se dan incondicionalmente justamente en el caso de las células T autorreactivas, puesto que éstas se definen más bien mediante el reconocimiento del antígeno.

Otra preparación para hacer inocuas las células T autorreactivas mediante la presentación de su antígeno específico, se basa en una carga de moléculas MHC aisladas de membranas de células del bazo con fragmentos de antígeno, p. ej., péptidos receptores de MBP, HSP y acetilcolina (Spack y col., 1995). Mediante la presentación del correspondiente antígeno sin señales coestimuladoras, las células T se convierten en perezosas, es decir, la unión del antígeno no provoca ninguna proliferación sino que las células permanecen en descanso. En el modelo animal de la enfermedad auto-inmunológica Myastenia Gravis, se pudo evitar la progresión de la enfermedad con un complejo de proteína. La desventaja del proyecto de la inducción a la inactividad consiste en que el efecto no puede mantenerse por un tiempo prolongado, puesto que por sí mismo, el antígeno no tóxico en poca cantidad no mata las células, sino que las inhibe transitoriamente.

En general falta en el estado actual de la técnica un sistema modular de un adecuado módulo efector, módulo de procesado, módulo modulador, módulo detector y módulo de afinidad que haga posible una aplicabilidad universal en diferentes indicaciones médicas. Con el conocimiento de las poblaciones celulares de importantes enfermedades, en particular en el terreno de células competentes inmunológicas, sería de desear poder influir certeramente sobre éstas o respectivamente poder eliminarlas.

Un objetivo de la presente invención es por lo tanto, el suprimir las desventajas conocidas a partir del estado de la técnica en la construcción de inmunotoxinas y al mismo tiempo garantizar que las inmunotoxinas despliegan su acción tóxica en un amplio abanico de células diana, solo intracelularmente.

La solución de este objetivo se logra mediante las versiones caracterizadas en las reivindicaciones.

La invención se refiere por consiguiente a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, la cual presenta los siguientes componentes:

(a) un módulo efector, que ejerce su acción citotóxica intracelularmente;

(b) un módulo de procesado, el cual está unido covalentemente con el módulo efector, y que presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa, en donde el módulo de procesado comprende el propéptido de lectina de muérdago o comprende un fragmento o derivado del mismo, el cual presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa, y la liberación intracelular del módulo efector puede tener lugar en las células diana mediante las propias proteasas de las células en el curso de la endocitosis inducida por el receptor en los endosomas y prelisosomas, en donde el propéptido de la lectina de muérdago es codificado por una molécula de ácido nucleico, seleccionada del grupo compuesto por:

(i): moléculas de ácido nucleico, las cuales comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.c ó un fragmento de la misma;

(ii): moléculas de ácido nucleico, las cuales comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 11.c ó un fragmento de la misma;

(iii): moléculas de ácido nucleico, las cuales hibridan con una molécula de ácido nucleico de (i) ó (ii) en condiciones restrictivas; y

(iv): moléculas de ácido nucleico, las cuales degeneran en las moléculas de ácido nucleico indicadas en (iii) correspondientemente al código genético; y

(c) un módulo detector que está unido covalentemente con el módulo de procesado, y el cual específicamente está unido a la superficie de una célula, con lo cual se induce la internalización de la proteína de fusión en la célula.

Bajo el término "módulo" se entiende según la invención un péptido que es codificado a partir de una secuencia de ADN y presenta determinadas propiedades funcionales. Estas propiedades funcionales se basan en la estructura primaria, secundaria y terciaria de dichos péptidos y se refieren a funciones bioquímicas, moleculares, enzimáticas, celulares y/o fisiológicas. Un módulo según la invención se caracteriza además porque presenta adaptadores favorables sobre un plano de ADN, los cuales permiten fácilmente una fusión con otros módulos, y estas secuencias de adaptadores sobre planos de péptidos no interfieren desventajosamente con las funciones del módulo.

Bajo el término "proteína de fusión" se acuerda según la invención, que en el caso de los ácidos nucleicos según la invención y las proteínas de fusión codificadas por los mismos, se trata de moléculas obtenidas recombinantemente.

Bajo la expresión "módulo detector, que está unido covalentemente con el módulo de procesado" se entiende según la invención aquellas versiones en las cuales entre estos dos módulos están situados covalentemente otros módulos o secuencias. A este respecto, está representada en la figura 10.c una de tales versiones según la invención: allí se encuentra el módulo detector unido covalentemente al módulo de procesado mediante un módulo modulador. Es importante en el sentido de la presente invención, que el empalme del módulo de procesado y el módulo detector con o sin otras secuencias intermedias tiene carácter covalente.

La función del módulo efector consiste, según la invención, en la muerte o modificación duradera de los procesos vitales de las células diana. Esto puede provocarse mediante las actividades enzimáticas del módulo efector, desajustando procesos fisiológicos intracelulares (p. ej., procesos metabólicos, en particular procesos metabólicos energéticos, procesos genéticomoleculares, en particular la traducción, transcripción y replicación y cascadas celulares específicas como p. ej., la inducción de procesos apoptóticos). En cualquier caso se modifica mediante la actividad intracelular del módulo efector el status fisiológico de una célula diana, p. ej., se modifica el comportamiento de crecimiento, p. ej., se retrasa o se aniqila completamente y se destruye. Como ejemplo preferido para un módulo efector adecuado sirve el dominio A recombinante de la lectina de muérdago (rMLA) ó un fragmento tóxico intracelular o un derivado del mismo. Bajo el término "fragmento" de una cadena A de la lectina del muérdago, se entiende según la invención, un péptido que presenta una parte de la secuencia de aminoácidos de esta cadena y presenta actividad tóxica intracelular. La toxicidad no debe presentar la misma magnitud que la cadena A completa. Un fragmento puede crearse por ejemplo mediante la escisión proteolítica de la cadena A obtenida recombinantemente o mediante manipulación recombinante de los ácidos nucleicos que codifican la cadena A y la subsiguiente expresión. El experto sabe en base a su conocimiento general de la especialidad y a la enseñanza de esta invención, cómo puede obtener aquí en esta solicitud, y después, los fragmentos recombinantes mencionados y analizar su actividad. La actividad catalítica de la rMLA consiste en la despurinización de las células eucarióticas 28S rARN. El empleo de la rMLA como módulo efector es de particular interés, puesto que, en dosis terapéuticas, ocasiona la muerte de las células principalmente por inducción de la apoptosis, de forma que, contrariamente a la necrosis deja de ocurrir en gran parte la aparición de reacciones inflamatorias que dañan los tejidos por la liberación de restos celulares y componentes celulares intracelulares. La muerte celular programada (apoptosis) juega, entre otros, un papel en la regulación de las poblaciones celulares del sistema inmunológico p. ej., en la eliminación de células T, las cuales mediante su antígeno específico según la concentración pueden ser estimuladas o "sobreexcitadas". Este fenómeno constituye en el caso de las enfermedades autoinmunológicas el mecanismo natural para reprimir la reacción auto-inmunológica (finalización de un brote) (Schmied y col., 1993) y por ello puede ser utilizado terapéuticamente para estimular las células T autorreactivas por cesión de determinadas cantidades de autoantígeno en la apoptosis (Gold y col., 1997).

La función de los módulos de procesado consiste según la invención, por una parte en el empalme covalente del módulo efector con los módulos modulador, detector o de afinidad a una cadena de polipéptidos, lo cual permite la constitución recombinante de las proteínas de fusión. Por otra parte se caracterizan por el contenido de secuencias de reconocimiento apropiadas para las proteasas, lo cual permite la liberación intracelular del módulo efector en la célula diana mediante las proteasas propias de la célula en el curso de la endocitosis inducida por el receptor en los endosomas y prelisosomas. El módulo de procesado de la lectina de muérdago satisface sorprendentemente, por ejemplo, en la fusión del terminal C a la rMLA, al contrario de las correspondientes secuencias en los propéptidos de otras RIP II de tipo vegetal como p. ej., de la ricina, tanto las condiciones previas para el procesado intracelular mediante proteasas endosómicas de células de mamíferos o respectivamente células humanas, así como las propiedades inactivadoras de la rMLA en estado no procesado. De preferencia las proteasas que escinden el módulo de procesado, son proteasas de mamíferos. Particularmente preferidas son las proteasas de origen humano. Además, se prefiere que estas proteasas se encuentren intracelularmente.

Como módulos detectores se entienden, en el sentido de la invención, todas las moléculas de base polipeptídica, que están en situación de proporcionar la proteína de fusión según la invención, mediante una específica afinidad a un acceso de la proteína de la superficie celular al interior de la célula. Como células diana son apropiadas en particular las células inmunológicas de la sangre, como p. ej., los linfocitos T, los cuales pueden ser discriminados por su dotación de receptores individuales mediante el empleo de módulos detectores apropiados. Como módulo detector pueden servir las proteínas, fragmentos de proteína o péptidos. Por ejemplo, en el caso de tratarse de péptidos de unión con MHC, se puede aprovechar para la inactivación selectiva de líneas de células T clonales, por ejemplo líneas de células T_{H}2 alergénicas.

Con la descripción efectuada en la solicitud de patente europea presentada con el número de entrada EP 95109949.8 de la secuencia de nucleótidos del gen de la lectina del muérdago se ha creado la base de la presente invención. Mediante la disponibilidad recombinante del gen de la ProML ha sido posible con un borrador modular flexible (representado como ejemplo en la figura 10.a-10.g) con un coste sorprendentemente pequeño, la creación de nuevas vacunas de inmunotoxinas con un amplio espectro de especificidades de células diana. El empleo de péptidos más cortos como módulos diana, que pueden ser empleados en particular para la unión selectiva con receptores de células T, hace posible una síntesis química directa de las correspondientes secuencias de ADN necesarias para ello (es el componente de los ácidos nucleicos según la invención), lo cual esencialmente ahorra tiempo como p. ej., en la construcción de anticuerpos apropiados. Otra ventaja del borrador según la invención para la obtención de nuevas toxinas altamente específicas, con respecto a la construcción de inmunotoxinas mediante anticuerpos biespecíficos, consiste en la unión covalente de los módulos mediante módulos de procesado, que inhiben una disociación extracelular de los módulos así como hace posible la liberación intracelular de la toxina. Además, se ha descubierto según la invención, que el propéptido natural de la lectina del muérdago debido a sus propiedades sensibles a las proteasas, las cuales hasta ahora no habían sido descritas para los propéptidos de otro tipo RIP II, son sobresalientes como fuente para módulos de procesado apropiados para la construcción de proteínas de fusión según la invención. Es sorprendente en este descubrimiento en particular que los módulos de procesado de origen vegetal son reconocidos también por las proteasas no vegetales, lo cual hace posible su empleo universal.

La expresión "origen vegetal" significa en el sentido de la presente invención una secuencia de péptidos que codifican mediante una molécula de ácido nucleico, la cual es homóloga a la región del genoma vegetal, o es un componente del mismo, a la que se añade una homología de la molécula de ácido nucleico mediante la hibridación en condiciones restrictivas.

Otra ventaja de la invención es que en la aplicación de las proteínas de fusión según la invención no aparece ningún problema mediante diversas vacunaciones como es el caso de las inmuno y mitotoxinas a base de toxinas bacterianas. Mejores propiedades muestra la rMLA como módulo efector de las proteínas de fusión según la invención frente a la ricina A, la más empleada hasta ahora para la construcción de inmunotoxinas. En la comparación directa las inmunotoxinas copuladas químicamente a base de MLA son muchas veces más efectivas que las correspondientes a base de ricina A. A esto hay que añadir que las inmunotoxinas a base de ricina A muestran fuertes efectos secundarios por su inespecífica actividad, lo cual no ha sido descrito hasta ahora para la MLA.

Otra ventaja de las proteínas de fusión según la invención es la posibilidad de su expresión recombinante, la cual tiene lugar de preferencia en el E. coli. Esta versión preferida de las proteínas de fusión según la invención está por ello libre de glicosilaciones y por esta razón no está unida, como las toxinas obtenidas de las plantas, a los receptores de glicósido de las células hepáticas. Esto conduce a pocos daños en el hígado a la vez que se logra un valor mitad de tiempo en sangre más prolongado y constituye por ello una fuerte mejora de las posibilidades terapéuticas. Las toxinas vegetales están efectivamente glicosiladas principalmente con radicales de manosa que están en el extremo lo cual conduce a un rápida degradación en el hígado. Una gran ventaja de la expresión recombinante de proteínas de fusión, p. ej., en E. coli es que estas proteínas no presentan ninguna glicosilación, con lo cual disminuye la toxicidad inespecífica de las toxinas vegetales sobre los hepatocitos no parenquimales (Skilleter y col., 1985; Magnusson y col., 1993) y al mismo tiempo, se prolonga el tiempo de valor medio terapéutico (Vitetta y col., 1993). Con ello se obtienen para el empleo de la proteína de fusión según la invención, por ejemplo, para la inactivación selectiva de células inmunológicas patológicas de la sangre un amplio abanico de ventajas frente a las toxinas conocidas hasta ahora. Las enormes ventajas de estas propiedades de las proteínas de fusión según la invención, se aplican ante todo en el campo de la medicina a disposición del experto.

Otra ventaja importante de las proteínas de fusión según la invención, es que comparadas con las inmunotoxinas convencionales presentan un peso molecular esencialmente menor, lo cual disminuye por una parte el peligro de reacciones inmunológicas, y por otra parte mejora la distribución de la substancia activa en los densos tejidos celulares.

En una versión preferida la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual,

(a) la cadena de la lectina del muérdago o un fragmento con actividad citotóxica intracelular o un derivado de la misma es codificada por una molécula de ácido nucleico, seleccionado del grupo compuesto por:

(i): moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.a ó un fragmento de la misma;

(ii): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 11.a ó un fragmento de la misma ; y

(iii): moléculas de ácido nucleico, que hibridan con una molécula de ácido nucleico de (i) ó (ii) en condiciones restrictivas; y

(iv): moléculas de ácido nucleico que están degeneradas en las moléculas de ácido nucleico citadas en (iii) correspondientemente al código genético; y/o

(b) el propéptido de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado del mismo, el cual presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa codificada por una molécula de ácido nucleico, escogida del grupo compuesto por:

(i): moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos citada en la figura 11.c ó un fragmento de la misma

(ii): moléculas de ácidos nucleicos, que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 11.c ó un fragmento de la misma;

(iii): moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con una molécula de ácido nucleico de (i) ó (ii) en condiciones restrictivas; y

(iv): moléculas de ácido nucleico que degeneran en las moléculas de ácido nucleico citadas en (iii) correspondientemente al código genético.

Hibridación en el sentido de la invención significa hibridación en condiciones convencionales de hibridación. De preferencia la hibridación tiene lugar en condiciones restrictivas. Esta clase de condiciones se encuentran descritas p. ej., en Sambrock y col., en "Molecular Cloning. A Laboratory Handbook" ("Clonado molecular, un Manual de Laboratorio") CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989 ó en Hames y Higgins "Nucleic acid hybridisation" ("Hibridación del ácido nucleico").IRL Press, Oxford, 1985. Estas condiciones se logran por ejemplo en un tampón de hibridación, el cual contiene 0,1 x SCC y 0,1% de SDS, en donde la hibridación y eventualmente los pasos de lavado subsiguientes (el tampón de lavado contiene eventualmente también 0,1 x SSC y 0,1% de SDS), tienen lugar de preferencia a aproximadamente 65ºC.

En otra versión, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, en la cual el módulo efector comprende la cadena A de la lectina del muérdago o un fragmento intracelularmente activo o un derivado del mismo.

Los derivados antes citados pueden ser derivados que se encuentran en forma natural o que se obtienen artificialmente p. ej., mediante técnicas de ADN recombinante. A estos pertenecen también moléculas que se diferencian de las moléculas de ácido nucleico antes citadas por la degeneración del código genético. Naturalmente caen dentro del concepto de derivado todas aquellas modificaciones posttranslacionales del módulo efector y/o módulo de procesado antes citados o aquellas que tienen lugar después de la obtención de la proteína de fusión, en tanto estos derivados presentan una actividad y/o una función igual o parecida a los antes mencionados módulos efectores y/o módulos de procesado.

En otra versión muy preferida la invención se refiere a una molécula de ácidos nucleicos en donde la proteína de fusión presenta además los siguientes componentes:

un módulo modulador el cual está unido covalentemente al módulo de procesado, al módulo efector y/o al módulo detector, y el cual modula la acción tóxica intracelular del módulo efector.

