KR102488961B1 - 그랜자임 b를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

세포 독성 물질, 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide), 절단 부위 (cleavage site), 및 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 세포막 투과용 조성물, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 항암 조성물이 제공된다.

Description

그랜자임 B를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도{Fusion protein comprising Granzyme B and use thereof}
세포 독성 물질, 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide), 절단 부위 (cleavage site), 및 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 세포막 투과용 조성물, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 항암 조성물이 제공된다.
암세포를 선택적으로 파괴시키는 것이 다양한 임상학적 환경에서 흔히 요구될 수 있다. 세포 내 다수의 시그널 전달(signal transduction) 경로는 세포의 사멸 및 생존과 연계되어 있고, 당해 경로를 제한하거나 차단하는 성분의 전달은 경로의 파괴를 유발할 수 있다. 이러한 시그널 전달 경로의 전형적인 예는 아폽토시스이고, 아폽토시스 경로 중의 다양한 요소들이 세포를 특이적으로 사멸시키기 위한 표적으로 유용하다.
　　세린 프로테아제 그랜자임 B(GrB)는 세포독성 T-림프구(CTL) 및 천연 킬러(NK) 세포에서 발견되며, 리소좀형 세포질 과립(또는 세포용해 과립) 내용물에 노출시 표적 세포에서 유도된 아폽토시스에 복합적으로 관여한다. 세포독성 림프구 과립은 퍼포린(perforin), 공극 형성 단백질, 및 그랜자임으로 명명되는 일군의 세린 프로테아제를 포함한다.
림프구 매개 세포용해에서, 퍼포린은 표적 세포 막에 삽입되어 중합화하고 공극을 형성시킴으로써 그랜자임 B의 표적 세포 세포질로의 접근을 매개하는 하는 것으로 알려져 있다. 일단 세포 내부에 도입되면, 그랜자임 B는 직접 카스파제를 활성화시키고 신속한 DNA 파괴를 유도하여 아폽토시스를 유도한다.
　　　그랜자임은 구조적으로 관련되어 있지만 다양한 기질에 대한 선호도를 나타낸다. 이 중에서, 그랜자임 B는 아스파르테이트 잔기 다음을 절단하는 특이적 활성을 통해 프로카스파제를 절단하고 카스파제-3의 성숙 과정에 관여하여 표적 세포에 대해 고도의 독성을 나타낸다. 그랜자임 B는 특정 환경하에서 직접 카스파제를 활성화시키고 보충시켜 다운스트림 카스파제 기질을 직접 손상시킴으로써 세포를 사멸시키는 것으로 추측되고 있다.
한편, 최근 들어 단백질과 같은 거대분자도 세포내 도입이 가능하도록 하는 다양한 기술이 개발되어 새로운 치료 방법으로 각광 받고 있으나, 표적 세포 또는 표적 기관으로의 정확한 표적화가 쉽지 않다는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 단백질의 세포막 투과에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
HIV-1의 TAT 단백질을 세포배양 배지에 첨가하면 이 단백질이 세포내로 들어가는 것을 발견하면서 단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD)이 처음 알려졌다. PTD가 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결되어 융합단백질을 이루어 세포내로 수송이 가능함에 따라 PTD를 이용하여 치료 목적의 약물, 펩타이드, 단백질 등을 세포내로 수송하려는 다양한 시도가 이루어지고 있다.
단백질 전달 도메인을 이용하여 그랜자임 B와 같은 세포 독성 물질을 암세포 내로 특이적으로 수송하는 기술의 개발이 요구된다.
일 예는 세포 독성 물질, 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), 절단 부위 (cleavage site), 및 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 세포 투과 펩타이드는 소수성 펩타이드 및 염기성 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 세포 독성 물질은 그랜자임 B (granzyme B)일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 포함하는 세포 독성 물질의 세포막 투과용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 이용하는 세포 독성 물질의 세포 내 전달 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 융합 단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
세포내 전달 역할을 하는 퍼포린과 아폽토시스를 유도하는 그랜자임 B를 모방한 새로운 종류의 항암제를 제안한다. 구체적으로, 퍼포린 대신 세포 투과 펩타이드 (CPP)를 이용하여 그랜자임 B(granzyme B)를 세포내로 전달함으로써 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있는 기술을 제안한다.
　　암의 치료를 위해, 그랜자임 B를 암세포에 전달할 수 있도록 세포내 전달 펩타이드인 CPP와 항암 효능을 나타내는 그랜자임 B를 융합하여 그랜자임 B의 세포내 전달이 가능한 융합 단백질을 디자인하고,　디자인된 융합 단백질의 세포내 전달을 통해 항암 기능을 확보하기 위한 기술이 제공된다.
이를 위하여, (1) 세포 독성 물질, (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), (3) 절단 부위 (cleavage site), 및 (4) 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
상기 세포 독성 물질은 세포, 특히 암세포에 독성을 나타낼 수 있는 모든 물질, 예컨대 그랜자임 B일 수 있다.
일 예에서, 상기 세포 독성 물질은 그랜자임 B (granzyme B)일 수 있다. 그랜자임 B는 세린 프로테아제 중 하나로, 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes: CTL) 및 천연 킬러 세포 (natural killer (NK) cell)에서 발현되며, 세포-매개 면역 반응에서 표적 세포의 아폽토시스를 유도하는데 중요한 역할을 한다. 그랜자임 B는 강력한 세포 독성을 가지고 있으나, 정상 세포에서는 비활성 상태로 존재하다가 암세포나 바이러스에 감염된 세포내에 특이적으로 활성화되어 많이 존재하는 카텝신(cathepsin)에 의하여 특정 부위가 절단되면서 활성화되어 세포 독성을 나타내는 특성을 갖는다. 따라서, 그랜자임 B는 정상 세포에는 무해하고 암세포에서만 특이적으로 강력한 세포 독성을 나타낼 수 있어서, 정상 세포에 보다 안전하고 암세포에는 보다 효과적인 항암 치료가 가능하다는 이점이 있다.
그랜자임 B (EC number: 3.4.21.79) 는 포유류, 예컨대, 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 또는 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등으로부터 유래되는 것일 수 있다. 예컨대, 그랜자임 B는 Accession number NP_004122의 아미노산 서열을 갖거나 Accession number NM_004131의 염기서열(mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 인간 그랜자임 B, Accession number NP_038570의 아미노산 서열을 갖거나 Accession number NM_013542의 염기서열(mRNA)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 그랜자임 B 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 그랜자임 B는 전장 (full-length) 그랜자임 B 또는 그랜자임 B의 단편일 수 있다. 상기 그랜자임 B의 단편은 그랜자임 B의 활성부위 (예컨대, iiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh; 서열번호 11) 및 절단 서열 (또는 절단 유도 서열; 예컨대, 카텝신 절단 서열 또는 그랜자임 B에 의한 자가 절단 서열)를 포함하는 것일 수 있다.
그랜자임 B는 리소좀에 있는 시스테인계 단백질 분해효소 중 대표적인 디펩티딜 펩타이드 분해효소 I(Dipeptidyl peptidase I; DPPI)에 의하여 활성화 된다. 디펩티딜 펩타이드 분해효소의 대표적인 예는 카텝신 C, 카텝신 H 등이 있다. 카뎁신 C의 경우, 다음의 경우를 제외하면 활성을 나타낼 수 있다: (i) N-말단의 아미노기가 차단되어 있는 경우, (ii) 절단 부위의 어느 한쪽이 프롤린 잔기가 있는 경우, (iii) N-말단 잔기가 리신 또는 아르기닌인 경우, 및/또는 (iv) 펩타이드 또는 단백질의 구조가 절단을 방해할 경우 (예컨대, 단백질 또는 펩타이드 접힘 등으로 인하여 절단 서열이 외부에 노출되지 못하고 내부에 묻히는 경우 등). 다른 예에서, 그랜자임 B는 자가 활성화 (self-activation or auto-activation)를 유도하는 특정 서열(예컨대, IEPD (서열번호 36) 등); 야생형에 존재 또는 인위적으로 삽입됨)에 의하여 자가활성화될 수 있다. 예컨대, 상기 절단 서열은 카텝신 절단 서열(예컨대, Dipeptidyl peptidase I의 절단 부위; 예컨대, GE)이거나, 상기 그랜자임 B의 활성 부위에 인위적으로 연결되어 그랜자임 B의 자가활성화를 유도하는 자가 절단 서열(예컨대, IEPD 등; "IEPD"의 경우, 그랜자임 B의 자가활성화에 의하여 IEPD 서열이 제거됨)을 포함하는 펩타이드 등일 수 있다.
상기 절단 서열(펩타이드)은 N 말단에 노출되어야 카텝신 등의 효소에 의한 절단 또는 자가 절단이 가능하다. 따라서, 상기 그랜자임 B의 단편에서, 상기 절단 부위는 상기 활성 부위의 N 말단에 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 그랜자임 B의 단편은
1) 그랜자임 B의 활성 부위, 및
2) 상기 활성 부위의 N 말단에 연결된 하나 이상의 디펩티딜 펩타이드 분해효소 I의 절단 서열 또는 하나 이상의 그랜자임 B의 자가 절단 서열 (예컨대, 'GE', 'IEPD' 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 2 내지 20개, 2 내지 15개, 또는 2 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 절단 서열 하나 이상)
을 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포 독성 물질, 예컨대 그랜자임 B는 그 N 말단 부위가 노출되어 있어야 카텝신 등의 효소에 의하여 인지되고 활성화될 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질에서, 세포 독성 물질, 예컨대 그랜자임 B는 융합 단백질의 N 말단에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "절단 서열" (그랜자임 B 단편에 포함)은 융합단백질 내에서 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP)와 표적화 부위 (targeting moiety) 사이에 위치하는 "절단 부위 (cleavage site)"와 구별하기 위하여 사용된다.
