CN117015403A - 含效应分子的靶向缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子经由缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可经由裂解从所述靶向缀合物释放。还提供了组合物和使用所述靶向缀合物的治疗或诊断方法。

Description

含效应分子的靶向缀合物及其用途
技术领域
本申请涉及包含效应分子的靶向缀合物及其用途。
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月25日提交的PCT申请PCT/CN2021/077864和2021年4月1日提交的PCT申请PCT/CN2021/084952的优先权，所述申请两者的内容以引用的方式整体并入本文。
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关于ASCII文本文件的以下提交的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：199872000240SE QLIST.TXT，记录日期：2021年2月24日，大小：163KB)。
背景技术
抗体已成功用作多种疾病的治疗剂和诊断剂。天然抗体通过结合至特定靶标而起作用。然而，抗体靶标可在患病(例如，肿瘤)组织和正常组织两者中表达。当抗体结合至患者的正常组织中表达的靶标时，患者可能经历不良的毒性副作用，所述毒性副作用的强度范围可从轻度到重度或甚至危及生命。此类副作用可导致抗体的有效剂量降低，其可降低抗体的治疗功效。抗体治疗甚至可能由于副作用而中断，其在一些情况下使人类患者不可使用抗体治疗剂。因此，对工程化优先结合至患病细胞和组织上的靶标的抗体存在未满足的需求。
抗体药物缀合物(ADC)是经设计以优先将药物(“有效载荷”)引导至表达由抗体所识别的表面抗原的患病组织的靶向治疗剂。ADC通常由经由能够在患病环境中释放治疗活性剂的化学接头与治疗活性剂(例如细胞毒性药物)连接的抗体组成。目前，已有五种ADC获得FDA批准用于治疗用途，并且超过100种正在进行临床研究。曲妥珠单抗恩他新和贝伦妥单抗维多汀是癌症治疗中最广泛使用的ADC(参见例如，Jackson等人,Pharm Res(2015)32:3458-3469)。目前批准或正在进行临床评价的大多数ADC是小分子药物-抗体缀合物。目前的ADC并入标准化学治疗剂，诸如抗有丝分裂剂和抗代谢物，包括奥瑞斯他汀类单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)、卡奇霉素和美登素1(DM1)的衍生物。参见例如，Polakis,Pharma Rev,2016,68(1)3-19。
尽管ADC具有概念优势和有前景的临床结果，但开发有效的ADC治疗剂仍然非常具有挑战性。ADC的总体设计、靶组织的选择、抗体、化学接头、药物附接位点和货物的性质都会影响ADC的功效和风险(参见例如，Chau等人,Lancet 2019；394:793-804)。例如，临床试验中的早期ADC受到所用小鼠抗体的免疫原性的影响，并且ADC开发的最新进展依赖于人源化抗体。ADC的其他突出挑战包括a)药物货物无效；b)药物过早释放，导致功效丧失和毒性；c)靶标表达水平；d)次优靶标选择性；e)如在和中观察到的副作用，诸如血小板减少症和神经病变。这些限制强调需要ADC的进一步改进，以寻找高效力的有效载荷、稳定的化学接头、有效且高度特异性的货物释放以及增加的抗体-靶标选择性。
ADC平台作为体内高度特异性的货物递送系统也适用于小分子药物递送以外的应用。例如，siRNA可与抗体融合并发展成为有效的体内mRNA敲低方法(参见等人,Nature Protocols,2016,11:22-36)。此类抗体介导的siRNA递送已在结肠癌治疗中显示出有希望的结果(参见等人,Clin Cancer Res 2015 15；21(6):1383-94.)。在ADC平台中仍然需要更广泛范围的设计、抗体类型和治疗剂的广度。
发明内容
本申请提供包含靶向部分和一个或多个效应分子的靶向缀合物，所述靶向缀合物的组合物、制备方法和使用方法。
在一些实施方案中，提供了一种包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子通过缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可通过裂解从所述靶向缀合物释放。在一些实施方案中，靶向缀合物包含式I的结构：
其中：A1是第一靶向部分；A2是第二靶向部分；P1是第一裂解位点；P2是第二裂解位点；P3是第三裂解位点；C是缀合位点；L是接头；D是效应分子；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20。在一些实施方案中，z＝0。在一些实施方案中，z＝1。在一些实施方案中，y＝0。在一些实施方案中，y＝1。在一些实施方案中，x＝0。在一些实施方案中，x＝1。在一些实施方案中，u＝0。在一些实施方案中，u＝1。在一些实施方案中，a是1或更大。在一些实施方案中，b是1或更大。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述靶向缀合物包含靶向肽。在一些实施方案中，所述靶向缀合物包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、纳米抗体、scFv、scFab、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段和dsFv。在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗体-肽融合蛋白。在一些实施方案中，所述抗体-肽融合蛋白包含Fc区。在一些实施方案中，所述肽融合至所述Fc区的C末端。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述靶向缀合物包含特异性地结合至靶部位处的靶分子(例如，细胞表面分子)的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶部位是疾病部位。在一些实施方案中，所述疾病是肿瘤。在一些实施方案中，所述靶分子选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、Trop2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、CD40、OX40、CD47、SIRPα、HER2、HER3、EGFR、VEGF、VEGR2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD79、整联蛋白αvβ3、αvβ6、MUC1、PMSA、uPAR和angiopep-2。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，裂解由所述靶向部分的靶部位处的条件触发。在一些实施方案中，所述靶部位处的条件选自由以下组成的组：蛋白酶、pH变化、氧化还原变化、缺氧、氧化应激、高热和细胞外ATP浓度。在一些实施方案中，所述靶部位是疾病部位。在一些实施方案中，所述疾病是肿瘤。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，裂解是通过蛋白酶进行的。在一些实施方案中，蛋白酶选自由以下各项组成的组：尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、纤溶酶、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS6、MMP1、MMP2、MMP-3、MMP-9、MMP-8、MMP-14、MT1-MMP、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14、TACE、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、成纤维细胞相关蛋白、蛋白裂解酶、PSMA和PSA。在一些实施方案中，所述蛋白酶是uPA。在一些实施方案中，裂解位点包含选自SEQ ID NO：50-55的氨基酸序列的氨基酸序列。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述效应分子选自由以下组成的组：治疗剂、寡核苷酸和可检测标记。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂。在一些实施方案中，所述效应分子选自由以下组成的组：基于蛋白质的药物、小分子药物、细胞毒性剂、毒素、免疫调节剂、抗炎剂、抗感染剂和表观遗传调节剂。在一些实施方案中，所述效应分子是寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是约2至约100个核苷酸长。在一些实施方案中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组：双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、反义RNA、小干扰RNA、微小RNA、短发夹RNA(shRNA)和CpG(胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤)寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：66-67组成的组的核酸序列。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述靶向缀合物包含两个或更多个效应分子。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述效应分子是选自由以下组成的组的细胞毒性剂：蒽环类药物、奥瑞斯他汀、喜树碱、考布他汀、尾海兔素、倍癌霉素、烯二炔、格尔德霉素、吲哚啉并苯二氮二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、微管溶素、哈米特林、spliceostatin、普拉地内酯以及它们的立体异构体、等排体、类似物或衍生物。在一些实施方案中，所述效应分子是SN38或其衍生物。在一些实施方案中，所述效应分子是MMAE或其衍生物。在一些实施方案中，所述效应分子选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，所述靶缀合物包含两个或更多个小分子效应分子。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，其中所述靶向缀合物包含式I的结构，A1是第一靶向肽或识别第一靶分子的第一抗体或其抗原结合片段，并且A2是第二靶向肽或识别第二靶分子的第二抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第一靶分子和所述第二靶分子是相同的。在一些实施方案中，所述第一靶分子和所述第二靶分子是不同的。在一些实施方案中，A1连接至所述缀合位点(C)的N末端，并且其中A2连接至所述缀合位点(C)的C末端。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述缀合位点是共价缀合位点。在一些实施方案中，所述缀合位点是内源性缀合位点。在一些实施方案中，缀合位点是引入所述靶向部分中的工程化缀合位点。在一些实施方案中，所述缀合位点存在于与所述靶向部分融合的肽中。在一些实施方案中，所述缀合位点是转谷氨酰胺酶缀合位点，如含谷氨酰胺的标签。在一些实施方案中，所述缀合位点包含彼此串联融合的多个含谷氨酰胺标签。在一些实施方案中，所述缀合位点包含选自由SEQ ID NO：1-12组成的组的氨基酸序列。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，所述缀合位点是非共价缀合位点。在一些实施方案中，所述缀合位点包含寡核苷酸结合多肽。在一些实施方案中，所述缀合位点包含CpG结合多肽。在一些实施方案中，所述缀合位点包含选自由SEQ ID NO：56-65组成的组的氨基酸序列。
在根据上述靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，其中所述靶向缀合物包含式I的结构，L由下式表示：SH2-间隔子、MAL-间隔子、NH2-间隔子或Osu-间隔子(Osu：氧基琥珀酰亚胺)。在一些实施方案中，L由下式表示：(Gly)n-(PEG)m-VC-PAB-(DMAE)k(式II)，其中n≥1，m≥2，并且k＝0或1。在一些实施方案中，L由下式表示：(Gly)n-(PEG)m-Val-Ala-PAB-(DMAE)k，其中n≥1，m≥2，并且k＝0或1。在一些实施方案中，L由(Gly)n-(PEG)m-P-PAB-(DMAE)k(式III)表示，其中n、m和k是整数，n≥1，m≥2，并且k＝0或1，P是裂解位点。
在一些实施方案中，提供了一种包含靶向部分的靶向缀合物，所述靶向部分缀合至具有选自由式(1)-(7)的化合物组成的组的式的治疗剂。
本文还描述了一种组合物，所述组合物包含上述靶向缀合物中的多个任一种。在一些实施方案中，所述组合物中的效应分子与靶向部分的平均比率是至少约1:1。在一些实施方案中，所述组合物中的至少两种靶向缀合物包含不同数量的效应分子。在一些实施方案中，其中所述效应分子是治疗剂或寡核苷酸，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，其中所述效应分子是可检测标记，所述组合物是诊断组合物。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上述药物组合物中的任一种。
在一些实施方案中，提供了一种诊断个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上述诊断组合物，其中检测到所述可检测标记表明存在所述疾病。
本文还提供了一种制备上述靶向缀合物中的任一种的方法，其中所述方法包括将所述效应分子缀合至所述靶向部分。
附图说明
图1A-10C描绘了示例性靶向缀合物的示意性结构，所述靶向缀合物包含A1：第一靶向部分，诸如具有或没有蛋白酶裂解位点的抗体或抗原结合片段或靶向肽(包括多特异性抗体和融合蛋白)；A2：第二靶向部分，诸如具有或没有蛋白酶裂解位点的抗体或抗原结合片段或靶向肽(包括多特异性抗体和融合蛋白)；D：效应分子，如小分子或寡核苷酸；P1：蛋白酶裂解位点1；P2：蛋白酶裂解位点2；P3：蛋白酶裂解位点3；C：缀合位点，如共价缀合位点或非共价缀合位点(例如，阳离子肽或中性电荷肽)；L：接头；X＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；b＝1-20。
图1A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图1B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图1C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝1；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图2A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝1；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图2B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图2C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝1；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图3A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图3B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝1；v＝1a＝1-20；b＝1-20。
图3C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝1；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图4A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝1；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图4B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图4C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝1；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图5A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图5B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图5C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝1；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图6A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝1；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图6B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图6C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝1；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图7A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图7B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图7C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝1；z＝0；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图8A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝1；u＝0；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图8B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图8C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝1；z＝1；u＝1；v＝1；a＝1-20；b＝1-20。
图9A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝0；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图9B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝0；z＝0；u＝1；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图9C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝1；y＝1；z＝0；u＝1；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图10A示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝0；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图10B示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝0；z＝0；u＝1；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图10C示出了示例性靶向缀合物，其中x＝0；y＝1；z＝0；u＝1；v＝0；a＝1-20；b＝1-20。
图11示出了非共价缀合至抗体的CpG ODN接头的凝胶迁移测定。
图12示出了共价缀合至抗体的CpG ODN接头的凝胶迁移测定。
图13示出了共价缀合至抗体的CpG ODN接头的凝胶迁移测定。
图14示出了PD-1/PD-L1免疫阻断报告子测定的剂量响应曲线。
图15A示出了使用HCT15-hPDL1细胞，化合物的剂量响应细胞毒性曲线。
图15B示出了使用HCT15-hPDL1细胞，抗体的剂量响应细胞毒性曲线。
图15C示出了使用HCT15-hPDL1细胞，ADC的响应细胞毒性曲线。
图16示出了抗体和缀合物在MDA-MB-231CDX模型中的体内抗肿瘤活性。
图17示出了使用PC3-hPDL1-hTROP2细胞，药物的剂量响应细胞毒性曲线。
图18示出了使用PC3-hPDL1-hTROP2细胞，ADC的剂量响应细胞毒性曲线。
图19示出了使用HCT15-hPDL1-hTROP2细胞，药物的剂量响应细胞毒性曲线。
图20示出了MC38-hPDL1-hTROP2小鼠同系肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性。
图21示出了PBMC-PC3-hPDL1-hTROP2 CDX模型中的体内抗肿瘤活性。
图22示出了HCT15-hPDL1-hTROP2 CDX模型中的体内抗肿瘤活性。
图23示出了HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞对不同CpG ODN-接头的响应。
图24示出了HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞对AOC的响应。
图25示出了MC38-hPDL1小鼠同系肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
本申请提供了使用包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物进行治疗或诊断的组合物和方法，其中所述效应分子通过缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可通过裂解从所述靶向缀合物释放。靶向部分特异性地识别并结合至靶标，如在患病组织或患病细胞(例如，肿瘤细胞)上表达的细胞表面分子。在靶向部分与靶标结合后，可触发靶向缀合物中的一个或多个裂解位点的裂解，其导致效应分子在靶部位处释放。在一些实施方案中，靶向缀合物是多特异性的。在一些实施方案中，靶向缀合物包含第一靶向部分和第二靶向部分，其中所述第一靶向部分和所述第二靶向部分通过缀合位点彼此融合，一个或多个效应分子缀合至所述缀合位点。例如，可通过将一个或多个scFv或scFab与单克隆抗体(例如，抗PDL1 mAb或抗Trop2 mAb)融合来设计靶向部分，所述单克隆抗体具有经证实的临床功效和安全性，以提供靶标识别的多特异性，从而提供增强的临床益处。本文所述的靶向缀合物可具有缀合至缀合位点的多于一种类型的货物(例如，寡核苷酸和小分子药物)，并且靶向部分可以是靶向肽或抗体或其抗原结合片段(包括多特异性抗体)或它们的组合。因此，与传统ADC相比，本文所述的靶向缀合物可具有增强的选择性靶标识别能力和功效。将多个缀合位点和不同类型的货物并入到一种靶向缀合物上为更有效的治疗效果开辟了潜力。寡核苷酸与其他治疗剂(例如，小分子药物)的组合的可能性扩展了本文所述的靶向缀合物可靶向的疾病的范围。
因此，本申请的一个方面提供了一种包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子通过缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可通过裂解从所述靶向缀合物释放。在一些实施方案中，裂解在细胞外发生。在一些实施方案中，靶向缀合物包含式(I)的结构，其中x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20。
还提供了用于上述方法中任一种的组合物、药盒和制品。
I.定义
术语在本文中如本领域通常使用的那样使用，除非在以下另外定义。
如本文所用的术语“靶向部分”是指特异性地结合至靶分子的基于多肽的结合分子，或其有助于特异性结合的部分。基于抗体的和基于非抗体的结合分子或其部分均在本文中考虑。
如本文所用的术语“治疗剂”是指具有治疗效果的分子。治疗剂可以是任何合适的分子实体，寡核苷酸除外。
如本文所用的术语“效应分子”是指可用于治疗和/或诊断目的的分子。示例性效应分子包括但不限于治疗剂、诊断标记和寡核苷酸。
术语“缀合”是指通过一个或多个共价键或非共价键将两个化学基团或部分化学连接在一起。缀合可以是两个化学基团或部分之间的直接缀合，或通过桥接两个化学基团或部分的第三化学基团或部分(例如，接头)间接缀合。
术语“缀合位点”是指直接连接两个化学部分的位点。
术语“抗体”以其最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要其展现所需抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。抗体和/或抗原结合片段可源自鼠类抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化型式、鲨鱼抗体可变结构域和人源化型式以及骆驼化抗体可变结构域。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常含有被称为互补决定区(CDR)的三个高度可变的环(轻链(LC)CDR，包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；重链(HC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可由Kabat、Chothia或Al-Lazikani惯例(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia1989；Kabat1987；Kabat 1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR被间插在称为框架区(FR)的侧翼区段之间，所述框架区比CDR更高度保守，并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别被分为亚类，诸如lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫化物稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至亲本抗体或亲本抗体片段(例如，亲本scFv)所结合的相同抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含被移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。
“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由处于紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(从重链和轻链各自产生3个环)，所述高变环促成用于抗原结合的氨基酸残基并且将抗原结合特性赋予给抗体。然而，虽然亲和力比整个结合位点低，但即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的一半Fv)也能够识别并结合抗原。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”是包含连接成单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scFv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见Plückthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意图是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.of Health and HumanServices,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273：927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45：3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27：55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体或其接枝抗体或变体的CDR意图处于如本文所定义和使用的术语的范围内。CDR预测算法和接口是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45：3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res.,38：D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic AcidsRes.,43：D432-D438(2015)。此段落中引用的参考文献的内容以引用的方式整体并入本文以供在本申请中使用并且可能包含在本文的一项或多项权利要求中。在一些实施方案中，本文提供的CDR序列是基于IMGT定义。例如，CDR序列可由VBASE2工具确定(www.vbase2.org/vbase2.php，还参见Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W：VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(Databaseissue)：D671-4，其以引用的方式整体并入本文)。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于以下中的一项或多项：减少由疾病引起的一种多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播、预防或延迟疾病的发生或复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高生活质量和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少疾病的病理后果。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用以描述哺乳动物，包括人。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体患有疾病或疾患(例如，癌症)。在一些实施方案中，个体需要治疗。
如本领域所理解的，“有效量”是指足以产生所需治疗结果(例如降低癌症的一种或多种症状的严重程度或持续时间、使癌症的一种或多种症状的严重程度稳定或消除癌症的一种或多种症状)或所需诊断结果的剂(例如，靶向缀合物)的量。对于治疗用途，有益或所需结果包括例如，减少由疾病引起的一种或多种症状(生化、组织学和/或行为)，包括在疾病发展过程中呈现的其并发症和中间病理表型、提高患有疾病的那些患者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、增强另一种药物的作用、延迟疾病的进展和/或延长患者的存活期。在一些实施方案中，有效量的剂可延长存活期(包括总体存活期和无进展存活期)；产生客观应答(包括完全应答或部分应答)；在某种程度上减轻疾病或疾患的一种或多种体征或症状；和/或改善受试者的生活质量。
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所比较的多肽中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的比对可以以在本领域技术人员的能力内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE产生氨基酸序列同一性值％(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
氨基酸取代可包括但不限于多肽中的一个氨基酸被另一氨基酸置换。示例性取代显示于表1中。可将氨基酸取代引入至目标抗体中，并且关于所需活性(例如保留/改善的抗原结合性、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)来筛选产物。
表1：示例性氨基酸取代.