Como "módulo modulador" se entienden según la invención todas las secuencias de polipéptidos, que están en situación de modular el desarrollo de la acción citotóxica de un módulo efector intracelular y las cuales están unidas con por lo menos otro módulo de la proteína de fusión, de preferencia mediante un módulo de procesado unido a los dos módulos en un plano genético. Módulos moduladores apropiados pueden ser por ejemplo componentes que ayudan a la translocación de la membrana, o aquellos que participan en mecanismos de transporte intracelular. A este respecto la modulación deseada se basa de preferencia en un reforzamiento de la actividad específica de la célula o en la supresión de una toxicidad no específica. En el caso de la rMLA se descubrió que estos requisitos son satisfechos por el dominio B recombinante de la lectina del muérdago (rMLB), la cual provoca un aumento de la toxicidad del módulo efector mediante un apoyo activo de su translocación del retículo endoplasmático al citoplasma de la célula. En el pasado pudo ya demostrarse que mediante el empleo de las RIP tipo II, en lugar de las RIP tipo I para la obtención de p. ej., agentes antitumorales, el efecto citotóxico de esta clase de substancias podía ser aumentado en varios órdenes de magnitud, lo cual a pesar del empleo terapéutico esperado de estos preparados no pudo conseguirse finalmente debido a la aparición de los más fuertes efectos secundarios. Una posible salida de este dilema son los intentos de inactivar el punto de unión del azúcar de la cadena B de ricina después de la copulación con el anticuerpo mediante derivatización química -la llamada "ricina bloqueada" (Shah y col., 1993)- lo cual sin embargo, no ha resuelto el problema en forma alguna debido a los importantes efectos secundarios generados antes como ahora. En una versión particularmente preferida según la invención, se ha hecho por primera vez el intento de intercambiar los aminoácidos responsables de la unión al azúcar, con empleo de procedimientos de biología molecular, por los correspondientes aminoácidos biológicamente no funcionales (funcionalmente inertes). Para la ricina similar a la lectina del muérdago, se conocen desde hace tiempo dos puntos de unión de azúcar en los subdominios 1\alpha y 2\gamma de la cadena B, a partir de la literatura (Rutenber y col., 1987; Vitetta y col., 1990; Swimmer y col., 1992, Lehar y col., 1994). Los ensayos efectuados según la invención, basados en este punto de partida, para inactivar la afinidad a los hidratos de carbono de la lectina de muérdago recombinante han dado por resultado que los puntos de unión del azúcar descritos para la ricina, se encuentran también en la lectina de muérdago. Sorprendentemente se observó sin embargo, que el intercambio de los aminoácidos análogos descritos para la ricina, en el caso de la lectina de muérdago la unión del azúcar no se eliminaba sino que solamente podía debilitarse alrededor del factor 5. Un subsiguiente detallado análisis de la estructura cristalina de la ricina B para detectar la presencia de otros puntos de unión de azúcar crípticos mediante cálculos de campos de fuerza apoyados por ordenador ha suministrado datos sobre la presencia de un potencial tercer punto de unión de azúcar -tanto para la lactosa como también para el ácido N-acetil-neurámico- en el subdominio 1\beta. En la literatura se había informado para la ricina B un tercer punto de unión de azúcar -también allí en el dominio 1\beta con participación de un único aminoácido (Frankel y col., 1996), lo cual confirmó adicionalmente esta suposición. Después de la substitución, según los cálculos efectuados, de los cuatro aminoácidos probablemente participantes de la unión con hidratos de carbono, el dominio 1\beta de la lectina de muérdago recombinante, pudo observarse adicionalmente al intercambio en el dominio 1\alpha y 2\gamma (ejemplo 7, figura 15), sorprendentemente en efecto una pérdida casi completa de la posibilidad de las variantes de las cadenas B, "rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma" de unirse a una matriz de afinidad lactosil-agarosa. Además, la rMLB B\Delta1\alpha1\beta2\gamma (riMLB) mostró no solamente la misma competencia de plegado como la secuencia tipo salvaje, sino que ahora como antes, la posibilidad de una asociación covalente con la cadena A de la lectina de muérdago recombinante (ejemplo 8.c). La figura 13 muestra un análisis Western-Blot de la asociación in vitro de rMLB B\Delta1\alpha1\beta2\gamma con rMLA mediante la detección inmunoquímica con anticuerpos monoclonaleas contra ambas cadenas individuales, del tamaño del peso molecular esperado de la Holo-toxina de aproximadamente 60 kDa. La citotoxicidad de la Holo-toxina no unida a hidratos de carbono así obtenida (rIML) frente a la línea celular linfática humana MOLT-4 proporcionó el 50% de viabilidad a una concentración de rIML de 25 ng/ml. Esto corresponde en comparación a 70 pg/ml en el caso del empleo de rML de un debilitamiento de la toxicidad no específica in vitro alrededor del factor 350 (ejemplo 9, figura 14).

La disponibilidad de un módulo modulador modificado de esta manera (rIMLB), abre ahora por primera vez la posibilidad de la constitución recombinante de antitoxinas inmunocelulares en las cuales existe la perspectiva de que los fatales efectos secundarios de las substancias disponibles hasta la fecha a base de las RIP tipo II natural puedan disminuirse en una medida justificable mediante el empleo de rIMLB. Para garantía de una especificidad inducida por el módulo detector, puede minimizarse, en el caso de rMLB, la unión a hidratos de carbono mediante intercambio ajustado de aminoácidos, por ejemplo, mediante el intercambio D23 a A, W38 a A, D235 a A, Y249 a A, Y68 a S, Y70 a S, Y75 a S, F79 a S (la nomenclatura se refiere a la secuencia de aminoácidos de rMLB según la figura 11b con D1 como aminoácido N-terminal).

En una versión preferida, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, en la cual el módulo de modulación o un fragmento del mismo, el cual posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina de muérdago, es codificado a partir de una molécula de ácido nucleico escogido del grupo compuesto de:

(i) moléculas de ácido nucleico, que contienen la secuencia de nucleótidos, que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.b ó un fragmento de la misma, en donde el fragmento posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina de muérdago;

(ii) moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 11.b ó un fragmento de la misma, en donde el fragmento codifica una secuencia de aminoácidos, que posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina de muérdago;

(iii) Moléculas de ácido nucleico, que hibridan con una molécula de ácido nucleico de (i) ó (ii) bajo condiciones restrictivas; y

(iv) Moléculas de ácido nucleico, correspondientes a las moléculas de ácido nucleico mencionadas en (iii) que están degeneradas en el código genético.

En otra versión preferida de la invención, la misma se refiere a una molécula de ácido nucleico en la que el módulo de modulación posee la actividad moduladora antes citada y comprende un alelo o derivado de la cadena B de la lectina de muérdago antes citada mediante deleción, substitución, inserción, adición y/o intercambio de aminoácidos.

Como otros módulos moduladores en el sentido de esta invención pueden utilizarse fragmentos cortos de péptidos como p. ej., el péptido "KDEL" ó "HDEL". A este respecto, se trata de péptidos señal que transmiten el transporte retrógrado activo de proteínas en dirección al retículo endoplasmático, lo cual se puede aprovechar para un aumento de la toxicidad del módulo efector admitido (Wales y col., 1993). Igualmente como módulos moduladores para clasificar pueden utilizarse las secuencias de polipéptidos según la invención, las cuales mantienen neutralizada la actividad catalítica de un módulo efector al exterior de una célula. Un ejemplo para citar es el propéptido de la lectina de muérdago, el cual inactiva la actividad catalítica de la rMLA, y solamente libera la actividad catalítica de la rMLA en el curso de un procesado intracelular en compartimentos celulares prelisosómicos. Esto aporta la ventaja de una drástica disminución de la toxicidad no específica de las proteínas de fusión que circulan por la sangre.

La modulación de la toxicidad mediante un módulo de modulación posee una gran importancia. Así, puede ser valioso, reducir en las células diana la toxicidad de un módulo efector para lograr ventajosas interferencias con las células diana. Por ejemplo, puede ser deseable una lenta muerte de las células diana para evitar el potencial vertido de componentes celulares perjudiciales en el organismo. Así, pueden evitarse reacciones desventajosas como superreacciones de tipo rápido o shocks anafilácticos. También es posible por modulación de los efectos tóxicos, una inducción a la finalización de programas celulares como la apoptosis. La apoptosis es un mecanismo natural de selección clónica y por ello, para el tejido circundante y todo el organismo un método comparativamente suave de eliminación específica de células patológicas.

En dependencia con esta versión se ha descubierto según la invención, que la rML puede modular la toxicidad de la rMLA, por lo cual existe la posibilidad de influenciar selectivamente la toxicidad de las proteínas de fusión según la invención. Este descubrimiento es desde el punto de vista médico, de una importancia inmensa. Por primera vez ha sido efectivamente posible, variar la acción de una y la misma inmunotoxina en una y la misma célula mediante la selección de un modulador adecuado. El experto deducirá naturalmente de ello que la acción moduladora de la cadena rMLB actúa también sobre otras toxinas, por ejemplo, las RIP tipo I ó RIP tipo II. En base al conocimiento de la acción moduladora de la cadena rMLB el experto está sin más en situación de comprobar la acción moduladora de otras moléculas que se unen al azúcar, por ejemplo, aquellas que de forma natural se encuentran en las RIP del tipo II. La propiedad de la cadena B de la lectina de muérdago de actuar sobre la unión del azúcar, modulando mediante la aceptación y activación de moléculas efectoras, hace suponer que por lo menos también otras cadenas B de RIP tipo II de origen vegetal tendrán un perfil de propiedades similar. Esta clase de moduladores tienen en el sentido de la invención, iguales ventajas para ser utilizados. Esta clase de moduladores están igualmente comprendidos en la presente invención.

En otra versión preferida de la invención la molécula de ácido nucleico presenta para la proteína de fusión además los siguientes componentes:

(e) un módulo de afinidad para la purificación, el cual está unido covalentemente al módulo efector, al módulo de procesado, al módulo detector y/o al módulo modulador.

Como módulos de afinidad se entienden aquellos componentes de las proteínas de fusión según la invención, los cuales no aspiran a tener un efecto terapéutico sino la posibilidad de poder purificar las proteínas de fusión según la invención, p. ej., mediante procedimientos cromatográficos de afinidad. Al experto le son naturalmente también familiares otros procedimientos como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de permeación sobre gel, la cromatografía de interacciones hidrófobas, con los cuales se pueden purificar las proteínas de fusión. En cambio, mediante el empleo de los módulos de afinidad es posible obtener con ayuda de un procedimiento de afinidad, substancias activas de preferencia homogéneas o esencialmente homogéneas. De forma ideal se trata en el caso de los módulos de afinidad, de un fragmento de péptido corto, como p. ej., una secuencia de hexahistidina con afinidad para los complejos quelatosefarosa, los cuales se fusionan de preferencia en la periferia de la secuencia (figura 10.a - 10.g). Esta versión de la invención hace posible principalmente una purificación rápida y sin problemas de la proteína de fusión según la invención.

Condicionado por la obtención recombinante de la proteína de fusión, los módulos mencionados de las versiones anteriormente citadas pueden colocarse mediante cualquier combinación de las correspondiente secuencias de los ácidos nucleicos en el orden deseado cada vez. El experto está en situación, en base a su experiencia en la especialidad, de obtener las correspondientes moléculas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo mediante la incorporación de sitios de escisión de restricción apropiados. Una selección de las posibilidades de combinación o respectivamente de colocaciones está representada en la figura 10.a - 10.g. El compartimiento celular periplasmático de la E. coli se aproxima más a la exigencia de una proteína conteniendo un puente de disulfuro, de tener un microambiente necesario para la formación de una estructura terciaria funcional. A partir del mismo, como se describe ampliamente en el ejemplo 10, se construyó un sistema de expresión modular periplasmático, que permite la fácil realización de todas las colocaciones necesarias de los módulos individuales en los vectores de expresión ITF (figura 17).

En otra versión preferida de la molécula de ácido nucleico según la invención, el módulo detector reconoce específicamente una célula del sistema inmunológico, una célula tumoral o una célula del sistema nervioso.

Un punto difícil de las actuales investigaciones reside en el terreno del equipo de detectores de las células inmunológicas, lo cual conduce a un rápido número creciente de receptores conocidos así como de sus ligandos. En base a la construcción modular de las proteínas de fusión según la invención, se pueden desarrollar nuevos conocimientos en este campo más rápidamente que hasta el presente para la creación de substancias activas de uso terapéutico. Este aspecto gana una especial significación en el desarrollo de preparados ajustados a los pacientes. Posibilidades de aplicación ricas en perspectivas de dichas proteínas de fusión montadas modularmente, consisten en el tratamiento de trastornos funcionales del sistema nervioso y del sistema inmunológico. En estas células se trata principalmente de células circulantes del sistema sanguíneo o del sistema linfático, las cuales ofrecen una buena accesibilidad física para las proteínas de fusión según la invención. El problema de una mala penetración tumoral en el caso de las inmunotoxinas no ocurre en este caso. Además, la apoptosis es justamente para las células del sistema inmunológico, un mecanismo natural de control de la expansión clonal, de forma que el empleo por ejemplo de la rMLA como módulo efector utiliza ventajosamente la natural susceptibilidad de las células inmunológicas para la apoptosis (ver también Bussing y col., 1996). Además, las ventajas del sistema modular son particularmente apropiadas para el tratamiento de alergias, puesto que para las mismas es necesario un gran repertorio de diferentes módulos detectores que sean específicos para los pacientes. Por ejemplo, en el caso de las alergias del tipo Sofort ocurre un salto de clase de células B inducido por células T_{H}2, a la producción de IgE alérgena, al contrario de la respuesta IgG inducida por células T_{H}1. Un plan terapéutico con utilización de las proteínas de fusión según la invención, consiste en emplear como módulo detector, péptidos alérgenos normalmente del tipo MHCII, y así eliminar selectivamente del cuerpo del paciente las células T_{H}2 responsables. Según el mismo principio es posible una terapia de enfermedades autoinmunológicas. Las terapias del MS empleadas actualmente como ejemplo de enfermedades autoinmunológicas comprenden conceptos diversos en la regulación del sistema inmunológico (Hohlfeld, 1997). En el tratamiento causal de las enfermedades autoinmunológicas está en primer plano la reducción de las correspondientes células T específicas de un antígeno. Una preparación actualmente preferida se basa en la expresión de un determinado subtipo de TCR, p. ej., en el MS mediante una vacunación con el péptido V\beta5.2 podía modularse la actividad de las células T reactivas con MBP (Vandenbark y col., 1996). El principio de este método se basa principalmente en un desplazamiento de la respuesta de la citoquina desde Th1 a Th2, a saber de las citoquinas proinflamatorias a las citoquinas inhibidoras. Finalmente se provoca pues, un efecto sistémico.

En el caso de las neuropatías desmineralizadoras (síndrome de Guillain Barre, neuritis), el antígeno es la mielina del sistema nervioso periférico (P2). En el modelo animal de la neuritis EAN pudo identificarse la región 53-78 de AS como péptido neuritógeno. El EAN puede ser o bien inducido activo mediante el neuritógeno P2 directamente o bien mediante la transferencia adoptiva de células T neuritógenas, que fueron aisladas a partir de ratas.

El péptido P2 recombinante ya fue empleado con éxito para calmar la EAN en la rata, en donde se aprovechó la acción del P2 inducido por la apoptosis (dosis 100 \mug diariamente intravenosa) (Weishaupt y col., 1997).

Es condición indispensable para la mitigación de un brote agudo de la enfermedad en el paciente, que se logre una correspondientemente alta concentración del antígeno inductor de la apoptosis a las células T autoreactivas en la periferia o en el lugar de la reacción inmunológica. Mediante la unión de pequeñas cantidades de antígeno a las células T tiene lugar naturalmente una proliferación. Mediante la copulación de una toxina en la secuencia de reconocimiento específica de las células T neuritógenas, se puede inducir una eliminación segura de células T, sin correr el peligro de un efecto estimulador contrario. Desencadenante por ejemplo de la esclerosis múltiple es la aparición y multiplicación de linfocitos T autorreactivos (Olive, 1995), los cuales reconocen un producto de degradación de "proteínas básicas de la mielina" en la mayoría de los casos la secuencia "VHFFKNIVTPRTP". Esto conduce a que las células nerviosas de los pacientes sean atacadas por el sistema inmunológico del propio cuerpo. También aquí el empleo como módulo detector de los péptidos desencadenantes de la enfermedad es la llave para la aplicación de una forma de terapia basada en la invención. Otra enfermedad de este tipo es la Miastenia Gravis, en la cual se llega a una reacción autoinmunológica contra los receptores de la acetilcolina. Además entra en cuestión un tratamiento de diversas leucemias o neoplasias.