상기 세포 투과 펩타이드는 세포막을 투과할 수 있는 모든 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 막전달 서열(membrane-translocation sequence; MTS) 또는 이의 단편 (상기 막전달 서열 중 연속하는 5개 이상의 아미노산 포함), 거대분자 세포내 전달 도메인 (Macromolecule Intracellular Transduction Domain; MTD), TAT 펩타이드 (예컨대, YGRKKRRQRRR (서열번호 24), RKKRRQRRR(서열번호 25)), MTD103 (LALPVLLLA; 서열번호 26), TP10 (AGYLLGKINLKALAALAKKIL; 서열번호 27), Penetratin (RQIKIWFQNRRMKWKK; 서열번호 28), MAP (model amphipathic peptide; 예컨대, KLALKLALKALKAALKLA(서열번호 29)), 및 소수성 펩타이드 및 염기성 펩타이드를 포함하는 세포 투과성 융합 펩타이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 막전달 서열은, 예컨대, AAVALLPAVLLALLAP (서열번호 12)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 이의 단편은 상기 아미노산 서열 중 연속하는 7 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편, 예컨대, AAVALLP (서열번호 13) 또는 AVLLALLAP(서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소수성 펩타이드와 염기성 펩타이드의 융합 펩타이드는,
소수성 아미노산을 전체 아미노산 개수 기준으로 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 예컨대, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%의 비율로 포함하는 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 또는 6 내지 30개의 아미노산을 포함하는 소수성 펩타이드; 및
1 내지 6개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 단위체, 또는 상기 펩타이드 단위체가 2 내지 6개 반복된 반복체를 포함하고, 염기성 아미노산으로 이루어진, 염기성 펩타이드
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포 투과성 융합 펩타이드에 있어서, 상기 소수성 펩타이드는 5 내지 100개, 5 내지 50개, 5 내지 40개, 또는 6 내지 30개의 아미노산을 포함하는 펩타이드로서, 소수성 아미노산을 전체 아미노산 개수 기준으로 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상, 예컨대, 60 내지 100%, 70 내지 100%, 80 내지 100% 또는 90 내지 100%의 비율로 포함하는 것일 수 있다. 상기 소수성 아미노산은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 소수성 펩타이드는 상기 소수성 아미노산 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며, 동일한 종류의 아미노산을 하나 또는 다수 개 포함할 수 있다. 또한 상기 소수성 펩타이드는 염기성 아미노산을 포함하지 않는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 소수성 펩타이드는 막전달 서열(membrane-translocation sequence; MTS, 예컨대 AAVALLPAVLLALLAP(서열번호 12)), 상기 막전달 서열의 단편 (예컨대, 상기 아미노산 서열 중 연속하는 7 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 단편; 예컨대, AAVALLP(서열번호 13) 또는 AVLLALLAP(서열번호 14)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 염기성 펩타이드는 1 내지 6개의 염기성 아미노산을 포함하는 염기성 펩타이드 단위체 또는 상기 단위체가 2 내지 6개 반복된 반복체를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 염기성 아미노산이 2개 이상 포함되는 경우, 서로 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 염기성 펩타이드가 7개 이상의 아미노산을 포함하는 경우 그 자체가 CPP (Cell penetrating Peptide) 역할을 하여 엔도좀으로 단백질을 전달하여 단백질 분해를 유도하므로, 염기성 펩타이드에 포함된 아미노산 개수는 6개 이하인 것이 좋다. 상기 염기성 펩타이드는 핵 내로의 이동을 유도하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 염기성 아미노산이 2개 이상 포함되는 경우, 각각 독립적으로 라이신, 아르기닌, 히스티딘 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 염기성 펩타이드는 상기 염기성 아미노산 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며, 동일한 종류의 아미노산을 하나 또는 다수 개 포함할 수 있다. 상기 염기성 펩타이드가 반복체를 포함하는 경우, 이를 구성하는 각각의 염기성 펩타이드 단위체는 서로 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 염기성 펩타이드 단위체는 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 이의 조합으로 이루어진 1 내지 6개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 염기성 펩타이드 단위체는 염기성 아미노산으로 구성된 KKKRK (서열번호 15), KKKR(서열번호 16), RKRK(서열번호 17), RKRKRK(서열번호 18), KKKKK(서열번호 19), KKKKKR(서열번호 20), KKKRKR(서열번호 21), R5(RRRRR) (서열번호 22), R6(RRRRRR) (서열번호 23) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염기성 펩타이드는 상기 소수성 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나, 두 개 이상의 염기성 펩타이드가 N 말단, C 말단, 또는 양 말단에 연결될 수 있다. 세포막 투과성을 보다 증진시키기 위하여, 상기 염기성 펩타이드는 소수성 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단, 보다 바람직하게는 C 말단에 연결될 수 있다. 염기성 펩타이드가 소수성 펩타이드의 양 말단에 연결된 경우 양 말단에 연결된 각 염기성 펩타이드는 서로 같거나 상이한 것일 수 있다.
구체예에서, 상기 세포 투과성 융합 펩타이드는,
소수성 펩타이드 및 상기 소수성 펩타이드의 C 말단에 연결된 염기성 펩타이드를 포함(즉 융합 펩타이드의 N 말단 쪽에 소수성 펩타이드가 위치하고, C 말단 쪽에 염기성 펩타이드가 위치)하거나,
소수성 펩타이드 및 상기 소수성 펩타이드의 N 말단에 연결된 염기성 펩타이드를 포함(즉 융합 펩타이드의 C 말단 쪽에 소수성 펩타이드가 위치하고, N 말단 쪽에 염기성 펩타이드가 위치)하는 것일 수 있으며,
융합 펩타이드의 세포 투과성을 보다 증진시키기 위하여, 상기 융합 펩타이드는 소수성 펩타이드 및 상기 소수성 펩타이드의 C 말단에 연결된 염기성 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 융합 펩타이드는 기존에 알려진 세포 투과 펩타이드보다 우수한 세포 투과성을 나타낼 수 있어서, 그랜자임 B의 세포내 전달에 보다 유리하게 사용될 수 있다.
상기 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위는 상기 융합 단백질의 세포 투과 펩타이드와 표적화 부위 사이에 위치하고 소정이 조건 하에서 절단되어 세포 투과 펩타이드를 비교적 분자량이 큰 표적화 부위로부터 유리시킴으로써, 세포 투과 펩타이드가 세포막 투과 활성을 나타낼 수 있도록 하여, 세포 투과 펩타이드에 연결된 세포 독성 물질의 세포막 투과 및 세포 내 수송이 가능하도록 하는 역할을 한다.
세포 독성 물질의 암세포 특이적 활성을 담보하기 위하여, 상기 절단 부위는 암세포 특이적이로 존재하는 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소에 의하여 절단되는 부위일 수 있다. 상기 암세포에 특이적으로 존재하는 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소는 암세포에서 특이적으로 분비되거나 암세포 세포막에 특이적으로 존재하는 (세포막 외부로 노출된) 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소, 예컨대 엔도펩티다아제일 수 있다. 상기 암세포 특이적 절단 효소는, 기질단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP; 예컨대, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP18, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A, MMP23B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27, MMP28 등), 카텝신 C 또는 카텝신 H (cathepsin C, or H), 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자 (urokinase-type plasminogen activator; uPA) 등으로 이루어진 군에서 선택된 효소의 절단 부위일 수 있다. 일 예에서, 상기 절단 부위로서 MMP9의 인식 부위(예컨대, SGKIPRTLTA; 서열번호 35) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적화 부위는 표적 세포 또는 조직을 특이적으로 표적할 수 있는 도메인으로서, 예컨대 암세포와 같은 특정 세포 또는 특정 조직을 표적화하는 물질일 수 있다. 상기 표적화 부위는 1종 이상이 하나씩 포함되거나 1종 이상이 2개 이상 포함될 수 있다. 예컨대, 상기 표적화 부위는 C 말단 및 N 말단에 동일 또는 상이한 종류가 하나씩 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표적화 부위는 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, DARPin 등의 단백질 스캐폴드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 표적화 부위는 표적 세포 (예컨대, 암세포)에 특이적으로 존재하거나 과발현되어 있는 각종 신호 전달 물질 (e.g., 각종 성장 인자), 각종 수용체 (e.g., 수용체 티로신 키나아제 단백질 등) 등을 특이적으로 인식하거나 여기에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, DARPin 등의 단백질 스캐폴드 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 단백질 스캐폴드는 단백질과 유사한 구조를 갖거나 특정 단백질 또는 특정 세포에 특이적으로 결합(및/또는 인식)하는 특성을 갖는 단백질 구조체로서, 예컨대, DARPin, 에피바디(Affibody), 라소(Lasso), 사이클로타이드(Cyclotide), 노틴(Knottin), Avimer, 쿠니츠 도메인(Kunitz Domain), 안티칼린(Anticalin), 아드넥틴(Adnectin), 프로넥틴(Pronectin), 피노머(Fynomer), 나노피틴(Nanofitin), 에필린(Affilin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
상기 성장 인자는, 예컨대, EGF(Epidermal growth factor), PDGF(Platelet-derived growth factor), FGF(fibroblast growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor) 등을 포함할 수 있다. 상기 수용체 티로신 키나아제 단백질은 각종 성장 인자의 수용체 등을 포함하며, 구체적으로 EGFR(Epidermal growth factor receptor), HER2, HER3 등을 포함하는 ErbB 패밀리, 인슐린 수용체, PDGF 수용체(Platelet-derived growth factor receptor; PDGFR), FGF 수용체(fibroblast growth factor receptor; FGFR), VEGF 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), c-Met 등을 포함하는 HGF 수용체(hepatocyte growth factor receptor; HGFR), Trk 수용체(tropomyosin-receptor-kinase receptor), Eph 수용체(Ephrin receptor), AXL 수용체, LTK 수용체 (Leukocyte receptor tyrosine kinase), TIE 수용체, ROR 수용체(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor), DDR 수용체 (Discoidin domain receptor), RET 수용체, KLG 수용체, RYK 수용체 (related to receptor tyrosine kinase receptor), MuSK 수용체 (Muscle-Specific Kinase receptor) 등을 포함할 수 있다.