可根据共同的侧链性质对氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员更换成另一类别。
术语“多肽”或“肽”在本文中用于涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白和经修饰的蛋白质，包括但不限于糖蛋白，以及所有其他类型的经修饰的蛋白质(例如，由磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等产生的蛋白质)。
术语“融合”是指遗传上连接两个多肽片段以提供单个连续多肽(“融合多肽”)。两个多肽片段可直接彼此连接，或通过位于其间的另一个多肽连接。常规重组DNA技术或化学基因合成可用于提供遗传编码融合多肽的核酸。
如本文所用的术语“表位”是指抗体所结合的抗原上的特定原子或氨基酸组。如果两个抗体或抗原结合片段表现出对抗原的竞争性结合，则它们可结合抗原内的同一表位。
如本文所用，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”和“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与靶向部分(例如，靶向肽或抗体或其抗原结合片段)之间的结合。在某些实施方案中，特异性结合决定在异质分子群体，包括生物分子(例如，细胞表面受体)存在下靶标的存在。例如，特异性地识别靶标(其可以是表位)的靶向部分是与其与其他分子的结合相比，以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合此靶标的抗体。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，靶向部分与无关分子的结合程度小于靶向部分与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性地结合靶标的靶向部分具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合蛋白质上的表位，所述表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。可通过本领域已知的方法通过实验方式测定靶向部分的结合特异性。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM和肽扫描。
如本文所用，“连接(link)”、“缀合(conjugate)”、“连接(ligate)”和“融合(fuse)”可互换使用来指两个化学部分共价或非共价连接。连接可以是直接的或间接的，例如通过接头。
术语“药物组合物”是指以下制剂：其呈允许其中所含的活性成分的生物活性有效的形式，且不含对将施用制剂的受试者具有不可接受毒性的另外组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的一种或多种成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、冷冻保护剂、张度剂、防腐剂以及它们的组合。药学上可接受的载体或赋形剂优选地符合毒理学和生产测试所要求的标准，和/或包括在由美国食品与药品管理局或其他州/联邦政府制定的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中，或在美国药典或其他公认药典中列出的用于在哺乳动物中，并且更具体地在人类中使用。
术语“包装插页(package insert)”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明，其含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或疾患(例如，癌症)的药物，或用于特异性地检测本文所述的生物标志物的探针的任何制品(例如，包装或容器)或药盒。在某些实施方案中，制品或药盒呈用于执行本文所述的方法的单位被推广、分发或销售。
应理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
本文中对“约”某一值或参数的提及包括(以及描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文中所用，提及“非”某一值或参数通常意指并描述“除某一值或参数外”。举例来说，方法不用于治疗X类型的疾病意指方法用于治疗除X以外的类型的疾病。
本文所用的术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同含义。
除非上下文明确地另有说明，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”或“所述”包括复数个指代物。
如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，如本文在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
II.靶向缀合物
本申请的一个方面提供了一种包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子通过缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可通过裂解从所述靶向缀合物释放。裂解可在患病部位，例如在肿瘤微环境中发生。在一些实施方案中，裂解在细胞外，如肿瘤微环境中的肿瘤细胞外发生。
在一些实施方案中，提供了包含式I的结构的靶向缀合物：
其中：A1是第一靶向部分；A2是第二靶向部分；P1是第一裂解位点；P2是第二裂解位点；P3是第三裂解位点；C是缀合位点；L是接头；D是效应分子；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1，v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20。
示例性靶向缀合物示于图1A-10C中，并在下文部分E“示例性靶向缀合物”中进行了描述。
本申请的靶向部分(A1)缀合至一个或多个效应分子(D)，所述效应分子可以是治疗剂、寡核苷酸、可检测标记以及它们的组合。在一些实施方案中，效应分子通过接头(L)在缀合位点(C)缀合至靶向部分。在一些实施方案中，效应分子在缀合位点(C)直接缀合至靶向部分而没有接头(L)。在一些实施方案中，裂解位点(P1，例如蛋白酶裂解位点)位于缀合位点(C)与效应分子(D)之间。在一些实施方案中，没有裂解位点(P1，例如蛋白酶裂解位点)位于缀合位点(C)与效应分子(D)之间。在一些实施方案中，靶向缀合物包含第二靶向部分(A2)。在一些实施方案中，第二靶向部分(A2)通过裂解位点(P2，例如蛋白酶裂解位点)融合至缀合位点(C)。在一些实施方案中，没有裂解位点(P2，例如蛋白酶裂解位点)位于第二靶向部分(A2)与缀合位点(C)之间。在一些实施方案中，效应分子(D)通过裂解位点(P3，例如蛋白酶裂解位点)融合至接头。在一些实施方案中，没有裂解位点(P3，例如蛋白酶裂解位点)位于接头(L)与效应分子(D)之间。
在一些实施方案中，提供了包含式I的结构的靶向缀合物：
其中：A1是第一抗体或其抗原结合片段；A2是第二抗体或其抗原结合片段；P1是第一裂解位点(例如蛋白酶裂解位点，如uPA裂解位点)；P2是第二裂解位点(例如蛋白酶裂解位点，如uPA裂解位点)；P3是第三裂解位点(例如蛋白酶裂解位点，如uPA裂解位点)；C是缀合位点(例如，转谷氨酰胺酶缀合位点)；L是接头；D是效应分子(例如，治疗剂、寡核苷酸或可检测标记)；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20。在一些实施方案中，A1是特异性地结合至免疫检查点分子如PD-L1的抗体或抗原结合片段(例如，全长抗体)。在一些实施方案中，A2是特异性地结合至肿瘤抗原如TROP-2的抗体或抗原结合片段(例如，全长抗体)。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含：抗PD-L1抗体的第一重链、第一转谷氨酰胺酶缀合位点和抗TROP2抗体的第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(b)第二多肽链，所述第二多肽链包含：所述抗PD-L1抗体的第二重链、第二转谷氨酰胺酶缀合位点和抗TROP2抗体的第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(c)包含所述抗PD-L1抗体的第一轻链的第三多肽链；(d)包含所述抗PD-L1抗体的第二轻链的第四多肽链；(e)通过第一接头缀合至所述第一转谷氨酰胺酶缀合位点的第一效应分子；以及(f)通过第二接头缀合至所述第二转谷氨酰胺酶缀合位点的第二效应分子。在一些实施方案中，第一多肽链从N末端至C末端包含：抗PD-L1抗体的第一重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第一转谷氨酰胺酶缀合位点、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和抗TROP2抗体的第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；并且第二多肽链从N末端至C末端包含：所述抗PD-L1抗体的第二重链、第三蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第二转谷氨酰胺酶缀合位点、第四蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和所述抗TROP2抗体的第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端各自包含：抗PD-L1抗体的重链、蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、转谷氨酰胺酶缀合位点和抗TROP2抗体的抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端各自包含：抗PD-L1抗体的重链、转谷氨酰胺酶缀合位点、蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和抗TROP2抗体的抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端各自包含：抗PD-L1抗体的重链、转谷氨酰胺酶缀合位点和抗TROP2抗体的抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)。在一些实施方案中，第一效应分子和第二效应分子相同。在一些实施方案中，第一效应分子和第二效应分子不同。在一些实施方案中，第一效应分子(包括第一接头)和/或第二效应分子(包括第二接头)是选自SN38、MMAE以及它们的衍生物的治疗剂，例如式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，第一效应分子和/或第二效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：66-67组成的组的核酸序列。在一些实施方案中，第一效应分子和/或第二效应分子是可检测标记。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一转谷氨酰胺酶缀合位点和/或第二转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，第一转谷氨酰胺酶缀合位点和/或第二转谷氨酰胺酶缀合位点包含选自由SEQ ID NO：1-12组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和/或第二蛋白酶裂解位点包含选自由SEQ ID NO：50-55组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与选自由SEQ ID NO：114、116、118、120、122、124、126和128组成的组的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％或100％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，第三多肽和/或第四多肽包含与选自由SEQ ID NO：115、117、119、121、123、125、127和129组成的组的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％或100％中的任一个)序列同一性。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链，所述第一多肽链从N末端至C末端包含：抗PD-L1抗体的第一重链和第一转谷氨酰胺酶缀合位点；(b)第二多肽链，所述第二多肽链从N末端至C末端包含：所述抗PD-L1抗体的第二重链和第二转谷氨酰胺酶缀合位点；(c)包含所述抗PD-L1抗体的第一轻链的第三多肽链；(d)包含所述抗PD-L1抗体的第二轻链的第四多肽链；(e)通过第一接头缀合至所述第一转谷氨酰胺酶缀合位点的第一效应分子；以及(f)通过第二接头缀合至所述第二转谷氨酰胺酶缀合位点的第二效应分子。在一些实施方案中，第一多肽链从N末端至C末端包含：抗PD-L1抗体的第一重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第一转谷氨酰胺酶缀合位点；并且第二多肽链从N末端至C末端包含：所述抗PD-L1抗体的第二重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第二转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端各自包含：抗PD-L1抗体的第一重链和第一转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，第一效应分子和第二效应分子相同。在一些实施方案中，第一效应分子和第二效应分子不同。在一些实施方案中，第一效应分子(包括第一接头)和/或第二效应分子(包括第二接头)是选自SN38、MMAE以及它们的衍生物的治疗剂，例如式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，第一效应分子和/或第二效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：66-67组成的组的核酸序列。在一些实施方案中，第一效应分子和/或第二效应分子是可检测标记。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一转谷氨酰胺酶缀合位点和/或第二转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，第一转谷氨酰胺酶缀合位点和/或第二转谷氨酰胺酶缀合位点包含选自由SEQID NO：1-12组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点和/或第二蛋白酶裂解位点包含选自由SEQ ID NO：50-55组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是德瓦鲁单抗、阿特珠单抗或它们的衍生物。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与选自由SEQ ID NO：100、102、104、106、108、110和112组成的组的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％或100％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，第三多肽和/或第四多肽包含与选自由SEQ ID NO：101、103、105、107、109、111和113组成的组的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％或100％中的任一个)序列同一性。
在一些实施方案中，靶向缀合物可包含任何合适数量的效应分子(D)、缀合位点(C)、蛋白酶裂解位点(P1、P2和P3)和接头(L)。在一些实施方案中，缀合位点C的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方案中，效应分子(D)的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点P1的数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方案中，第二蛋白酶裂解位点P2的数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方案中，第三蛋白酶裂解位点P3的数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。在一些实施方案中，接头L的数量可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任一个。
靶缀合物可包含下文描述的部分A-D中描述的靶向部分、效应分子、缀合位点、裂解位点(例如，蛋白酶裂解位点)和接头中的任一者。
在一些实施方案中，靶向缀合物包含单个效应分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含多个效应分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含效应分子的单个分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含两个或更多个相同的效应分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含两个或更多个不同的效应分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含每个效应分子的单个拷贝。在一些实施方案中，靶向缀合物包含每个效应分子的两个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，靶向缀合物具有高药物药物载量。术语“药物载量”是指靶向缀合物中效应分子的数量与靶向部分(例如，抗体或其抗原结合片段)之间的比率。例如，缀合至总计8个效应分子的抗体的药物载量为8。靶向缀合物的每个分子具有整数值的药物载量。然而，在组合物中，靶向缀合物的不同分子可具有不同值的药物载量。因此，组合物可具有整数值或非整数值的平均药物载量。
在一些实施方案中，靶向缀合物具有至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、17:1、18:1、19:1或20:1中的任一个的效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，靶向缀合物具有不超过约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1中的任一个的效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，靶向缀合物具有约1:1-2:1、2:1-4:1、4:1-8:1、1:1-10:1、1:1-16:1、4:1-20:1、10:1-20:1、1:1-20:1或2:1-20:1中的任一个的效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。
在一些实施方案中，靶向缀合物的药物载量是至少约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或更大中的任一个。在一些实施方案中，靶向缀合物的药物载量是不超过约100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1中的任一个。在一些实施方案中，靶向缀合物的药物载量是约2:1-4:1、2:1-8:1、2:1-10:1、2:1-16:1、4:1-20:1、10:1-20:1、20:1-40:1、40:1-100:1、2:1-20:1、2:1-40:1或10:1-40:1中的任一个。
在一些实施方案中，靶向缀合物具有至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、17:1、18:1、19:1或20:1中的任一个的寡核苷酸与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，靶向缀合物具有不超过约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1中的任一个的寡核苷酸与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，靶向缀合物具有约1:1-2:1、2:1-4:1、4:1-8:1、1:1-10:1、1:1-16:1、4:1-20:1、10:1-20:1、1:1-20:1或2:1-20:1中的任一个的寡核苷酸与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。
还提供了制备靶向缀合物的方法，所述方法包括将效应分子缀合至靶向部分。
A.靶向部分
本申请的靶向缀合物包含一个或多个靶向部分。在一些实施方案中，靶向缀合物包含特异性地结合至第一靶分子的第一靶向部分、特异性地结合至第二靶分子的第二靶向部分和缀合位点，其中所述第一靶向部分通过所述缀合位点融合至所述第二靶向部分。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分相同。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分不同。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分特异性地结合至相同的靶向分子。在一些实施方案中，第一靶向部分和第二靶向部分特异性地结合至不同的靶向分子。在一些实施方案中，裂解位点(例如，蛋白酶裂解位点)位于第一靶向部分与缀合位点之间。在一些实施方案中，裂解位点(例如，蛋白酶裂解位点)位于第二靶向部分与缀合位点之间。
抗体或其抗原结合片段
在一些实施方案中，靶向部分包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶部分是包含抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。在一些实施方案中，靶向部分是单克隆抗体。在一些实施方案中，靶向部分是全长抗体。在一些实施方案中，靶向部分是抗原结合片段。示例性抗原结合片段包括但不限于单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、单结构域抗体(例如，VHH)、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双抗体、三抗体和四抗体。
在一些实施方案中，靶向部分包含scFv。在一些实施方案中，scFv从N末端至C末端包含：VL-VH，其中破折号是键或肽接头。在一些实施方案中，scFv从N末端至C末端包含：VH-VL，其中破折号是键或肽接头。在一些实施方案中，靶向部分是包含scFv的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是scFv-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是scFv-Fv融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是scFv-全长抗体融合蛋白。在一些实施方案中，scFv的N末端共价融合至全长抗体的重链或轻链的C末端。
在一些实施方案中，靶向部分是Fab或Fab’。在一些实施方案中，靶向部分是含有Fab的多肽，其可包含野生型铰链序列(通常在多肽的Fab部分的羧基末端)的部分或全部。含有Fab的多肽可获自或源自任何合适的免疫球蛋白。在一些实施方案中，含有Fab的多肽可以是Fab-融合蛋白，其将Fab片段与融合配偶体组合，所述融合配偶体如受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子，趋化因子或一些其他蛋白质或蛋白质结构域。在一些实施方案中，靶向肽是靶蛋白的结构域或部分。
在一些实施方案中，靶向部分包含纳米抗体，也称为单结构域抗体(sdAb)。示例性sdAb包括但不限于来自仅重链抗体(例如，VHH或VNAR)的重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4链抗体的单结构域(如VH或VL)、仅人源化重链抗体、由表达人重链区段的转基因小鼠或大鼠产生的人sdAb、以及除源自抗体的那些以外的工程化结构域和单结构域支架。在一些实施方案中，靶向部分包含VHH。
在一些实施方案中，靶向部分包含多特异性抗体。在一些实施方案中，靶向部分是多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。示例性双特异性抗体包括全长和Fab 2构建体，以及双抗体。在一些实施方案中，双抗体是通过肽接头连接的单链Fv(scFv)片段的非共价二聚体。在一些实施方案中，另一种形式的双抗体是单链(Fv)，其中两个scFv片段彼此共价连接。在一些实施方案中，多特异性抗体是三特异性抗体。示例性三特异性抗体包括Fab3和三抗体，后者是双抗体的三-scFv型式。在一些实施方案中，scFv-Fc由融合至完整Fc区的两个连接的单链可变片段组成。在一些实施方案中，微型抗体类似于scFv-Fc，但仅含有CH1结构域而不是完整Fc区。其他多价构建体包括IgNAR和hcIgG。
在一些实施方案中，靶向部分是嵌合、人、部分人源化、完全人源化或半合成抗体。抗体和/或抗体片段可源自鼠类抗体、兔抗体、人抗体、完全人源化抗体、骆驼科动物抗体可变结构域和人源化型式、鲨鱼抗体可变结构域和人源化型式以及骆驼化抗体可变结构域。在一些实施方案中，靶向部分是拮抗剂抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向部分是激动剂抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含一个或多个抗体恒定区，如人抗体恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区具有选自IgA、IgG、IgD、IgE和IgM的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG恒定区，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。在一些实施方案中，当效应子功能合乎需要时，可选择包含人IgG1重链恒定区或人IgG3重链恒定区的抗体。在一些实施方案中，当效应子功能不合乎需要时，可选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的抗体。在一些实施方案中，抗体包含人IgG4重链恒定区。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含稳定化结构域。在一些实施方案中，稳定化结构域包含Fc结构域。术语“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端非抗原结合区。所述术语包括天然Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，Fc结构域选自由以下组成的组：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM以及它们的组合和杂合体的Fc片段。在一些实施方案中，Fc结构域源自人IgG。在一些实施方案中，Fc结构域包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或组合或杂合IgG的Fc结构域。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc结构域相比，Fc结构域具有降低的效应子功能(如通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)水平所测量，如降低至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的效应子功能)。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。在一些实施方案中，靶向部分包含与野生型IgG或野生型抗体的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代的变体Fc区。