En una versión preferentemente preferida de la invención, la célula diana es una célula del sistema inmunológico. Esta puede ser por una parte una célula del sistema inmunológico inespecífico y por otra parte, una célula del sistema inmunológico específico. En el último caso puede tratarse de células B ó células T, en particular, células T_{H}2. Además, pueden ser también células degeneradas de células diana del sistema inmunológico. También, células en particular células degeneradas del sistema nervioso, por ejemplo células nerviosas, pueden ser por selección células diana apropiadas para el módulo detector.

En otra versión preferida de la molécula de ácido nucleico según la invención, el módulo de afinidad es una secuencia de histidina, tiorredoxina, Strep-Tag, Tag T7, FLAG-Tag, unión de maltosa y proteína ó GFP (proteína verde fluorescente). El módulo de afinidad es por lo tanto una secuencia de péptidos, la cual se caracteriza por una especificidad de la unión con ligandos o por la presencia de un epítope apropiado, lo cual hace posible una purificación selectiva de preferencia mediante un procedimiento cromatográfico de afinidad, p. ej., mediante ligandos inmovilizados o anticuerpos inmovilizados. Esta clase de módulos de afinidad tienen siempre la propiedad de unirse a ligandos con una alta especificidad y con altas constantes de unión, las cuales por su lado son copuladas como ligandos a matrices de preferencia cromatográficas. Así pueden prepararse en procesos con solamente pocos pasos, proteínas de fusión purificadas en alto grado, de lisados o restos de células.

Otra versión preferida de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, la cual contiene el módulo modulador de la cadena B de lectina de muérdago o un fragmento o derivado de la misma o el péptido KDEL ó HDEL.

En esta versión se han substituído por ejemplo las secuencias de rMLB por fragmentos o derivados de rMLB. Como ya se explicó anteriormente en dependencia con el empleo de la cadena de rMLA, el experto tiene la posibilidad en base a su conocimiento de la especialidad, de preparar ácidos nucleicos recombinantes que codifican dichas proteínas de fusión. Con respecto a un ensayo con el cual pueda comprobarse la función moduladora de los fragmentos o derivados, nos remitimos a los ejemplos que siguen más adelante.

En otra versión particularmente preferida de la molécula de ácido nucleico según la invención, la cadena B de lectina de muérdago presenta un cambio en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 ó una combinación de dichos cambios. Particularmente preferida según la invención es además la versión en la cual el cambio está en la posición D23 a A, W38 a A, D235 a A, Y249 a A, Y68 a S, Y70 a S, Y75 a S, F79 a S (la nomenclatura se refiere a la secuencia de aminoácidos de rMLB según la figura 11b con D1 como aminoácido N-terminal). Esta versión es especialmente preferida porque los restos de aminoácido en las posiciones citadas participan en el montaje de los sitios de unión al azúcar, y el azúcar o las glicoproteínas o los glicolípidos pueden unirse sobre la superficie de la célula. La eliminación de los puntos de unión del azúcar actúa de forma que no tiene lugar un acoplamiento no específico inducido por el azúcar en células no deseadas. Con ello, la frecuencia con la cual la proteína de fusión según la invención, alcanza efectivamente el lugar del efecto deseado, aumenta todavía significativamente.

En otra versión particularmente preferida de las invención, la molécula de ácido nucleico es ADN.

En otra versión preferida de la molécula de ácido nucleico según la invención, ésta es ARN.

La invención se refiere además, a un vector el cual contiene una molécula de ácido nucleico según la invención.

La construcción de vectores apropiados para la propagación y de preferencia para la expresión del ácido nucleico según la invención, es familiar para un experto. En tanto se emplea el vector para la obtención de la proteína de fusión, el experto se esfuerza en conseguir un rendimiento lo más alto posible en la proteína de fusión y en correspondencia por ejemplo añade un potente promotor al vector. Por otro lado y por ejemplo, cuando el vector es un componente de un medicamento puede ser una ventaja que la expresión de los ácidos nucleicos tenga lugar solamente en la célula diana. En este caso el experto escogerá un sistema de expresión inducida. El vector puede contener en el sentido de la presente invención también más de un ácido nucleico según la invención.

Para la expresión o respectivamente propagación del vector es necesario además un anfitrión apropiado. Con esto, la invención se refiere a un anfitrión que es transformado por el vector según la invención, o contiene una molécula de ácido nucleico según la invención. La invención comprende también aquellos anfitriones que contienen varios vectores y/o moléculas de ácido nucleico según la invención.

Los procedimientos de transformación están descritos en el estado actual de la técnica para los más distintos tipos de células y organismos anfitriones, y pueden seleccionarse por el experto según puntos de vista apropiados.

Son particularmente preferidos según la invención, los siguiente anfitriones procariotas: E. coli, Bacillus subtilis ó Streptomyces coelicolor y los siguientes anfitriones eucariotas; Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp., ó Pichia pastoris. En el caso de sistemas de expresión eucariotas es particularmente ventajoso el empleo de módulos moduladores, puesto que con ayuda de un módulo modulador puede evitarse el dañar al anfitrión con el producto de la expresión.

La invención se refiere además a una proteína de fusión que codifica una molécula de ácido nucleico según la invención o es producida por un anfitrión según la invención.

Las ventajas y posibilidades de aplicación de la proteína de fusión han sido ya explicadas en función de las diferentes versiones de la molécula de ácido nucleico según la invención, las cuales se toman como referencia.

Además la invención se refiere a procedimientos para la obtención de la proteína de fusión según la invención, en la que un anfitrión según la invención se hace crecer en condiciones apropiadas y a continuación se aisla la proteína de fusión.

El procedimiento según la invención es de preferencia un procedimiento microbiológico de fermentación, el cual se efectúa en condiciones habituales. A este respecto, la proteína de fusión producida puede aislarse del sobrenadante o del anfitrión después de su disgregación. La última versión incluye también la desnaturalización y la renaturalización de la proteína de fusión, siempre que esto se produzca por ejemplo en las bacterias en forma de cuerpos de inclusión.

Las implicaciones farmacéuticas y el significado básico de la invención para la medicina ha sido ya anteriormente discutido. Conforme a ello se refiere también la invención a un medicamento que contiene una proteína de fusión según la invención y un soporte farmacéuticamente aceptable.

Los ensayos descritos hasta ahora de obtención de las inmunotoxinas mediante el empleo del dominio A de la lectina del muérdago debían realizarse hasta ahora por el camino de la copulación bioquímica, p. ej., con SPDP (Paprocka y col.,1992). En dos estudios de esta clase, (Tonevitsky y col., 1991, 1996), se comparó la efectividad de la inmunotoxina nMLA obtenida con las correspondientes inmunotoxinas de ricina A, en donde la inmunotoxina nMLA había demostrado tener 15-80 veces más efectividad que la inmunotoxina basada en la ricina A. Gracias a la posibilidad hasta ahora no existente en el estado de la técnica, de poder utilizar componentes de la lectina de muérdago obtenidos recombinantemente, ha llegado a ser posible la obtención de medicamentos según la invención.

La forma y dosis de la administración del medicamento según la invención es responsabilidad del médico actuante, el cual es en particular conocedor del estado de la enfermedad del paciente. Otros factores que pueden influir en la forma y dosis de la administración son la edad, constitución, superficie corporal y peso del paciente así como la ruta de administración. Los soportes farmacéuticamente aceptables son ya conocidos en el estado actual de la técnica y comprenden soluciones de sal común tamponadas con fosfato, agua, emulsiones como emulsiones aceite/agua, etc. Composiciones de medicamentos, que contienen dichos soportes pueden formularse de acuerdo con procedimientos convencionales. La administración del medicamento puede ser sistémica o local y por regla general tiene lugar parenteralmente. Las formas habituales de administración son p. ej., intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica, entre las cuales la administración intravenosa es la preferida. Las dosificaciones preferidas para el tratamiento intravenoso oscilan desde 1 ng de substancia activa por kg de peso corporal hasta 500 \mug/kg. Para el empleo ex vivo se utilizan de preferencia dosificaciones en el margen de 1 pg/ml hasta 500 ng/ml. Estas dosis se administran de preferencia diariamente. Siempre que el tratamiento hace necesaria una infusión continua, las dosificaciones están en los márgenes citados más arriba.

Por consiguiente, la invención se refiere pues, a un medicamento que contiene,

una proteína de fusión, la cual es codificada por una molécula de ácido nucleico según la invención, en donde la proteína de fusión contiene un módulo efector, un módulo de procesado, un módulo detector, y eventualmente un módulo de afinidad y/o un módulo modulador, o un vector el cual contiene la correspondiente molécula de ácido nucleico, en donde el modulador comprende la cadena B de lectina de muérdago o un fragmento o derivado del mismo, el cual posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina de muérdago.

El módulo modulador puede estar empalmado pues covalentemente en el medicamento según la invención, con otros módulos, y así ser codificado por el mismo vector como estos módulos, o pueden estar presente como una unidad separada y entonces es codificado por un segundo vector, aunque de preferencia, junto con los otros módulos mediante las secuencias presentes en un vector único.

En la versión en la cual el medicamento contiene el polipéptido citado, se produce éste de preferencia antes de la formulación del medicamento como una proteína de fusión empalmada covalentemente. Con ello se garantiza en cierta medida que el complejo de polipéptido el cual contiene tanto el módulo efector, el módulo de procesado y el módulo detector como también de preferencia el módulo modulador, está incluido en una y la misma célula diana. En tanto el medicamento contiene el/los vector(es) según la invención, se aplican por regla general 10^{6} a 10^{22} copias por vector según el esquema de administración representado anteriormente. Los vectores según la invención pueden emplearse también como terapéuticos génicos. Procedimientos para el empleo terapéutico génico de vectores se conocen igualmente en el estado actual de la técnica.

La versión en la cual el medicamento contiene los vectores es de una particular ventaja cuando no se pretende un rápido efecto tóxico. Este puede por ejemplo ser el caso cuando el medicamento se administra como terapia acompañante. En esta versión, la especificidad de las células diana se alcanza cuando se emplea un vector apropiado, por ejemplo un vector retroviral. En el estado actual de la técnica se conocen una serie de vectores retrovirales que son específicos por ejemplo, para las células T. La expresión de los ácidos nucleicos puede tener lugar por ejemplo mediante promotores sensibles a la temperatura. En la práctica el paciente puede por ejemplo durante un período de tiempo apropiado ser expuesto a una fuente de calor, con lo cual la expresión de los ácidos nucleicos se inducirá y la toxina en la célula diana desarrollará el efecto deseado.

En una versión preferida del medicamento según la invención antes discutido, el modulador es, o respectivamente el módulo de modulación comprende, la cadena B de lectina de muérdago o un fragmento o derivado del mismo.

En particular se prefiere por las razones antes citadas, que la cadena B de la lectina de muérdago presente un cambio en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 (la nomenclatura se refiere a la secuencia de aminoácidos de la rMLB según la figura 11.b como aminoácido terminal) o una combinación de dichos cambios, en donde el cambio es en la posición 23 de preferencia un cambio D23 a A, en la posición 38 de preferencia W38 a A, en la posición 235 de preferencia D235 a A, en la posición 249 de preferencia Y249 a A, en la posición 68 de preferencia Y68 a S, en la posición 70 de preferencia Y70 a S, en la posición 75 de preferencia Y75 a S, y en la posición 79 de preferencia F79 a S. Es particularmente preferido en este caso así como también en las versiones que se describen a continuación, las cuales se refieren a estos intercambios, que estén presentes por lo menos dos, de preferencia por lo menos tres, cuatro, cinco, seis, siete y con la mayor preferencia, 8 de esta clase de intercambios.

La invención se refiere además a un kit que contiene un vector que contiene una molécula de ácido nucleico según la invención.

Con el kit según la invención se puede en particular investigar la eficiencia de diferentes módulos en diferentes/ sobre diferentes células diana in vitro. Como ejemplos para la situación in vivo se cultivaron in vitro, p. ej., células neoplásicas transformadas y se transfectaron con los vectores. El resultado de la expresión de los diferentes módulos sobre la viabilidad de las células transfectadas puede seguirse por ejemplo con el microscopio. Con ello el kit según la invención proporciona valiosos resultados para el desarrollo de medicamentos por ejemplo para la terapia de
tumores.

En una versión preferida, el modulador es en el kit según la invención, la cadena B de la lectina de muérdago o un fragmento o un derivado de la misma.

Es particularmente preferido que la cadena B de la lectina del muérdago presente en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 un cambio o una combinación de tales cambios, de forma que tiene lugar un intercambio en la posición 23 de preferencia un intercambio D23 a A, en la posición 38 de preferencia W38 a A, en la posición 235 de preferencia D235 a A, en la posición 249 de preferencia Y249 a A, en la posición 68 de preferencia Y68 a S, en la posición 70 de preferencia Y70 a S, en la posición 75 de preferencia Y75 a S y en la posición 79 de preferencia F79 a S.

Además se refiere la invención al empleo de la cadena B de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado de la misma, para el modulado de la efectividad de una toxina intracelularmente activa.

Como ya se ha representado anteriormente, se muestra en la presente invención por primera vez, que el componente de unión con el azúcar de una RIP tipo II está en situación de modular intracelularmente el efecto citotóxico de una toxina y en particular de aumentarlo. Se desprende de ello según la invención que p. ej., la cadena de la lectina del muérdago no solamente modula la toxicidad de la cadena A de la lectina del muérdago sino que también las otras toxinas en particular las de RIP tipo I ó de RIP tipo II. El experto puede mediante las enseñanzas según la invención comprobar fácilmente si el modulador modifica verdaderamente la toxicidad de una toxina determinada. En este sentido está comprendido según la invención, el empleo de todas las toxinas intracelulares y no solamente la cadena A de la lectina del muérdago.

Es preferido según la invención un empleo en donde la toxina es intracelularmente un producto de escisión de una proteína de fusión, el cual contiene los siguientes componentes:

(a) un módulo efector, que contiene la toxina;

(b) un módulo de procesado, el cual está unido covalentemente al módulo efector y el cual presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa; y

(c) un módulo detector el cual está unido con el módulo de procesado, el cual se une específicamente a la superficie de una célula, con lo que induce el paso de la proteína de fusión al interior de la célula; y eventualmente

(d) un módulo de afinidad, el cual está unido covalentemente con el módulo efector, el módulo de procesado, el módulo detector y/o el módulo modulador.

Esta versión preferida utiliza además el concepto modular según la invención y descrito al principio. En este sentido esta versión tiene ventajas particularmente prácticas para el desarrollo de medicamentos.

Es particularmente preferido una utilización en donde la cadena B de lectina de muérdago presenta un cambio en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 ó una combinación de dichos cambios, de manera que tiene lugar un intercambio en la posición 23 de preferencia un intercambio D23 a A, en la posición 38 de preferencia W38 a A, en la posición 235 de preferencia D235 a A, en la posición 249 de preferencia Y249 a A, en la posición 68 de preferencia Y68 a S, en la posición 70 de preferencia Y70 a S, en la posición 75 de preferencia Y75 a S, y en la posición 79 de preferencia F79 a S.

Se prefiere además una utilización mediante la toxina de la cadena A de las RIP tipo II (lectina de muérdago, ricina, abrina, ebulina, modecina y volquensina) ó de las RIP tipo I (saporina, gelonina, agrostina, asparina, briodina, colocina, crotina, curzina, diantina, lufina, tricosantina y tricoquirina), o un fragmento o derivado intracelularmente tóxico de los mismos.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para la comprobación in vitro de un modulador prospectivo, en donde se efectúan los siguientes pasos:

(a) Transfección de una célula diana con un vector el cual contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un módulo efector, un módulo de procesado, un módulo detector y eventualmente un módulo de afinidad;

(b) Transfección de una célula diana con un vector el cual contiene un ácido nucleico el cual codifica un modulador prospectivo;

(c) Expresión de los ácidos nucleicos en la célula diana; y

(d) Medición de la actividad moduladora del modulador prospectivo sobre la toxicidad de la toxina.