상기 항체는 앞서 설명한 표적 세포에 특이적으로 존재하거나 과발현되어 있는 각종 신호 전달 분자, 각종 수용체 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 항원으로 인식하는 모든 서브타입 (IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,), 또는 IgM)의 항체일 수 있으며, 상기 항원 결합 단편은 상기 항원과 특이적으로 결합하는 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로, 상기 항체의 중쇄 CDR (complementarity determining region), 경쇄 CDR, 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위 또는 이들의 조합 (예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2)을 의미하는 것이다. 일 예에서, 표적화 부위로서 항체의 항원 결합 단편, 예컨대 scFv 또는 scFv-Fc를 사용할 수 있다.
상기 DARPin (designed ankyrin repeat protein)은 표적 단백질에 대하여 높은 특이성과 높은 결합 친화도를 보이는 유전공학적으로 제작된 항체 모사 단백질 (antibody mimetic protein)이다. DARPin은 천연 안키린 (ankyrin) 단백질로부터 유래된 것으로 반복 단위체(ankyrin repeat motif)가 2개 이상 또는 3개 이상, 예컨대 4 또는 5개 반복된 구조를 갖는다. 상기 반복 단위체가 3개, 4개, 또는 5개 반복된 DARPin의 경우 분자량이 각각 약 10 kDa, 14 kDa 또는 약 18 kDa 정도이다. DARPin은 주로 구조적 기능을 하는 코어 부분과 표적과 결합하는 표적 결합 부분을 포함하며, 상기 코어 부분은 보존된 아미노산 서열을 갖고, 상기 표적 결합 부분은 상기 코어 바깥쪽에 위치하는 부분으로 표적에 따라서 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
DARPin은 항원에 대하여 높은 친화도를 가지면서도 분자량이 작고 안정성이 우수하기 때문에 물성(예컨대, 체내 pharmacokinetic (PK) properties) 및 체내 안정성 측면에서 유리하고, 다른 단백질과의 융합이 용이하여, 안정성 및 물성이 우수한 융합 단백질 제작에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 DARPin은 동일한 아미노산 서열을 갖는 DARPin이 하나 또는 2 내지 10개, 2 내지 5개, 또는 2 내지 3개가 반복되어 포함되거나, 동일하거나 서로 다른 단백질을 표적으로 하고 서로 다른 아미노산 서열을 갖는 2종 이상, 예컨대 2 내지 10종, 2 내지 5종, 또는 2 내지 3종이 포함될 수 있다.
사용 가능한 DARPin의 예를 아래의 표 1에 기재하였으며, 그 아미노산 서열을 도 4a-4g 및 서열번호 37-68에 기재하였다:
Target protein DARPins
Human IgG1-Fc I_01/02/07/11/13/19
TNF-alpha T_01/02/07/08/09/16/25/27/37/40
ErbB1 (EGFR) E_01/67/68/69
ErbB2 (1-509) 9_16/26/29
ErbB2 (1-631) H_14
ErbB4 B4_01/02/07/33/45/50/58
CitS cp34_15/16
일 예에서 표적화 부위로서의 DARPin으로 EGFR을 표적으로 하는 항 EGFR DARPin을 사용할 수 있다. 상기 항 EGFR DARPin은 DARPin 고유의 구조를 가지면서 EGFR에 특이적으로 결합하는 모든 DARPin일 수 있으며, 예컨대, 다음에 기재된 4종의 항 EGFR DARPin 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다:
항 EGFR DARPin (서열번호 30):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddtwgwtplhlaayqghleivevllkngadvnaydyigwtplhlaadghleivevllkngadvnasdyigdtplhlaahnghleivevllkhgadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
항 EGFR DARPin (서열번호 31):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnatdndgntplhlsawighleivevllkhgadvnaddllgmtplhlaadtghleivevllkygadvnardtrgktplhlaardghleivevllkhdadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
항 EGFR DARPin (서열번호 32):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnafdywgmtplhlaadnghleivevllkhgadvnasdnfgftplhlaafyghleivevllkhgadvnafdmwgntplhlaaqnghleivevllkngadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
항 EGFR DARPin (서열번호 33):
dlgkklleaaragqddevrilmangadvnaddnagrtplhlaanfghleivevllkngadvnakghhcntplhlaawaghleivevllkygadvnadddegytplhlaadigdleivevllkygadvnawdmygrtplhlaasaghleivevllkygadvnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 세포 독성 물질은 암세포 특이적으로 존재하는 효소에 의하여 활성화되기 위하여 N 말단에 노출되도록 위치하고, 상기 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위는 세포 투과 펩타이드와 표적화 부위 사이에 위치하여, 표적화 부위에 의하여 암세포에 도달시 특이적으로 절단되어 세포 투과 펩타이드를 표적화 부위로부터 유리시켜 세포막 투과 기능을 활성화시키고, 상기 세포 독성 물질은 상기 세포막 투과 기능이 활성화된 세포막 투과 부위와 함께 세포막을 투과하여 세포 내부로 이동할 수 있도록 세포막 투과 부위에 연결된 것이 좋다. 따라서, 상기 융합 단백질은, N 말단에서 C 말단 방향으로, (1) 세포 독성 물질 (예컨대, 그랜자임 B), (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), (3) 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위 (cleavage site), 및 (4) 표적화 부위 (targeting moiety)를 순서대로 포함하는 것일 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 세포 독성 물질이 그랜자임 B의 활성 부위 및 절단 서열을 포함하는 그랜자임 B의 단편인 경우, 상기 융합 단백질은, N 말단에서 C 말단 방향으로, (1') 디펩티딜 펩타이드 분해효소 I의 절단 서열 또는 그랜자임 B의 자가 절단 서열 및 그랜자임 B의 활성 부위, (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), (3) 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위 (cleavage site), 및 (4) 표적화 부위 (targeting moiety)를 순서대로 포함하는 것일 수 있다.
상기 융합 단백질의 각 구성 성분, 즉, 세포 독성 물질, 세포 투과 펩타이드, 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위, 및 표적화 부위와, 상기 세포 투과성 융합 펩타이드의 소수성 펩타이드 및 염기성 펩타이드는, 각각 독립적으로 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 20개 또는 2 내지 10개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다.
상기 각 구성 성분은 단백질에 통상적으로 존재하는 펩타이드 결합과 같은 공유 결합에 의하여 연결된 것일 수 있다.
상기 융합 단백질에 포함된 세포 독성 물질, 특히 그랜자임 B은 세포 독성이 매우 강하기 때문에 매우 효과적인 암세포 사멸이 가능하지만, 정상 세포에도 치명적인 독성을 나타내므로, 상기 융합 단백질의 암세포로의 표적화와 세포 독성 물질의 표적 특이적 작용이 매우 중요하다. 이를 위하여, 본 발명에서 제안되는 융합 단백질은 (1) 표적화 물질에 의한 암세포로의 표적, (2) 절단 부위에 의한 암세포에서의 특이적 절단 및 이로 인한 세포내 투과 펩타이드의 활성화, 및 (3) 세포 독성 물질로서 암세포에 특이적으로 존재하는 카텝신에 의하여 활성화되는 그랜자임 B를 선택함으로써 세포 독성 물질의 암세포 특이적 활성화의 다중 안전 기작을 포함한다. 따라서, 상기 융합 단백질은 세포 독성 물질의 암세포로의 전달 효율 및 세포 독성 물질의 암세포 특이적 세포막 투과 및/또는 세포내 전달 효율을 증진시킬 수 있어서, 세포 독성 물질의 세포 내 전달 용도 또는 암세포 사멸 용도로 매우 유리하게 적용될 수 있다.
이에, 일 예에서, 상기 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
구체적으로, 일 예에서, 상기 융합 단백질을 포함하는 세포막 투과용 조성물을 제공한다. 다른 예에서, 상기 융합 단백질을 포함하는 세포내 전달용 조성물이 제공된다. 상기 세포막 투과가 적용 가능한 세포는 암세포 등과 같은 병변 부위의 세포일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 이용하는 세포 독성 물질 (예컨대, 그랜자임 B)의 세포 내 전달 방법(또는 세포막 투과 방법)을 제공한다. 구체적으로, 상기 세포막 투과 방법 또는 세포 내 전달 방법은 상기 융합 단백질을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 상기 융합 단백질의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포 독성 물질의 세포내 전달 또는 암의 예방 및/또는 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택되는 동물, 또는 상기 동물로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대 혈청), 또는 이의 배양물일 수 있으며, 상기 융합 단백질에 포함된 세포 독성 물질의 전달 (예컨대 세포내 전달) 또는 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물 또는 이로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직 또는 체액 등일 수 있다.