抗体可由两条相同的轻蛋白质链(轻链)和两条相同的重蛋白质链(重链)组成，它们全部通过链间二硫键链共价连接在一起。轻链和重链的N末端区域一起可形成抗体的抗原识别位点。在结构上，抗体的各种功能可局限于离散的蛋白质结构域或区域。在一些实施方案中，抗体包含抗原结合部分，所述抗原结合部分包含含有VH的重链和含有VL的轻链。包括单链抗体在内的抗原结合片段可包含单独的或与以下的整体或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。
在一些实施方案中，改变抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。向抗体添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使得产生或除去一个或多个糖基化位点来便利地实现。在一些实施方案中，改变抗体以提高或降低抗体上的反应性官能团的反应性。在一些实施方案中，改变抗体以增加或减少反应性官能团的数量。在一些实施方案中，改变抗体以提高或降低反应性官能团暴露的程度。反应性官能团可位于抗体的N末端、C末端或氨基酸的侧链中。反应性官能团可天然存在于抗体中或并入。反应性官能团可以是胺或其衍生物、羧基或其衍生物、硝基或其他官能团。在一些实施方案中，反应性官能团是胺。在一些实施方案中，胺位于抗体的Fc区中。
可使用本领域已知的方法获得特异性地结合至靶分子的抗体，如通过免疫非人哺乳动物并从其获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆抗体文库和后续选择或使用噬菌体展示。还提供了编码本文所述的任一种抗体或抗原结合片段的核酸构建体、载体和用于制备的宿主细胞。
靶向肽
在一些实施方案中，靶向部分包含靶向肽。术语“靶向肽”是指基于非抗体的多肽，其特异性地结合至靶分子，例如靶部位处的细胞表面分子。在一些实施方案中，靶向部分是融合蛋白，所述融合蛋白包含融合至靶向肽的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，靶向多肽包含非抗体支架。非抗体支架是产生针对不同种类的靶标的特异性的工程化蛋白质支架。与抗体相比，工程化蛋白质支架提供更小的尺寸和更简单的结构，其有利于重组基因表达、双功能融合蛋白的构建和组织穿透。参见例如，Skerra,Curr.Opin.Biotech.2007,18:298-304。已经报告了超过50种不同的非抗体支架。参见例如，Vazquez-Lombardi,Rodrigo,等人Drug discovery today 20.10(2015)：1271-1283。示例性非抗体支架包括但不限于脂质运载蛋白、抗运载蛋白(anticalin)(源自人脂质运载蛋白的人工抗体模拟蛋白)、‘T-体'、肽(例如，BICYCLETM肽)、亲和体(由α螺旋组成的抗体模拟物，例如三螺旋束)、肽体(肽-Fc融合物)、DARPin(设计的锚蛋白重复序列蛋白，包含重复基序的工程化的抗体模拟蛋白)、affimer、avimer、打结素(含有3个二硫桥的蛋白质结构基序)、单域抗体、亲和夹环、胞外结构域、受体胞外结构域、受体、细胞因子、配体、免疫细胞因子和中心体蛋白(centryin)。参见例如，WO2019084060，其以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，靶向部分包含抗运载蛋白。抗运载蛋白是开发较为活跃的非抗体支架之一，具有大量处于临床前开发阶段的针对CTLA-4、铁调素、肝细胞生长因子受体(HGFR；MET)、IL-4Ra和IL-23/IL-17的先导化合物。PRS-050(Pieris)是靶向VEGF-A的抗血管生成抗运载蛋白，目前正在进行I期临床研究。一种靶向DARPin的VEGF-A，靶向视网膜血管生成病症的MP0112(Molecular Partners/Allergan)目前也在临床研究中进行评估。FDA批准的单一非抗体支架包括Kunitz结构域(艾卡拉肽；Dyax)，一种用于治疗遗传性血管性水肿的血浆激肽释放酶抑制剂；(CSL-Behring)和(ViroPharma/Shire)，以及缓激肽受体拮抗剂(Shire)。参见例如，Vazquez-Lombardi,Rodrigo,等人Drug discovery today 20.10(2015)：1271-1283。
在一些实施方案中，靶向肽包含源自靶分子的受体或配体的多肽。在一些实施方案中，靶向多肽是使靶分子与其配体或受体的结合完全或部分阻断，如阻断至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一个的抑制性多肽。在一些实施方案中，靶向肽的长度是至少约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个氨基酸中的任一个。
在一些实施方案中，靶向肽包含稳定化结构域。稳定化结构域可以是使靶向肽稳定的任何合适的结构域。在一些实施方案中，稳定化结构域延长靶向肽的体内半衰期。在一些实施方案中，稳定化结构域是Fc结构域，如在“抗体或其抗原结合片段”部分中描述的Fc结构域中的任一个。在一些实施方案中，稳定化结构域是白蛋白结构域。在一些实施方案中，靶向肽和稳定化结构域通过接头，如肽接头彼此融合。
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。举例来说，源自仅重链抗体的铰链区的序列可用作接头。肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供柔性。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。在一些实施方案中，肽接头包含用于酶促反应的底物序列。在一些实施方案中，肽接头包含连接靶向肽和稳定化结构域的酶的底物序列。
靶向肽可使用本领域已知的方法，如通过筛选多肽文库获得。多肽可使用化学合成制备或使用重组DNA技术产生。还提供了编码本文所述的任一种靶向肽的核酸构建体、载体和用于制备的宿主细胞。
靶分子和示例性靶向部分
靶向部分特异性地结合至一个或多个靶分子。在一些实施方案中，靶向部分是单特异性的，即特异性地结合至单个靶分子。在一些实施方案中，靶向部分是多特异性的，即特异性地结合至单个靶分子中的两个或更多个不同的靶位点或两个或更多个不同的靶分子。在一些实施方案中，靶向部分具有单个靶结合位点。在一些实施方案中，靶向部分具有两个或更多个靶结合位点。
在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合至细胞表面分子。在一些实施方案中，细胞表面分子是靶部位处的细胞表面分子。在一些实施方案中，靶部位是疾病部位。在一些实施方案中，疾病是肿瘤。在一些实施方案中，疾病是炎症性疾病。在一些实施方案中，疾病是纤维化疾病。在一些实施方案中，疾病是感染。在一些实施方案中，疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病是免疫缺陷疾病。
示例性靶分子包括但不限于蛋白质、聚糖、脂质、其他小分子或它们的组合。在一些实施方案中，细胞表面分子是肿瘤特异性标志物/肿瘤抗原。如本文所述，“肿瘤特异性标志物”或“肿瘤抗原”是指可在赘生性肿瘤细胞上和/或在肿瘤微环境中表达的分子标志物。肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原。例如，肿瘤抗原可以是在与肿瘤相关的细胞如赘生性细胞、基质细胞、内皮细胞、成纤维细胞或肿瘤浸润性免疫细胞上表达的抗原。例如，肿瘤抗原Her2/Neu可由某些类型的乳腺癌和卵巢癌过表达。肿瘤抗原也可由肿瘤异位表达并导致细胞周期失调、细胞凋亡减少、转移和/或逃避免疫监视。肿瘤抗原通常是蛋白质或源自其的多肽，但也可以是聚糖、脂质或其他有机小分子。此外，肿瘤抗原可通过与正常细胞相比，癌细胞所表现出的翻译后加工的增加或减少而产生，所述翻译后加工例如蛋白质糖基化、蛋白质脂化、蛋白质磷酸化或蛋白质乙酰化。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面碳水化合物。在一些实施方案中，细胞表面碳水化合物是单糖。在一些实施方案中，细胞表面聚糖是寡糖。在一些实施方案中，细胞表面碳水化合物是多糖。在一些实施方案中，细胞表面碳水化合物是聚糖。在一些实施方案中，细胞表面碳水化合物是糖缀合物，如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖。在一些实施方案中，细胞表面聚糖选自由以下组成的组：GD2、GD3、GM2、Ley、sLe、聚唾液酸、岩藻糖基GM1、Tn、STn、BM3或GloboH。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是细胞表面蛋白。在一些实施方案中，细胞表面蛋白选自由以下组成的组：CD5、CD19、CD20、CD25、CD37、CD30、CD33、CD45、CAMPATH-1、BCMA、CS-1、PD-1、PD-Ll、B7-H3、B7-DC(PD-L2)、HLA-DR、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、MUC1、MUC15、MUC16、叶酸结合蛋白、A33、G250、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CA-125、CA19-9、表皮生长因子、HER2、IL-2受体、EGFRvIII(de2-7 EGFR)、EGFR、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、腱生蛋白、金属蛋白酶、内皮唾液酸蛋白、血管内皮生长因子、avβ3、WT1、LMP2、HPV E6、HPV p53非突变体、NY-ESO-1、GLP-3、MelanA/MARTl、Ras突变体、gpl00、p53突变体、PRI、bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、PSA、hTERT、STNI、TNC、肉瘤易位断点融合蛋白、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、ERG、NAI7、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、间皮素(MSLN)、PSCA、MAGEAl、MAGE-A3、CYPIBI、PLAVI、BORIS、Tn、ETV6-AN1L、NY-BR-1、RGS5、SART3、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TESI、精子蛋白17、LCK、MAGE C2、MAGE A4、GAGE、TRAILI、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 3、PAGE4、VEGFR2、MAD-CTI、PDGFR-B、MAD-CT-2、ROR2、CMET、HER3、EPCAM、CA6、NAPI2B、TROP2、密封蛋白-6(CLDN6)、密封蛋白-16(CLDN16)、CLDN18.2、RON、LY6E、FRA、DLL3、PTK7、尿溶蛋白-IB(UPKIB)、LIVI、RORI、STRA6、TMPRSS3、TIV1PRSS4、TIV1EM238、Clorf186、Fos相关抗原1、VEGFRI、内皮糖蛋白、VTCNI(B7-H4)、VISTA以及它们的片段。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、Trop2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、CD40、OX40、CD47、SIRPα、HER2、HER3、EGFR、VEGF、VEGR2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD79、整联蛋白αvβ3、αvβ6、MUC1、PMSA、uPAR和Angiopep-2。在一些实施方案中，肿瘤靶抗原是Trop2。Trop-2，也称为上皮糖蛋白-1、胃肠抗原733-1、膜组分表面标志物-1和肿瘤相关钙信号转导蛋白-2，是TACSTD2基因的蛋白质产物。Trop-2是不依赖于Trop-2表达的基线水平在所有癌症类型中上调的跨膜糖蛋白。Trop-2是靶向治疗剂的理想候选物，这是由于它是具有在多种肿瘤中过表达的细胞外结构域的跨膜蛋白以及其相对于正常细胞的上调表达。参见例如，Onco Targets Ther.2019；12：1781–1790。
在一些实施方案中，靶分子与纤维化或炎症性疾病相关。在一些实施方案中，靶分子选自由以下组成的组：钙粘蛋白11、PDPN、LRRC15、整联蛋白a、4f37、整联蛋白a2f31、MADCAM、肾小球足细胞特异性蛋白(Nephrin)、肾小球足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)、IFNARI、BDCA2、CD30、c-KIT、FAP、CD73、CD38、PDGFRf3、整联蛋白avf31、整联蛋白avf33、整联蛋白avf38、GARP、内皮液唾酸蛋白、CTGF、整联蛋白avf36、CD40、PD-1、TIM-3、TNFR2、DEC205、DCIR、CD86、CD45RB、CD45RO、MHC II类、CD25、LRRC15、MMP14、GPX8和F2RL2。
在一些实施方案中，靶分子与感染或免疫缺陷疾病相关。在一些实施方案中，靶分子是传染因子的蛋白质，如致病细菌或病毒。
在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合至免疫检查点蛋白。免疫检查点蛋白调控免疫激活。然而，一些癌症可通过刺激免疫检查点靶标来保护它们自己免受攻击。参见例如，Nature Reviews.Cancer.12(4)：252–64。抑制性检查点分子是癌症免疫疗法的靶标，因为它们具有用于多种类型的癌症的潜力。在一些实施方案中，靶向部分包含免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂是抑制免疫系统的控制机制的活性的化合物。免疫系统检查点或免疫检查点是免疫系统中通常用于维持自我耐受或调节生理免疫应答的持续时间和幅度以使附带组织损伤最小化的抑制途径。免疫检查点抑制剂可通过刺激刺激性检查点分子的活性或抑制途径中的抑制性检查点分子的活性来抑制免疫系统检查点。免疫系统检查点分子包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1蛋白(PD-1)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡1配体2(PD-L2)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、B7-1、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(TIM3)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、含V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞激活抑制因子(VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和A2A腺苷受体(A2aR)。因此，免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、B7-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、VISTA、KIR、A2aR和TIM3的拮抗剂。例如，结合至CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、B7-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、VISTA、KIR、A2aR或TIM3并拮抗它们的功能的抗体是免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，靶向部分包含特异性地结合至免疫检查点分子的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体源自本领域中已知的任何抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体包括但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗(imfinzi)、BGB-A333、SHR-1316(HTI-1088)、CK-301、BMS-936559、恩沃利单抗(KN035、ASC22)、CS1001、MDX-1105(BMS-936559)、LY3300054、STI-A1014、FAZ053、CX-072、INCB086550、GNS-1480、CA-170、CK-301、M-7824、HTI-1088(HTI-131、SHR-1316)、MSB-2311、AK-106、AVA-004、BBI-801、CA-327、CBA-0710、CBT-502、FPT-155、IKT-201、IKT-703、10-103、JS-003、KD-033、KY-1003、MCLA-145、MT-5050、SNA-02、BCD-135、APL-502(CBT-402或TQB2450)、IMC-001、KD-045、INBRX-105、KN-046、IMC-2102、IMC-2101、KD-005、IMM-2502、89Zr-CX-072、89Zr-DFO-6E11、KY-1055、MEDI-1109、MT-5594、SL-279252、DSP-106、Gensci-047、REMD-290、N-809、PRS-344、FS-222、GEN-1046、BH-29xx、FS-118、它们的生物仿制药以及它们的衍生物。在一些实施方案中，也可使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合至PD-L1的抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是本文所述的任一种抗PD-L1抗体的衍生物。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体源自选自由以下组成的组的抗体：德瓦鲁单抗、阿特珠单抗和阿维鲁单抗。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体源自德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，靶向部分与德瓦鲁单抗竞争性地结合至相同或基本相同的表位。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含VH和VL，其中所述VH包含：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR H1、包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的CDR H2和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的CDR H3；并且其中所述VL包含：包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR L1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的CDR L2和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR L3。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO 84:的氨基酸序列；和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体源自阿特珠单抗。在一些实施方案中，靶向部分与阿特珠单抗竞争性地结合至相同或基本相同的表位。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含VH和VL，其中所述VH包含：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR H1、包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR H2和包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR H3；并且其中所述VL包含：包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR L1、包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR L2和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR L3。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列；和/或轻链，所述轻链包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列。
在一些实施方案中，靶向部分包含本文所述的靶向部分的变体。例如，抗体的变体可包含说明性抗体(“亲本抗体”)的氨基酸序列的一个或多个修饰，同时保留亲本抗体氨基酸序列的总体分子结构。可修饰亲本抗体链的任何区的氨基酸序列，如框架区、CDR区或恒定区。修饰的类型包括亲本抗体的一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或它们的组合。在一些实施方案中，抗体变体包含与亲本抗体的相应CDR具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％中的任一个)序列同一性的CDR(例如，CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2或CDR L3)。在一些实施方案中，抗体变体包含VH，所述VH包含与亲本抗体的VH至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％中的任一个)同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体变体包含VL，所述VL包含与亲本抗体的VL至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％中的任一个)同一的氨基酸序列。在一些特定实施方案中，抗体变体包含对如亲本抗体的VH、VL、重链或轻链中的任一者中所列的氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守或非保守取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个添加和/或缺失。
在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合至钙信号转导蛋白。细胞内钙信号转导蛋白参与细胞信号传导、迁移、增殖和分化。已经表明，细胞内钙信号转导蛋白通过其上调各种原癌基因和细胞周期相关途径的能力而具有致癌潜力。在一些实施方案中，细胞内钙信号转导蛋白是肿瘤相关钙信号转导蛋白。肿瘤相关钙信号转导蛋白是癌症免疫疗法的靶标，因为它们在多种类型的癌症中差异表达。在一些实施方案中，靶向部分特异性地结合至肿瘤相关钙信号转导蛋白2(Trop-2)。
Trop-2也称为滋养细胞表面抗原2、M1S1、GA733-1、EGP-1或TACSTD2。Trop-2是最初在人胎盘滋养细胞中发现并且随后被发现在大多数人类癌症中高表达、但在正常成人组织中仅显示受限或有限表达的细胞表面糖蛋白。参见例如，Varughese等人,GynecologicOncology,122:171-177,2011。不受任何理论或假设束缚，Trop-2参与多种细胞信号传导途径，其中许多与肿瘤发生相关。例如，在甲状腺癌细胞侵袭中，Trop-2信号转导被视为ERK和JNK途径的下游效应。Stoyanova等人证明Trop-2信号传导增强癌细胞的干细胞样性质，因为Trop-2通过b-连环蛋白信号传导调控增殖和自我更新。据推测，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)可调控Trop-2磷酸化和钙信号转导，因为Trop-2的细胞质结构域含有与蛋白激酶C磷酸化位点重叠的PIP2结合序列。参见例如，Zaman等人,Onco Targets Ther.2019；12：1781–1790。Trop-2已显示在肿瘤进展和转移中发挥作用。参见例如，Lin等人,EMBO MolMed.2012年6月；4(6):472-85。已显示Trop-2的表达水平升高预示着包括前列腺癌在内的癌症复发。参见例如，Hsu等人,PNAS,2020；117(4):2032-2042。由于Trop-2在多种癌症中过表达，所以它已成为有前景的治疗靶标。沙西妥珠单抗戈维替康(IMMU-132)是与SN-38(一种靶向DNA复制的细胞毒性剂)缀合的抗Trop2抗体，已在多种恶性肿瘤，包括三阴性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌和转移性铂耐药尿路上皮癌中显示出治疗活性。