Con el procedimiento según la invención se pueden comprobar múltiples moduladores prospectivos que pueden ser de los más diferentes orígenes. De preferencia son moduladores de origen vegetal. El procedimiento puede emplearse también en una versión preferida para comprobar la influencia de las modificaciones en un modulador. Así, puede modificarse por ejemplo la configuración de un modulador mediante técnicas recombinantes, de forma que presenta otro dominio que no está presente en el estado natural, el cual cumple una función biológica deseada. Con el procedimiento según la invención puede comprobarse si y hasta que punto esta modificación afecta las propiedades moduladoras del modulador. Naturalmente pueden comprobarse también otras modificaciones familiares al experto en el modulador con este procedimiento. El experto puede seleccionar células diana según sus datos experimentales.

Al experto le es posible, introducir una molécula de ácido nucleico que codifica un módulo efector, un módulo de procesado, un módulo detector y eventualmente un módulo de afinidad, estable o transitorio, en una célula diana deseada. Según ello la invención se refiere además a un procedimiento para la comprobación in vitro de un modulador prospectivo, en la cual se efectúan los siguientes pasos:

(a) Transfección de una célula diana que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un módulo efector, un módulo de procesado, un módulo detector y eventualmente un módulo de afinidad, con un vector el cual contiene un ácido nucleico que codifica un modulador prospectivo;

(b) Expresión de los ácidos nucleicos en la célula diana; y

(c) Medición de la actividad moduladora del modulador prospectivo sobre la toxicidad de la toxina.

Finalmente la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un modulador, en el cual se efectúan los mismos pasos que en el procedimiento de comprobación in vitro descrito anteriormente, y además los siguientes pasos:

(d) Aislamiento del modulador

(e) ó respectivamente

El aislamiento puede efectuarse de preferencia según procedimientos estándar.

Antes de que la invención se detalle mediante los ejemplos, se exponen puntos de vista generales de cómo puede transformarse técnicamente la invención sobre la base de un conocimiento general de la especialidad:

El carácter modular de los componentes módulo efector (E), módulo modulador (M), módulo detector (T), módulo de procesado (P) y módulo de afinidad (A), se comprueba habitualmente mediante la introducción de sitios de corte de restricción apropiados, en cada caso en el término N- y C- de las correspondientes moléculas de ácido nucleico o respectivamente genes. La secuencia del ácido nucleico del módulo efector en la versión aquí discutida de rMLA, contiene en el N-terminal una secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción NdeI, lo cual abre la posibilidad para la fusión de los N-terminales del módulo efector con módulos de procesado (Ejemplo 1). Las fusiones de los C-terminales son posibles p. ej., mediante un sitio de corte de restricción AvaI (figura 11.a). En la secuencia codificadora para el módulo modulador (de preferencia rMLB) pueden aprovecharse por ejemplo los sitios de corte de restricción N-terminales StuI ó BspLU11I y el sitio de corte de restricción C-terminal EcoRV, para la fusión génica con otros módulos (figura 11.b). Los módulos de procesado los cuales pueden obtenerse p. ej., a partir del propéptido recombinante de la lectina de muérdago (figura 11.c) pueden debido a su corta secuencia en forma de casettes génicas sintetizarse químicamente en los sitios de corte de restricción necesarios cada vez, y ser adaptadas al correspondiente perfil de proteasas específicas a las células diana, en donde este último puede aumentar todavía el efecto selectivo de la proteína de fusión según la invención.

La preparación de las proteínas de fusión con un alto grado de pureza tiene lugar de preferencia mediante uno o más pasos de cromatografía, de preferencia mediante cromatografías de afinidad que permiten un enriquecimiento de las proteínas de fusión, por ejemplo, con el empleo de los módulos de afinidad. Además, la selección de un módulo funcional de detección puede hacer posible una purificación adicional. El orden de los pasos de purificación puede ser cualquiera. En el ejemplo 3 se muestra la utilización de un procedimiento de purificación de dos pasos sin el empleo de un módulo de afinidad. En el primer paso tiene lugar una purificación de la proteína de fusión según la invención mediante su afinidad a la heparina inducida por el módulo detector y en el segundo paso tiene lugar una purificación adicional mediante un anticuerpo inmovilizado, el cual presenta una afinidad para el módulo efector. Entre los métodos más efectivos, para el enriquecimiento de las proteínas a partir de extractos celulares, está la cromatografía de afinidad. Es de una particular ventaja para el enriquecimiento de las ITF, el empleo de los His-Tag como módulo de afinidad (secuencia de hexahistidina con afinidad a la niquel-NTA-sefarosa), puesto que incluso la presencia de sales caótrofas no muestra ninguna desventajosa influencia sobre el comportamiento a la unión. El empleo del módulo de afinidad "His-Tag" para la expresión de las ITF en forma nativa está descrito en el ejemplo 12.b, y en forma desnaturalizada en el ejemplo 12.c, ejemplarmente descritos en el ejemplo de ITF-P2-C1. Con ello puede tener lugar el enriquecimiento y purificación de proteínas en forma nativa (figura 25) así como en forma desnaturalizada (figura 24), de forma que según el comportamiento específico de la correspondiente variante ITF el método puede resultar más ventajoso de utilizar. De forma interesante tiene lugar la purificación en condiciones de desnaturalización junto al casi completo enriquecimiento de proteínas extrañas, también los productos de degradación proteolítica (figura 24) lo cual subraya adicionalmente la ventaja de este método. Un procedimiento para la presentación de ITF soluble, a partir de cuerpos de inclusión conteniendo ITF disuelto en GuHCl, está descrito en el ejemplo 12.c.

Como ejemplo de una proteína de fusión según la invención, del tipo TPE (con módulo detector, modulo de procesado, módulo efector) se fusionó el "basic fibroblast growth factor" ("factor básico de crecimiento del fibroblasto") (bFGF) como módulo detector mediante un módulo de procesado en el terminal N de la rMLA. Como módulo de procesado se emplea un dominio sensible a la proteasa correspondiente a un fragmento de la secuencia del bFGF situado en el terminal C. El dominio está limitado por la presencia de elementos estructurales secundarios poco pronunciados del fragmento de la secuencia del bFGF situado en el N-terminal. En base a esta propiedad pueden reconocerse las secuencias de reconocimiento de proteasas situadas en este fragmento para proteasas de las células diana. La preparación de la substancia puede efectuarse mediante la expresión heteróloga del gen de fusión en E. Coli según el ejemplo 3. La figura 4.a muestra la identidad de la substancia obtenida por este procedimiento mediante la detección inmunológica con los anticuerpos monoclonales anti-bFGF y anti-nMLA en un análisis Western-Blot.

La funcionalidad de una proteína de fusión del tipo bFGF-MLA se determinó frente a células B16 según el ejemplo 5. La ventaja del empleo de las células B16 se basa en que como es sabido los receptores bFGF se presentan multiplicados sobre su superficie celular. La comparación del efecto aniquilador de células de la bFGF-rMLA (figura 4.a) con el efecto del módulo efector, en forma de rMLA (figura 4.b) solo, demostró espectacularmente la realización del concepto según la invención del empleo de un módulo diana. Mientras la rMLA en el margen de concentración investigado de 200 pg/ml hasta 4 \mug/ml no causaba ningún efecto tóxico sobre las células B16, la bFGF-MLA desplegaba una potente acción citotóxica con una semiviabilidad máxima (valor IC_{50}) de las células B16 a una concentración de 48 ng/ml (figura 7.a). Con ello, pudo mostrarse según la invención, que el módulo efector rMLA no efectivo, mediante un empalme covalente por medio de un módulo de procesado con un módulo detector, p. ej., bFGF, podía emplearse selectivamente para la muerte de las células B16.

En otro ejemplo de ejecución se demostró el efecto de un módulo de modulación (rMLB) sobre un módulo efector (rMLA). Una proteína de fusión del tipo TPE, en este caso la bFGF-MLA (ver más arriba), se asocia con la rMLB, según el ejemplo 4, mediante un proceso in vitro de renaturalización efectuado juntamente con rMLB (figura 5.a-5.b). La asociación utiliza durante el proceso de renaturalización las propiedades específicas de la rMLB para la asociación covalente con la rMLA mediante la formación de un puente de disulfuro. El material de partida necesario para ello en forma de las dos cadenas de polipéptidos, puede obtenerse mediante la expresión en E. coli en forma de cuerpos de inclusión citoplasmática según el ejemplo 2. El efecto creciente de la toxicidad del módulo modulador (rMLB) puede comprobarse en un modelo in vitro según el ejemplo 6. Una comparación de la citotoxicidad de la bFGF-MLA/rMLB con la citotoxicidad de la construcción TPE no modulada (bFGF-MLA) muestra una mejora del valor IC_{50} alrededor del factor 5, de 48 ng/ml a 10 ng/ml (figura 8.b). Este resultado confirma de forma impresionante la funcionalidad de la rMLB como módulo modulador. La actividad de unión al hidrato de carbono presente en la rMLK-ITF modulada, aquí demostrada, del módulo modulador (rMLB) no tiene a este respecto ninguna influencia sobre la incorporación en las células; lo cual puede demostrarse porque la adición de lactosa, un inhibidor competitivo de la unión del hidrato de carbono de la rMLB, no ocasiona ninguna inhibición de la funcionalidad del polipéptido asociado TPE/M (figura 8.a).

El ejemplo de referencia 1 muestra el empleo de un polipéptido con la combinación del módulo EPMT para la investigación de la funcionalidad del propéptido ProML como módulo de procesado. En este ejemplo especial se emplea como módulo modulador y módulo detector (M^{T}) una cadena rMLB/tipo salvaje en cuyos subdominios 1\alpha y 2\gamma se cargó una intrínseca actividad de unión del hidrato de carbono, la cual en el presente ejemplo puede aprovecharse ventajosamente para una unión poco específica con la estructura de superficie de glicosilo de las células diana MOLT4 y con ello para la detección del constructo. Esta función de detección se puede comprobar sobre el plano de estructura de los citados subdominios y con ello diferenciarse funcionalmente con claridad de los dominios modulados. Este modelo mínimo aprovecha las nuevas propiedades de las ProML recombinantes preparadas, en particular de sus propéptidos. En este caso, se copula el módulo efector (rMLA) mediante el propéptido de la lectina de muérdago según el ejemplo 3 en el módulo modulador (rMLB). La obtención de este rML-ITF en forma de ProML (figura 6) puede efectuarse mediante la expresión en E. coli y la acumulación citoplasmática de cuerpos de inclusión, como se ha mencionado en el ejemplo de referencia 2.

La idoneidad de la ProML, la cual se prepara en los ejemplos de referencia y no pertenece a la invención, como módulo EPMT muestra el ensayo de funcionalidad frente a las células inmunológicas de la sangre, como p. ej., de la línea celular leucémica humana MOLT-4 según el ejemplo 9 (figura 9.a). La efectividad observada de la ProML, con un valor IC_{50} de 5 ng/ml, muestra la asombrosa propiedad hasta ahora no conocida de un propéptido RIP tipo II, de poder preparar un módulo de procesado funcional en forma de una secuencia sensible a las proteasas. Además, mantendrá inactivado el módulo efector (rMLA) mediante el propéptido intacto fuera de la célula. Esto hasta ahora, no pudo demostrarse para otras proformas conocidas de otras RIP-tipo II. Para poder efectuar una detección específica de una célula diana, es ventajoso desconectar la actividad de unión no específica del dominio modulador. Para ello, es importante conocer los sitios de unión del hidrato de carbono así como los aminoácidos participantes en la unión. Estos fueron intercambiados como se ha descrito en el ejemplo 7 en el caso de la cadena B de la lectina del muérdago mediante mutación sobre el plano del ácido nucleico. A continuación se preparó la rIML inactivada para la unión al hidrato de carbono, según los pasos que figuran en el ejemplo 8 (a.-c.) mediante la expresión de las cadenas individuales y el coplegado in vitro (figura 13). La citotoxicidad de esta variante rML está como puede verse en el ejemplo 9, drásticamente reducida, de forma que en el pretendido pequeño margen de dosificación de una potencial terapia con ITF, puede obtenerse como resultado una drástica reducción del riesgo de efectos secundarios en comparación con las inmuno- y mitotoxinas hasta ahora conocidas (figura 14).

El ejemplo 10 describe la forma de proceder para la construcción de vectores los cuales sirven como punto de partida para la construcción de cualquier toxina ITF mediante la inserción modular de módulos diana, así como además, abrir la posibilidad para la realización de diferentes colocaciones y combinaciones de los módulos ITF individuales (figura 16 y figura 17).

Para demostrar la funcionalidad de una toxina ITF con un módulo detector específico, se insertó la secuencia del neuritógeno péptido P2 (Weishaupt y col., 1995) en forma de un fragmento génico sintético (figura 9) en el vector pIML-03-H (ejemplo 11, figura 17 y 18) y se indujo la expresión (ejemplo 12.a). La purificación de esta variante ITF puede efectuarse a continuación mediante el módulo de afinidad tanto en condiciones nativas (ejemplo 12b, figura 24) como en condiciones de desnaturalización (ejemplo 12.b, figura 25), o respectivamente, puede ser renaturalizada in vitro (ejemplo 12.c; figura 27). La efectividad de una de dichas toxinas ITF se describirá con más detalle más adelante. Una condición indispensable y a la vez un problema importante del desarrollo de substancias de acción citotóxica a base deproteínas inactivadoras de ribosomas es el empalme de módulos de toxina, de modulación y diana de manera que al exterior de las células diana y en condiciones fisiológicas permanezcan unidos establemente, aunque intracelularmente estén separados entre sí de forma que el efecto toxina pueda manifestarse. Esta exigencia debe cumplirse con el empleo de engarces de polipéptido (módulos de procesado), los cuales fuera de la célula garantizan un empalme estable, aunque intracelularmente son escindidos hidrolíticamente por enzimas especiales -i.d. R. proteasas-. En las toxinas ITF basadas en la lectina del muérdago pudo emplearse con éxito por primera vez uno de estos engarces -o respectivamente módulo de procesado en el sentido de la invención- el cual hace posible la necesaria funcionalidad de la toxina. Como consecuencia de la sensibilidad de las proteasas del módulo de procesado utilizado, se deduce de todas formas que ya durante la expresión heteróloga de los correspondientes genes ITF en E. coli, se obtienen módulos efectores hidrolíticamente escindidos, como productos secundarios (ejemplo 12, figura 26), los cuales deben separarse a continuación de los ITF mediante operaciones de acabado y purificación. Mediante el empleo de cepas de E. coli con una deficiencia apropiada de proteasas se puede limitar adicionalmente el contenido en productos de degradación.

El efecto del ITF con el péptido P2 neuritógeno como dominio diana sobre las células T autorreactivas específicas de P2 in vitro se analiza por ejemplo mediante citometría de flujo en un FACS (fluorescence activated cell sorter) ("clasificador de células activadas por fluorescencia") (ejemplo 13). Mediante el método de tintura (anexina-V/yoduro de propidio) pueden diferenciarse las célula apoptóticas de las necrótidas. Las mediciones después de 2 horas (figura 28) y después de 24 horas (figura 29) muestran (descripción más detallada en el ejemplo 13) que según la duración del tratamiento y concentración, ambas clases de muerte celular son inducidas por el ITF.

Las figuras muestran:

Figura 1.a: Construcción de un vector para la expresión de una rML-ITF del tipo TPE (bFGF-MLA).

Figura 1.b: Secuencia de procesado C-terminal, de bFGF.

Figuta 1.c: Vector de expresión del módulo efector (rMLA).

Figura 2: Vectores para la expresión del módulo TPE (bFGF-MLA) y M(rMLB) para la asociación in vitro.

Figura 3: Construcción de un vector para la expresión de un rML-ITF del tipo EPM^{T} (ProML).

Figura 4.a: Expresión recombinante de bFGF-MLA.

Figura 4.b: Expresión recombinante de rMLA.

Figura 5.a: Expresión recombinante de bFGF-MLA/rMLB (tintura completa de la proteína).

Figura 5.b: Expresión recombinante de bFGF-MLA/rMLB (análisis Western-Blot).

Figura 6: Expresión recombinante de ProML.

Figura 7: Citotoxicidad de bFGF-MLA.

Figura 8.a: Citotoxicidad de bFGF-MLA/rMLB.

Figura 8.b: Modulación de la citotoxicidad de bFGF-MLA mediante rMLB.

Figura 9.a: Citotoxicidad de ProML.

Figura 9.b: Citotoxicidad de ProML en comparación cob rML.

Figura 10: Ejemplo de selección de posibilidades de combinación del módulo rML-ITF.

Figura 11.a: Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos derivada, de rMLA.

Figura 11.b: Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos derivada, de rMLB.

Figura 11.c: Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos derivada, del propéptido de rML.