상기 융합 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 핵산을 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질의 투여는 경구 투여 또는 비경구적 투여에 의하여 수행되거나, 상기 세포, 조직, 또는 체액에 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.
또한 상기 융합 단백질은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 예는 (1) 세포 독성 물질, (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), (3) 절단 부위 (cleavage site), 및 (4) 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 세포 독성 물질의 세포막 투과성을 증진시키는 방법을 제공한다. 또 다른 예는 (1) 세포 독성 물질, (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP), (3) 절단 부위 (cleavage site), 및 (4) 표적화 부위 (targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, 세포막 투과성이 증진된 세포 독성 물질 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 융합 단백질을 제조하는 단계는 생체외에서 수행되는 단계일 수 있다. 상기 융합 단백질의 각 구성 요소는 설명한 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결된 것일 수 있다.
상기 융합 단백질의 제조는 화학적 단백질 합성 또는 각 구성 요소를 암호화하는 유전자 단편을 포함하는 발현 벡터에 의한 단백질 발현 등의 통상적인 단백질 제조 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 융합 단백질의 각 구성 요소인 세포 독성 물질, 세포 투과 펩타이드, 절단 부위, 및 표적화 부위에 대한 구체적 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 제공되는 그랜자임 B의 효과적인 암세포 특이적 세포내 전달이 가능한 융합 단백질과 이를 함유하는 항암 조성물은 기존 항암제와는 전혀 다른 기작의 "First-in class" 항암 활성을 발휘하여, 보다 강력한 항암제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 일 실시예에 따른 융합 단백질의 구성을 모식적으로 보여준다.
도 2는 일 실시예에 따른 융합 단백질의 발현을 확인한 면역블라팅 결과이다.
도 3은 그랜자임B 융합 단백질을 투여시 인간 대장암 세포주인 HCT116(ATCC) 및 RKO(ATCC) 세포주의 세포 생존률을 보여주는 그래프이다.
도 4a 내지 4g는 DARpin의 아미노산 서열을 예시적으로 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 융합 단백질의 제조
1.1. GZB - MTS - BAA - M9R -D(E)의 제조
N 말단에서 C 말단 방향으로, 그랜자임 B(GZB)-세포 투과성 융합펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]-절단부위(M9R)-표적화부위[EGFR DARPin (D(E))]을 포함하는 융합 단백질(아미노산 서열: 서열번호 1; 염기서열: 서열번호 2)을 제작하였다(도 1의 첫 번째). 이때 염기성 서열(BAA)는 대표적 핵전달신호인 KKRK로 구성된 서열을 사용하였다.
상기 실시예 1.1 에서 제조한 벡터를 이용하여 단백질 복합체를 과발현시키기 위해, 상기 벡터로 형질 전환된 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다. 이 때, 배양액으로 LB 배지를 사용하였으며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 1 mM의 IPTG를 넣고 18 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를, 10% 글리세롤, 0.25M NaCl을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(10,000 g)를 이용하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni2+-NTA superflow 칼럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10% 글리세롤 및 1 M NaCl로 세척한 다음, 용출 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10% 글리세롤, 0.25 M NaCl 및 0.2M 이미다졸)으로 상기 단백질 복합체를 용출하였다. 단백질 복합체가 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.
도 2는 실시예 1에서 제작한 벡터로부터 발현된 단백질 복합체들을 상기 방법에 의해 발현한 결과를 SDS-PAGE를 통해 나타낸 것이다.
제작된 융합 단백질(서열번호 1)의 각 구성 부분 및 이를 암호화하는 염기 서열을 아래의 표 2에 정리하였다:
N->C 아미노산 서열 코딩 염기 서열
His6 MRGSHHHHHHDYDIPTT Atgcgcggcagccatcaccatcaccatcacgattacgatatcccaacgacc
Dar(E) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
Linker GS Ggcagc
TEV ENLYFQGS gaaaacctgtattttcagggatcc
Linker GSGS ggcagcggcagc
GZB mqpillllaflllpradageiiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh ATGCAGCCGATCCTGCTCCTCCTGGCGTTCCTGCTGCTGCCACGTGCTGACGCTGGTGAAATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAACCGCACTCTCGTCCGTACATGGCTTACCTGATGATCTGGGACCAGAAATCTCTGAAACGTTGCGGTGGTTTCCTGATCCAGGACGACTTCGTTCTGACCGCTGCTCACTGCTGGGGTTCTTCTATCAACGTTACCCTGGGTGCTCACAACATCAAAGAACAGGAACCGACCCAGCAGTTCATCCCGGTTAAACGTCCGATCCCGCACCCGGCTTACAACCCGAAAAACTTCTCTAACGACATCATGCTGCTGCAGCTGGAACGTAAAGCTAAACGTACCCGTGCTGTTCAGCCGCTGCGTCTGCCGTCTAACAAAGCTCAGGTTAAACCGGGTCAGACCTGCTCTGTTGCTGGTTGGGGTCAGACCGCTCCGCTGGGTAAACACTCTCACACCCTGCAGGAAGTTAAAATGACCGTTCAGGAAGACCGTAAATGCGAATCTGACCTGCGTCACTACTACGACTCTACCATCGAACTGTGCGTTGGTGACCCGGAAATCAAAAAAACCTCTTTCAAAGGTGACTCTGGTGGTCCGCTGGTTTGCAACAAAGTTGCTCAGGGTATCGTTTCTTACGGTCGTAACAACGGTATGCCGCCGCGTGCTTGCACCAAAGTTTCTTCTTTCGTTCACTGGATCAAAAAAACCATGAAACGTCAC
Linker GS Ggcagc
MTS AAVALLPAVLLALLAP gccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgccc
BAA KKKRK aaaaagaagcgcaag
linker GS Ggcagc
N9R SGKIPRTLTA AGCGGCAAAATTCCGCGTACCCTGACCGCG
linker AS Gctagc
Dar(E) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
(이 중에서, N 말단 부위의 His6-D(E)-TEV 는 발현 및 시험을 위하여 삽입된 것으로, 융합 단백질의 활성과 무관하며, 실제 융합 단백질의 활성 실험에서는 상기 부위가 제거된 상태로 사용되었다. 이하 동일)
1.2. GEGZB - MTS - BAA - M9R - Dar ( EGFR )- MTS - BAA 의 제조
N 말단에서 C 말단 방향으로, 그랜자임 B 단편(GEGZB)-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]-절단부위(M9R)-표적화부위[EGFR DARPin (Dar(EGFR))]-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]을 포함하는 융합 단백질(아미노산 서열: 서열번호 3; 염기서열: 서열번호 4)을 제작하였다 (도 1의 두 번째). 이때 염기성 서열(BAA)는 대표적 핵전달신호인 KKRK로 구성된 서열을 사용하였다.
구체적으로, 상기 단백질의 제작 과정은 실시예 1.1과 같은 제작과정을 거친다. 제작된 융합 단백질(서열번호 3)의 각 구성 부분 및 이를 암호화하는 염기 서열을 아래의 표 3에 정리하였다:
N->C 아미노산 서열 코딩 염기 서열
His6 MRGSHHHHHHDYDIPTT Atgcgcggcagccatcaccatcaccatcacgattacgatatcccaacgacc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS Ggcagc
TEV-GEGZB ENLYFQGeiiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh gaaaacctgtattttcagGGAGAAATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAACCGCACTCTCGTCCGTACATGGCTTACCTGATGATCTGGGACCAGAAATCTCTGAAACGTTGCGGTGGTTTCCTGATCCAGGACGACTTCGTTCTGACCGCTGCTCACTGCTGGGGTTCTTCTATCAACGTTACCCTGGGTGCTCACAACATCAAAGAACAGGAACCGACCCAGCAGTTCATCCCGGTTAAACGTCCGATCCCGCACCCGGCTTACAACCCGAAAAACTTCTCTAACGACATCATGCTGCTGCAGCTGGAACGTAAAGCTAAACGTACCCGTGCTGTTCAGCCGCTGCGTCTGCCGTCTAACAAAGCTCAGGTTAAACCGGGTCAGACCTGCTCTGTTGCTGGTTGGGGTCAGACCGCTCCGCTGGGTAAACACTCTCACACCCTGCAGGAAGTTAAAATGACCGTTCAGGAAGACCGTAAATGCGAATCTGACCTGCGTCACTACTACGACTCTACCATCGAACTGTGCGTTGGTGACCCGGAAATCAAAAAAACCTCTTTCAAAGGTGACTCTGGTGGTCCGCTGGTTTGCAACAAAGTTGCTCAGGGTATCGTTTCTTACGGTCGTAACAACGGTATGCCGCCGCGTGCTTGCACCAAAGTTTCTTCTTTCGTTCACTGGATCAAAAAAACCATGAAACGTCAC
linker GS Ggcagc
MTS AAVALLPAVLLALLAP gccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgccc
BAA KKKRK aaaaagaagcgcaag
linker GS Ggcagc
N9R SGKIPRTLTA AGCGGCAAAATTCCGCGTACCCTGACCGCG
NheI AS Gctagc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS Ggcagc
TAT YGRKKRRQRRR tatggccgcaagaaacgtcgccagcgccgtcgt
NLS KKKRK aagaaaaaacgtaag
(이 중에서, N 말단 부위의 His6-D(E)-TEV 는 발현 및 시험을 위하여 삽입된 것으로, 융합 단백질의 활성과 무관하며, 실제 융합 단백질의 활성 실험에서는 상기 부위가 제거된 상태로 사용되었다. 이하 동일)
1.3. GEGZB - MTS - BAA - M9R - Dar ( EGFR )의 제조
N 말단에서 C 말단 방향으로, 그랜자임 B 단편(GEGZB)-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]-절단부위(M9R)-표적화부위[EGFR DARPin (Dar(EGFR))]을 포함하는 융합 단백질(아미노산 서열: 서열번호 5; 염기서열: 서열번호 6)을 제작하였다 (도 1의 세 번째). 이때 염기성 서열(BAA)는 대표적 핵전달신호인 KKRK로 구성된 서열을 사용하였다.