在一些实施方案中，靶向部分包含抗Trop-2抗体或其片段。在一些实施方案中，靶向部分包含抗Trop-2scFv。在一些实施方案中，靶向部分包含抗Trop-2scFab。在一些实施方案中，靶向部分包含抗Trop-2纳米抗体。抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体可源自本领域已知的任何抗Trop-2抗体。示例性抗Trop-2抗体包括但不限于hRS7、162-46.2、MAB650、K5-70、K5-107、K5-116-2-1、T6-16、T5-86、BR110、3E9、6G11、7E6、15E2、18B1、77220、KM4097、KM4590、A1、A3、162-25.3以及由杂交瘤AR47A6.4.2、AR52A301.5、PTA-12871、PTA-12872、PD08019、PD 08020和PD 08021产生的抗体、它们的生物仿制药以及它们的衍生物。在一些实施方案中，也可使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合至Trop-2的抗体。在一些实施方案中，抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体是本文所述的任一种抗Trop-2抗体的衍生物。在一些实施方案中，抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体源自由hRS7、162-46.2和MAB650组成的组。在一些实施方案中，抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体源自hRS7。
在一些实施方案中，抗Trop-2抗体(例如，scFv、scFab或纳米抗体)源自hRS7。参见例如，美国专利号7,238,785。在一些实施方案中，靶向部分与hRS7竞争性地结合至相同或基本相同的表位。在一些实施方案中，抗Trop-2抗体(例如，scFv或scFab)包含VH和VL，其中所述VH包含：包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDR H1、包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDR H2和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的CDR H3；并且其中所述VL包含：包含SEQID NO:137的氨基酸序列的CDR L1、包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDR L2和包含SEQID NO:139的氨基酸序列的CDR L3。在一些实施方案中，抗Trop-2抗体(例如，scFv或scFab)包含VH，所述VH包含SEQ ID NO：140的氨基酸序列；和/或VL，所述VL包含SEQ ID NO：141、142或143的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗Trop-2scFv包含SEQ ID NO：131、132或133。在一些实施方案中，抗Trop-2scFab包含SEQ ID NO：130。
在一些实施方案中，靶向部分是多特异性抗体，所述多特异性抗体包含融合至选自由scFv、scFab和纳米抗体组成的组的抗原结合片段的全长抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体包含融合至抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体的全长抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体的重链的C末端融合至抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体的N末端。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体的轻链的C末端融合至抗Trop-2scFv、scFab或纳米抗体的N末端。在一些实施方案中，靶向部分包含本文所述的任一种抗PD-L1抗体。
B.效应分子
靶向缀合物包含一个或多个效应分子。示例性效应分子包括但不限于治疗剂、寡核苷酸和可检测标记。靶向缀合物可包含单一类型的效应分子或不同类型的效应分子。在一些实施方案中，靶向缀合物包含一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，靶向缀合物包含一种或多种寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向缀合物包含一种或多种可检测标记。在一些实施方案中，靶向缀合物包含治疗剂和寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向缀合物包含可检测标记和治疗剂。在一些实施方案中，靶向缀合物包含可检测标记和寡核苷酸。
在一些实施方案中，靶向缀合物包含第一效应分子和第二效应分子。在一些实施方案中，第一效应分子(例如，治疗剂)与第二效应分子(例如，寡核苷酸)之间的比率是至少约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1中的任一个。在一些实施方案中，第一效应分子(例如，治疗剂)与第二效应分子(例如，寡核苷酸)之间的比率不超过约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10中的任一个。在一些实施方案中，第一效应分子(例如，治疗剂)与第二效应分子(例如，寡核苷酸)之间的比率是约1:10至10:1、1:9至约9:1、1:8至8:1、1:7至7:1、1:6至6:1、1:5至5:1、1:4至4:1、1:3至3:1、1:2至2:1、1:10至1:5、1:5至1:1、1:1至5:1、5:1至5:10中的任一个。
治疗剂
在一些实施方案中，效应分子是治疗剂。示例性治疗剂包括但不限于药物、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂、化学治疗剂等。在一些实施方案中，治疗剂是小分子药物。在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。
可根据本发明的实施方案使用各种各样的化学治疗剂。“化学治疗剂”是指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些剂或药物按其在细胞内的活动模式(例如，它们是否影响细胞周期且在哪一阶段影响细胞周期)分类。或者，剂可基于其直接交联DNA、嵌入DNA中或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来进行表征。
示例性化学治疗剂包括但不限于，烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；乙酰精宁(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海绵他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺以及尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其卡奇霉素γll和卡奇霉素ωll；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁以及佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双去氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨以及氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷以及睾内酯；抗肾上腺素药，如米托坦和曲洛斯坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；德福法明；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃坡西龙；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素(rhizoxin)；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-l l)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；卡铂；丙卡巴肼；普卡霉素；吉西他滨；诺维本；法尼基蛋白转移酶抑制剂；反铂；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，治疗剂是激酶抑制剂。靶向激酶组包括受体酪氨酸激酶，例如BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-a、PDGFR-β、cKit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK；细胞质酪氨酸激酶，例如c-SRC、c-YES、Abl、JAK-2；丝氨酸/苏氨酸激酶，例如ATM、Aurora A&B、CDKs、mTOR、PKCi、PLKs、b-Raf、S6K、STK11/LKB1；和脂质激酶，例如PI3K、SKI。示例性小分子激酶抑制剂包括，例如，PHA-739358、尼洛替尼、达沙替尼和PD166326、NSC 74341 1、拉帕替尼(GW-572016)、卡奈替尼(CI-1033)、西马尼布(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索坦(SU1 1248)、索拉非尼(BAY 43-9006)和来氟米特(SU101)。关于更多信息，参见例如Zhang等人2009：Targeting cancerwith small molecule kinase inhibitors.Nature Reviews Cancer 9,28-39。”
在一些实施方案中，化学治疗剂是抗DNA修复剂。在一些实施方案中，DNA损伤修复和应答抑制剂选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、PARP抑制剂、RAD51抑制剂和选自CHCK1、ATM或ATR的DNA损伤应答激酶的抑制剂。在一些实施方案中，化学治疗剂包含拓扑异构酶抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂包含拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱和相关化合物。拓扑异构酶I(TOP1)酶在高等真核生物中必不可少，因为需要它们来松弛通过转录、复制和染色质重塑产生的DNA超螺旋。拓扑异构酶在其裂解反应期间特别容易受到拓扑异构酶I抑制剂的影响，并且在其裂解DNA时可能被抗癌药物捕获。喜树碱是从中国树喜树(Camptotheca acumate)中分离的生物碱，是一种天然产物，TOP1是其唯一细胞靶标。不受任何理论或假设束缚，喜树碱及其衍生物通过抑制TOP1活性发挥作用，导致DNA双链断裂和细胞死亡。喜树碱的衍生物已被开发用于临床使用。示例性喜树碱衍生物包括但不限于盐酸拓扑替康(Hycamtin)、盐酸伊立替康(Camptosar)、SN-38(伊立替康的活性形式)、9-NC、9-AC、DE-310、勒托替康GI-147211NX 211、吉马替康(ST-1481)、PEG-喜树碱、BNP-1350、DB-67、BN 80915。FDA最近批准了两种喜树碱衍生物：用于卵巢癌和肺癌的拓扑替康以及用于结肠直肠癌的伊立替康。参见例如，Pommier,Nature Reviews Cancer 6,789–802(2006)。
在一些实施方案中，治疗剂是7-乙基-10-羟基-20(S)-喜树碱(SN-38)。SN-38是伊立替康的活性代谢物，但其活性是伊立替康本身的1000倍。体外细胞毒性测定表明，SN-38的效力相对于伊立替康从2至2000倍变化。由于其低溶解度和超毒性，SN-38已被开发成药物缀合物以获得更好的治疗效果。参见例如，美国专利号7,999,083和8,080,250。
在一些实施方案中，SN-38在其10-羟基位置缀合至靶向部分。在涉及CPT类似物如SN-38的药物-接头前体制剂中在C-20碳酸酯存在下选择性再生10-羟基的方法是本领域中已知的。参见例如，美国专利号10,266,605。在一些实施方案中，SN-38在20-羟基位置缀合至靶向缀合物。也可使用药物中的反应性羟基的其他保护基团，如SN-38中的酚羟基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基，并且在将衍生化的药物连接至抗体偶联部分之前通过四丁基氟化铵对这些进行脱保护。CPT类似物的10-羟基可替代地被保护为酯或碳酸酯。在一些实施方案中，SN-38通过接头缀合至靶向部分。
在一些实施方案中，治疗剂包含有丝分裂抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂包含微管蛋白阻断剂。微管/微管蛋白抑制剂根据其作用机制可分为两大类：促进微管蛋白聚合且稳定微管结构的剂(例如紫杉醇)和抑制微管蛋白聚合且去稳定微管结构的剂(如美登木素生物碱、奥瑞斯他汀、长春花碱和长春新碱)。参见例如，Chen等人,Molecules 22:1281,2017。示例性微管蛋白破坏剂包括但不限于奥瑞斯他汀、微管溶素、秋水仙碱、长春花生物碱、紫杉烷、念珠藻素、美登木素生物碱、哈米特林和其他微管蛋白破坏剂。奥瑞斯他汀是天然产物尾海兔素的衍生物。示例性奥瑞斯他汀包括尾海兔素-10、MMAE(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-去甲麻黄碱)和MMAF(N-甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸)以及它们的衍生物。WO 2015/057699描述聚乙二醇化奥瑞斯他汀，包括MMAE。考虑使用的另外尾海兔素衍生物公开于美国专利号9,345,785中，其以引用的方式并入本文。微管溶素包括但不限于微管溶素D、微管溶素M、微管苯丙氨酸、微管酪氨酸以及它们的衍生物。秋水仙碱包括但不限于秋水仙碱、CA-4以及它们的衍生物。长春花生物碱包括但不限于长春花碱(VBL)、长春瑞滨(VRL)、长春新碱(VCR)、长春地辛(VDS)以及它们的衍生物。紫杉烷包括但不限于紫杉醇、多西他赛以及它们的衍生物。念珠藻素包括但不限于念珠藻素-1、念珠藻素-52以及它们的衍生物。美登木素生物碱包括但不限于美登素、美登醇、美登素类似物、DM1、DM3、DM4、安丝菌素(ansamatocin)-2以及它们的衍生物。示例性美登木素生物碱药物部分包括具有经修饰的芳环的那些，如：C-19-脱氯(通过氢化锂铝还原安丝菌素(ansamytocin)P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌属进行脱甲基作用或使用LAH进行脱氯作用来制备)；以及C-20-脱甲基、C-20-酰氧基(—OCOR)、+/-脱氯(通过使用酰氯进行酰化作用来制备)，以及它们的衍生物。
微管蛋白破坏剂已用于白血病的抗体药物缀合物中。例如，本妥昔单抗维多汀是由通过蛋白酶可裂解接头缀合至微管破坏剂单甲基奥瑞斯他汀E的抗CD30单克隆抗体组成的抗体-药物缀合物。本妥昔单抗维多汀已被批准用于在非ASCT候选者的患者中自体干细胞移植(ASCT)失败或至少2次先前多药化疗方案失败后治疗经典霍奇金淋巴瘤，以及作为处于增加的复发/进展风险的霍奇金淋巴瘤患者的ASCT后巩固治疗。参见(本妥昔单抗维多汀)美国处方信息和(本妥昔单抗维多汀)欧盟产品特性摘要。它还被批准用于至少一种先前多药化疗方案失败后的全身性间变性大细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，微管蛋白破坏剂包括奥瑞斯他汀。在一些实施方案中，治疗剂是单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)。MMAE是尾海兔素10的合成衍生物，并且通过抑制微管蛋白聚合而充当非常有效的抗有丝分裂剂。MMAE的合成和结构描述于美国专利号6,884,869中，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，治疗剂还包含药物接头。在一些实施方案中，药物接头通过可裂解接头缀合至治疗剂。在一些实施方案中，药物接头通过不可裂解接头缀合至治疗剂。在一些实施方案中，接头是胺供体基团接头。在一些实施方案中，接头是不可裂解接头。合适的不可裂解接头包括但不限于NH2―R―X、NH2NH―R―X和NH2―O―R―X，其中R是烷基或聚乙二醇基团(也称为PEG)，其中X是活性部分。聚乙二醇基团或PEG基团可具有式―(CH2CH2O)n―，其中n是至少1的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大)。
在一些实施方案中，接头是可裂解接头。合适的可裂解接头包括但不限于Lys―Phe―X、Lys―Val―Cit―PAB―X、NH2―(CH2CH2O)n―Val―Cit―PAB―X和NH2―(CH2CH2O)n―(Val―Cit―PAB―X)2，其中X是活性部分，并且n是至少1的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更大)。PAB是指对氨基苄氧基羰基。Ci t是指瓜氨酸。其他示例性胺供体基团接头包括但不限于Ac-Lys-Gly、氨基己酸、Ac-Lys-β-Ala、氨基-PEG2(聚乙二醇)-C2、氨基-PEG3-C2、氨基-PEG6-C2、Ac-Lys-Val(缬氨酸)-Cit(瓜氨酸)-PAB(对氨基苄氧基羰基)、氨基己酰基-Val-Cit-PAB、腐胺和Ac-Lys-腐胺。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-VC-PAB-(DMAE)k(式II)，其中n、m和k是整数，n≥1，m≥2，并且k是0或1。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-VC-PAB，其中n和m是整数，n≥1，并且m≥2。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-Val-Ala-PAB-(DMAE)k，其中n、m和k是整数，n≥1，m≥2，并且k是0或1。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-Val-Ala-PAB，其中n和m是整数，n≥1，并且m≥2。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-P-PAB-(DMAE)k(式III)，其中n、m和k是整数，n≥1，m≥2，并且k是0或1，P是裂解位点。在一些实施方案中，接头是(Gly)n-(PEG)m-P-PAB，其中n和m是整数，n≥1，并且m≥2。
在一些实施方案中，接头是支链的。在一些实施方案中，接头是直链的。在一些实施方案中，接头具有多于一个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)用于附接治疗剂的附接位点。这些治疗剂可彼此相同或不同。
在一些实施方案中，治疗剂是甘氨酸3-酰氨基-PEG8-VC-PAB-DMAE-苯酚连接的SN38，如下式(1)化合物所示，其中接头连接至SN38的位置10且具有8-PEG间隔子：
在一些实施方案中，治疗剂是甘氨酸3-酰氨基-PEG8-VC-PAB-DMAE-α-羟基内酯连接的SN38，如下式(2)化合物所示，其中接头连接至SN38的位置20且具有8-PEG间隔子：
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-(PEG)4-VC-PAB-MMAE，如下式(3)化合物所示，其中接头连接至MMAE并且具有4-PEG间隔子：
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-(PEG)8-VC-PAB-MMAE，如下式(4)化合物所示，其中接头连接至MMAE并且具有8-PEG间隔子：
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-酰氨基-PEG8-LGGSGRNAQVRLE-PAB-DMAE-苯酚连接的SN38，如下式(5)化合物所示：
式(5)的化合物含有可被uPA裂解的接头。
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-酰氨基-PEG8-LGGSGRNAQVRLE-PAB-DMAE-α-羟基内酯连接的SN38，如下式(6)化合物所示：
式6的化合物含有可被uPA裂解的接头。
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-酰氨基-PEG8-LGGSGRNAQVRLE-PAB-MMAE，如下式(7)化合物所示：
式(7)的化合物含有可被uPA裂解的接头。
在一些实施方案中，治疗剂是甘氨酸3-酰氨基-PEG8-Val-Ala-PAB-DMAE-苯酚连接的SN38，其中接头连接至SN38的位置10且具有8-PEG间隔子。
在一些实施方案中，治疗剂是甘氨酸3-酰氨基-PEG8-Val-Ala-PAB-DMAE-α-羟基内酯连接的SN38，其中接头连接至SN38的位置20且具有8-PEG间隔子。
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-(PEG)4-Val-Ala-PAB-MMAE，其中接头连接至MMAE并且具有4-PEG间隔子。
在一些实施方案中，治疗剂是(甘氨酸)3-(PEG)8-Val-Ala-PAB-MMAE，其中接头连接至MMAE并且具有8-PEG间隔子。
还提供了具有式(1)-(7)化合物的结构的化合物，以及包含这些化合物的靶向缀合物(例如，抗体药物缀合物)。
在一些实施方案中，靶向缀合物包含缀合至靶向部分的约1-80种治疗剂。在一些实施方案中，靶向缀合物包含缀合至靶向部分的约1-4、1-5、5-10、4-10、10-20、1-20、10-20、20-40或40-80种治疗剂中的任一个。在一些实施方案中，靶向缀合物包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70或80种治疗剂中的任一个。在一些实施方案中，靶向缀合物包含不超过约80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1种治疗剂中的任一个。
寡核苷酸
在一些实施方案中，效应细胞是寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200或更多个核苷酸或碱基对中的任一个。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度不超过约200、150、120、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5或2个核苷酸或碱基对中的任一个。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度是约2-10、5-10、10-20、10-40、10-60、10-80、10-100、100-150、150-200、20-40、40-80、80-100、100-200、10-150、10-200、2-20、2-50或2-100个核苷酸或碱基对中的任一个。
在一些实施方案中，寡核苷酸是DNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是双链DNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链DNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是合成DNA。
在一些实施方案中，寡核苷酸是RNA。示例性RNA包括但不限于单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)或微小RNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是合成RNA。
在一些实施方案中，寡核苷酸是免疫调节多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是病原体相关分子模式(PAMP)或可激活免疫细胞的其他基序。PAMP是与各种病原体相关的分子，并且被Toll样受体(TLR)和其他激活先天免疫应答的模式识别受体(PRR)识别。PAMP在没有病原体的情况下募集免疫系统的能力提供了用于通过使用先天免疫系统应答来治疗涉及细胞破坏的多种疾病的策略(例如，抗癌疗法)。已针对多种治疗应用研究的一类PAMP是免疫刺激多核苷酸，如CpG寡脱氧核苷酸(ODN)(例如，阿托莫德)。据认为，CpG ODN介导免疫细胞(例如B细胞、单核细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC))中的TLR9二聚化以上调细胞因子(例如，I型干扰素和白细胞介素)，从而激活自然杀伤细胞。示例性PAMP包括但不限于CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、单纯疱疹病毒(HSY)DNA、dsRNA、ssRNA。此外，寡核苷酸可包含沉默基因表达或诱导细胞内死亡信号传导的一个或多个核酸序列，包括但不限于dsRNA、siRNA、shRNA或微小RNA。在一些实施方案中，寡核苷酸选自由以下组成的组：GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸是CpG ODN。CpG ODN是短的单链合成DNA分子，其含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(“C”)，然后是鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(“G”)。“p”是指连续核苷酸之间的磷酸二酯键。在一些实施方案中，CpG ODN具有经修饰的硫代磷酸酯(PS)主链，例如，CpG ODN中的所有核苷酸或部分核苷酸具有PS主链。当CpG基序未甲基化时，它们充当免疫刺激剂。CpG基序被认为是病原体相关分子模式(PAMP)，因为它们在微生物基因组中丰富，但在脊椎动物基因组中很少见。CpG-ODN结合至并激活Toll样受体9(TLR9)，从而起始支持适应性免疫的后续发展的先天免疫应答。CpG-ODN已被用作疫苗佐剂以获得所需的免疫调节和协同免疫应答。CpG ODN通常分为三类：A类、B类和C类。A类CpG-ODN通常含有poly-G尾部，具有在3'末端和5'-末端的硫代磷酸酯主链和包含磷酸主链的中央回文序列。A类CpGODN通常在中央回文序列中含有CpG。B类CpG-ODN通常包含完全硫代磷酸酯主链，并且B类CpG ODN的5'端的序列通常对TLR9激活至关重要。C类CpG-ODN包含完全硫代磷酸酯主链和3'端序列，能够形成双链体。在一些实施方案中，CpG-ODN被甲基化。在一些实施方案中，CpG-ODN未甲基化。
在一些实施方案中，靶向部分缀合至包含CpG基序的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向部分缀合至包含多个CpG基序的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向部分缀合至包含具有相同序列的CpG基序的多个重复序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向部分缀合至具有不同序列的多个CpG-ODN。