La secuencia de nucleótidos de la figura 11 muestra diferentes sitios de escisión de restricción, codones de principio y final, los cuales pueden ser eliminados o modificados por el experto en caso de necesidad según los fines de la invención. Esta clase de versiones están mostradas en las figura 11a' - 11c'.

Figura 11.d: Región que flanquea la casette génica de ProML en el vector de expresión pT7ProML.

Figura 11.e: Región que flanquea la casette génica de IML en el vector de expresión pIML-02-P.

Figura 12: Expresión recombinante de rML

Figura 13: Expresión recombinante de rIML (rML\Delta1\alpha1\beta2\gamma).

Figura 14: Citoxicidad de rIML con sitios de unión a los hidratos de carbono inactivados, en comparación con el rML (tipo salvaje).

Figura 15: Construcción de un vector para la expresión de un derivado de rML sin afinidad para los hidratos de carbono.

Figura 16: Construcción de un sistema de expresión periplasmático modular para la expresión de las toxinas ITF.

Figura 17: Ensamblaje de las toxinas ITF a base del vector pIML-03-H ó respectivamente pIML-03-P con actividad específica frente a células diana.

Figura 18: Vector para la expresión de una toxina ITF, específico frente a una línea celular T neuritógena reactiva con el P2.

Figura 19: Casette de genes sintética, que codifica los aminoácidos 53 a 78 de la proteína P2.

Figura 20: Casette de engarces sintética, para la preparación de modularidad en el extremo 3' de rMLB\Delta1\alpha1\beta2\gamma.

Figura 21: Casette de engarces sintética para la preparación de modularidad en el extremo 3'de rMLB\Delta1\alpha1\beta2\gamma con el módulo de afinidad ("His-Tag").

Figura 22: Oligonucleótido mutágeno para la inactivación de los sitios de unión a los hidratos de carbono en rMLB.

Figura 23: Oligonucleótidos mutágenos para la construcción de cassettes de genes ITF modulares.

Figura 24: Purificación de ITF-P2-C1 en Ni-NTA-sefarosa en condiciones de desnaturalización.

Figura 25: Purificación de ITF-P2-C1 en Ni-NTA-sefarosa en condiciones fisiológicas.

Figura 26: Procesado de pITF-P2-C1 en la producción en E. coli.

Figura 27: Expresión del ITF mediante el plegado in vitro.

Figura 28: Análisis FACS de células T específicas de P2, después de dos horas de incubación con ITF-P2-C1.

Figura 29: Análisis FACS de células T específicas de P2, después de 24 horas de incubación con ITF-P2-C1.

Los ejemplos siguientes aclaran la invención:

Ejemplo 1 Construcción de un vector para la expresión heteróloga de una proteína de fusión del tipo TPE (bFGF-MLA) en E. coli

Como ejemplo para la introducción específica en la célula diana de la actividad inactivadora de los ribosomas de la cadena A de la lectina del muérdago (rMLA), se construyó un gen de fusión que condujo a una célula anfitriona apropiada (E. coli BL21) para la acumulación citoplasmática de una proteína de fusión compuesta del factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF) y rMLA. La proteína de fusión posee de esta forma el componente bFGF como módulo detector y el dominio rMLA como módulo efector. La secuencia C-terminal del bFGF contiene un sitio de escisión de la tripsina (Lappi y col., 1994) y sirve como módulo de procesado (figura 1.b).

A partir de una preparación del ADN del plásmido (minipreparación del plásmido, Qiagen) del plásmido pUC-bFGF (R&D Systems, Wiesbaden) propagado mediante E-coli azul XL1, se amplificó el gen bFGF (Abraham y col., 1986) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la utilización del cebador específico del bFGF (figura 1.a). Después de la hidrólisis del producto de amplificación con la endonucleasa de restricción NdeI y subsiguiente purificación (kit de purificación de PCR, firma Qiagen) se empalmó covalentemente el fragmento de ADN con el vector pT7-ML14-17 también hidrolizado con NdeI y desfosforilado (figura 1.c), cuya construcción está descrita en detalle en la solicitud de la patente europea nº 95109949.8, en una reacción T4-ligasa. Después de la transformación del inserto de ligación en E. coli azul XL1, se seleccionaron los clones, mediante plaqueado sobre agar de ampicilina, que habían establecido dentro de la célula el plásmido deseado pT7bFGF-MLA. El ADN del plásmido de los clones escogidos se analizó mediante hidrólisis con endonucleasas de restricción adecuadas para detectar la aparición electroforética de magnitudes de fragmentos característicos antes mencionados. La secuencia correcta del gen bFGF de un clon positivo escogido, se comprobó mediante análisis de la secuencia de
nucleótidos.

El vector de expresión obtenido pT7bFGF-MLA (figura 1.a) contiene el gen de fusión que codifica la bFGF-MLA bajo el control del promotor phi10. Después de la inducción con IPTG tiene lugar en E. coli BL21 la formación de la T7-polimerasa, con una alta velocidad de transcripción del gen de bFGF-MLA. El producto génico formado puede aislarse a continuación de la fracción soluble o de cuerpos insertados, de las células.

Ejemplo 2 Construcción de los vectores para la expresión heteróloga de una proteína de fusión asociada del tipo TPE/M (bFGF-MLA/rMLB)

Para la expresión de una proteína de fusión asociada: el tipo TPE/M que consta de bFGF-MLA copulada in vitro y rMLB, es necesario por un lado un vector para la expresión de bFGF-MLA (pT7bFGF-MLA) y por otro lado un vector para la expresión de rMLB (pT7-ML25-26) (figura 2). La construcción del vector pT7bFGF-MLA está descrita en el ejemplo 1. Para la construcción del vector pT7-ML25-26 se amplificó la secuencia completa codificadora de rMLB mediante una PCR específica, a partir del ADN complejo genómico de Viscum album, con lo que mediante la región no complementaria del oligonucleótido del cebador empleado se introdujeron los elementos de control de la traducción así como las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción, mediante las cuales el gen para rMLB ha sido clonado en el vector de expresión (descripción detallada en la solicitud de patente europea nº 95109949.8).

Ejemplo de referencia 1

Construcción de un vector para la expresión heteróloga de un polipéptido del tipo EPM^{T} (ProML) en E. coli

Para la expresión recombinante de ProML -la proteína precursora de ML inactiva RIP, sintetizada en el muérdago- se aislaron del muérdago mediante PCR, y se combinaron, fragmentos de genes clonados para la rMLA (pML14-17), el propéptido (pML7-9) y la rMLB (pML25-26) (descripción detallada en la solicitud de patente europea nº 95109949.8) en dos reacciones de ligasa secuenciales, y a continuación se clonaron en el vector de expresión pT7-7 (figura 3).

A continuación se preparó después de la hidrólisis con NruI/KpnI del vector pML7-9 la pro-secuencia mediante electroforesis sobre gel de agarosa y se clonó en el vector pML14-17 desfosforilado e hidrolizado con NruI/KpnI (figura 3). Después de la transformación de E. coli azul XL1 se validaron los clones resistentes a la ampicilina del ADN del plásmido, mediante hidrólisis con NruI/KpnI para detectar la inserción de la pro-secuencia. En el vector pML7-17 así obtenido, se fusionó según la misma estrategia aunque empleando las endonucleasas de restricción AatII y BamHI, la secuencia de la cadena rMLB con la pro-secuencia, lo cual condujo al vector pML7-26. El vector de expresión pT7proML se obtuvo con el mismo procedimiento por reclonado de la ProML-secuencia en el vector pT7-7 mediante los sitios de corte de restricción NdeI y BamHI. La figura 11.d muestra la posición de las secuencias de reconocimiento de las nucleasas de restricción, la cual permite una inserción de la casette de genes modular en un correspondiente vector. En la figura 11.d. se muestra además la colocación de los elementos de control de la traducción, en este caso del codon de partida ATG como el codon de finalización TGA y TAA, para la ejemplar expresión citoplasmática de un polipéptido del tipo EPM^{T} (ProML) en E. coli. El gen ProML está bajo el control del promotor phi10-T7. En la transformación del plásmido en E. coli BL21, el cual está a disposición en el gen de la polimerasa T7 en trans, se forma después de la inducción con IPTG la T7-ARN-polimerasa y en el sentido de una cascada de refuerzo para la transcripción del gen controlado por el promotor T7. Como consecuencia de la formación masiva del ARNm específico a emplear, se produce según la eficiencia de la traducción y propiedades de la proteína, una acumulación en una medida distinta, del producto génico en la fase soluble o en los cuerpos de inserción del citoplasma.

Ejemplo 3 Procedimiento para la producción de una proteína de fusión (bFGF-MLA) mediante la expresión soluble en E. coli

La expresión heteróloga descrita aquí y en el ejemplo 6, de los correspondientes genes de rML-ITF tiene lugar en E. coli BL21, la cual cuenta con un gen T7 integrado en el cromosoma bajo el control del promotor Lac. Después de la adición de IPTG tiene lugar la expresión inducida por la T7-ARN polimerasa del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. El producto génico puede obtenerse a partir de la fracción soluble (este ejemplo) o de la fracción no soluble (ejemplo 6) de la desintegración celular, con lo que el enriquecimiento de las proteínas de fusión en la fracción deseada puede dirigirse en uno u otro sentido mediante la cantidad de IPTG empleada para la inducción.

Para la producción de la proteína de fusión bFGF-MLA recombinante se introdujeron 10 ml de un subcultivo de E. coli BL21-(pT7bFGF-MLA; figura 1.a) crecido en reposo con el medio LB-Amp en 1000 ml de medio LB-Amp, y se incubó en un matraz de 2000 ml, y a 37ºC a 190 rpm. Cuando se alcanzó un grueso de células correspondiente a una OD_{578} de 0,9 se indujo la expresión del gen de fusión mediante la adición de 500 \muM de IPTG. Tres horas después de la inducción se recogieron las células por centrifugación (10 minutos, 6000 rpm, 4ºC; Sorvall rotor GS3). El sedimento de células se resuspendió en tampón A (600 mM de NaCl; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 4ºC) y se desintegró mediante el paso por dos veces en una celda de presión "French Press" (de la firma SLM Instruments) a 1500 psi. La separación de los componentes celulares insolubles tuvo lugar por centrifugación /17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, Sorvall rotor SS34).

El enriquecimiento de la proteína de fusión bFGF-MLA soluble, con el componente bFGF tuvo lugar mediante la unión a una matriz de afinidad de heparina inmovilizada (1 ml de HiTrap heparina-sefarosa: firma Pharmacia) con un flujo constante de 1 ml por minuto [Äkta Chromatographieanlage ("documento anexo de cromatografía"); firma Pharmacia]. La proteína unida a la matriz de afinidad se eluyó con tampón B (2M de NaCl; 10 mM de Tris-HCl; pH 7,4), y para la preparación de otra purificación se dializó frente a tampón C (50 mM de NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 10% (v/v) de glicerina, 0,05% (v/v) de Tween-20). La separación de los productos de degradación conteniendo bFGF así como las proteínas de E. coli copurificadas tuvo lugar mediante la unión de la proteína de fusión bFGF-MLA a una matriz de inmunoafinidad anti-rMLA (260 \mug de anti-nMLA-IgG (TA5) inmovilizada en proteína A-sefarosa CL4B (firma Sigma, Deisenhofen) según el método de Harlow & Spur, 1988). El anticuerpo monoclonal anti-nMLA-IgG TA5 (Tonevitsky y col., 1995) fue obtenido y puesto a disposición por el autor. Como también otros anticuerpos aquí empleados pueden obtenerse mediante procedimiento estándar empleando los correspondientes inmunógenos (en el caso del TA5, éste es el ML-1 ó MLA). Después de 2 horas de incubación de la matriz de afinidad en la solución de proteína con agitación a 4ºC se eliminaron las proteínas no unidas por lavado con tampón D (1 M de NaCl; 50 mM de NaH_{2}PO_{4}; pH 7,4). La proteína unida se eluyó con tampón E (0,1 M de glicina; 300 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 10% (v/v; glicerina 0,05% (v/v) Tween-20; pH 3,0); directamente en tampón de retroceso (1M de Na_{2}PO_{4}; pH 8,0). La identidad de la proteína fue comprobada mediante análisis Western-Blot con anticuerpos monoclonales anti-nMLA (TA5) (Tonovitsky y col., 1995) así como anti-bFGF (F-6162, firma Sigma, Deisenhofen) y un segundo anticuerpo de detección conjugado con fosfatasa alcalina anti-IgG de ratón-IgG (firma Sigma, Deisenhofen (figura 4.a).

Ejemplo 4 Expresión de una proteína de fusión asociada: tipo TEP/M (bFGF-MLA/rMLB)

La preparación de bFGF-MLA y rMLB puede efectuarse mediante la utilización de los vectores de expresión pT7bFGF-MLA y pT7-ML25-26 (figura 2). Para ello se introdujeron cada vez 10 ml de precultivos de cultivos crecidos en reposo en medio LB-Amp E. coli-BL21/pT7bFGF-MLA o respectivamente E. coli-BL21/pT7-ML25-26 en 1000 ml cada vez de medio LB-Amp en un matraz de 2000 ml, y agitado a 37ºC a 190 rpm. Cuando se alcanzó una densidad de células correspondiente a una OD_{578} de 0,9 se indujeron las expresiones mediante la adición de 500 \muM de IPTG. Tres horas después de la inducción se retiraron las células por centrifugacióm (10 minutos, 6000 rpm, 4ºC, Sorvall rotor GS3).

El sedimento celular A conteniendo la bFGF-MLA y el sedimento celular B conteniendo la rMLB fueron resuspendidos cada vez en 20 ml de tampón de desintegración (20 mM de NaH_{2}PO_{4}; 50 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; pH 7,4; 4ºC) y se disgregaron mediante el paso por dos veces en una celda a presión "French Press" (SLM Instruments) a 1500 psi. Mediante centrifugado (30 minutos, 10000 rpm, 4ºC, rotor SS34) se sedimentaron cada vez los componentes celulares insolubles. Los sedimentos A y B que contienen los cuerpos de inclusión se lavaron cada vez con tampón STET (8% (p/v) de sacarosa; 50 mM de EDTA; 0,05% (v/v) de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl; pH 7,4) y a continuación se disolvieron agitando durante 4 horas en 15 ml de tampón de desnaturalización (6 M de cloruro de guanidinio; 20 mM de DTT; 50 mM de Tris-HCl; pH 8,0; temperatura ambiente). Mediante centrifugación (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, Sorvall rotor SS34) se separaron cada vez los componentes celulares insolubles. El contenido en bFGF-MLA de la solución A se determinó mediante análisis Western-Blot con detección inmunoquímica mediante anticuerpos monoclonales anti-bFGF (F-6162, firma Sigma) a base de un estándar de bFGF (F-0291, firma Sigma, Deisenhofen). El contenido en rMLB de la solución B se determinó mediante análisis Western-Blot con detección inmunoquímica mediante anticuerpos monoclonales anti-rMLB (TB33, Tonevitsky y col., 1995) y un anticuerpo de detección IgG-IgG anti-ratón conjugado con una fosfatasa alcalina (Sigma, Deisenhofen), a base de un estándar de cantidad ML1 (firma MADAUS AG, Köln; lote nº 220793. Los anticuerpos monoclonales empleados anti-nMLB-IgG TB33 fueron puestos a disposición por el autor. Como los otros anticuerpos aquí utilizados, éstos pueden obtenerse mediante procedimientos estándar utilizando el correspondiente inmunógeno (en el caso del TB33, éste es el ML-1 ó el MLB).

Para la asociación in vitro del bFGF-MLA con rMLB se añadió gota a gota una solución de proteína (6 M de cloruro de guanidinio; 2 mM de DTT; 50 mM de Tris HCl; pH 6,0) con un contenido en componentes de copulación cada vez de 0,5 mg, con una velocidad de aproximadamente 1 ml/hora a 4ºC con agitación en tampón de plegado o respectivamente tampón de copulación (50 mM de NaH_{2}PO_{4}; 50 mM de KCl; 1 mM de EDTA; 10% (v/v) de glicerina; 100 mM de glucosa; 20 mM de lactosa; 1 mM de glutatión reducido; 1 mM de glutatión oxidado; pH 8,0) desde 28 veces el volumen de la solución de proteína hasta una concentración final teórica en bFGF-MLA/rMLB de 7,5 \mug/ml. Después de agitar durante 24 horas a 4ºC se sedimentaron los componentes insolubles (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, Sorvall rotor SS34). Las proteínas solubles se concentraron en un factor de cinco (celda con agitación con sobrepresión de N_{2} con membrana de ultrafiltración Diaflo YM30, firma Amicon) y se dializó frente a un tampón de cromatografía (20 mM de NaH_{2}PO_{4}; 300 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 0,1 g/litro de PVP K17; pH 8,0).