구체적으로, 상기 단백질의 제작 과정은 실시예 1.1과 같은 제작과정을 거친다. 제작된 융합 단백질(서열번호 5)의 각 구성 부분 및 이를 암호화하는 염기 서열을 아래의 표 4에 정리하였다:
N->C 아미노산 서열 코딩 염기 서열
His6 MRGSHHHHHHDYDIPTT Atgcgcggcagccatcaccatcaccatcacgattacgatatcccaacgacc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS ggcagc
TEV-GEGZB ENLYFQGeiiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh gaaaacctgtattttcagGGAGAAATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAACCGCACTCTCGTCCGTACATGGCTTACCTGATGATCTGGGACCAGAAATCTCTGAAACGTTGCGGTGGTTTCCTGATCCAGGACGACTTCGTTCTGACCGCTGCTCACTGCTGGGGTTCTTCTATCAACGTTACCCTGGGTGCTCACAACATCAAAGAACAGGAACCGACCCAGCAGTTCATCCCGGTTAAACGTCCGATCCCGCACCCGGCTTACAACCCGAAAAACTTCTCTAACGACATCATGCTGCTGCAGCTGGAACGTAAAGCTAAACGTACCCGTGCTGTTCAGCCGCTGCGTCTGCCGTCTAACAAAGCTCAGGTTAAACCGGGTCAGACCTGCTCTGTTGCTGGTTGGGGTCAGACCGCTCCGCTGGGTAAACACTCTCACACCCTGCAGGAAGTTAAAATGACCGTTCAGGAAGACCGTAAATGCGAATCTGACCTGCGTCACTACTACGACTCTACCATCGAACTGTGCGTTGGTGACCCGGAAATCAAAAAAACCTCTTTCAAAGGTGACTCTGGTGGTCCGCTGGTTTGCAACAAAGTTGCTCAGGGTATCGTTTCTTACGGTCGTAACAACGGTATGCCGCCGCGTGCTTGCACCAAAGTTTCTTCTTTCGTTCACTGGATCAAAAAAACCATGAAACGTCAC
linker GS ggcagc
MTS AAVALLPAVLLALLAP gccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgccc
BAA KKKRK aaaaagaagcgcaag
linker GS ggcagc
N9R SGKIPRTLTA AGCGGCAAAATTCCGCGTACCCTGACCGCG
NheI AS gctagc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
(이 중에서, N 말단 부위의 His6-D(E)-TEV 는 발현 및 시험을 위하여 삽입된 것으로, 융합 단백질의 활성과 무관하며, 실제 융합 단백질의 활성 실험에서는 상기 부위가 제거된 상태로 사용되었다. 이하 동일)
1.4. IEPDGZB - MTS - BAA - M9R - Dar ( EGFR )- MTS - BAA 의 제조
N 말단에서 C 말단 방향으로, 그랜자임 B 단편(IEPDGZB)-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]-절단부위(M9R)-표적화부위[EGFR DARPin (Dar(EGFR))]-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]을 포함하는 융합 단백질(아미노산 서열: 서열번호 7; 염기서열: 서열번호 8)을 제작하였다 (도 1의 네 번째). 이때 염기성 서열(BAA)는 대표적 핵전달신호인 KKRK로 구성된 서열을 사용하였다.
구체적으로, 상기 단백질의 제작 과정은 실시예 1.1과 같은 제작과정을 거친다. 제작된 융합 단백질(서열번호 7)의 각 구성 부분 및 이를 암호화하는 염기 서열을 아래의 표 5에 정리하였다:
N->C 아미노산 서열 코딩 염기 서열
His6 MRGSHHHHHHDYDIPTT Atgcgcggcagccatcaccatcaccatcacgattacgatatcccaacgacc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS Ggcagc
TEV ENLYFQGS gaaaacctgtattttcagggatcc
linker GSGS ggcagcggcagc
IEPD-GZB MGSIEPDiiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh ATGGGCAGCATCGAACCAGATATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAACCGCACTCTCGTCCGTACATGGCTTACCTGATGATCTGGGACCAGAAATCTCTGAAACGTTGCGGTGGTTTCCTGATCCAGGACGACTTCGTTCTGACCGCTGCTCACTGCTGGGGTTCTTCTATCAACGTTACCCTGGGTGCTCACAACATCAAAGAACAGGAACCGACCCAGCAGTTCATCCCGGTTAAACGTCCGATCCCGCACCCGGCTTACAACCCGAAAAACTTCTCTAACGACATCATGCTGCTGCAGCTGGAACGTAAAGCTAAACGTACCCGTGCTGTTCAGCCGCTGCGTCTGCCGTCTAACAAAGCTCAGGTTAAACCGGGTCAGACCTGCTCTGTTGCTGGTTGGGGTCAGACCGCTCCGCTGGGTAAACACTCTCACACCCTGCAGGAAGTTAAAATGACCGTTCAGGAAGACCGTAAATGCGAATCTGACCTGCGTCACTACTACGACTCTACCATCGAACTGTGCGTTGGTGACCCGGAAATCAAAAAAACCTCTTTCAAAGGTGACTCTGGTGGTCCGCTGGTTTGCAACAAAGTTGCTCAGGGTATCGTTTCTTACGGTCGTAACAACGGTATGCCGCCGCGTGCTTGCACCAAAGTTTCTTCTTTCGTTCACTGGATCAAAAAAACCATGAAACGTCAC
linker GS Ggcagc
MTS AAVALLPAVLLALLAP gccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgccc
BAA KKKRK aaaaagaagcgcaag
linker GS Ggcagc
N9R SGKIPRTLTA AGCGGCAAAATTCCGCGTACCCTGACCGCG
NheI AS Gctagc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS Ggcagc
TAT YGRKKRRQRRR tatggccgcaagaaacgtcgccagcgccgtcgt
NLS KKKRK aagaaaaaacgtaag
(이 중에서, N 말단 부위의 His6-D(E)-TEV 는 발현 및 시험을 위하여 삽입된 것으로, 융합 단백질의 활성과 무관하며, 실제 융합 단백질의 활성 실험에서는 상기 부위가 제거된 상태로 사용되었다. 이하 동일;
그램자임 B 단편의 N-말단쪽에 포함된 “IEPD” 서열은 자가 활성화를 유도하는 부위로, 그랜자임 B의 자가 활성화에 의하여 절단되어, 그 다음에 연결된 "IIG" 서열이 그랜자임 B 단편의 N-말단에 노출된다.)
1.5. IEPDGZB - MTS - BAA - M9R - Dar ( EGFR )의 제조
N 말단에서 C 말단 방향으로, 그랜자임 B 단편(IEPDGZB)-세포 투과성 융합 펩타이드[막전달서열(MTS)-염기성서열(BAA)]-절단부위(M9R)-표적화부위[EGFR DARPin (Dar(EGFR))]을 포함하는 융합 단백질(아미노산 서열: 서열번호 9; 염기서열: 서열번호 10)을 제작하였다 (도 1의 다섯 번째). 이때 염기성 서열(BAA)는 대표적 핵전달신호인 KKRK로 구성된 서열을 사용하였다.