在一些实施方案中，CpG-ODN可表现出优于主要含有核苷间磷酸(例如，超过50％的核苷间磷酸)而基本上不牺牲它们的免疫刺激活性的CpG-ODN的稳定性(例如，针对核酸酶的稳定性)。这种效果可例如通过并入至少50％(例如，至少70％)核苷间硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯或通过包含核苷间磷酸三酯和/或核苷间无碱基间隔子来实现。磷酸三酯和无碱基间隔子也便于与靶向部分缀合。相对于具有完全硫代磷酸酯主链的多核苷酸，基于磷酸的磷酸三酯和无碱基间隔子也可用于降低脱靶活性。不希望受理论束缚，这种效果可通过减少自我递送而不破坏靶向部分介导的递送至靶细胞来实现。因此，寡核苷酸可包含约15个或更少的连续核苷间硫代磷酸酯(例如，约14个或更少、约13个或更少、约12个或更少、约11个或更少、或约10个或更少连续核苷间硫代磷酸酯)。例如，含有总计约12至约16个核苷的CpG-ODN可含有约10个或更少连续核苷间硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，CpG ODN例如在一个或两个末端处(例如，在六个5'-末端核苷或六个3'-末端核苷内)包含一个或多个硫代磷酸酯(例如，约1至约6个或约1至约4个)。包含一个或多个核苷间磷酸三酯和/或硫代磷酸酯可通过降低核酸外切酶介导的降解速率来增强多核苷酸的稳定性。
在一些实施方案中，CpG ODN还包含一个或多个(例如，1至6个、1至12个、1至18个、1至24个)辅助部分(例如，聚乙二醇(PEG))。辅助部分可以是加帽基团、生物可逆基团或非生物可逆基团的一部分。辅助部分可与接头(例如，与免疫调节(例如，免疫刺激)多核苷酸中的磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合的接头)键合。在CpG ODN中包含辅助部分(例如，PEG)可相对于缺乏此类辅助部分的参考缀合物改善靶向缀合物的药代动力学和/或生物分布性质。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸连接至可裂解接头。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸和连接的接头包含5'氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN(式IV)的结构，其中间隔子是(CH2)n-(PEG)m，h、n和m是整数，h＝0或1，n≥1，并且m≥0，P是裂解位点。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸和连接的接头包含3'氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN(式V)的结构，其中间隔子是(CH2)n-(PEG)m，h、n和m是整数，h＝0或1，n≥1，并且m≥0，P是裂解位点。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸包含选自由以下组成的组的核酸序列：
5’-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT-3’(SEQ ID NO:66)和
5’-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:67)，其中*表示硫代磷酸酯键联。
在一些实施方案中，CpG寡核苷酸及其附接的接头包含选自以下的结构：
5’氨基修饰剂-(CH2)12-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:68)、
5’氨基修饰剂-(CH2)12-硫醇(CH2)6-S-S-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:69)、
5’氨基修饰剂-(CH2)6-(PEG)6-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:70)、
5’氨基修饰剂-(CH2)12-(PEG)6-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:71)、
5’硫醇修饰剂-(CH2)6-S-S-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-3’(SEQ ID NO:72)、
5'-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T*-S-S-(CH2)6-3’硫醇修饰剂(SEQ ID NO:73)和式VIII：
5'氨基修饰剂-LGGSGRNAQVRLEGSG(SEQ ID NO：147)-(PE G)12-T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*C*G*T*T*C*G*A*A*T(SEQ ID NO：157)，
其中*表示硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，CpG寡核苷酸具有与SEQ ID NO：66或67的核酸序列具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％；或100％中的任一个)序列同一性的核酸序列。还提供了CpG寡核苷酸，所述CpG寡核苷酸包含与SEQ ID NO：66或67的核酸序列具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％；或100％中的任一个)序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含接头，如化学接头或肽接头。在一些实施方案中，接头选自由SH2-间隔子、MAL-间隔子、NH2-间隔子和Osu-间隔子组成的组。如本文所用，间隔子在存在时将靶向部分直接或间接连接至效应分子。参见例如，US20100040637A1。在一些实施方案中，接头是poly-PEG接头。
可检测标记
在一些实施方案中，效应分子是可检测标记。如本文所用，标记是有助于检测靶向部分和/或有助于检测靶向部分所结合的分子的部分。非限制性示例性标记包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶促基团、化学发光基团、生物素、表位标签、金属结合标签等。本领域技术人员可根据预定应用选择合适的标记。
对于诊断目的，标记可以是放射性核素、放射造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和感光剂(photoactive agent)。此类诊断标记为熟知的并且可使用任何此类已知标记。
在一些实施方案中，可检测标记是放射性核素。“放射性核素”通常被称为“放射性同位素(radioactive isotopes)”或“放射性同位素(radioisotopes)”。可连接至本文所述的靶向部分的示例性放射性核素或稳定同位素包括但不限于110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ-发射体、β-发射体或正电子发射体。
有用的顺磁性离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物以及铊化合物。各种各样的荧光标记为本领域中已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛以及荧光胺。有用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
在一些实施方案中，效应分子包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，螯合化合物螯合放射性金属。在一些实施方案中，螯合化合物螯合金属18F。在一些实施方案中，螯合化合物是亲水性螯合化合物，其可结合金属离子并有助于确保快速体内清除。特别有用的金属螯合物组合包括2-苄基-DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)及其单甲基类似物和环己基类似物，它们与总能量范围为60至4,000keV的诊断同位素一起用于放射成像，所述同位素如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99Tc、94Tc、11C、13N、15O、76Br。相同的螯合物在与非放射性金属如锰、铁和钆复合时可用于MRI。大环螯合化合物，如NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸)、TETA(溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)和NETA({4-[2-(双-羧甲基-氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三唑烷-1-基}-乙酸)与各种诊断放射性金属如镓、钇和铜一起使用。可通过根据目标金属调整环大小而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。
在一些实施方案中，螯合化合物包含可缀合至靶向部分的官能团。在一些实施方案中，螯合化合物包含可与靶向部分中的伯胺(-NH2)基团反应的官能团。可与靶向部分的伯胺(例如赖氨酸侧链)缀合的示例性官能团包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯酯。大多数这些官能团通过酰化或烷基化缀合至胺。
在一些实施方案中，螯合化合物包含可与靶向部分中的半胱氨酸侧链(即，巯基)反应的官能团。示例性巯基反应性基团包括但不限于卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮杂环丙烷、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂。大多数这些基团通过烷基化(通常形成硫醚键)或二硫键交换(形成二硫键)缀合至巯基。
C.缀合位点
在一些实施方案中，靶向缀合物包含一个或多个缀合位点。缀合位点允许效应分子共价或非共价连接至靶向部分。缀合位点可以是靶向部分的一部分或存在于引入靶向部分中的化学部分中。在一些实施方案中，效应分子缀合至位于第一靶向部分与第二靶向部分之间的缀合位点。
缀合位点可包含用于共价缀合的一个或多个反应性基团。蛋白质中常见的反应性基团包括伯胺(–NH2)、羧基(–COOH)、巯基(–SH)和羰基(–CHO，其可通过氧化糖蛋白中的碳水化合物基团而产生)。
在一些实施方案中，缀合位点在靶向部分的多肽链中。在一些实施方案中，缀合位点在靶向部分的氨基酸残基的侧链处。在一些实施方案中，缀合位点在靶向部分的多肽链的N末端处。在一些实施方案中，缀合位点在靶向部分的多肽链的C末端处。
在一些实施方案中，缀合位点是靶向部分上的内源性缀合位点。在一些实施方案中，缀合位点是引入靶向部分中的工程化缀合位点。例如，缀合位点可存在于与靶向部分融合的肽，如标签中。
在一些实施方案中，靶向部分是双特异性的或二价的，其中所述靶向部分包含：(1)包含缀合位点的缀合部分C，和(2)两个靶标结合部分A1和A2，其中A1是靶向肽或识别第一靶分子的抗体或其抗原结合片段，并且其中A2是靶向肽或识别第二靶分子的抗体或其抗原结合片段，并且其中A1融合至C的N末端，并且其中A2融合至C的C末端。在一些实施方案中，A1和A2不同。在一些实施方案中，A1和A2相同。
在一些实施方案中，缀合位点包含反应性硫醇基团，例如靶向部分的半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，缀合位点包含反应性胺基团(“胺缀合位点”)，例如靶向部分的赖氨酸或精氨酸残基。伯胺存在于每条多肽链的N末端以及赖氨酸和精氨酸(Lys、K)残基的侧链中。这些伯胺在生理pH下带正电；因此，它们主要出现在天然蛋白质三级结构的外表面上，其中它们易于接近引入水性介质中的缀合试剂。另外，在典型的生物或蛋白质样品中的可用官能团之中，伯胺尤其是亲核性的；这使得它们易于靶向与若干反应性基团缀合。最具有特异性和最有效的试剂之一是使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)反应性基团的那些试剂。在一些实施方案中，可通过用诸如特劳特试剂(2-亚氨基硫烷)、MBS、SPDP、SATA以及它们的衍生物的试剂修饰，在伯胺(尤其是赖氨酸残基的那些)的位点引入巯基。
转谷氨酰胺酶缀合位点
在一些实施方案中，效应分子(例如，治疗剂)缀合至靶向部分中的转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，靶向部分和效应分子通过异肽键彼此缀合。在一些实施方案中，靶向部分包含转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，靶向部分和效应分子通过转谷氨酰胺基反应彼此缀合。在一些实施方案中，转谷氨酰胺基反应由转谷氨酰胺酶催化。
转谷氨酰胺酶缀合已描述于例如WO2019057772和WO2012059882中。转谷氨酰胺酶是蛋白质-谷氨酰胺-谷氨酰转移酶，其通常催化谷氨酰胺残基与赖氨酸残基的pH依赖性转酰胺基作用。转谷氨酰胺酶可从多种来源获得或制备，或被工程化以催化一个或多个内源性谷氨酰胺残基与一个或多个赖氨酸残基或含有一种或多种反应性胺的胺供体剂的转酰胺基作用。转谷氨酰胺酶将酰基供体谷氨酰胺的γ-谷氨酰胺酰基转移至酰基受体胺基团，如伯胺或赖氨酸的ε-氨基，从而产生连接酰基供体谷氨酰胺和酰基受体残基的异肽键。由转谷氨酰胺酶催化形成的异肽键对蛋白酶活性高度稳定，并且不一定位于N末端和C末端。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶优先识别含有具有酰基受体基团的氨基酸残基的肽序列和含有具有酰基供体基团的氨基酸残基的肽序列。具有酰基受体基团的氨基酸残基在本文中称为“酰基受体残基”(例如，赖氨酸、N末端甘氨酸)，并且具有酰基供体基团的氨基酸残基在本文中称为“酰基供体残基”(例如，谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，酰基供体残基是内源性Gln。在一些实施方案中，内源性Gln位点位于靶向部分(例如，抗体或其抗原结合片段)的Fc区中。在一些实施方案中，靶向部分的Fc中的Gln被去糖基化。在一些实施方案中，内源性Gln位点不在Fc区中。在一些实施方案中，在靶向部分中存在多于一个内源性酰基供体Gln。在一些实施方案中，内源性Gln在靶向部分的N末端处。在一些实施方案中，内源性Gln在靶向部分的C末端处。在一些实施方案中，内源性Gln在靶向部分的内部位置处。
在一些实施方案中，酰基供体残基是引入靶向部分中的工程化Gln残基。在一些实施方案中，非内源性Gln通过氨基酸修饰(如插入或取代)并入靶向部分中。在一些实施方案中，取代包括用另一个(例如，非野生型氨基酸残基)置换野生型氨基酸。在一些实施方案中，插入包括插入一个或多个氨基酸(例如，插入一个、两个、三个或更多个氨基酸)。
在一些实施方案中，非内源性Gln在标签中。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签包含至少一个Gln。在一些实施方案中，标签包含同一序列的多个拷贝。在一些实施方案中，存在多个连接至靶向部分的含Gln标签。在一些实施方案中，标签通过肽接头连接至靶向部分。在一些实施方案中，肽接头是至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸长。在一些实施方案中，标签还可包含纯化标签。示例性纯化标签包括但不限于FLAG、GST、HA、聚组氨酸、Myc、T7、AU1表位、AU5表位、ABP、链霉抗生物素蛋白/生物素、钙调蛋白结合肽、MBP、氯霉素乙酰转移酶、几丁质结合结构域、半乳糖结合蛋白、EE-标签、组氨酸亲和标签等。
在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列(XrQsXt-Lp)q(式VI，SEQ ID NO:154)，其中r≥0，t≥0，s≥1，p＝0或1，q≥1，L是接头，X是任何氨基酸(例如，常规氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gln、Ile、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或非常规氨基酸)。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列(XQXX-Lp)q(式VII，SEQ ID NO:155)，其中p＝0或1，q≥1，L是氨基酸接头，X是任何氨基酸(例如，常规氨基酸Leu、Ala、Gly、Ser、Val、Phe、Tyr、His、Arg、Asn、Glu、Asp、Cys、Gln、Ile、Met、Pro、Thr、Lys或Trp或非常规氨基酸)。在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：Q、LQG、LLQ、LQSP(SEQ ID NO:153)、LLQGG(SEQ ID NO:13)、LLQG(SEQ ID NO:14)、GLLQG(SEQ ID NO:15)、LSLSQG(SEQ ID NO:16)、GGGL LQGG(SEQ ID NO:17)、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:18)、GLLQ GGG(SEQ ID NO:19)、GLLQGG(SEQ ID NO:20)、GLLQ(SEQ ID NO:21)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:22)、LLQGA(SEQ IDNO:23)、LLQYQGA(SEQ ID NO:24)、LLQGSG(SEQ ID NO:25)、LL QYQG(SEQ ID NO:26)、LLQLLQG(SEQ ID NO:27)、SLLQG(SEQ ID NO:28)、LLQLQ(SEQ ID NO:29)、LLQLLQ(SEQ IDNO:30)、LLQGR(SEQ ID NO:31)、LLQGPP(SEQ ID NO:32)、LLQG PA(SEQ ID NO:33)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:34)、GGLLQGA(SEQ ID NO:35)、LLQGPGK(SEQ ID NO:36)、LLQGPG(SEQID NO:37)、LLQGP(SEQ ID NO:38)、LLQP(SEQ ID NO:39)、LLQP GK(SEQ ID NO:40)、LLQAPGK(SEQ ID NO:41)、LLQGAPG(SEQ ID NO:42)、LLQGAP(SEQ ID NO:43)、LLQLQG(SEQID NO:44)、QVQLKE(SEQ ID NO:45)、VQLKE(SEQ ID NO:46)、LQ QP(SEQ ID NO:47)、PQQF(SEQ ID NO:48)、和GQQQL(SEQ ID NO:49)、LLQGLLQGLLQG(SEQ ID NO:1)、LLQGGSGLLQGGSGLLQG(SEQ ID NO:2)、LQSPLQSPLQSP(SEQ ID NO:3)、LQS PGSGLQSPGSGLQSP(SEQ ID NO:4)、PNPQLPFPNPQLPFPNPQL PF(SEQ ID NO:5)、PNPQLPFGSGPNPQLPFGSGPNPQLPF(SEQ ID NO:6)、PKPQQFMPKPQQFMPKPQQFM(SEQ ID NO:7)、PKPQ QFMGSGPKPQQFMGSGPKPQQFM(SEQ ID NO:8)、GQQQLGGQ QQLGGQQQLG(SEQ ID NO:9)、GQQQLGGSGGQQQLGGSGGQQ QLG(SEQ ID NO:10)、RLQQPRLQQPRLQQP(SEQ ID NO:11)、RLQQPGSGRLQQPGSGRLQQP(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，提供了包含选自由SEQ ID NO：1-12组成的组的氨基酸序列的转谷氨酰胺酶缀合肽。在一些实施方案中，提供了包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子通过转谷氨酰胺酶缀合肽缀合至所述靶向部分，所述转谷氨酰胺酶缀合肽包含选自由SEQ ID NO：1-12组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，含Gln标签在靶向部分的N末端处。在一些实施方案中，含Gln标签在靶向部分的C末端处。在一些实施方案中，含Gln标签在靶向部分的内部位置处。
在一些实施方案中，靶向部分包含至少一个内源性谷氨酰胺残基，其通过抗体工程化在转酰胺基反应中具有反应性。在一些实施方案中，抗体工程化是抗体去糖基化(例如，酶促去糖基化)；或氨基酸修饰，包括抗体上的氨基酸缺失、插入、取代、突变或它们的任何组合。例如，抗体中位置297处的野生型氨基酸Asn(N)可被氨基酸Ala(A)取代或置换，从而导致位置297处的无糖基化和位置295处的反应性内源性谷氨酰胺(Q)。在另一个实例中，抗体中的氨基酸修饰是位置297处从N至Q的氨基酸取代，从而导致位置297处的无糖基化、位置295处的反应性内源性Q以及在转谷氨酰胺酶存在下N297Q和Q295与这两个位点处的一种或多种胺供体剂之间的位点特异性缀合。在一些实施方案中，可对抗体进行工程化以除去糖基化位点。
在一些实施方案中，靶向部分包含对转谷氨酰胺酶缀合具有反应性的内源性谷氨酰胺残基。
在一些实施方案中，靶向部分包含具有多个谷氨酰胺残基的转谷氨酰胺酶缀合位点，所述谷氨酰胺残基对于缀合至效应分子中的胺基团具有反应性。在一些实施方案中，转谷氨酰胺酶缀合位点包含串联的多个含谷氨酰胺的标签序列，其中多个(例如，2、3、4、5、6个或更多个)效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。
寡核苷酸结合多肽(OBP)
在一些实施方案中，寡核苷酸通过引入至靶向部分的寡核苷酸结合多肽非共价缀合至靶向部分。在一些实施方案中，寡核苷酸通过电荷-电荷相互作用缀合至寡核苷酸结合多肽。在一些实施方案中，寡核苷酸结合多肽是阳离子肽。在一些实施方案中，寡核苷酸结合多肽是带中性电荷的肽。
许多核酸结合蛋白使用短肽序列来提供识别其靶标的特异性，所述靶标可具有特定序列或特定构象。含有交替赖氨酸的肽已显示与呈Z构象的聚(dG–d5meC)结合，并使更高的能量形式稳定。参见例如，H.Takeuchi等人,(1991)FEBS Lett.,279,253–255和H.Takeuchi等人,(1994)J.Mol.Biol.,236,610–617。
在一些实施方案中，CpG结合多肽带正电荷。在一些实施方案中，CpG结合多肽包含一个或多个带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，CpG结合多肽包含极性氨基酸残基。在一些实施方案中，CpG结合多肽包含含有多个带正电荷的氨基酸残基的短基序。在一些实施方案中，短基序包含串联的带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，CpG结合肽还包含在N末端的修饰。在一些实施方案中，CpG结合肽包含在N末端的氨基苯甲酸。
在一些实施方案中，CpG结合多肽选自由以下组成的组：RSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS(SEQ ID NO:56)；RRRLHRIHRRQHRS CRRRKRR(SEQ ID NO:57)；MPRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRR RRGGRRRR(SEQ ID NO:58)；KKSAKKTPKKAKKPKKSAKKTPKKAKKP(SEQ ID NO:59)；AKKAKSPKKAKAAKPKKAPKSPAKAK(SEQ ID NO:60)；MRRAHHRRRRASHRRMRGG(SEQ ID NO:61)；KHKHKHKHKKKHKHKHKHKKKHKHKHKHKK(SEQ ID NO:62)；KGKGKGKGKKKGKGKGKGKKKGKGKGKGKK(SEQ ID NO:63)；KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA(SEQ ID NO:64)；和YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSY(SEQ ID NO:65)。还提供了包含选自由SEQID NO：56-65组成的组的氨基酸序列的CpG结合多肽。在一些实施方案中，提供了包含靶向部分、CpG寡核苷酸和CpG结合多肽的靶向缀合物，其中所述CpG寡核苷酸通过所述CpG结合多肽缀合至所述靶向部分，并且其中所述CpG结合多肽包含选自由SE Q ID NO：56-65组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CpG结合多肽融合至靶向部分。在一些实施方案中，CpG结合多肽融合至靶向部分的一条或多条多肽链的N末端。在一些实施方案中，CpG结合多肽融合至靶向部分的一条或多条多肽链的C末端。在一些实施方案中，CpG结合多肽融合至靶向部分的一条或多条多肽链的内部位置。在一些实施方案中，其中靶向部分是抗体或抗原结合片段，CpG结合多肽例如通过单个肽键或接头融合至抗体或抗原结合片段的重链的C末端。在一些实施方案中，其中靶向部分是抗体或抗原结合片段，CpG结合多肽例如通过单个肽键或肽接头融合至抗体或抗原结合片段的轻链的C末端。
D.裂解位点
在一些实施方案中，靶向缀合物包含一个或多个裂解位点。在一些实施方案中，靶向缀合物包含靶向部分中的或连接至靶向部分的一个或多个裂解位点。在一些实施方案中，靶向部分不包含一个或多个裂解位点。在一些实施方案中，靶向缀合物包含效应分子中的或连接至效应分子的一个或多个裂解位点。在一些实施方案中，靶向缀合物包含寡核苷酸结合多肽中的或连接至寡核苷酸结合多肽的一个或多个裂解位点。
在一些实施方案中，靶向缀合物中的一个或多个裂解位点在靶部位，例如患病部位处裂解。在一些实施方案中，裂解由靶部位处的条件触发，所述条件如蛋白酶、pH的变化、氧化还原水平、缺氧、氧化应激、高热和/或细胞外ATP浓度。在一些实施方案中，靶向缀合物中的一个或多个裂解位点在非靶部位处，如在正常或健康组织中裂解。在一些实施方案中，在非靶部位处未发现触发靶部位处的裂解位点的裂解的条件。在一些实施方案中，触发裂解位点的裂解的条件与非靶部位处的条件相比以至少约1.5、2、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或更高中的任一个的水平存在于靶部位处。例如，使裂解位点裂解的蛋白酶(例如，uPA)与非靶部位处蛋白酶的浓度相比以至少约1.5、2、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或更高的浓度存在于靶部位处。在一些实施方案中，与非靶部位处的细胞外ATP浓度相比，靶部位处的细胞外ATP浓度是至少约1.5、2、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或更高中的任一个。在一些实施方案中，与非靶部位处的pH相比，靶部位处的pH低至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5或3中的任一个。在一些实施方案中，与非靶部位处的pH相比，靶部位处的pH高至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5或3中的任一个。