El enriquecimiento de bFGF-MLA/rMLB soluble y de unión a la lactosa tuvo lugar mediante cromatografía de afinidad en una matriz de afinidad de \beta-lactosil-agarosa (nº 20364; firma Pierce) con una velocidad de flujo constante de 0,3 ml/minuto. La proteína unida se eluyó con 400 mM de tampón de cromatografía conteniendo lactosa. La fracción de eluato obtenida se dializó frente a tampón de conservación (20 mM de NaH_{2}PO_{4}; 300 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 0,1 g/litro de PVP K17; pH 7,0). La pureza de la muestra de bFGF-MLA/rMLB empleada se documentó mediante PAGE con subsiguiente tintura con plata (figura 5.a). La identidad de las bandas de la muestra se comprobó mediante análisis Western-Blot con los anticuerpos monoclonales anti-bFGF (F-6162, firma Sigma) y anti-rMLB (TB33, Tonevitsky y col., 1995) así como un anticuerpo de detección de IgG de la IgG de anti-ratón conjugado a una fosfatasa alcalina (Sigma, Deisenhofen) (figura 5.b).

Ejemplo de referencia 2

Preparación de un rML-ITF del tipo EPM^{T} (ProML) mediante la expresión en E. Coli en forma de cuerpos de inclusión citoplasmática

Para la producción de proML recombinante se introdujeron en un matraz de 2000 ml, 10 ml de un precultivo de E. coli-BL21/pT7proML crecido en reposo en un medio LB-Amp, en 1000 ml de medio LB-Amp, y se agitó a 37ºC con 190 UpM. Cuando se alcanzó una densidad celular correspondiente a una OD_{578} de 0,9, se indujo la expresión mediante la adición de 500 \muM de IPTG. Tres horas después de la inducción se separaron las células por centrifugación (10 minutos, 6000 rpm, 4ºC, Sorvall rotor GS3). El sedimento de células se resuspendió en 20 ml de tampón de desintegración (20 mM de NaH_{2}PO_{4}; 50 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; pH 7,4; 4ºC) y se desintegró mediante el paso por dos veces por una celda de presión "French Press" (SLM Instruments) a 1500 psi. Mediante centrifugado (30 minutos, 10000 rpm, 4ºC, rotor SS34) se sedimentaron los componentes celulares insolubles. Los sedimentos que contienen los cuerpos de inclusión fueron lavados cinco veces con tampón STET (8% (p/v) de sacarosa; 50 mM de EDTA; 0,05% (v/v) de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl; pH 7,4) y a continuación se disolvió con agitación durante 4 horas en 15 ml de tampón de desnaturalización (6 M de cloruro de guanidinio; 20 mM de DTT; 50 mM de Tris-HCl; pH 8,0; temperatura ambiente). Mediante centrifugación (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, Sorvall rotor SS34) se separaron los componentes celulares insolubles.

El contenido de ProML de esta solución se determinó mediante análisis Western-Blott con detección inmunoquímica mediante anticuerpos monoclonales anti-rMLA (TA5, Tonevitsky y col., 1995) a base de un estándar de cantidad ML-1 (firma MADAUS AG, Köln; lote nº 220793). La solución de proteína se retamponó mediante filtración sobre gel (PD10, firma Pharmacia) en condiciones de renaturalización (6 M de cloruro de guanidinio; 10 mM de NaH_{2}PO_{4}; pH 4,5) y se ajustó a una concentración de ProML de 400 \mug/ml. El ProML renaturalizado, se obtuvo con agitación continua mediante la adición gota a gota (aproximadamente 1 ml/hora) de la solución de proteína en 20 veces el volumen de tampón de plegado (50 mM de KCl; 1 mM de EDTA; 100 mM de glucosa; 10 mM de lactosa; 10% (v/v) de glicerina; 3 mM de glutatión oxidado; 0,6 mM de glutatión reducido; 50 mM de Tris-HCl; pH 8,5; 4ºC). El sobrenadante obtenido después de la centrifugación (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC) se concentró a 4ºC por un factor 4 (celda de agitación con sobrepresión de N_{2} con membrana de ultrafiltración Diaflo YM30, de la firma Amicon) y se centrifugó de nuevo (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC). A continuación se dializó la muestra frente a tampón de almacenamiento (300 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 100 mg/litro de PVP-K17; 20 mM de NaH_{2}PO_{4}; pH 8,0; 4ºC).El rendimiento y la identidad de los ProML renaturalizado se comprobaron mediante análisis Western-Blot de un PAGE efectuado en condiciones reductoras mediante el empleo de los anticuerpos monoclonales específicos de MLA y MLB, TA5 y TB33 (Tonevitsky y col., 1995) así como un anticuerpo de detección IgG, anti-IgG de ratón, conjugado a una fosfatasa alcalina (Sigma, Deisenhofen) (figura 6).

Para el enriquecimiento selectivo de ProML con un componente de la cadena B renaturalizado funcionalmente, se diluyó la solución de proteína 1/10 en tampón de cromatografía (100 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 100 mg/litro de PVP-K17; 0,05% (p/v) de BSA; 50 mM de acetato de Na/ácido acético glacial; pH 5,6: 4ºC), se unió a una matriz de afinidad \beta-lactosil-agarosa (nº 20364, firma Pierce) con una velocidad de flujo constante de 0,3 ml/minuto y se eluyó con 400 mM de tampón de cromatografía conteniendo lactosa. La fracción de eluato obtenida se dializó frente a tampón de almacenamiento (20 mM de NaH_{2}PO_{4}; 300 mM de NaCl; 1 mM de EDTA; 0,1 g/litro de PVP K17; pH 7,0).

Ejemplo 5 Funcionalidad de una proteína de fusión del tipo TPE (bFGF-MLA) frente a células diana

La citotoxicidad de la proteína de fusión bFGF-MLA se determinó frente a la línea de células B16 de ratón (DKFZ Heidelberg, TZB nº 630083) en un margen de concentración de 375 ng/ml a 37,5 pg/ml. Para ello se inoculó una placa de microtitulación de 96 pocillos (firma Nunc, Wiesbaden) con 1500 células B16 cada uno, en 100 \mul de medio de cultivo (RPMI-1640 (R-7880, firma Sigma) más 5% de FKS) cada uno. La concentración de la solución de bFGF-MLA empleada para ello, se determinó mediante análisis Western-Blot con detección inmunológica con anticuerpos anti-bFGF monoclonales (F-6162, firma Sigma) a base de una solución conteniendo bFGF con un contenido en bFGF conocido (F-0291, firma Sigma).

Después de 24 horas de incubación en la estufa de incubación (37ºC; 5% de CO_{2}) se verificó microscópicamente la adhesividad de las células. 10 \mul del sobrenadante se intercambiaron frente a medio de cultivo -en diluciones crecientes de la proteína de fusión bFGF-MLA contenida- de forma que se efectuaron seis copias del paso de dilución pro bFGF-MLA. Después de 72 horas más de incubación se efectuó la cuantificación del efecto citotóxico mediante la determinación de la viabilidad de las células según el método WST-1 (Scudiero y col., 1988). La evaluación de la reacción coloreada se efectuó mediante la determinación de la densidad óptica a una longitud de onda de 490 nm (longitud de onda de referencia: 690 nm) con un fotómetro de placas de microtitulación (firma MWG-Biotech, Ebersberg). El valor de IC_{50} (concentración de bFGF-MLA, la cual conduce a una disminución de la viabilidad frente al control positivo del 50%), se obtuvo mediante un ajuste de las curvas de 4 parámetros a los valores de medición. La proteína de fusión bFGF-MLA mostró una actividad citotóxica con un valor de IC_{50} de 48 ng/ml
(figura 7).

Para la verificación del efecto citotóxico de la proteína de fusión bFGF-MLA mediante la internalización inducida por la bFGF mediante una unión específica a la molécula receptora bFGF presente en la superficie de células B16, se determinó según el mismo procedimiento el efecto citotóxico de la rMLA sobre las células B16 en un margen de concentración de 4 \mug/ml a 200 pg/ml (figura 7). A este respecto se muestra en el margen de concentración del valor IC_{50} de la proteína de fusión bFGF-MLA de 48 ng/ml, cualquier efecto citotóxico de la rMLA. En la mayor concentración empleada de 4 \mug/ml se aprecia una viabilidad de las células B16 de más del 60%, lo cual puede valorarse como una citotoxicidad de principio de la rMLA mediante una absorción no específica.

Mediante la fusión del módulo efector con el módulo de procesado y el módulo detector, pudo obtenerse una substancia activa (bFGF-MLA), que está en situación de aniquilar las células diana con un valor IC_{50} de 48 ng/ml. Por el contrario, el módulo efector (rMLA) no muestra ninguna toxicidad no específica hasta una concentración investigada de 4 \mug/ml. Mediante la fusión con el módulo de procesado y el módulo detector pudo aumentarse la toxicidad del módulo efector como mínimo en un factor 100.

Ejemplo 6 Funcionalidad de una proteína de fusión asociada del tipo TPE/M (bFGF-MLA/rMLB) frente a células diana

La citotoxicidad de la proteína fusionada asociada in vitro (bFGF-MLA copulada con rMLB mediante un coplegado) se determinó frente a la línea de células de ratones B16 (DKFZ Heidelberg, TZB nº 630083) en un margen de concentración de 65 ng/ml a 1 pg/ml, la cual concentración había sido determinada mediante un "Enzyme-Linked-Lectin-Assay" ("análisis enzimático de la lectina" (ELLA) (Vang y col., 1986).

Para ello se inoculó una placa de microtitulación de 96 pocillos (firma Nunc, Wiesbaden) con 1500 células B16 en cada uno, en 100 \mul de medio de cultivo (RPMI-1640 (R-7880, firma Sigma) más 5% de FKS) cada uno. Después de 24 horas de incubación en la estufa de incubación (37ºC; 5% de CO_{2}) se verificó microscópicamente la adhesividad de las células. 10 \mul del sobrenadante se intercambiaron frente a medio de cultivo -en diluciones crecientes de la proteína de fusión bFGF-MLA/rMLB contenida- de forma que se efectuaron seis copias por cada paso de dilución pro bFGF-MLA. Después de 72 horas más de incubación se efectuó la cuantificación del efecto citotóxico mediante la determinación de la viabilidad de las células según el método MTT (M-5655, firma Boehringer; Mossmann,
1983).

La evaluación de la reacción coloreada se efectuó mediante la determinación de la densidad óptica a una longitud de onda de 560 nm (longitud de onda de referencia: 690 nm) con un fotómetro de placas de microtitulación (firma MWG-Biotech, Ebersberg). El valor de IC_{50} (concentración de bFGF-MLA/rMLB, la cual conduce a una disminución de la viabilidad frente al control positivo alrededor del 50%), se obtuvo mediante un ajuste de las curvas de 4 parámetros en los valores de medición.

La proteína de fusión bFGF-MLA/rMLB mostró una actividad citotóxica con un valor de IC_{50} de 10 ng/ml (figura 8.a). La absorción específica de la célula mediante la unión a los receptores de la superficie de la célula específicos de la bFGF, se comprobó mediante un ensayo paralelo idéntico, a excepción de la presencia de 20 mM de lactosa en el medio, con lo cual no se debilitó el efecto citotóxico en el caso de la bFGF-MLA/rMLB (figura 8.a).

Mediante la adición del modulador el valor de IC_{50} como medida para la toxicidad específica de la proteína de fusión -TPE (bFGF-MLA), pudo aumentarse de 48 ng/ml a 10 ng/ml en el caso de bFGF-MLA/rMLB (figura 8.b). Con ello se pudo demostrar que la toxicidad especificada mediante un módulo detector (bFGF) del módulo efector (rMLA) puede aumentar un número múltiplo de veces mediante un módulo modulador (rMLB).

Ejemplo de referencia 3

Citotoxicidad de un polipéptido del tipo EPM^{T} (ProML) frente a células humanas linfáticas de leucemia

El desarrollo de la actividad citotóxica de la ProML se determinó con la línea celular humana mononuclear linfática de la leucemia MOLT-4 (Colección Europea de Cultivos Celulares Animales nº 85011413) en un margen de concentración de 0,6 ng/ml - 30 ng/ml.

Las células MOLT-4 se cultivaron en un medio MDC-1 exento de suero (firma PAN SYSTEMS; Aidenbach) y para el ensayo se ajustaron a una densidad celular de 1,6 \times 10^{5} células/ml con una viabilidad > 98%. Por cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (firma Nunc, Wiesbaden) se sembraron 90 \mul (correspondientes a 18000 células MOLT-4) y se mezclaron con 10 \mul en dilución creciente en cada uno, de medio MDC-1 conteniendo ProML. El contenido en ProML de la solución empleada se cuantificó previamente mediante análisis ELLA (Vang y col., 1986) a base de un estándar de cantidad de ML-1 (firma MADAUS AG, Köln, lote nº 220793). Como controles se emplearon preparaciones con medio puro y con adición de tampón de almacenamiento ProML. Para cada concentración de ProML así como los controles se prepararon seis copias. Las células se incubaron durante 72 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} en la estufa de incubación.

La cuantificación del efecto citotóxico se efectuó mediante la determinación de la viabilidad de las células según el método WST-1 (Scudiero y col., 1988). La evaluación de la reacción coloreada tuvo lugar mediante determinación de la densidad óptica en una longitud de onda de 490 nm (longitud de onda de referencia: 690 nm) con un fotómetro de placas de microtitulación (firma MWG-Biotech, Ebersberg). El valor IC_{50} (concentración de ProML la cual conduce a una disminución de la viabilidad (o respectivamente densidad óptica), frente al control positivo, alrededor del 50%), se obtuvo mediante un ajuste de las curvas de 4 parámetros a los valores de medición obtenidos. El ProML desplegó citotoxicidad frente a las células MOLT-4 con un valor IC_{50} de 5 ng/ml. Que este efecto descansa sobre una endocitosis específica inducida por rMLB, se demuestra mediante una elevación del valor IC_{50} a 26 ng/ml en presencia de 20 mM de lactosa (figura 9.a).

El resultado muestra de manera sorprendente la potencia de la secuencia Pro natural, como módulo de procesado efectivo para funcionar. La toxicidad del ProML ha disminuído con ello a un valor IC_{50} de 5 ng/ml frente al rML activo RIP con un valor IC_{50} de 200 pg/ml alrededor del factor 25 (figura 9.b). Juntamente con la propiedad de mantener inactivo el dominio efector en estado de no procesado, resultan para el ProML unas propiedades ideales para el empleo como componente EPM en medicamentos.

Ejemplo 7 Construcción de un módulo modulador derivado del rMLB con afinidad disminuída a los hidratos de carbono

En base a los datos de la Literatura sobre la ricina así como mediante cálculos adicionalea de los campos de fuerza apoyados por ordenador, se identificaron en total ocho aminoácidos en la cadena B de la lectina del muérdago, para los cuales podía aceptarse con probabilidad una participación funcional en la unión a los hidratos de carbono. Por esta razón se intercambiaron los codones para estos aminoácidos mediante mutagénesis dirigidas por oligonucleótidos efectuadas sucesivamente según Deng y col., 1992 (Chamäleon Mutagenese Kit, Stratagene) frente a codones de alanina (D23 a A, W38 a A, D235 a A, Y249 a A) o respectivamente codones de serina (Y68 a S, Y70 a S, Y75 a S, F79 a S) (figura 15, figura 22.a). Como cebador de selección se emplearon cambiándolos, el cebador "pT7 Ssp I -> Eco RV" y "pT7 Eco RV -> Ssp I" (figura 22.b). El ADN del plásmido de los clones escogidos cada vez obtenidos mediante las mutagénesis (E. coli, azul XI 1), se comprobó mediante análisis de la secuencia de nucleótidos para detectar la presencia de la secuencia de ADN mutada esperada cada vez.