구체적으로, 상기 단백질의 제작 과정은 실시예 1.1과 같은 제작과정을 거친다. 제작된 융합 단백질(서열번호 9)의 각 구성 부분 및 이를 암호화하는 염기 서열을 아래의 표 6에 정리하였다:
N->C 아미노산 서열 코딩 염기 서열
His6 MRGSHHHHHHDYDIPTT Atgcgcggcagccatcaccatcaccatcacgattacgatatcccaacgacc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
linker GS ggcagc
TEV ENLYFQGS gaaaacctgtattttcagggatcc
linker GSGS ggcagcggcagc
IEPD-GZB MGSIEPDiiggheakphsrpymaylmiwdqkslkrcggfliqddfvltaahcwgssinvtlgahnikeqeptqqfipvkrpiphpaynpknfsndimllqlerkakrtravqplrlpsnkaqvkpgqtcsvagwgqtaplgkhshtlqevkmtvqedrkcesdlrhyydstielcvgdpeikktsfkgdsggplvcnkvaqgivsygrnngmppractkvssfvhwikktmkrh ATGGGCAGCATCGAACCAGATATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAACCGCACTCTCGTCCGTACATGGCTTACCTGATGATCTGGGACCAGAAATCTCTGAAACGTTGCGGTGGTTTCCTGATCCAGGACGACTTCGTTCTGACCGCTGCTCACTGCTGGGGTTCTTCTATCAACGTTACCCTGGGTGCTCACAACATCAAAGAACAGGAACCGACCCAGCAGTTCATCCCGGTTAAACGTCCGATCCCGCACCCGGCTTACAACCCGAAAAACTTCTCTAACGACATCATGCTGCTGCAGCTGGAACGTAAAGCTAAACGTACCCGTGCTGTTCAGCCGCTGCGTCTGCCGTCTAACAAAGCTCAGGTTAAACCGGGTCAGACCTGCTCTGTTGCTGGTTGGGGTCAGACCGCTCCGCTGGGTAAACACTCTCACACCCTGCAGGAAGTTAAAATGACCGTTCAGGAAGACCGTAAATGCGAATCTGACCTGCGTCACTACTACGACTCTACCATCGAACTGTGCGTTGGTGACCCGGAAATCAAAAAAACCTCTTTCAAAGGTGACTCTGGTGGTCCGCTGGTTTGCAACAAAGTTGCTCAGGGTATCGTTTCTTACGGTCGTAACAACGGTATGCCGCCGCGTGCTTGCACCAAAGTTTCTTCTTTCGTTCACTGGATCAAAAAAACCATGAAACGTCAC
linker GS ggcagc
MTS AAVALLPAVLLALLAP gccgcggtagcgctgctcccggcggtcctgctggccttgctggcgccc
BAA KKKRK aaaaagaagcgcaag
linker GS ggcagc
N9R SGKIPRTLTA AGCGGCAAAATTCCGCGTACCCTGACCGCG
NheI AS gctagc
Dar(EGFR) DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNADDTWGWTPLHLAAYQGHLEIVEVLLKNGADVNAYDYIGWTPLHLAADGHLEIVEVLLKNGADVNASDYIGDTPLHLAAHNGHLEIVEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIDNGNEDLAEILQ GATCTGGGCAAAAAACTGCTGGAAGCGGCGCGCGCGGGCCAGGATGATGAAGTGCGCATTCTGATGGCGAATGGTGCGGATGTTAACGCGGACGATACCTGGGGCTGGACCCCACTGCATCTGGCCGCGTATCAGGGTCACCTGGAAATCGTGGAGGTGCTGCTGAAAAACGGCGCGGATGTGAACGCGTATGATTATATTGGCTGGACCCCGCTGCATCTGGCGGCGGATGGCCATCTGGAAATTGTGGAAGTGCTGCTGAAAAACggcGCTGATGTTAATGCTAGCGATTATATTGGCGATACGCCGCTGCACCTGGCAGCGCATAACGGCCATCTGGAGATTGTTGAAGTTCTGCTGAAGCATGGCGCCGATGTGAATGCGCAGGATAAATTTGGCAAAACCGCGTTTGATATTAGCATTGATAACGGCAACGAAGATCTGGCGGAAATTCTGCAG
(이 중에서, N 말단 부위의 His6-D(E)-TEV 는 발현 및 시험을 위하여 삽입된 것으로, 융합 단백질의 활성과 무관하며, 실제 융합 단백질의 활성 실험에서는 상기 부위가 제거된 상태로 사용되었다. 이하 동일;
그램자임 B 단편의 N-말단쪽에 포함된 “IEPD” 서열은 자가 활성화를 유도하는 부위로, 그랜자임 B의 자가 활성화에 의하여 절단되어, 그 다음에 연결된 "IIG" 서열이 그랜자임 B 단편의 N-말단에 노출된다.)
실시예 2: 그랜자임 융합단백질의 암세포 증식 억제 효과 시험
인간 대장암 세포주인 HCT116(ATCC) 및 RKO(ATCC) 세포주를 대상으로 상기 그랜자임 융합 단백질의 투여에 의한 항암 효과를 확인하였다.
상기 세포들을 각각 96-well plate에 well당 1x103개가 포함되도록 10%의 FBS가 포함된 RPMI 배지 (Gibco) 또는 DMEM 배지(Gibco)로 분주 하고, 다음날, 그랜자임 융합 단백질 (IEPDGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR)- MTS-BAA; 실시예 1에서 제작된 그랜자임 융합 단백질; 서열번호 7, 및 IEPDGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR); 실시예 1에서 제작된 그랜자임 융합 단백질; 서열번호 9)을 각각 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6 uM (2배씩 농도 증가)의 농도로 well 당 100uL씩 처리한 다음, 24hr 동안 CO2 배양기에서 온도 37℃, CO2 5%의 조건으로 배양하였다. CellTiter-Glo reagent(Promega)를 80uL씩 각 well에 가한 뒤, luminescence를 EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer)로 측정하여 세포 생존률을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, HCT116 및 RKO 세포주에서 1.6uM 농도에서 40~60%의 항암효과를 나타냈다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Fusion protein comprising Granzyme B and use thereof <130> OPP20134090US <150> KR 10-2014-0060005 <151> 2014-05-19 <160> 68 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of precursor of GZB-MTS-BAA-M9R-D(E) <400> 1 Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 35 40 45 Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His 50 55 60 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His 85 90 95 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 100 105 110 Ser Asp Tyr Ile Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly 115 120 125 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 130 135 140 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 165 170 175 Phe Gln Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Gln Pro Ile Leu Leu Leu Leu 180 185 190 Ala Phe Leu Leu Leu Pro Arg Ala Asp Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly 195 200 205 His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile 210 215 220 Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Gln Asp 225 230 235 240 Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val 245 250 255 Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe 260 265 270 Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn 275 280 285 Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg 290 295 300 Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val 305 310 315 320 Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro 325 330 335 Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln 340 345 350 Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr 355 360 365 Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys 370 375 380 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile 385 390 395 400 Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys 405 410 415 Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Arg His Gly 420 425 430 Ser Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala 435 440 445 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Gly Ser Ser Gly Lys Ile Pro Arg Thr Leu 450 455 460 Thr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala 465 470 475 480 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val 485 490 495 Asn Ala Asp Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 500 505 510 Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp 515 520 525 Val Asn Ala Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 530 535 540 Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp 545 550 555 560 Val Asn Ala Ser Asp Tyr Ile Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 565 570 575 His Asn Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala 580 585 590 Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser 595 600 605 Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 610 615 620 <210> 2 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of precursor of GZB-MTS-BAA-M9R-D(E) <400> 2 catatgcgcg gcagccatca ccatcaccat cacgattacg atatcccaac gaccgatctg 60 ggcaaaaaac tgctggaagc ggcgcgcgcg ggccaggatg atgaagtgcg cattctgatg 120 gcgaatggtg cggatgttaa cgcggacgat acctggggct ggaccccact gcatctggcc 180 gcgtatcagg gtcacctgga aatcgtggag gtgctgctga aaaacggcgc ggatgtgaac 240 gcgtatgatt atattggctg gaccccgctg catctggcgg cggatggcca tctggaaatt 300 gtggaagtgc tgctgaaaaa cggcgctgat gttaatgcta gcgattatat tggcgatacg 360 ccgctgcacc tggcagcgca taacggccat ctggagattg ttgaagttct gctgaagcat 420 ggcgccgatg tgaatgcgca ggataaattt ggcaaaaccg cgtttgatat tagcattgat 480 aacggcaacg aagatctggc ggaaattctg cagggcagcg aaaacctgta ttttcaggga 540 tccggcagcg gcagcatgca gccgatcctg ctcctcctgg cgttcctgct gctgccacgt 600 gctgacgctg gtgaaatcat cggtggtcac gaagctaaac cgcactctcg tccgtacatg 660 gcttacctga tgatctggga ccagaaatct ctgaaacgtt gcggtggttt cctgatccag 720 gacgacttcg ttctgaccgc tgctcactgc tggggttctt ctatcaacgt taccctgggt 780 gctcacaaca tcaaagaaca ggaaccgacc cagcagttca tcccggttaa acgtccgatc 840 ccgcacccgg cttacaaccc gaaaaacttc tctaacgaca tcatgctgct gcagctggaa 900 cgtaaagcta aacgtacccg tgctgttcag ccgctgcgtc tgccgtctaa caaagctcag 960 gttaaaccgg gtcagacctg ctctgttgct ggttggggtc agaccgctcc gctgggtaaa 1020 cactctcaca ccctgcagga agttaaaatg accgttcagg aagaccgtaa atgcgaatct 1080 gacctgcgtc actactacga ctctaccatc gaactgtgcg ttggtgaccc ggaaatcaaa 1140 aaaacctctt tcaaaggtga ctctggtggt ccgctggttt gcaacaaagt tgctcagggt 1200 atcgtttctt acggtcgtaa caacggtatg ccgccgcgtg cttgcaccaa agtttcttct 1260 ttcgttcact ggatcaaaaa aaccatgaaa cgtcacggca gcgccgcggt agcgctgctc 1320 ccggcggtcc tgctggcctt gctggcgccc aaaaagaagc gcaagggcag cagcggcaaa 1380 attccgcgta ccctgaccgc ggctagcgat ctgggcaaaa aactgctgga agcggcgcgc 1440 gcgggccagg atgatgaagt gcgcattctg atggcgaatg gtgcggatgt taacgcggac 1500 gatacctggg gctggacccc actgcatctg gccgcgtatc agggtcacct ggaaatcgtg 1560 gaggtgctgc tgaaaaacgg cgcggatgtg aacgcgtatg attatattgg ctggaccccg 1620 ctgcatctgg cggcggatgg ccatctggaa attgtggaag tgctgctgaa aaacggcgct 1680 gatgttaatg ctagcgatta tattggcgat acgccgctgc acctggcagc gcataacggc 1740 catctggaga ttgttgaagt tctgctgaag catggcgccg atgtgaatgc gcaggataaa 1800 tttggcaaaa ccgcgtttga tattagcatt gataacggca acgaagatct ggcggaaatt 1860 ctgcag 1866 <210> 3 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of precursor of GEGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR)-MTS-BAA <400> 3 Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 35 40 45 Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His 50 55 60 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His 85 90 95 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 100 105 110 Ser Asp Tyr Ile Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly 115 120 125 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 130 135 140 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 165 170 175 Phe Gln Gly Glu Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg 180 185 190 Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg 195 200 205 Cys Gly Gly Phe Leu Ile Gln Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His 210 215 220 Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys 225 230 235 240 Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro 245 250 255 His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu 260 265 270 Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg 275 280 285 Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val 290 295 300 Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu 305 310 315 320 Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp 325 330 335 Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro 340 345 350 Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 355 360 365 Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly 370 375 380 Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile 385 390 395 400 Lys Lys Thr Met Lys Arg His Gly Ser Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro 405 410 415 Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Gly Ser 420 425 430 Ser Gly Lys Ile Pro Arg Thr Leu Thr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Lys 435 440 445 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 450 455 460 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp Thr Trp Gly Trp 465 470 475 480 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu 485 490 495 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp Tyr Ile Gly 500 505 510 Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu 515 520 525 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser Asp Tyr Ile Gly 530 535 540 Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly His Leu Glu Ile Val 545 550 555 560 Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe 565 570 575 Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu 580 585 590 Ala Glu Ile Leu Gln Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 595 600 605 Arg Arg Lys Lys Lys Arg Lys 610 615 <210> 4 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of precursor of GEGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR)-MTS-BAA <400> 4 catatgcgcg gcagccatca ccatcaccat cacgattacg atatcccaac gaccgatctg 60 ggcaaaaaac tgctggaagc ggcgcgcgcg ggccaggatg atgaagtgcg cattctgatg 120 gcgaatggtg cggatgttaa cgcggacgat acctggggct ggaccccact gcatctggcc 180 gcgtatcagg gtcacctgga aatcgtggag gtgctgctga aaaacggcgc ggatgtgaac 240 gcgtatgatt atattggctg gaccccgctg catctggcgg cggatggcca tctggaaatt 300 gtggaagtgc tgctgaaaaa cggcgctgat gttaatgcta gcgattatat tggcgatacg 360 ccgctgcacc tggcagcgca taacggccat ctggagattg ttgaagttct gctgaagcat 420 ggcgccgatg tgaatgcgca ggataaattt