在一些实施方案中，裂解位点是蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，裂解位点可被疾病特异性蛋白酶如肿瘤特异性蛋白酶裂解。在一些实施方案中，与正常组织相比，肿瘤特异性蛋白酶在患病组织如肿瘤组织中以升高的水平表达。例如，研究表明，肿瘤组织表现出特定蛋白酶的活性增加和相反内源性抑制剂的活性降低(Sevenich L和JoyceJA.Genes&Dev.2014.28：2331-2347.2014)。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自由以下组成的组：蛋白裂解酶(MTSP1)、尿型纤溶酶原激活物(uPA)、豆荚蛋白、PSA (也称为KLK3、激肽释放酶相关肽酶-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、蛋白酶3(Pr3)、组织蛋白酶B和组织蛋白酶K。在一些实施方案中，裂解在肿瘤部位，例如在肿瘤中微环境中发生。在一些实施方案中，裂解在细胞外，如肿瘤微环境中的肿瘤细胞外发生。
在一些实施方案中，裂解位点是选自由以下组成的组的酶的底物：豆荚蛋白、纤溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MT1-MMP、组织蛋白酶、半胱天冬酶、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、β-β分泌酶、uPA和PSA。
在一些实施方案中，裂解位点是uPA底物肽。尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)是作为尿激酶纤溶酶原激活系统(uPAS)的一部分的丝氨酸蛋白酶。uPA转化参与许多需要基底膜(BM)和/或细胞外基质(ECM)重塑的生理病理过程，包括肿瘤进展和转移的丝氨酸蛋白酶纤溶酶中的酶原纤溶酶原。在一些实施方案中，uPA裂解位点包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：LSGRSDNH(SEQ ID NO：50)、SGRSA(SEQ ID NO：51)、LGGSGRSANAILE(SEQ ID NO：52)、LGGSGR NAQVRLE(SEQ ID NO：53)、GSGRNAQV(SEQ ID NO：54)和SGR(SEQ ID NO：55)。还提供了包含选自由SEQ ID NO：50-55组成的组的氨基酸序列的uPA裂解肽。
在一些实施方案中，靶向缀合物包含可被疾病特异性蛋白酶(如uPA，例如SEQ IDNO：50-55中的任一个)裂解的单一肽底物。在一些实施方案中，靶向缀合物包含可被疾病特异性蛋白酶裂解的肽底物的两个或更多个拷贝(如2、3、4、5个或更多个中的任一个)。在一些实施方案中，靶向缀合物包含可被多于一种(例如，2、3、4种或更多种中的任一个)疾病特异性蛋白酶裂解的肽底物。在一些实施方案中，靶向缀合物包含可被一种或多种(例如，2、3、4种或更多种中的任一个)疾病特异性蛋白酶裂解的两种或更多种(例如，2、3、4种或更多种中的任一个)肽底物。可混合和匹配本文公开的任一个蛋白酶肽底物序列(例如，SEQ IDNO：50-55)以提供具有最佳机制和动力学的疾病感知可释放部分，以用于在靶(例如疾病病)部位释放效应分子。不同的蛋白酶底物序列或其拷贝可通过肽接头彼此融合以提供合适的裂解位点。
E.示例性靶向缀合物
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：靶向部分、通过缀合位点缀合至所述靶向部分的一个或多个效应分子。在一些实施方案中，每个效应分子通过一个或多个接头和/或一个或多个蛋白酶裂解位点缀合至缀合位点。在一些实施方案中，效应分子共价缀合至靶向部分。在一些实施方案中，效应分子非共价缀合至靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分包含两个或更多个多肽链。在一些实施方案中，靶向部分包含蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，靶向缀合物包含第一靶向部分、第二靶向部分和连接所述第一靶向部分和所述第二靶向部分的缀合位点，其中一个或多个效应分子缀合至所述缀合位点。在一些实施方案中，蛋白酶裂解在细胞外发生。在一些实施方案中，靶向缀合物具有式I的结构。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图1A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：112的抗体重链和含有SEQ ID NO：113的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第一缀合位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第二缀合位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图1B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和SEQ ID NO：125的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第三蛋白酶裂解位点、第二缀合位点、第四蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图1C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第四裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一和/所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二和/或所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图2A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：112的抗体重链和含有SEQ ID NO：113的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：112的抗体重链和含有SEQ ID NO：113的抗体轻链；和选自由式(5)化合物、式(6)化合物和式(7)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第一缀合位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第二缀合位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第四裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图2B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和SEQ ID NO：125的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和SEQ ID NO：125的抗体轻链；和选自由式(5)化合物、式(6)化合物和式(7)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第三蛋白酶裂解位点、第二缀合位点、第四蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第四裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第六裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二效应分子和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第五蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第六裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图2C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图3A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一缀合位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二缀合位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图3B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：114或122的抗体重链和含有SEQ ID NO：115或123的抗体轻链；和选自由式(1)、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一缀合位点、第一蛋白酶裂解位点、第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图3C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第一裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第二裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图4A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链；和选自由式(5)化合物、式(6)化合物和式(7)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第一裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第二裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图4B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：114或122的抗体重链和含有SEQ ID NO：115或123的抗体轻链；和选自由式(1)化合物、式(2)化合物、式(3)化合物和式(4)化合物组成的组的治疗剂。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：114或122的抗体重链和含有SEQ ID NO：115或123的抗体轻链；和选自由式(5)化合物、式(6)化合物和式(7)化合物组成的组的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一缀合位点、第一蛋白酶裂解位点、第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解位点的第一效应分子(例如，小分子药物)；(F)包含第二接头和第四裂解位点的第二效应分子(例如，小分子药物)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一效应分子通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二效应分子通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三裂解位点裂解后，所述第一效应分子从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第四裂解位点裂解后，所述第二效应分子从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个效应分子缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图4C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图5A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：112的抗体重链和含有SEQ ID NO：113的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含选自由SEQ ID NO：68-73组成的组的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第一缀合位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第二缀合位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图5B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和含有SEQ ID NO：125的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含选自由SEQ ID NO：68-73组成的组的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第三蛋白酶裂解位点、第二缀合位点、第四蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图5C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解位点的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第四裂解位点的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图6A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：112的抗体重链和含有SEQID NO：113的抗体轻链、包含SEQ ID NO：157的核酸序列的CpG ODN和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的裂解位点，其中所述裂解位点位于所述抗体重链与所述CpG ODN之间。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第一缀合位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点(例如，uPA裂解位点)、第二缀合位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解位点的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第四裂解位点的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图6B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和含有SEQ IDNO：125的抗体轻链、包含SEQ ID NO：157的核酸序列的CpG ODN和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的裂解位点，其中所述裂解位点位于所述抗体重链与所述CpG ODN之间。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第三蛋白酶裂解位点、第二缀合位点、第四蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第四裂解位点的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第六裂解位点的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第五裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第六裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图6C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图7A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含选自SEQ ID NO：68-73的组的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一抗原结合片段(例如，scFv/、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图7B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：114或122的抗体重链和含有SEQ ID NO：115或123的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含选自由SEQ ID NO：68-73组成的组的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一缀合位点、第一蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头的第二效应分子(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图7C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一缀合位点；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二缀合位点；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第一裂解位点的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第二裂解位点的第二效应分子(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图8A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链、包含SEQ ID NO：157的核酸序列的CpG ODN和包含SEQ IDNO：147的氨基酸序列的裂解位点，其中所述裂解位点位于所述抗体重链与所述CpG ODN之间。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第一裂解位点的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第二裂解位点的第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图8B中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：114或122的抗体重链和含有SEQ ID NO：115或123的抗体轻链、包含SEQ ID NO：157的核酸序列的CpG ODN和包含SEQ ID NO：147的氨基酸序列的裂解位点，其中所述裂解位点位于所述抗体重链与所述CpG ODN之间。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一缀合位点、第一蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二缀合位点、第二蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)包含第一接头和第三裂解的第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)包含第二接头和第四裂解的第二效应分子(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸通过所述第一接头缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸通过所述第二接头缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图8C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点和第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点和第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图9A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有选自由SEQ ID NO：106、108和110组成的组的序列的抗体重链和含有选自由SEQ ID NO：107、109和111组成的组的序列的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含SEQID NO：67的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)和第一抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二蛋白酶裂解位点、第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)和第二抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图9B中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一蛋白酶裂解位点、第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)、第二蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第三蛋白酶裂解位点、第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)、第四蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv/scFab/纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一寡核苷酸和所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；其中在所述第三蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二寡核苷酸和所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第四蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图9C中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链和第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链和第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图10A中。示例性靶向缀合物可包含：靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：100的抗体重链和含有SEQ ID NO：101的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含SEQ ID NO：67的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图10B中。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(A)第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端包含：第一抗体重链、第一非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)、第一蛋白酶裂解位点和第一抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(B)第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端包含：第二抗体重链、第二非共价缀合位点(例如，寡核苷酸结合多肽)、第二蛋白酶裂解位点和第二抗原结合片段(例如，scFv、scFab或纳米抗体)；(C)第一抗体轻链；(D)第二抗体轻链；(E)第一寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；(F)第二寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)；其中所述第一抗体重链和所述第一抗体轻链形成特异性地结合至第一表位的第一抗原结合位点；其中所述第二抗体重链和所述第二抗体轻链形成特异性地结合至第二表位的第二抗原结合位点；其中所述第一抗原结合片段特异性地结合至第三表位；其中所述第二抗原结合片段特异性地结合至第四表位；其中所述第一寡核苷酸非共价缀合至所述第一缀合位点；其中所述第二寡核苷酸非共价缀合至所述第二缀合位点；其中在所述第一蛋白酶裂解位点裂解后，所述第一抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放；并且其中在所述第二蛋白酶裂解位点裂解后，所述第二抗原结合片段从所述靶向缀合物中释放。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第一缀合位点。在一些实施方案中，两个或更多个寡核苷酸缀合至第二缀合位点。示例性靶向缀合物示于图10C中。