Ejemplo 8 Expresión de las variantes de la lectina de muérdago recombinante (8.a - 8.c) (8.a) Expresión del rMLA en E. coli en forma de cuerpos de inclusión insolubles y preparación de una solución de cloruro de guanidinio conteniendo rMLA

Para la expresión de la cadena A de la lectina de muérdago recombinante, se inocularon 1000 ml de medio LB/Amp (en un matraz de cultivo de 2 litros) con 10 ml de un cultivo previo crecido en reposo (50 ml), y se cultivó a 37ºC y 190 rpm, controlando el crecimiento mediante la medición de la turbidez a 578 nm. Cuando se alcanzó una OD578 de 1,0 se indujo la expresión del gen rML mediante la adición de 0,5 mM de IPTG. Dos horas más tarde se retiraron las células (20 minutos, 6000 rpm, 4ºC, Beckmann rotor Ja10). El sedimento de células obtenido se resuspendió en 20 ml de tampón de desintegración (100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DDT, 1 mM de PMSF, 50 mM de Tris/HCl pH 8,0) y se desintegró dos veces con un homogeneizador con presión de gas N_{2} a 1500 psi. Los cuerpos de inclusión conteniendo rMLA, los llamados "inclusion bodies" ("cuerpos de inclusión"), se sedimentaron mediante la subsiguiente centrifugación (30 minutos, 10000 rpm, 4ºC, Beckmann JA20). El sedimento se enriqueció con proteínas de E. coli, lavando 3 veces, cada una de ellas con 30 ml de tampón STET (50 mM de EDTA, 8% (p/v) de glucosa, 0,05% (v/v) de Tween-20, 50 mM de Tris/HCl, pH 7,4 según Babbitt y col., 1990). Después de disolver el sedimento de células residuales en cloruro de guanidinio (6 M de GuHCl, 100 mM de DTT, 50 mm de Tris/HCl, pH 8,0) durante 12 horas a temperatura ambiente, se sedimentaron los componentes no solubles por centrifugado (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, rotor JA20), y se desecharon. El contenido en rMLA de la solución obtenida se determinó mediante análisis Western-Blot con utilización de los anticuerpos monoclonales TA5 específicos del nMLA y rMLA, a base de una muestra nML1 estandarizada.

(8.b) Expresión del rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma en E. coli en forma de cuerpos de inclusión y preparación de una solución de cloruro de guanidinio conteniendo rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma

Para la expresión de la cadena B de la lectina de muérdago recombinante, o respectivamente la variante rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma no unida con el hidrato de carbono se inyectaron de cada uno, 1000 ml de medio LB/Amp (en un matraz de cultivo de 2 litros) con 10 ml de un cultivo previo en reposo, lavado, (50 ml) y se cultivó a 37ºC y 190 rpm, controlando el crecimiento mediante la medición de la turbidez a 578 nm. Cuando se alcanzó una OD_{578} de 1,0 se indujo la expresión del rMLB ó respectivamente del rMLB D1\alpha1\beta2\gamma mediante la adición de 0,5 mM de IPTG. Cuatro horas después de la inducción se separaron las células (20 minutos, 6000 rpm, 4ºC, Beckmann, rotor JA10). El sedimento de células obtenido se resuspendió en 20 ml de tampón B de disgregación (50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DTT, 1 mM de PMSF, 20 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 7,2), y se disgregó dos veces con un homogeneizador de gas N_{2} a presión a 1500 psi. Los cuerpos de inclusión conteniendo rMLB se sedimentaron mediante la subsiguiente centrifugación (30 minutos, 10000 rpm, 4ºC, Beckmann Ja20). El sedimento se lavó para el enriquecimiento en proteínas de E. coli, durante 3 veces con 30 ml cada vez de tampón STET (50 mM de EDTA, 8% (p/v) de glucosa, 0,05% (v/v) de Tween-20, 50 mM de Tris/HCl, pH 7,4 según Babbitt y col., 1990). Después de disolver el sedimento de células residual en cloruro de guanidinio (6 M de GuHCl, 100 mM de DTT, 50 mm de Tris/HCl, pH 8,0) durante 12 horas a temperatura ambiente se sedimentaron los componentes insolubles por centrifugación (17000 rpm, 30 minutos, 4ºC, rotor JA20) y se desecharon. El contenido en rMLB de la solución obtenida se determinó mediante análisis Western-Blot utilizando el anticuerpo monoclonal específico de la nMLB y rMLB (TB33) a base de una muestra de referencia con un contenido conocido de nML1. El mismo procedimiento puede utilizarse para la obtención de la rMLB (secuencia de aminoácidos idéntica a la lectina de muérdago natural).

(8.c) Procedimiento para la expresión de la rIML-holotoxina mediante el plegado in vitro

El procedimiento sirve para el plegado y al mismo tiempo, para la copulación de la variante rMLB (rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma), no unida al hidrato de carbono, con la MLA para la obtención de la lectina de muérdago recombinante (Holo) con reducida afinidad a los hidratos de carbono (rIML).

Los componentes desnaturalizados disueltos en GuHCl de rIML, rMLA y rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma (ver ejemplo 8.a y ejemplo 8.b), se ajustaron a una concentración de 200 \mug/ml, se mezclaron con las mismas partes y se ajustaron mediante permeación sobre gel (PD10, Pharmacia) en condiciones definidas de tampón (6 mM de GuHCl, 2 mM de DTT, 50 mm de Tris/HCl, pH 8,0). El plegado y la asociación in vitro se efectuó a continuación añadiendo lentamente gota a gota esta solución en un volumen de tampón de plegado 30 veces mayor (50 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 100 mM de glucosa, 20 mM de lactosa, 10% (v/v) de glicerina, 1 mM de glutatión reducido, 1 mM de glutatión oxidado, 50 mM de Na_{2}PO_{4}, pH 8,0) en continua agitación a 4ºC durante aproximadamente 12 horas. A continuación se sedimentaron los componentes no solubles (30 minutos 17000 rpm, 4ºC, rotor JA20) y el contenido en rIML soluble del sobrenadante concentrado aproximadamente 10 veces se cuantificó mediante un análisis Western-Blot (figura 13). Para la expresión de la rML soluble se procedió según el mismo procedimiento aunque en lugar de rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma se empleó para la secuencia de aminoácidos, la rMLB idéntica de la cadena B de la lectina de muérdago natural.

Ejemplo 9 Determinación de la citotoxicidad del rIML frente a las células humanas de leucemia linfática

Se determinó la citotoxicidad frente a las células MOLT-4 de la holo-proteína rIML obtenida mediante el plegado in vitro y unida covalentemente mediante un puente de disulfuro, a partir de la cadena B inactivada (rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma) y la cadena A de la lectina de muérdago recombinante (rMLA) mediante un test de citotoxicidad en un margen de concentración de 100 pg/ml - 100 ng/ml según el procedimiento descrito en el ejemplo de referencia 3. El valor IC_{50} así encontrado de rIML de 25 ng/ml disminuyó frente al valor IC_{50} del modelo natural nML (extraído para comparar), idéntico a la rML hasta en la glicosilación - alrededor del factor 350 (figura 14), y es aproximadamente 40 veces mayor que la toxicidad de la cadena A recombinante (IC_{50} > 1 \mug/ml). A partir de este comportamiento puede deducirse la conclusión de que la actividad de la lectina de la cadena B, que conduce a la absorción no específica de la toxina en cualquier tipo de células, podía ser por lo menos fuertemente debilitada mediante el intercambio de aminoácidos efectuado.

Ejemplo 10 Construcción de vectores de expresión con casettes génicos modulares colocados, para los módulos efector, de procesado, modulador y de afinidad

A partir del vector pT7-ProML, el cual contiene el gen estructural de la Pro-lectina de muérdago, se crearon las correspondientes casettes de genes modulares, por modificación de la secuencia de ADN mediante mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos (Deng y col., 1992), las cuales casettes se pueden intercambiar mediante métodos relativamente fáciles por otras casettes de genes con dominios alternativos de afinidad, efector, modulador y de procesado. Mediante estas modificaciones es posible además la inserción sin problemas de los módulos diana delante o detrás de cada módulo. El compartimiento celular periplasmático de E. coli cumple en gran medida las exigencias de una proteína que contiene puentes de disulfuro en cuanto al microambiente necesario para la formación de una estructura terciaria funcional. Por este motivo se emplearon en este ejemplo las casettes de genes además en un vector periplasmático de expresión.

A partir del gen estructural para el ProML se intercambiaron mediante mutagénesis dirigida a los oligo-nucleótidos (Deng y col., 1992), la secuencia de reconocimiento Nde I que se encuentra en el extremo 5' del gen estructural del módulo efector rMLA, por una secuencia de reconocimiento Stu I, así como se introdujo en el extremo 5' del gen estructural del modulador (MLB) una secuencia de reconocimiento Nhe I (figura 16.1 arriba; figura 23 a-b). El módulo modulador rMLB (de unión con el hidrato de carbono) fue intercambiado a continuación por un módulo modulador no afín a los hidratos de carbono rIMLB (rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma) -a partir del vector pT7rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma- (ver figura 16.1 abajo). Seguidamente, se hidrolizaron los vectores pT7ProML (Stu I, Nhe I) así como el pT7rMLB \Delta1\alpha1\beta2\gamma, cada vez con las endonucleasas de restricción Nhe I y Sal I. A continuación, se separaron electroforéticamente los genes estructurales de 0,8 kbp para rIMLB en un gel de agarosa (1% p/v) del vector de expresión y se extrajo del material del gel (kit de extracción de gel, Qiagen). A continuación, se empalmó covalentemente el fragmento de gen así preparado en una reacción de T4-ligasa, con el vector pT7ProML (Stu I, Nhe I) restringido y además, desfosforilado. Después de la transformación de la preparación de ligación en E. coli azul XL1 y plaqueado sobre agar selectivo conteniendo ampicilina, se preparó el ADN a partir de cultivos de 5 ml durante la noche de clones de E. coli escogidos en expansión (Qia-Präp Kit, Qiagen). El ADN a partir de aquellos clones que contienen el vector pT7IML escogido (Stu I, Nhe I), puede mediante la adición de la endonucleasa de restricción Tth111 I ser linealizado y a base de la aparición de una banda de 3,3 kb característica puede ser identificado por electroforesis sobre gel de agarosa (figura 16.1 abajo). El vector así obtenido pT7IML (Stu I. Nhe I) fue modificado de nuevo mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido, de modo que la secuencia de reconocimiento AgeI en la región 5' del gen MLA se eliminó, una secuencia de reconocimiento Eco NI cerca del extremo 3' del gen estructural IML se transformó en una secuencia de reconocimiento Age I, así como se introdujo en el extremo 3' del gen MLA una secuencia de reconocimiento Ava I (figura 16.2, figura 23 c. - e.). El vector así obtenido pT7IML (Stu I, Ava I, Nhe I, Age I), se mezcló en la relación molar de 3:1 con el vector de expresión periplasmática pASK75 (está a disposición el gen para la secuencia señal ompA en el mismo marco de lectura 5' para la secuencia de reconocimiento Stu I), y se restringió con las endonucleasas Stu I y Sal I. Después de la separación de la enzima (kit de separación de la PCR, Qiagen), se empalmaron covalentemente los fragmentos de ADN aparecidos por incubación con T4-ligasa. Después de la separación de la T4-ligasa (kit de separación de la PCR, Qiagen), se linealizaron los productos de la ligación no deseados aparecidos cuantitativamente por tratamiento con las endonucleasas Eco RI (secuencia de reconocimiento en el engarce múltiple de pASK75 entre las secuencias de reconocimiento Stu I y Sal I) y Cla I (secuencia de reconocimiento en el vector pT7) antes de la transformación de E. coli azul XL1. A partir de 5 ml de un cultivo "durante-la-noche" de clones azul XL1 seleccionados después de plaqueado de la preparación de transformación cultivados sobre agar selectivo de ampicilina, se preparó el ADN (kit Qia-Prep, de Qiagen). En la figura 11.e se muestra como ejemplo la colocación de las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción así como los codones del final de la traducción TAG y TAA, los cuales hacen posible una expresión secretora así como una inserción de la casette de genes modular en un correspondiente vector. Por tratamiento con endonucleasas de restricción apropiadas y subsiguiente electroforesis sobre agarosa, se identificaron clones con muestras de bandas características que habían establecido el plásmido pIML-02-P intracelular deseado (figura 16.2 abajo).

Para la preparación de modularidad en la región 3' del módulo modulador, se clonaron ahora los correspondientes fragmentos de genes sintéticos (figura 16.3 arriba). Se calentaron iguales volúmenes de oligonucleótidos sintéticos complementarios entre sí con una concentración de 10 pmoles/\mul en un termociclador durante 1 minuto a 95ºC, y se hibridaron mediante enfriamiento a 4ºC (3ºC/minuto). Las secuencias de nucleótidos de los correspondientes pares de oligonucleótidos se generan de manera que después de la hibridación los extremos de los ADN aparecidos son complementarios a los extremos de ADN de los vectores de expresión antes tratados con las correspondientes endonu-cleasas de restricción (figura 16.3 centro). Además se escindió del vector pIML-02-P una región 3' de 100 bp de longitud en gen IMLB con las endonucleasas Age I y Bam HI (Age I y Sal I). Mediante un subsiguiente tratamiento de la solución con fosfatasa alcalina (NEB) y separación de la enzima (kit de separación de la PCR) se inhibió la posible religación de los fragmentos durante la siguiente ligación. En cada reacción de T4-ligasa se fusionó un fragmento génico (figura 20) el cual contenía la secuencia de aminoácidos de rIMLB, con el vector restringido con la Age I/Sal I (pIML-02-P), y adicionalmente se prepararon las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción Acc 65I, Bse RI, Sal I y Bam HI para la clonación de dominios diana (figura 16.3). En una segunda reacción con ligasa, se fusionó asimismo, otro fragmento génico sintético con extremos de ADN, complementario a los productos de restricción de AgeI, Bam HI del vector, el cual además codificó los aminoácidos C-terminales de rIMLB y también un módulo de afinidad (His-Tag) de la secuencia (Gly)_{3}-Tyr-(His)_{6} (figura 21) (figura 16.3 centro).

Los vectores de expresión obtenidos pIML-03-P y pIML-03-H sirven como construcciones de partida para la expresión de toxinas ITF, las cuales se forman mediante fusión con genes estructurales para los más distintos módulos diana (figura 16.3 abajo). Los módulos diana pueden añadirse mediante los sitios de corte de restricción antes o después de cada módulo (módulo efector, módulo de procesado, módulo modulador, módulo de afinidad) (figura 17).

Ejemplo 11 Construcción de una variante ITF con toxicidad frente a una línea celular T neuritógena

En un ejemplo seleccionado se construye una toxina ITF para el aniquilamiento de una línea celular T humana reactiva a la P2 (Weishaupt y col., 1995), la cual contiene como módulo detector, una secuencia de ADN sintética (figura 19), que codifica un fragmento de 26 aminoácidos (AS 53-78) de la proteína P2 (componente de la mielina en el sistema nervioso periférico), entre el módulo modulador y el de afinidad del vector pIML-03-H (figura 17 I.u.). Seguidamente se restringió el vector pIML-03-H, análogamente al procedimiento descrito en el ejemplo 10, con Acc 65I y Eco RV, se desfosforiló, se purificó y se ligó en presencia de T4-ligasa con los nucleótidos previamente hibridados. Después de la transformación de la preparación de ligación en E. coli azul XL1, se investigó el ADN del plásmido, de clones seleccionados proliferantes en agar selectivo de ampicilina, con la endonucleasa de restricción Eco RI en presencia del módulo detector (vector linealizado en el electroferograma sobre gel de agarosa). La secuencia del plásmido seleccionado con tarjeta de restricción positiva fue verificado finalmente mediante análisis de la secuencia de nucleótidos (figura 18).

Ejemplo 12 Preparación de toxinas ITF en el ejemplo de ITF-P2-C1 (12.a) Expresión de pITF-P2-C1 en E. coli BL21

Para la expresión del pITF-P2-C1 se inoculó de un cultivo de duración de glicerina, un precultivo de 50 ml y se cultivó hasta una fase logarítmica posterior (25ºC, 150 rpm). Cada 10 ml de este precultivo se reinocularon en 1000 ml de medio LB/Amp (cada uno en un matraz de cultivo de 2000 ml). El transcurso del crecimiento se controló mediante la medición de la turbidez a 578 nm. A una densidad óptica de 1,0 se indujo la expresión del gen ITF-P2-C1 mediante la adición de 200 \muM de tetraciclina anhidra. Para el control del transcurso de la expresión, se extrajo cada 30 minutos a partir del momento de la inducción una cantidad igual de células, se hirvieron en tampón de muestras (10% de SDS, 200 mM de DTT, 50 mM de Tris/HCl, pH 6,8) y se analizaron mediante un Western-Blott (figura 26). Después de un tiempo de inducción de dos horas las células se sedimentaron (20 minutos, 6000 rpm, 4ºC, rotor JA20), se resuspendieron en 20 ml/litro de volumen de cultivo con tampón de disgregación (600 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 10% (v/v) de glicerina, 50 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 8,0), y a continuación se disgregaron mediante un homogeneizador a presión de gas N_{2} (1 \times 1500 psi) y subsiguiente tratamiento con ultrasonidos (2 minutos, 50 W, 50% de pulso de tiempo). A continuación, se separó la fracción soluble de los componentes insolubles por centrifugación (45 minutos, 20000 rpm, 4ºC, rotor JA20).