ggcaaaaccg cgtttgatat tagcattgat 480 aacggcaacg aagatctggc ggaaattctg cagggcagcg aaaacctgta ttttcaggga 540 gaaatcatcg gtggtcacga agctaaaccg cactctcgtc cgtacatggc ttacctgatg 600 atctgggacc agaaatctct gaaacgttgc ggtggtttcc tgatccagga cgacttcgtt 660 ctgaccgctg ctcactgctg gggttcttct atcaacgtta ccctgggtgc tcacaacatc 720 aaagaacagg aaccgaccca gcagttcatc ccggttaaac gtccgatccc gcacccggct 780 tacaacccga aaaacttctc taacgacatc atgctgctgc agctggaacg taaagctaaa 840 cgtacccgtg ctgttcagcc gctgcgtctg ccgtctaaca aagctcaggt taaaccgggt 900 cagacctgct ctgttgctgg ttggggtcag accgctccgc tgggtaaaca ctctcacacc 960 ctgcaggaag ttaaaatgac cgttcaggaa gaccgtaaat gcgaatctga cctgcgtcac 1020 tactacgact ctaccatcga actgtgcgtt ggtgacccgg aaatcaaaaa aacctctttc 1080 aaaggtgact ctggtggtcc gctggtttgc aacaaagttg ctcagggtat cgtttcttac 1140 ggtcgtaaca acggtatgcc gccgcgtgct tgcaccaaag tttcttcttt cgttcactgg 1200 atcaaaaaaa ccatgaaacg tcacggcagc gccgcggtag cgctgctccc ggcggtcctg 1260 ctggccttgc tggcgcccaa aaagaagcgc aagggcagca gcggcaaaat tccgcgtacc 1320 ctgaccgcgg ctagcgatct gggcaaaaaa ctgctggaag cggcgcgcgc gggccaggat 1380 gatgaagtgc gcattctgat ggcgaatggt gcggatgtta acgcggacga tacctggggc 1440 tggaccccac tgcatctggc cgcgtatcag ggtcacctgg aaatcgtgga ggtgctgctg 1500 aaaaacggcg cggatgtgaa cgcgtatgat tatattggct ggaccccgct gcatctggcg 1560 gcggatggcc atctggaaat tgtggaagtg ctgctgaaaa acggcgctga tgttaatgct 1620 agcgattata ttggcgatac gccgctgcac ctggcagcgc ataacggcca tctggagatt 1680 gttgaagttc tgctgaagca tggcgccgat gtgaatgcgc aggataaatt tggcaaaacc 1740 gcgtttgata ttagcattga taacggcaac gaagatctgg cggaaattct gcagggcagc 1800 tatggccgca agaaacgtcg ccagcgccgt cgtaagaaaa aacgtaag 1848 <210> 5 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of precursor of GEGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR) <400> 5 Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 35 40 45 Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His 50 55 60 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His 85 90 95 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 100 105 110 Ser Asp Tyr Ile Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly 115 120 125 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 130 135 140 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 165 170 175 Phe Gln Gly Glu Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg 180 185 190 Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg 195 200 205 Cys Gly Gly Phe Leu Ile Gln Asp Asp Phe Val Leu Thr Ala Ala His 210 215 220 Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala His Asn Ile Lys 225 230 235 240 Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys Arg Pro Ile Pro 245 250 255 His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp Ile Met Leu Leu 260 265 270 Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val Gln Pro Leu Arg 275 280 285 Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln Thr Cys Ser Val 290 295 300 Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His Ser His Thr Leu 305 310 315 320 Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys Cys Glu Ser Asp 325 330 335 Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro 340 345 350 Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 355 360 365 Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Asn Asn Gly 370 375 380 Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile 385 390 395 400 Lys Lys Thr Met Lys Arg His Gly Ser Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro 405 410 415 Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Gly Ser 420 425 430 Ser Gly Lys Ile Pro Arg Thr Leu Thr Ala Ala Ser Asp Leu Gly Lys 435 440 445 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile 450 455 460 Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp Thr Trp Gly Trp 465 470 475 480 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His Leu Glu Ile Val Glu 485 490 495 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp Tyr Ile Gly 500 505 510 Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val Glu 515 520 525 Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser Asp Tyr Ile Gly 530 535 540 Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly His Leu Glu Ile Val 545 550 555 560 Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe 565 570 575 Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu 580 585 590 Ala Glu Ile Leu Gln 595 <210> 6 <211> 1794 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of precursor of GEGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR) <400> 6 Cys Ala Thr Ala Thr Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys 1 5 10 15 Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 20 25 30 Cys Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala 35 40 45 Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Ala 100 105 110 Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Thr Gly Gly 115 120 125 Thr Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys Gly Cys Gly 130 135 140 Gly Ala Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr 145 150 155 160 Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr 165 170 175 Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr 180 185 190 Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly 195 200 205 Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys 225 230 235 240 Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly 245 250 255 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala 260 265 270 Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys 275 280 285 Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly 290 295 300 Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Thr 325 330 335 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly 340 345 350 Gly Cys Gly Ala Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Cys Ala 355 360 365 Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Ala Ala Cys 370 375 380 Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly 385 390 395 400 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala 405 410 415 Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Ala Thr Gly Thr Gly 420 425 430 Ala Ala Thr Gly Cys Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr 435 440 445 Thr Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Thr 450 455 460 Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala Thr 465 470 475 480 Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys 485 490 495 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Ala 500 505 510 Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly 515 520 525 Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala 530 535 540 Thr Cys Ala Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Gly Ala 545 550 555 560 Ala Gly Cys Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Ala Cys Thr Cys Thr 565 570 575 Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr 580 585 590 Ala Cys Cys Thr Gly 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precursor of IEPDGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR)- MTS-BAA <400> 7 Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 35 40 45 Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His 50 55 60 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His 85 90 95 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 100 105 110 Ser Asp Tyr Ile Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asn Gly 115 120 125 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 130 135 140 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Gly Ser Glu Asn Leu Tyr 165 170 175 Phe Gln Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Gly Ser Ile Glu Pro Asp Ile 180 185 190 Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His 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gcgcggatgt gaacgcgtat 1560 gattatattg gctggacccc gctgcatctg gcggcggatg gccatctgga aattgtggaa 1620 gtgctgctga aaaacggcgc tgatgttaat gctagcgatt atattggcga tacgccgctg 1680 cacctggcag cgcataacgg ccatctggag attgttgaag ttctgctgaa gcatggcgcc 1740 gatgtgaatg cgcaggataa atttggcaaa accgcgtttg atattagcat tgataacggc 1800 aacgaagatc tggcggaaat tctgcagggc agctatggcc gcaagaaacg tcgccagcgc 1860 cgtcgtaaga aaaaacgtaa g 1881 <210> 9 <211> 608 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of precursor of IEPDGZB-MTS-BAA-M9R-Dar(EGFR) <400> 9 Met Arg Gly Ser His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp 20 25 30 Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 35 40 45 Asp Thr Trp Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Gln Gly His 50 55 60 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Ile Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Gly His 85 90 95 Leu Glu 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tggcgatacg 360 ccgctgcacc tggcagcgca taacggccat ctggagattg ttgaagttct gctgaagcat 420 ggcgccgatg tgaatgcgca ggataaattt ggcaaaaccg cgtttgatat tagcattgat 480 aacggcaacg aagatctggc ggaaattctg cagggcagcg aaaacctgta ttttcaggga 540 tccggcagcg gcagcatggg cagcatcgaa ccagatatca tcggtggtca cgaagctaaa 600 ccgcactctc gtccgtacat ggcttacctg atgatctggg accagaaatc tctgaaacgt 660 tgcggtggtt tcctgatcca ggacgacttc gttctgaccg ctgctcactg ctggggttct 720 tctatcaacg ttaccctggg tgctcacaac atcaaagaac aggaaccgac ccagcagttc 780 atcccggtta aacgtccgat cccgcacccg gcttacaacc cgaaaaactt ctctaacgac 840 atcatgctgc tgcagctgga acgtaaagct aaacgtaccc gtgctgttca gccgctgcgt 900 ctgccgtcta acaaagctca ggttaaaccg ggtcagacct gctctgttgc tggttggggt 960 cagaccgctc cgctgggtaa acactctcac accctgcagg aagttaaaat gaccgttcag 1020 gaagaccgta aatgcgaatc tgacctgcgt cactactacg actctaccat cgaactgtgc 1080 gttggtgacc cggaaatcaa aaaaacctct ttcaaaggtg actctggtgg tccgctggtt 1140 tgcaacaaag ttgctcaggg tatcgtttct tacggtcgta acaacggtat gccgccgcgt 1200 gcttgcacca aagtttcttc tttcgttcac tggatcaaaa aaaccatgaa acgtcacggc 1260 agcgccgcgg tagcgctgct cccggcggtc ctgctggcct tgctggcgcc caaaaagaag 1320 cgcaagggca gcagcggcaa aattccgcgt accctgaccg cggctagcga tctgggcaaa 1380 aaactgctgg aagcggcgcg cgcgggccag gatgatgaag tgcgcattct gatggcgaat 1440 ggtgcggatg ttaacgcgga cgatacctgg ggctggaccc cactgcatct ggccgcgtat 1500 cagggtcacc tggaaatcgt ggaggtgctg ctgaaaaacg gcgcggatgt gaacgcgtat 1560 gattatattg gctggacccc gctgcatctg gcggcggatg gccatctgga aattgtggaa 1620 gtgctgctga aaaacggcgc tgatgttaat gctagcgatt atattggcga tacgccgctg 1680 cacctggcag cgcataacgg ccatctggag attgttgaag ttctgctgaa gcatggcgcc 1740 gatgtgaatg cgcaggataa atttggcaaa accgcgtttg atattagcat tgataacggc 1800 aacgaagatc tggcggaaat tctgcag 1827 <210> 11 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Active region of granzyme B <400> 11 Ile Ile Gly Gly His Glu Ala Lys Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Met Ile Trp Asp Gln Lys Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe 20 25 30 Leu 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Artificial Sequence <220> <223> Unit of basic peptide <400> 20 Lys Lys Lys Lys Lys Arg 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Unit of basic peptide <400> 21 Lys Lys Lys Arg Lys Arg 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Unit of basic peptide <400> 22 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Unit of basic peptide <400> 23 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 24 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 25 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTD103 <400> 26 Leu Ala Leu Pro Val Leu Leu Leu Ala 1 5 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TP10 <400> 27 Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 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Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 50 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin B4_50 <400> 50 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala His Asp 20 25 30 Arg Tyr Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 