在根据此部分中描述的靶向缀合物中任一种的一些实施方案中，第一和第二效应分子相同。在一些实施方案中，第一和第二效应分子不同。在一些实施方案中，靶向部分是但特异性的。在一些实施方案中，靶向部分是多特异性的，如双特异性或三特异性。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链和转谷氨酰胺酶缀合位点，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：100具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：101具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链和转谷氨酰胺酶缀合位点，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：104具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：105具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、转谷氨酰胺酶缀合位点、蛋白酶裂解位点和寡核苷酸结合多肽，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：106具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：107具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、转谷氨酰胺酶缀合位点、蛋白酶裂解位点和寡核苷酸结合多肽，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：108具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：109具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、转谷氨酰胺酶缀合位点、蛋白酶裂解位点和寡核苷酸结合多肽，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：110具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：111具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、蛋白酶裂解位点和转谷氨酰胺酶缀合位点；其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：112具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：113具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、转谷氨酰胺酶缀合位点和scFab，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：114具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：115具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、蛋白酶裂解位点、转谷氨酰胺酶缀合位点和scFab，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ IDNO：116具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：117具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、转谷氨酰胺酶缀合位点和scFv，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：122具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三和第四多肽链包含与SEQ ID NO：123具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链、蛋白酶裂解位点、转谷氨酰胺酶缀合位点和scFv，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ IDNO：124具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三和第四多肽链包含与SEQ ID NO：125具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链和scFv，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：126具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三和第四多肽链包含与SEQ ID NO：127具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)效应分子，其中所述效应分子缀合至转谷氨酰胺酶缀合位点。在一些实施方案中，效应分子是治疗剂，如选自式(1)-(7)的化合物。在一些实施方案中，效应分子是寡核苷酸，如CpG寡核苷酸，例如包含选自由SEQ ID NO：66-73和157组成的组的核酸序列的寡核苷酸。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链和转谷氨酰胺酶缀合位点，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：104具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：105具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)SEQ ID NO：70的CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向缀合物还包含一个或多个uPA裂解位点，所述一个或多个uPA裂解位点包含选自SEQ ID NO：50-55的一个或多个氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：104的抗体重链和含有SEQ ID NO：105的抗体轻链；和CpG ODN，所述CpG ODN包含SEQ ID NO：70的核酸序列。在一些实施方案中，靶向缀合物还包含一个或多个uPA裂解位点，所述一个或多个uPA裂解位点包含选自SEQ ID NO：50-55的一个或多个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含：(a)第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和第二多肽链从N末端至C末端包含：抗体重链和转谷氨酰胺酶缀合位点，其中所述第一多肽链和所述第二肽链包含与SEQ ID NO：124具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；(b)包含抗体轻链的第三多肽链和第四多肽链，其中所述第三多肽链和第四多肽链包含与SEQ ID NO：125具有至少80％(例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、或99％、或100％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列；和(c)式(1)化合物的治疗剂。在一些实施方案中，靶向缀合物还包含一个或多个uPA裂解位点，所述一个或多个uPA裂解位点包含选自SEQ ID NO：50-55的一个或多个氨基酸序列。
在本文所述的任何实施方案中，提供了靶向缀合物，所述靶向缀合物包含靶向部分，所述靶向部分包含含有SEQ ID NO：124的抗体重链和含有SEQ ID NO：125的抗体轻链；和式(1)化合物的治疗剂。在一些实施方案中，靶向缀合物还包含一个或多个uPA裂解位点，所述一个或多个uPA裂解位点包含选自SEQ ID NO：50-55的一个或多个氨基酸序列。
III.使用方法
本文所述的靶向缀合物及其组合物(如药物组合物)可用于治疗或诊断各种疾病，如癌症，包括实体瘤或血液癌症、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗个体(如人)的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所述的任一种靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含选自由治疗剂和寡核苷酸组成的组的效应分子。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌和子宫癌。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病(如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含式I结构的靶向缀合物：
其中：A1是特异性地结合至与所述疾病相关的第一靶分子的第一靶向部分；A2是特异性地结合至与所述疾病相关的第二靶分子的第二靶向部分；P1是第一裂解位点；P2是第二裂解位点；P3是第三裂解位点；C是缀合位点；L是接头；D是治疗剂或寡核苷酸；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1a＝1-20；并且b＝1-20。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。在一些实施方案中，患病部位是肿瘤部位。在一些实施方案中，裂解在肿瘤部位，例如在肿瘤微环境中发生。在一些实施方案中，裂解在细胞外，如肿瘤微环境中的肿瘤细胞外发生。
在一些实施方案中，提供了诊断个体(如人)的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本文所述的任一种靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含可检测标记，并且其中检测到所述可检测标记指示所述疾病的存在。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、甲状腺癌和子宫癌。
在一些实施方案中，提供了诊断个体的疾病(如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含式I结构的靶向缀合物：
其中：A1是特异性地结合至与所述疾病相关的第一靶分子的第一靶向部分；A2是特异性地结合至与所述疾病相关的第二靶分子的第二靶向部分；P1是第一裂解位点；P2是第二裂解位点；P3是第三裂解位点；C是缀合位点；L是接头；D是可检测标记；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20；并且其中检测到所述可检测标记指示存在所述疾病。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。在一些实施方案中，患病部位是肿瘤部位。在一些实施方案中，裂解在肿瘤部位，例如在肿瘤微环境中发生。在一些实施方案中，裂解在细胞外，如肿瘤微环境中的肿瘤细胞外发生。
在一些实施方案中，提供了将效应分子(例如，治疗剂、寡核苷酸和/或可检测标记)优先递送至需要用所述效应分子治疗或诊断的个体的患病部位的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含式I结构的靶向缀合物，其中：A1是特异性地结合至与所述疾病相关的第一靶分子的第一靶向部分；A2是特异性地结合至与所述疾病相关的第二靶分子的第二靶向部分；P1是第一裂解位点；P2是第二裂解位点；P3是第三裂解位点；C是缀合位点；L是接头；D是效应分子；x＝0或1；y＝0或1；z＝0或1；u＝0或1；v＝0或1；a＝1-20；并且b＝1-20。在一些实施方案中，所述疾病选自由以下组成的组：肿瘤、感染、炎症性疾病、自身免疫性疾病和免疫缺陷疾病。
在一些实施方案中，所述方法增加效应分子在需要用所述效应分子治疗的个体的患病部位的有效浓度。在一些实施方案中，与以相同有效量向个体施用效应分子相比，效应分子的有效浓度在患病部位增加约10％、20％、50％、1×、2×、5×、10×或更多诊断任一个。
在一些实施方案中，所述方法减少患有需要用效应分子治疗的疾病的个体中效应分子与正常组织中的靶分子的结合。在一些实施方案中，与向个体施用效应分子相比，靶向缀合物的施用使效应分子与其在正常细胞上的靶分子的结合减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。
在一些实施方案中，所述方法降低效应分子对患有需要用效应分子治疗的疾病的个体的毒性(如中靶组织外毒性)。在一些实施方案中，与向个体施用相同有效量的效应分子相比，靶向缀合物的施用使效应分子的毒性降低约约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。
还提供了本文所述的任一种靶向缀合物用于治疗或诊断有需要的个体的疾病，或本文所述的任一种靶向缀合物在制备用于治疗或诊断有需要的个体的疾病的药物中的用途。
本文所述的靶向缀合物可通过多种途径施用于个体，例如，与靶向缀合物中的靶向部分相同的施用途径。示例性施用途径包括但不限于胃肠外、静脉内、肌内和皮下施用。
向个体施用的靶向缀合物的有效量、合适的剂量和给药方案可根据特定组合物、施用途径和所治疗的特定疾病类型而变化。在一些实施方案中，靶向缀合物的有效量是基于靶向部分和/或效应分子(例如，治疗剂、寡核苷酸和/或可检测标记)的有效量。
在一些实施方案中，个体是哺乳动物，如人、啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。
在一些实施方案中，靶向缀合物单独使用或与其他抗癌治疗组合使用，所述其他抗癌治疗如化学治疗剂、电离辐射、激素疗法、细胞因子、免疫疗法、细胞疗法、疫苗、单克隆抗体、抗血管生成剂、靶向治疗剂(小分子药物)或生物疗法。例如，化学治疗剂包括但不限于抗肿瘤烷基化剂，如氮芥(盐酸氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、白消安)、亚硝基脲(BCNU/卡莫司汀、CCNU/洛莫司汀、MeCCNU/司莫司汀、福莫司汀、链脲佐菌素)、四嗪类(达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺)、氮丙啶类(噻替派、丝裂霉素C、AZQ/地吖醌)、盐酸丙卡巴肼、六甲密胺、阿多来新；顺铂及其类似物，顺铂、卡铂、奥沙利铂；抗代谢药、甲氨蝶呤、其他抗叶酸剂、5-氟嘧啶(5-氟尿嘧啶/5-FU)、阿糖胞苷、阿扎胞苷、吉西他滨、6-硫嘌呤(6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤)、羟基脲；拓扑异构酶相互作用剂表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)、喜树碱类似物(盐酸拓扑替康、伊立替康、9-氨基喜树碱)、蒽环类药物及相关化合物(盐酸多柔比星、表柔比星脂质体、盐酸道诺霉素、盐酸道诺霉素柠檬酸盐脂质体、表柔比星、伊达比星)、米托蒽醌、洛索蒽醌、放线菌素-D、安吖啶、吡唑并吖啶；抗微管剂长春花生物碱(长春地辛、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨)、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛)、雌莫司汀；氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、2'-脱氧柯福霉素、高三尖杉酯碱、苏拉明、博来霉素、L-天冬酰胺酶、氟尿苷、卡培他滨、克拉屈滨、亚叶酸、喷司他丁、类视黄醇(全反式视黄酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、异维甲酸、维甲酸)、帕米膦酸盐、沙利度胺、环孢菌素；激素疗法抗雌激素(他莫昔芬、托瑞米芬、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(氨鲁米特、来曲唑/弗隆、阿那曲唑/arirnidex、依西美坦/阿诺新、伏氯唑)、促性腺激素释放激素类似物、抗雄激素(氟他胺、康士德)、氟甲睾酮、己烯雌酚、奥曲肽、醋酸亮丙瑞林、诺雷德；类固醇和非类固醇抗炎剂(地塞米松、泼尼松)；单克隆抗体，包括但不限于，抗HER2/neu抗体(赫赛汀/曲妥珠单抗)、抗EGFR抗体(西妥昔单抗/爱必妥、ABX-EGF/帕尼单抗、尼妥珠单抗)、抗CD20抗体(美罗华/利妥昔单抗、替伊莫单抗/泽娃灵、托西莫单抗/百克沙)、抗CD33抗体(吉妥珠单抗/麦罗塔)、阿仑单抗/坎帕斯、贝伐单抗/安维汀；以及小分子抑制剂。
IV.药物组合物、药盒和制品
本申请还提供了包含本文公开的任一种靶向缀合物的组合物(例如，药物组合物)、药盒和制品。在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任一种靶向缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，组合物(如药物组合物)包含载体、稀释剂或赋形剂，其可促进向有需要的个体施用所述组合物。载体、稀释剂和赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖例如乳糖或多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理上相容的溶剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含多种靶向缀合物。在一些实施方案中，药物组合物中的靶向缀合物分子不具有相同数量的效应分子。在一些实施方案中，药物组合物中的至少两种靶向缀合物包含不同数量的效应分子。药物组合物中效应分子与靶向部分之间的比率在一定范围内，以便药物组合物获得监管批准。
在一些实施方案中，药物组合物的平均药物载量是至少约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或更大中的任一个。在一些实施方案中，药物组合物的平均药物载量是不超过约100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1中的任一个。在一些实施方案中，药物组合物的平均药物载量是约2:1-4:1、2:1-8:1、2:1-10:1、2:1-16:1、4:1-20:1、10:1-20:1、20:1-40:1、40:1-100:1、2:1-20:1、2:1-40:1或10:1-40:1中的任一个。
在一些实施方案中，药物组合物具有至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、17:1、18:1、19:1或20:1中的任一个的平均效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，药物组合物具有不超过约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1中的任一个的平均效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。在一些实施方案中，药物组合物具有约1:1-2:1、2:1-4:1、4:1-8:1、1:1-10:1、1:1-16:1、4:1-20:1、10:1-20:1、1:1-20:1或2:1-20:1中的任一个的平均效应分子与靶向部分(例如，第一靶向部分和/或第二靶向部分)比率。
本文所述的药物组合物可按照普遍接受的程序通过混合成分来制备。例如，可在搅拌机或其他标准设备中简单地混合所选组分以产生浓缩混合物，然后可通过添加水或增稠剂以及可能的缓冲液来控制pH或额外的溶质来控制张力而调节至最终浓度和粘度。
其他药学上可接受的载体及其制剂描述于标准制剂论文中，例如，E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences。还参见Wang,Y.J.和Hanson,M.A.“ParenteralFormulations of Proteins and Peptides：Stability and Stabilizers,”Journal ofParenteral Science and Technology,Technical Report No.10,增刊42:2S(1988)。
在一些实施方案中，药物组合物是液体混悬液。在一些实施方案中，药物组合物是无菌组合物。
还提供了包括本文所述的任一种靶向缀合物的药盒。本发明的药盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。药盒可任选地提供额外的组分，如缓冲剂和解释性信息。因此，本申请还提供制品，所述制品包括小瓶(如密封小瓶)、瓶、广口瓶、软包装等。
制品可包括容器和在所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。通常，容器容纳有组合物，所述组合物可有效治疗或诊断如本文所述的疾病，并且可具有无菌进入口。标签或包装插页指示组合物用于治疗或诊断个体的疾病。标签或包装插页还将包括用于将组合物施用于个体的说明。
包装插页是指习惯上包括于治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及此类治疗或诊断产品使用的警告的信息。在一些实施方案中，包装插页指示组合物用于治疗或诊断疾病(如癌症)。
另外，制品还可包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。它还可包括从商业和使用者的角度看所需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
实施例
以下实施例仅意图例示本发明，并且因此不应视为以任何方式限制本发明。通过说明而不是通过限制的方式提供以下实施例和详述。
实施例1uPA底物肽的设计和筛选
1.肽裂解效率
尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)底物肽(SEQ ID NO：50-54)针对uPA裂解底物的效率、但对组织型纤溶酶原激活物(tPA)消化的抗性进行筛选。将底物肽和PBS添加至384板并与uPA或tPA混合。通过荧光共振能量转移(FRET)方法测量消化效率。将所有肽溶液使用20mM PBS pH＝7.4稀释至50μL。实验设计显示在表2中。结果显示在表3-5中。
表2.实验设计
uPA有效地裂解了SEQ ID NO：50-54的肽，如下表3所示：
表3.SEQ ID NO：50-54的uPA裂解
荧光强度达到平稳期所需的时间越短，uPA消化越快。荧光强度的增加倍数越高，uPA消化越有效。因此，肽的uPA消化速率的排序为：SEQ ID NO：52、54>SEQ ID NO：53>SEQID NO：50>SEQ ID NO：51。反应效率的排序为SEQ ID NO：51>SEQ ID NO：50>SEQ ID NO：54>SEQ ID NO：52>SEQ ID NO：53。
在7.5×10-3mg/mL tPA浓度下，仅SEQ ID NO：51和52被适度消化，如表4所示：
表4.在7.5×10-3mg/mL浓度下的tPA消化
在2.25×10-2mg/mL tPA浓度下，SEQ ID NO：51、52和54被消化，如表5所示：
表5.在2.25×10-2mg/mL浓度下的tPA消化
2.通过FRET测量的血浆中底物肽的稳定性
将血浆与抗生素(青霉素-链霉素)混合，然后将SEQ ID NO：50-54的肽添加至血浆混合物。将反应混合物在室温下孵育。在0小时、8小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时、120小时和144小时取样用于FRET测量。实验设计显示在表6中。
表6.实验设计
血浆中每种底物肽的荧光强度的增加倍数显示在下表7中：
表7.SEQ ID NO：50-54的荧光强度的增加倍数
血浆中肽稳定性的排序为大约：SEQ ID NO：53>SEQ ID NO：51、52>SEQ ID NO：50>SEQ ID NO：54。
3.来自动力学测量的血浆中底物肽的稳定性
如表8所示设计实验。将血浆-肽混合物在室温下孵育12小时，并连续测量荧光强度。结果显示在表9中。PS：青霉素-链霉素。
表8.实验设计
表9.底物稳定性的动力学测量
血浆中肽稳定性的排序为大约：SEQ ID NO：52、53>SEQ ID NO：50>SEQ ID No：51、54。对于SEQ ID NO 52和53，荧光强度随时间分别增加至2.0倍和1.7倍，但在12小时内没有达到平稳期。SEQ ID NO：50在4.8小时内达到平稳期，并且荧光强度的最大增加倍数是2.8倍。SEQ ID NO：51和54的荧光强度在3.6小时内分别增加至2.3倍和2.7倍。
4.抗体中的uPA消化
在重链中含有uPA底物序列的抗体Ab3C(重链序列SEQ ID NO：108，轻链序列SEQID NO：109)、Ab3E(重链序列SEQ ID NO：110，轻链序列SEQ ID NO：111)和Ab5D(重链序列SEQ ID NO：124，轻链序列SEQ ID NO:125)用于测试抗体中的uPA消化效率。不含uPA底物序列的抗体Ab5C(重链序列SEQ ID NO：122，轻链序列SEQ ID NO:123)用作对照。实验设计显示在下表10中。将反应混合物在37℃下孵育24小时。
表10.实验设计
1Ab3C、Ab3E、Ab5C和Ab5D的初始浓度分别是2.12mg/mL、1.07mg/mL、9.2mg/mL和7.8mg/mL。2uPA的初始浓度是0.25mg/mL。3EDTA的浓度是1mM。
通过LC-MS分析uPA消化产物。Ab3C、Ab3E和Ab5D的重链被uPA裂解以产生具有预期分子量的片段。Ab5C未被uPA裂解。
实施例2.药物接头的设计、合成和分析
1.实验目的
(1)设计含有不同分子量的PEG间隔子的MMAE药物接头，研究谷氨酰胺转移酶催化的MMAE药物接头与多肽和抗体缀合的偶联效率，并筛选具有高偶联效率的PEG间隔子和药物接头。(2)设计连接至SN-38的不同位置的接头，并且筛选具有高偶联效率、稳定性和生物活性的SN-38药物接头。
2.药物接头的合成
化学合成了式(1)-(7)的化合物并通过HPLC、LC-MS和H-NMR对其进行了测试。药物接头在符合质量标准后用于后续实验。
3.组织蛋白酶B对药物接头的限制酶消化
为了模拟药物在生理条件下的释放，使药物接头经受组织蛋白酶B的裂解，之后发生消除反应并释放未修饰的药物。
3.1反应机制
(1)式(1)化合物消化
(2)式(2)化合物消化
3.2.实验方法
将冻干的组织蛋白酶B酶粉末溶解于130μL纯水中，并且分装到13个管中，每个管10μL。此时，每个管的浓度是0.15mg/ml(4.15μM)。然后将激活缓冲液(20mM乙酸钠、30mMDTT、15mM EDTA，pH 5.5)添加至酶的管中以在室温下激活酶1小时。将经激活的酶用酶消化缓冲液(25mM乙酸钠，1mM EDTA，pH 5.5)稀释至125nM。将药物接头添加至经激活的酶中至最终浓度62.5μM，并在37℃下孵育3小时。
3.3结果和结论
式(1)和(2)的化合物均被有效消化。式(1)化合物被消化以释放SN38，并且式(2)化合物被消化以释放SN38衍生物。
4.稳定性研究
通过测量式(1)化合物、式(2)化合物和SN-38中的内酯和内酯开环产物，在不同pH的缓冲液、血浆和动态pH溶液中测试了药物的稳定性。
4.1SN-38的稳定性
分别制备pH为4的盐酸溶液和pH为10的氢氧化钠溶液。将5mg的SN-38溶解于5mL乙腈中。通过在室温下在pH＝10下振荡SN-38持续10分钟、然后将pH调回4并在取样前在室温下振荡10分钟来测量SN-38在pH变化(pH＝10至pH＝4)的溶液中的稳定性。然后将SN-38在室温下在振荡器上孵育过夜(16小时)，然后进行测定。
表11.SN-38稳定性测试的实验设计
4.2式(1)和(2)化合物在缓冲液中的稳定性