(12.b) Funcionalidad del módulo de afinidad en condiciones nativas en el ejemplo de enriquecimiento de ITF-P2-C1 a partir de la fracción soluble de extractos de E. coli

Durante la expresión en E. coli puede enriquecerse en ITF-P2-C1 soluble acumulado, mediante cromatografía de afinidad con níquel-NTA-sefarosa. Para ello se preparó un extracto de la proteína soluble de E. coli (ver ejemplo 12.a). 40 ml de esta solución de proteína se incubaron con adición de 1 ml de material de columna (Ni-NTA-sefarosa, Qiagen) durante 30 minutos a 4ºC, con agitación. A continuación se lavó la matriz de la columna dos veces con 5 ml de tampón de lavado (600 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 10% (v/v) de glicerina, 50 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 8,0). La proteína reunida se eluyó a continuación con tampón de elución (600 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, 10% (v/v) de glicerina, 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 6,5). Las fracciones del eluato se analizaron a continuación mediante un Western-Blot (figura 25) para determinar su contenido en ITF, se reunieron las fracciones seleccionadas, se concentraron hasta un volumen de 2 ml y se dializó frente al tampón de conservación (500 mM de NaCl, 10% (v/v) de glicerina, 0,1 g/litro de PVP, 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,6). El contenido en ITF de la solución así obtenida se determinó mediante análisis Western-Blot a base de una muestra de referencia nML1 de una concentración conocida.

(12.c) Funcionalidad del módulo de afinidad en condiciones de desnaturalización en el ejemplo del enriquecimiento de ITF-P2-C1 a partir de la fracción insoluble de extractos de E. coli

Los cuerpos de inclusión contenidos en el sedimento de un disgregado celular total de E. coli, conteniendo ITF (ver ejemplo 12.a) se disolvieron mediante 12 horas de incubación con 1 ml/tampón de desnaturalización (7 M de GuHCl, 50 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 8,0) con simultánea desnaturalización. Mediante centrifugación (1 hora, 20000 rpm, 4ºC, rotor JA20) se sedimentaron los componentes insolubles de la célula. Para el enriquecimiento del ITF-P2-C1, se incubó con agitación el sobrenadante soluble durante 2 horas con 1 ml de matriz de afinidad (Ni-NTA-sefarosa, Qiagen), el material de la columna se lavó con 2 \times 5 ml de tampón de lavado (7 M de GuHCl, 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 6,3) y la proteína reunida se eluyó con 4 ml de tampón de elución 1 (7 M de GuHCl, 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 4,5) y 4 ml de tampón de elución 2 (7 M de GuHCl, 250 mM de imidazol, 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 4,5). El contenido en ITF de la solución de cloruro de guanidinio así obtenida se determinó a continuación mediante análisis Western-Blot con utilización del anticuerpo monoclonar TB33 a base de una muestra de nML1 de concentración conocida (figura 24).

(12.d) Procedimiento para la expresión de toxinas ITF mediante el plegado in vitro

La expresión del ITF plegado en solución se efectúa mediante la adición lentamente, gota a gota, de una solución de GuHCl conteniendo ITF en 90 veces su volumen de tampón de plegado (50 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 100 mM de glucosa, 10 mM de lactosa, 10% (v/v) de glicerina, 5 mM de glutatión reducido, 1 mM de glutatión oxidado, 50 mM de Tris/HCl, pH 8,5), agitando durante 12 horas a 4ºC. A continuación, se sedimentan los componentes no solubles mediante centrífugación (45 minutos, 20000 rpm, 4ºC, rotor JA20), y el sobrenadante se concentra alrededor del factor 100. Después de la diálisis frente a 1000 veces el volumen de tampón de almacenamiento (500 mM de NaCl, 10% (v/v) de glicerina, 0,1 g/litro de PVP, 20 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7,6), se obtiene el ITF soluble, activo (figura 27). La concentración obtenida en ITF soluble puede determinarse mediante análisis Western-Blot con anticuerpos monoclonales contra nMLB (TB33) tomando como base una muestra de referencia con un contenido de nIML conocido.

Ejemplo 13 Determinación de la citotoxicidad de la ITF-P2-C1 contra células T específicas del P2

La línea celular G7TC neuritógena específica del P2 (Weishaupt y col., 1997) de la rata Lewis hembra se cultivó en el medio RPMI 1640 con 1% de suero de rata. Después de descongelarse las células se efectuó el contaje de las células vivientes, la obtención de la suspensión de células con una densidad de 500 000 células/ml y a continuación la siembra en placas con 6 pocillos en un volumen de 2,5 ml por pocillo. El tratamiento con la construcción P2-C1 del ITF (los terminales C en el pro-ML con sitios de unión al hidrato de carbono inactivados se fusionan al péptido P2 y al módulo de afinidad fusionados). El tratamiento se efectuó durante 2 horas ó respectivamente 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} en vapor de agua saturado con un volumen máximo de 1/25 la dilución de la substancia ensayo o respectivamente el mismo volumen de tampón. A una concentración del ITF-P2-C1 de 50 ng/ml se obtienen en los volúmenes escogidos de 50, 75 y 100 \mul en 2,5 ml de volumen de cultivo las concentraciones finales de 1, 1,5 y 2 ng/ml. Para la comprobación de la citotoxicidad (apoptosis y necrosis), se efectúa una tinción fluorescente y la correspondiente comprobación por citometría de flujo. El principio se basa en la unión de la anexina V marcada con FITC, a la fosfatidilserina, la cual se transloca sobre la cara externa de las membranas de las células apoptósicas. Adicionalmente, se tiñen mediante yoduro de propidio, el cual se une al ADN, aquellas células que en base a un efecto tóxico (necrosis directa, necrosis secundaria después de la apoptosis) presentan una permeabilidad elevada de la membrana, es decir, las células apoptósicas se marcan con FITC (fluorescencia de color verde) mientras que las células necróticas se tiñen el doble ó solamente presentan tinción del PI (fluorescencia de color rojo). La ejecución de la tinción tiene lugar después de la comprobación con el kit comercialmente adquirible con 100 \mul de suspensión de células cada vez. La incubación de las células T específicas de P2, con el ITF da como resultado después de 2 horas una elevación de las células apoptósicas de 1 ng/ml a tres veces el control de tampón (figura 28.a LR versus 28.b LR), mientras que a 2 ng/ml aparece un desplazamiento a las células necróticas (figura 28.a UL versus 28.c UL). Después de 24 horas tuvo lugar un drástico efecto con respecto a la elevación de la parte de células necróticas del 4% en el control hasta el 16,6% (figura 29.a UL versus 29.d. UL). Con 1 ng/ml se mide por el contrario una ligera elevación del número de células apoptósicas (2,7 hasta 3,8%) (figura 29.a. LR versus 29.b. LR). Se comprueba también que el ITF a base de la lectina de muérdago, como se esperaba según la invención, ejerce los dos efectos descritos para esta toxina vegetal sobre las células inmunológicas.

Indice de abreviaciones

A	módulo de afinidad
bFGF	factor de crecimiento de los fibroblastos básicos
DTT	ditiotreitol
E	módulo efector
EDTA	etilendiaminotetraacetato
GPF	"proteína con fluorescencia verde"
IgE	inmunoglobulina E
IgG	inmunoglobulina G
IL-2	interleucina 2
IPTG	isopropiltiogalactosido
ITF	proteína de fusión inmunológica diana
M	módulo modulador
MHC	complejo principal de histocompatibilidad
P	módulo de procesado
PAGE	electroforesis sobre gel de poliacrilamida
ProML	lectina de muérdago
RIP	proteína inactivadora de ribosomas
(r)ML	lectina de muérdago recombinante
(r)MLA	cadena A de la lectina de muérdago recombinante
(r)MLB	cadena B de la lectina de muérdago recombinante
nMLA	cadena A de la lectina de muérdago natural
nMLB	cadena B de la lectina de muérdago natural
SPDP	N-succinimidil-3-(2-piridiltio-)propionato
T	módulo detector

Además se emplean para los aminoácidos las abreviaciones habituales.

Lista de literatura

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Claims

1. Molécula de ácido nucleico, la cual codifica una proteína de fusión, que presenta los siguientes componentes:

(a) un módulo efector, que ejerce su acción citotóxica intracelularmente; (b) un módulo de procesado, el cual está unido covalentemente al módulo efector, y que presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa, en donde el módulo de procesado comprende el propéptido de lectina de muérdago o un fragmento o derivado del mismo, en donde el fragmento o derivado presenta una secuencia de reconocimiento para una proteasa y la liberación intracelular del módulo efector en las células diana mediante las propias proteasas de las células en el curso de la endocitosis inducida por el receptor puede tener lugar en los endosomas y prelisosomas, y en donde el propéptido de la lectina de muérdago es codificado por una molécula de ácido nucleico, seleccionada del grupo compuesto por:

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el módulo efector es un módulo efector que actúa citotóxicamente en el interior de la célula, en donde dicho módulo efector comprende la cadena A de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado del mismo que actúa citotóxicamente en el interior de la célula, en donde la cadena A de la lectina del muérdago codifica a partir de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por;

(i): moléculas de ácido nucleico, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.a ó un fragmento de la misma;

(ii): moléculas de ácido nucleico, que comprenden la secuencia de nucleótidos indicada en la figura 11.a ó un fragmento de la misma;

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el módulo efector comprende la cadena A de la lectina del muérdago o un fragmento con actividad citotóxica intracelular o un derivado del mismo.

4. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión presenta además, los siguientes componentes:

(d) un módulo modulador el cual está unido covalentemente con el módulo de procesado, el módulo efector y/o con el módulo detector, y el cual modula el efecto tóxico intracelular del módulo efector.

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en donde el módulo modulador es codificado a partir de una molécula de ácido nucleico, seleccionada del grupo formado por:

(i): moléculas de ácido nucleico, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.b ó un fragmento de la misma, en donde el fragmento posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina del muérdago;

(ii): moléculas de ácido nucleico, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada en la figura 11.b ó un fragmento de la misma, en donde el fragmento codifica la secuencia de aminoácidos que posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina del muérdago;

(iv): moléculas de ácido nucleico que degeneran en las moléculas de ácido nucleico citadas en (iii), correspondientemente al código genético.

6. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión presenta además, los siguientes componentes:

(e) Un módulo de afinidad para la purificación, el cual está unido covalentemente con el módulo efector, el módulo de procesado, el módulo detector y/o el módulo modulador.

7. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el módulo detector reconoce específicamente una célula del sistema inmunológico, una célula tumoral o una célula del sistema nervioso.

8. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en donde la célula del sistema inmunológico es una célula del sistema inmunológico específico.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8, en donde la célula del sistema inmunológico es una célula T ó una célula del sistema inmunológico no específico y en donde la célula tumoral es una célula degenerada del sistema inmunológico.

10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en donde la célula T es una célula T_{H}2.

11. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 6 a 10, en donde el módulo de afinidad comprende una secuencia de histidina, tiorredoxina, Strep-Tag, T7-Tag, Flag-Tag, proteína de unión con maltosa ó GFP.

12. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 11, en donde el módulo modulador comprende la cadena B de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado de la misma, el cual posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina del muérdago, o los péptidos KDEL ó HDEL.

13. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 12, en donde la cadena B de la lectina del muérdago presenta un cambio en la reposición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 ó una combinación de dichos cambios.

14. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en donde el cambio está situado en la posición D23 a A, W38 a A, D235 a A, Y249 a A, Y68 a S, Y70 a S, Y75 a S y F79 a S.

15. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 14, la cual es ADN.

16. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 14, la cual es ARN.

17. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Anfitrión no humano, el cual es transformado mediante un vector según la reivindicación 17, ó contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 16.

19. Anfitrión según la reivindicación 18, el cual es un anfitrión procariótico o un anfitrión eucariótico.

20. Anfitrión según la reivindicación 19, en donde el anfitrión procariótico es el E. coli, Bacillus subtilis o el Streptomyces coelicolor ó en donde el anfitrión eucariótico es un Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Spodoptera sp. ó Pichia pastoris.

21. Proteína de fusión la cual codifica a partir de una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 16, ó es producida por un anfitrión según una de las reivindicaciones 18, 19 ó 20.

22. Procedimiento para la obtención de una proteína de fusión según la reivindicación 21, en donde se cultiva un anfitrión según una de las reivindicaciones 18, 19 ó 20 en condiciones apropiadas, y se separa la proteína de fusión.

23. Medicamento que contiene una proteína de fusión según la reivindicación 21, y un soporte farmacéuticamente compatible.

24. Medicamento que contiene una proteína de fusión que es codificada a partir de una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 11, 15 ó 16, ó a partir de un vector el cual contiene la molécula de ácido nucleico.

25. Medicamento que contiene una proteína de fusión que es codificada a partir de una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 11, 15 ó 16, ó un vector el cual contiene la molécula de ácido nucleico, en donde el modulador comprende la cadena B de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado de la misma, el cual posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina del muérdago.

26. Medicamento según la reivindicación 25, en donde la cadena B de la lectina del muérdago presenta un cambio en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 ó una combinación de dichos cambios.

27. Medicamento según la reivindicación 26, en donde el cambio en la posición 23 es un cambio D23 a A, en la posición 38 un cambio W38 a A, en la posición 235 un cambio D235 a A, en la posición 249 un cambio Y249 a A, en la posición 68 un cambio Y68 a S, en la posición 70 un cambio Y70 a S, en la posición 75 un cambio Y75 a S y en la posición 79 un cambio F79 a S.

28. Kit que contiene un vector, el cual contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 16.

29. Kit que contiene un vector, el cual es codificado por una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 11, 15 ó 16, o un vector el cual contiene la molécula de ácido nucleico, en donde el modulador comprende la cadena B de la lectina del muérdago o un fragmento o derivado de la misma, que posee la actividad biológica de la cadena B de la lectina del muérdago.

30. Kit según la reivindicación 29, en donde la cadena B de la lectina del muérdago presenta un cambio en la posición de los aminoácidos 23, 38, 68, 70, 75, 79, 235 ó 249 ó una combinación de dichos cambios.

31. Kit según la reivindicación 30, en donde el cambio en la posición 23 es un cambio D23 a A, en la posición 38 un cambio W38 a A, en la posición 235 un cambio D235 a A, en la posición 249 un cambio Y249 a A, en la posición 68 un cambio Y68 a S, en la posición 70 un cambio Y70 a S, en la posición 75 un cambio Y75 a S y en la posición 79 un cambio F79 a S.

32. Procedimiento para el ensayo in vitro de un modulador prospectivo, en el cual se efectúan los siguientes pasos:

(a) Transfección de una célula diana con un vector el cual contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 11, 15 ó 16;

(c) Expresión de los ácidos nucleicos en la célula diana; y

33. Procedimiento para el ensayo in vitro de un modulador prospectivo, en el cual se efectúan los siguientes pasos:

(a) Transfección de una célula diana la cual contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 11, 15 ó 16, con un vector el cual contiene un ácido nucleico que codifica un modulador prospectivo;

(b) Expresión del ácido nucleico en la célula diana; y

34. Procedimiento para la obtención de un modulador prospectivo, en el cual se ejecutan los siguientes pasos:

(b) transfección de una célula diana con un vector el cual contiene un ácido nucleico que codifica un modulador prospectivo;

(c) Expresión de los ácidos nucleicos en la célula diana;

(d) Medición de la actividad moduladora del modulador prospectivo sobre la toxicidad de la toxina; y

(e) separación del modulador.

35. Procedimiento para la obtención de un modulador prospectivo, en el cual se ejecutan los siguientes pasos:

(a) Transfección de una célula diana que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 11, 15 ó 16, con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica un modulador prospectivo;

(b) Expresión de los ácidos nucleicos en la célula diana;

(c) Medición de la actividad moduladora del modulador prospectivo sobre la toxicidad de la toxina; y

(d) Separación del modulador.