50 55 60 Asp His Asp Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Lys Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Asp Asp Ser Met Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg His Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Asn Asp Phe Met Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser 130 135 140 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 145 150 155 160 Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp 165 170 175 Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 180 185 <210> 51 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin B4_58 <400> 51 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Thr Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Phe Asp 20 25 30 Ser Asn Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala His 50 55 60 Asp Ser Tyr Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Arg Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Phe Asp Ser Thr Gly Gln Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Gln Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Ser Asp Arg Met Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Thr 130 135 140 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val 145 150 155 160 Asn Ala Lys Asp Phe Val Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr 165 170 175 Arg Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp 180 185 190 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 195 200 205 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 210 215 220 <210> 52 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_01 <400> 52 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp 20 25 30 Ile Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Val Gly His Gln 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 50 55 60 Asp Thr Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Phe Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 His Asp Arg Phe Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Ser Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_02 <400> 53 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Arg Asp 20 25 30 Met Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Met Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Asn Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly 100 105 110 Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 115 120 <210> 54 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_07 <400> 54 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser Asp 20 25 30 Lys Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Ile Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala His 50 55 60 Asp Ser Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Phe Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly 100 105 110 Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 115 120 <210> 55 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_11 <400> 55 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile Asp 20 25 30 Thr Ile Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Asp Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala 50 55 60 Asp Asn Trp Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Arg Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Asp Asp Val Gln Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Thr Ala His His Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 56 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_13 <400> 56 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Phe Asp 20 25 30 Met Ser Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Asp Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn 50 55 60 Asp Leu Trp Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Arg Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn Gly 100 105 110 Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 115 120 <210> 57 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin I_19 <400> 57 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp 20 25 30 Asn Lys Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ser Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp 50 55 60 Asp Tyr Phe Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Gln Arg Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Ala Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 58 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_01 <400> 58 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Asp Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp 20 25 30 Ile Trp Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser 50 55 60 Asp Phe Ser Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Lys Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Asn Asp Ala Thr Gly Thr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Lys Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 59 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_02 <400> 59 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Val Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ala Asp 20 25 30 His Gln Ser Phe Thr Pro Leu His Leu Tyr Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ser 50 55 60 Asp Trp His Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Thr Asp His Ser Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Leu Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 60 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_07 <400> 60 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp 20 25 30 Trp Lys Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Ser Ala Met Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile 50 55 60 Asp Phe Ser Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Leu Ile Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 His Asp Ser Ala Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Thr Lys Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 61 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_08 <400> 61 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Trp Asp 20 25 30 Phe Leu Gly Leu Ile Pro Leu Arg Leu Ala Ala Ala Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Thr Tyr Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Asn Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Leu Asp Asn Thr Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Tyr Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 62 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_09 <400> 62 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Ser Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp 20 25 30 Phe Gln Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr 50 55 60 Asp Gln Met Gly Met Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Asp Asp Thr His Gly Ala Thr Pro Leu His Leu Ala Ala His Thr Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 63 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_16 <400> 63 Asp Leu Gly Lys Lys Pro Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp 20 25 30 Ile Val Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr 50 55 60 Asp Met Gln Val Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Leu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Glu Asp Ser Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Lys Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 64 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_25 <400> 64 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asp Asp 20 25 30 Arg Arg Gly Ile Pro Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala His 50 55 60 Asp Met Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Thr Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Ile Asp Phe Thr Gly His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Arg Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 65 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_27 <400> 65 Asp Leu Gly Lys Lys Pro Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Tyr Asp 20 25 30 Arg His Gly Leu Thr Pro Leu His Leu Val Ala Ile Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile 50 55 60 Asp Ile Ile Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ser Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Ser Asp Val Thr Gly Ser Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Lys Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 66 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_37 <400> 66 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala His Asp 20 25 30 Lys Arg Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Thr Gly His Leu 35 40 45 Glu Met Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn Ala Val 50 55 60 Asp Ile Gln Gly Arg Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Trp Ile Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Met Asp Asp Phe Gly Glu Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Thr Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 67 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin T_40 <400> 67 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Ser Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp 20 25 30 Arg Val Gly Phe Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Met Phe Gly His Leu 35 40 45 Glu Leu Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Ile 50 55 60 Asp Phe Gln Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gln Leu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Leu Asp Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile His Gly 100 105 110 His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 68 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DARPin <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(220) <223> each Xaa is independently Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Arg, His or Lys <400> 68 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Xaa Asp 20 25 30 Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala Xaa 50 55 60 Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa 130 135 140 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp Val 145 150 155 160 Asn Ala Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa 165 170 175 Xaa Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Xaa Gly Ala Asp 180 185 190 Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile 195 200 205 Asp Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 210 215 220

Claims (12)

  1. (1) 그랜자임 B, 또는 'GE' 또는 'IEPD'(서열번호 36) 및 서열번호 11로 이루어진 그랜자임 B의 활성부위를 포함하는 그랜자임 B의 단편,
    (2) 세포 투과 펩타이드 (cell penetrating peptide; CPP),
    (3) 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위 (cleavage site), 및
    (4) 표적화 부위 (targeting moiety)
    를 N 말단에서 C 말단 방향으로 순서대로 포함하고,
    상기 세포 투과 펩타이드는 서열번호 12 내지 14 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 소수성 펩타이드와 서열번호 15 내지 23 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 염기성 펩타이드로 이루어진 융합 펩타이드이고,
    상기 펩타이드 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 절단 부위는 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이고,
    상기 표적화부위는 ErbB 패밀리, 인슐린 수용체, PDGF 수용체(Platelet-derived growth factor receptor; PDGFR), FGF 수용체(fibroblast growth factor receptor; FGFR), VEGF 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), HGF 수용체(hepatocyte growth factor receptor; HGFR), Trk 수용체(tropomyosin-receptor-kinase receptor), Eph 수용체(Ephrin receptor), AXL 수용체, LTK 수용체 (Leukocyte receptor tyrosine kinase), TIE 수용체, ROR 수용체(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor), DDR 수용체 (Discoidin domain receptor), RET 수용체, KLG 수용체, RYK 수용체 (related to receptor tyrosine kinase receptor), 또는 MuSK 수용체를 표적으로 하는 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 DARPin인,
    융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 표적화 부위는 EGFR(Epidermal growth factor receptor)을 표적으로 하는 DARPin인 것인, 융합 단백질.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 또는 제8항의 융합 단백질을 포함하는 항암용 약학 조성물.
  12. 삭제
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