pH＝7.4的20mM磷酸盐缓冲液(1L)的制备：将8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、7.3g磷酸氢二钠十二水合物和0.48g磷酸二氢钾溶解于水中并稀释至1L，pH 7.4。
将缓冲液用饱和磷酸溶液和氢氧化钠溶液调节至pH 9.0、7.0和5.0。在研究药物在pH变化(9至5)溶液中的稳定性时，将式(1)/(2)化合物在pH 9下在室温下在振荡器上孵育10分钟。将溶液pH值调回5，并在测试前在室温下振荡过夜(16小时)。
表12.缓冲液中式(1)/(2)化合物稳定性测试的实验设计
4.3式(1)和(2)化合物在血浆中的稳定性
蛋白质沉淀溶液的制备：将1g NaCl添加至3mL甲醇和5mL乙腈，搅拌1小时，然后在使用前在室温下静置1小时。
然后将200μL蛋白质沉淀溶液添加至反应溶液并以8000g离心10分钟。收集上清液用于分析。
表13.血浆中式(1)/(2)化合物稳定性测试的实验设计
4.4结果和结论
SN-38在酸性条件下以内酯形式存在(94％)，并且在碱性条件下以内酯开环形式(92％)存在。在测试前使SN-38经受碱性条件持续10分钟且然后经受酸性条件后，56％的SN-38以内酯形式存在，并且存在42％的内酯开环产物。孵育过夜后，86％以内酯形式存在，并且13％以内酯类开环产物形式存在。
式(1)化合物在酸性条件下主要以内酯形式存在(88％)，并且在碱性条件下其主要以呈开环形式的内酯形式存在(92％)。在测试前使式(1)化合物经受碱性条件持续10分钟且然后经受酸性条件后，98％呈内酯形式，并且0.21％呈内酯开环产物形式。式(1)化合物在血浆中部分水解，主要呈内酯开环形式；
式(2)化合物受pH影响较小，在缓冲液中98％以内酯形式存在。式(2)化合物在血浆中的稳定性也优于式(2)化合物在血浆中的稳定性。式(2)化合物在血浆中主要以内酯形式存在，并且开环产物基本不可见。
实施例3.CpG-ODN-接头的设计和合成
设计、合成了CpG ODN(胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸)和SEQ ID NO：66-73的接头和式VIII并测试了它们在谷氨酰胺转移酶催化后与谷氨酰胺转移酶底物序列的偶联效率。CpG-ODN用亚磷酰胺化学合成，并通过电泳和质谱进行表征。CpG ODN接头的式是5'氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN(式IV)和3’氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN(式V)，其中间隔子是(CH2)n-(PEG)m，h、n和m是整数，h＝0或1，n≥1，并且m≥0，P是裂解位点。
实施例4.谷氨酰胺转移酶缀合肽的设计和筛选
1.实验目的
使用谷氨酰胺转移酶(转谷氨酰胺酶)研究了底物肽(SEQ IDNo:1-12)与小分子毒素(药物接头，式II-V)之间的偶联效率。选择具有高偶联效率的底物肽用于开发肽缀合物、蛋白质缀合物和抗体缀合物。
表14.底物肽的序列
2.肽合成和分析
肽通过常规固相合成方法合成，并通过HPLC和LC-MS进行分析。
3.肽合成和分析
在本文使用了微生物/细菌转谷氨酰胺酶(MTG/BTG)。MTG/BTG的酶活性通过本领域的常规方法测定。然后使用谷氨酰胺转移酶将药物接头与SEQ ID NO：1-12的肽交联。肽与药物接头之间的反应性由产物的HPLC峰面积确定。
将肽用pH＝7.4的PBS稀释至10mg/mL。将药物接头(式(1)-(4)化合物)溶解于DMSO中至31mg/mL。反应混合物含有最终浓度为1mg/mL的肽、最终浓度为20％的DMSO，并且肽:药物接头的摩尔比是1:5。将谷氨酰胺转移酶添加至反应混合物中至最终浓度25U/mL。在室温下16小时后通过RP-HPLC测量反应。结果显示在表15中。
表15.交联产物的HPLC峰面积.DPR：最终产物的药物肽比率
4.结论
在SN-38药物之间，与位置10的羟基基团处的接头反应的式(1)化合物相较于与位置20处的接头反应的式(2)化合物具有更高反应性。在两种MMAE药物之间，式(4)化合物(8个PEG间隔子)与式(3)化合物(4个PEG间隔子)相比具有更高反应性。
式(1)化合物能够与DPR＝4的SEQ ID NO：7-10、与DPR＝3的SEQ ID NO 1-6和11-12以及一些DPR＝2产物交联。肽的交联反应性的总体顺序大约是：SEQ ID NO：9≈SEQ IDNO：10>SEQ ID NO：7≈SEQ ID NO：8>SEQ ID NO：5≈SEQ ID NO：4≈SEQ ID NO：3>SEQ IDNO：2>SEQ ID NO：6>SEQ ID NO：12≈SEQ ID NO：11>SEQ ID NO：1。
式(2)化合物能够与DPR＝3的SEQ ID NO:1、与DPR＝2的SEQ ID NO：2、5和6以及与DPR＝1的所测试的其他肽交联。肽的交联反应性的总体顺序大约是：SEQ ID NO：1>SEQ IDNO：5>SEQ ID NO：6>SEQ ID NO：4>SEQ ID NO：2>SEQ ID NO：12>SEQ ID NO：3>SEQ ID NO：8、9、10、11>SEQ ID NO：7。
式(3)化合物主要与DPR＝1的肽交联。肽的交联反应性的总体顺序大约是：SEQ IDNO：8、9、10、12>SEQ ID NO：5、7>SEQ ID NO：4、6>SEQ ID NO：11>SEQ ID NO：3>SEQ ID NO：1、2。
式(4)化合物能够与DPR＝3的SEQ ID NO：2、3、4和7、与DPR＝2的SEQ ID NO：6、8、11交联，并且肽的交联反应性的总体顺序大约为：SEQ ID NO：2、3、4、7>SEQ ID NO：8>SEQID NO：6、11>SEQ ID NO：1>SEQ ID NO：5、10>SEQ ID NO：9、12。
实施例5.抗体的表征
表达了单特异性PD-L1抗体Ab2B(重链SEQ ID NO:100，轻链SEQ ID NO:101)、Ab3A(重链SEQ ID NO:104，轻链SEQ ID NO:105)、Ab3B(重链SEQ ID NO:106，轻链SEQ ID NO:107)、Ab3C(重链SEQ ID NO:108，轻链SEQ ID NO:109)、Ab3E(重链SEQ ID NO:110，轻链SEQID NO:111)、Ab3F(重链SEQ ID NO:112，轻链SEQ ID NO:113)以及双特异性PD-L1/Trop-2抗体Ab4A(重链SEQ ID NO:114，轻链SEQ ID NO:115)、Ab4B(重链SEQ ID NO:116，轻链SEQID NO:117)、Ab5A(重链SEQ ID NO:118，轻链SEQ ID NO:119)、Ab5B(重链SEQID NO:120，轻链SEQ ID NO:121)、Ab5C(重链SEQ ID NO:122，轻链SEQ ID NO:123)、Ab5D(重链SEQ IDNO:124，轻链SEQ ID NO:125)、Ab5E(重链SEQ ID NO:126，轻链SEQ ID NO:127)和Ab5F(重链SEQ ID NO:128，轻链SEQ ID NO:129)并测试了其对人PD-L1/B7-H1/CD274的亲和力并且进一步测试了双特异性抗体的人Trop-2/TACSTD2蛋白的亲和力。对PD-L1的亲和力的结果显示在表20中。对Trop-2的亲和力的结果显示在表21中。结果显示了单特异性和双特异性抗体均保持对一种或多种抗原的高亲和力。
表16.抗体对PD-L1的亲和力
编号 配体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
1 Ab2B 1.125E+06 1.658E-04 1.474E-10
2 Ab3A 7.363E+05 2.124E-04 2.884E-10
3 Ab3B 1.018E+06 1.163E-04 1.142E-10
4 Ab3C 1.010E+06 2.399E-04 2.375E-10
5 Ab3E 8.390E+05 2.527E-04 3.012E-10
6 Ab3F 7.311E+05 2.225E-04 3.044E-10
7 Ab4A 9.742E+05 2.797E-04 2.871E-10
8 Ab4B 9.160E+05 2.247E-04 2.453E-10
9 Ab5A 1.091E+06 2.649E-04 2.428E-10
10 Ab5B 1.772E+06 2.716E-04 1.533E-10
11 Ab5C 1.781E+06 2.822E-04 1.572E-10
12 Ab5D 1.137E+06 2.703E-04 2.377E-10
13 Ab5E 1.611E+06 2.823E-04 1.753E-10
14 Ab5F 8.818E+05 2.205E-04 2.500E-10
表17.抗体对Trop-2的亲和力
实施例6.抗体药物缀合物(ADC)的合成和表征
1.单特异性抗体的抗体-药物缀合
将药物-接头(式(1)和(2)化合物)缀合至SEQ ID NO：104(包含重链和谷氨酰胺转移酶底物序列)和105(轻链)的抗PD-L1抗体Ab3A或SEQ ID NO：112(包含重链、uPA底物肽和谷氨酰胺转移酶底物序列)和113(轻链)的抗PD-L1抗体Ab3F。缀合实验的实验设计显示在表18中。将反应混合物在室温下孵育16小时，并通过质谱法测定缀合产物的药物与抗体比率(DAR)。
表18.实验设计
对于ADC Ab3A-CD-1，DAR值为3.93，并且对于Ab3A-CD-2，DAR值为3.77。对于ADCAb3F-CD-1，DAR值为4.98，并且对于Ab3F-CD-2，DAR值为4.85。
2.双特异性抗体的抗体-药物缀合
将药物接头(式(1)和(2)化合物)缀合至抗PD-L1和抗Trop-2双特异性抗体Ab5C(重链SEQ ID NO：122，轻链SEQ ID NO：123)和Ab5D(重链SEQ ID NO：124，轻链SEQ ID NO:125)。通过质谱法测定缀合产物的药物与抗体比率(DAR)。将反应混合物在室温下孵育16小时。缀合实验的实验设计和ADC的DAR值显示在表19中。
表19.实验设计和ADC的DAR
3.ADC的抗原结合能力
测试了本实施例中的ADC对人PD-L1/B7-H1/CD274的亲和力，并且进一步测试了双特异性抗体-药物接头缀合物对人Trop-2/TACSTD2的亲和力。结果显示在表20中。
表20.ADC的亲和力
实施例7.抗体寡核苷酸缀合物(AOC)的合成和表征
1.非共价抗体-CpG ODN缀合
将SEQ ID NO：67的CpG ODN非共价缀合至抗PD-L1抗体Ab3B(重链SEQ ID NO：106和轻链SEQ ID NO:107)、Ab3C(重链SEQ ID NO：108和轻链SEQ ID NO:109)和Ab3E(重链SEQID NO：110和轻链SEQ ID NO:111)。缀合实验的设计显示在表21中。将反应混合物在室温下孵育16小时，并通过凝胶迁移测定确定缀合产物的药物与抗体比率(DAR)。结果显示在图11中。
表21.实验设计
图11显示了SEQ ID NO：67有效地非共价结合至抗体。结合效率的顺序为Ab3C>Ab3B>Ab3E。此外，当mAb:CpG的摩尔比高于2:1时，所有CpG ODN都与Ab3C结合。
2.共价抗体-CpG ODN缀合
将包含SEQ ID NO:68、69和71的CpG序列的CpG ODN-接头分别通过谷氨酰胺转移酶共价缀合至Ab3A(重链SEQ ID NO:104，轻链SEQ ID NO:105)。将CpG ODN-接头与Ab3A以40:1摩尔比混合。将谷氨酰胺转移酶添加至反应混合物至最终浓度5U/mL,并将反应混合物在室温下孵育16小时。通过凝胶迁移测定分析缀合产物。结果显示在图12和13中。
图12和13显示了谷氨酰胺转移酶能够催化CpG ODN-接头和抗体与谷氨酰胺转移酶底物序列之间的缀合。包含SEQ ID NO：71的序列的CpG ODN接头表现出最高缀合效率，其次是SEQ ID NO：68和69的CpG ODN。这些结果表明接头的长度影响缀合效率，其中三者中最长的具有最高偶联效率。
实施例8.针对PD-1/PD-L1阻断的免疫检查点生物测定
荧光素酶报告子测定用于阻断PD-1/PD-L1对NFAT途径的激活的机制分析。生物测定由两种遗传工程化细胞系组成：PD-1效应细胞，其是在NFAT启动子控制下表达人PD-1和荧光素酶报告基因(NFAT-Luc2)的Jurkat T细胞；PD-L1 aAPC/293T-OS8细胞，其是表达人PD-L1的293T-OS8细胞。简而言之，将Jurkat-NFAT-Luc2-PD1稳定效应细胞和293T-OS8-PD-L1稳定细胞系以1:1的比率在连续稀释的抗体存在下一式三份在37℃、5％CO2下共培养6小时。使用ONE-StepTM荧光素酶测定系统(ONE-StepTMLuciferase Assay System，BPSBioscience)测量发光。
结果和结论
表22.PD-1/PD-L1免疫阻断报告子测定的IC50总结
药物名称 IC50(nM)
Ab2B 0.456nM
Ab3A 0.387nM
Ab5C 0.593nM
Ab5D 0.497nM
阿特珠单抗 0.731nM
从PD-1/PD-L1免疫阻断报告子测定获得的IC50值总结于表22中。药物的剂量响应曲线显示在图14中。结果揭示，都基于抗体Ab2B构建的融合抗体Ab3A、双特异性抗体Ab5C和Ab5D具有与Ab2B相似的免疫阻断效力，这也与参考抗体阿特珠单抗相似。
实施例9.体外细胞毒性研究
细胞系构建和培养条件
使用具有人PDL1基因(NM_014143)序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源人PDL1基因的人结肠直肠腺癌HCT15细胞系。所述细胞系被命名为HCT15-hPDL1。将细胞使用补充有10％FBS加1μg/ml嘌呤霉素的RPMI1640培养基在37℃下在5％CO2下培养。
细胞毒性研究
根据制造商的说明书，通过发光细胞存活力测定(Luminescent Cell Viability Assay，Promega)来测定体外抗肿瘤活性。简而言之，将细胞以在100μL完全培养基中每孔2×103个细胞接种到96孔板中，然后在37℃与5％CO2下孵育过夜。未处理的细胞用作对照。将100μL培养基中的ADC、抗体或有效载荷分别以不同浓度一式两份添加，其中以1uM的浓度开始进行2倍稀释系列。使细胞暴露于测试品5天。通过微板读取仪在450nm处测量吸光度。细胞存活率(％)使用下式计算：样品/对照×100％。生成了剂量响应曲线并通过非线性回归分析计算50％抑制浓度(IC50)。
结果和结论
表23.使用HCT15-hPDL1细胞的细胞毒性研究的IC50总结
从使用HCT15-hPDL1细胞的体外细胞毒性研究获得的IC50值总结于表23中。药物的剂量响应细胞毒性曲线显示在图15中。Ab3A-CD-1是抗体Ab3A与式(1)的药物-接头化合物的缀合物，Ab3A-CD-2是抗体Ab3A与式(2)的药物-接头化合物的缀合物，Ab3F-CD-1是抗体Ab3F与式(1)的药物-接头化合物的缀合物，并且Ab3F-CD-2是抗体Ab3F与式(2)的药物接头-化合物的缀合物。
使用HCT15-hPDL1细胞的体外细胞毒性的结果揭示，SN38连接的式(1)化合物和式(2)化合物的细胞毒性效力显著低于SN38的细胞毒性效力。式(2)化合物的细胞毒性效力优于式(1)化合物的细胞毒性效力(如图15A所示)。抗体Ab2B、Ab3A和Ab3F未发现细胞毒性(如图15B所示)。含有式(2)化合物的Ab3A-CD-2和Ab3F-CD-2的细胞毒性效力显著优于含有式(1)化合物的Ab3A-CD-1和Ab3F-CD-1的细胞毒性效力(如图15C所示)。
实施例10.使用MDA-MB-231CDX模型的体内治疗功效研究
细胞系
将来自ATCC的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用补充有10％FBS的莱博维茨氏L-15培养基(Leibovitz's L-15medium)在37℃下无CO2的情况下培养。
动物
将严重免疫缺陷型M-NSG小鼠在CRO公司(Shanghai,China)的无特定病原体(SPF)级动物护理设施中圈养和维持。将实验开始时6-8周龄小鼠用标准实验室食物和随意饮水维持。所有动物实验获得批准并均根据公司的机构动物护理指南(Institutional AnimalCare Guid elines)进行。
体内治疗功效研究
对于细胞系来源的异种移植物(CDX)模型，将悬浮于100μL含30％Matrigel的PBS中的1×107个MDA-MB-231细胞皮下注射到M-NSG雌性小鼠的右侧腹中。当肿瘤体积达到80-200mm3时，将小鼠以相似平均肿瘤体积和体重分组并以表24中描述的剂量腹膜内注射样品。分组和给药当天表示为第0天。在整个研究持续时间内每周两次测量肿瘤体积。根据下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度×宽度2)×0.5。
所有实验的数据均通过Graphpad Prism 8.0软件呈现为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的统计学显著性使用双因素ANOVA、随后学生t检验确定。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
表24.MDA-MB-231CDX模型的剂量汇总表
结果和结论
如图16所示，体内治疗功效研究揭示，在MDA-MB-231CDX模型中，与抗体Ab2B相比，所有四种ADC都具有更好的肿瘤抑制作用。当与相同的式(1)化合物或式(2)化合物缀合时，抗体Ab3A和Ab3F显示出相似的肿瘤抑制作用。与含有式(2)化合物的Ab3A-CD-2和Ab3F-CD-2相比，含有式(1)化合物的Ab3A-CD-1和Ab3F-CD-1显示出更好的体内肿瘤抑制作用。因此，在后续的体外和体内功效研究中，对式(1)化合物作为ADC中的模型药物-接头化合物进一步进行研究。
实施例11.双特异性ADC的体外细胞毒性研究
细胞系构建和培养条件
使用具有人PDL1基因(NM_014143)和人TROP2(NM_002353.2)基因序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因和人TR OP2基因的人前列腺癌PC3细胞系。所述细胞系被命名为PC3-hPDL 1-hTROP2。将细胞使用补充有10％FBS加1μg/ml嘌呤霉素和100ug/ml潮霉素的汉姆氏F12K培养基(Ham's F12K medium)在37℃下在5％CO2下培养。
使用具有人PDL1基因(NM_014143)和人TROP2(NM_002353.2)基因序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因和人TR OP2基因的人结肠直肠腺癌HCT15细胞系。所述细胞系被命名为HCT15-hPDL1-hTROP2。将细胞使用补充有10％FBS加1μg/ml嘌呤霉素和100ug/ml潮霉素的RPMI1640培养基在37℃下在5％CO2下培养。
细胞毒性研究
根据制造商的说明书，通过发光细胞存活力测定(Luminescent Cell Viability Assay，Promega)来测定体外抗肿瘤活性。简而言之，将细胞以在100μL完全培养基中每孔2×103个细胞接种到96孔板中，然后在37℃在5％CO2下孵育过夜。未处理的细胞用作对照。将100μL培养基中的ADC、抗体或有效载荷分别以不同浓度一式两份添加，其中以1uM的浓度开始进行2倍稀释系列。使细胞暴露于测试品5天。通过微板读取仪在450nm处测量吸光度。细胞存活率(％)使用下式计算：样品/对照×100％。生成了剂量响应曲线并通过非线性回归分析计算50％抑制浓度(IC50)。
结果和结论
表25.使用PC3-hPDL1-hTROP2细胞的细胞毒性研究的IC50总结
从使用PC3-hPDL1-hTROP2细胞的体外细胞毒性研究获得的IC50值总结于表25中。药物的剂量响应细胞毒性曲线显示在图17和18中。Ab3A-CD-1是抗体Ab3A与式(1)的药物-接头化合物的缀合物，Ab5C-CD-1是在Fc区无uPA裂解位点的双特异性抗体Ab5C与式(1)的药物-接头化合物的缀合物，并且Ab5D-CD-1是在Fc区含有uPA裂解位点的双特异性抗体Ab5D与式(1)的药物-接头化合物的缀合物。
使用PC3-hPDL1-hTROP2细胞的体外细胞毒性的结果揭示，SN38连接的式(1)化合物和式(2)化合物的细胞毒性效力显著低于SN38的细胞毒性效力。式(2)化合物的细胞毒性效力优于式(1)化合物的细胞毒性效力。抗体Ab2B、双特异性抗体Ab5C和Ab5D未发现细胞毒性。Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1的细胞毒性效力显著高于Ab3A-CD-1的细胞毒性效力。与Ab5C-CD-1相比，Ab5D-CD-1具有更好的细胞毒性效力，表明双特异性抗体的Fc区中的uPA裂解位点提高了体外细胞毒性。
表26.使用HCT15-hPDL1-hTROP2细胞的细胞毒性测定的IC50总结
从使用HCT15-hPDL1-hTROP2细胞的体外细胞毒性研究获得的IC50值总结于表26中。药物的剂量响应细胞毒性曲线显示在图19中。体外细胞毒性结果证明，Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1的细胞毒性效力显著高于Ab3A-CD-1的细胞毒性效力。与Ab5C-CD-1相比，Ab5D-CD-1具有更好的细胞毒性效力，表明双特异性抗体的Fc区中的uPA裂解位点提高了体外细胞毒性。
实施例12.使用MC38-hPDL1-hTROP2小鼠同系肿瘤模型的体内治疗功效研究
细胞系
使用具有人PDL1基因(NM_014143)和人TROP2(NM_002353.2)基因序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因和人TR OP2基因的鼠结肠腺癌MC38细胞系。所述细胞系被命名为MC38-hPDL1-hTROP2。将细胞使用补充有10％FBS、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃下在5％CO2下培养。
动物
将表达人PD-L1的转基因C57BL/6J小鼠系统C57BL/6-hPDL1小鼠在CRO公司(Shanghai,China)的无特定病原体(SPF)级动物护理设施中圈养和维持。将实验开始时6-8周龄的小鼠用标准实验室食物和随意饮水维持。所有动物实验获得批准并均根据公司的机构动物护理指南进行。
体内治疗功效研究
对于同系肿瘤小鼠模型，将悬浮于100μL PBS中的5×106个MC38-hPDL1-hTROP2细胞皮下注射到C57BL/6-hPDL1雌性小鼠的右侧腹中。当肿瘤体积达到100-150mm3时，将的小鼠按相似平均肿瘤体积和体重分组并以表27中描述的剂量静脉内注射样品。分组和给药当天表示为第0天。在整个研究持续时间内每周两次测量肿瘤体积。根据下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度×宽度2)×0.5。
所有实验的数据均通过Graphpad Prism 8.0软件呈现为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的统计学显著性使用双因素ANOVA、随后学生t检验确定。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
表27.MC38-hPDL1-hTROP2小鼠同系肿瘤模型的剂量汇总表
结果和结论
使用MC38-hPDL1-hTROP2小鼠同系肿瘤模型的体内治疗功效研究的结果显示在图20中。Ab6A-ADC作为参考ADC药物，其是抗TROP2 hRS7抗体与药物-接头CL2A-SN38的缀合物。
体内治疗功效研究表明，与媒介物相比，所有测试的药物，包括抗体Ab2B、ADCAb6A ADC、Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1都具有更好的肿瘤抑制作用。双特异性抗体ADC，Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1与抗体Ab2B和ADC Ab6A ADC相比具有更好的肿瘤抑制作用。在不同的给药方案(15mg/kg每周两次或35mg/kg每周一次)下，Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1在研究期间内的肿瘤抑制没有显著差异。
实施例13.使用PBMC-PC3-hPDL1-hTROP2 CDX模型的体内治疗功效研究
细胞系
使用具有人PDL1基因(NM_014143)和人TROP2(NM_002353.2)基因序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因和人TROP2基因的人前列腺癌PC3细胞系。所述细胞系被命名为PC3-hPDL1-hTROP2。将细胞使用补充有10％FBS加1μg/ml嘌呤霉素和100ug/ml潮霉素的汉姆氏F12K培养基在37℃下在5％CO2下培养。
动物
将严重免疫缺陷型M-NSG小鼠在CRO公司(Shanghai,China)的无特定病原体(SPF)级动物护理设施中圈养和维持。将实验开始时6-8周龄的小鼠用标准实验室食物和随意饮水维持。所有动物实验获得批准并均根据公司的机构动物护理指南进行。
体内治疗功效研究
对于外周血单核细胞和细胞系来源的异种移植物(PBMCs-CDX)模型，将悬浮于100μL含30％Matrigel的PBS中的1×107个PC3-hPDL1-hTROP2细胞皮下注射到M-NSG雌性小鼠的右侧腹中，随后静脉内注射悬浮于200μL PBS中的5×106个人PBMC。当肿瘤体积达到80-160mm3时，将小鼠按相似平均肿瘤体积和体重分组并以表28中描述的剂量静脉内注射样品。分组和给药当天表示为第0天。在整个研究持续时间内每周两次测量肿瘤体积。根据下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度×宽度2)×0.5。
所有实验的数据均通过Graphpad Prism 8.0软件呈现为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的统计学显著性使用双因素ANOVA、随后学生t检验确定。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
表28.PBMC-PC3-hPDL1-hTROP2 CDX模型的剂量汇总表
结果和结论
使用PBMC-PC3-hPDL1-hTROP2 CDX模型的体内治疗功效研究的结果显示在图21中。体内治疗功效研究表明，与抗体Ab2B相比，Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1具有更好的肿瘤抑制作用。在不同的给药方案(15mg/kg每周两次或35mg/kg每周一次)下，Ab5C-CD-1和Ab5D-CD-1在研究期间的肿瘤抑制没有显著差异。然而，在35mg/kg给药方案下，三只小鼠(3/8)在初始施用Ab5C-CD-1后第9天、第11天和第15天死亡，没有小鼠(0/8)在研究的同一时期内施用Ab5D-CD-1后死亡，表明与在Fc区不含uPA裂解位点的Ab5C-CD-1相比，在Fc区含有uPA裂解位点的Ab5D-CD-1具有更好的安全性。
实施例14.使用HCT15-hPDL1-hTROP2 CDX模型的体内治疗功效研究
细胞系
使用具有人PDL1基因(NM_014143)和人TROP2(NM_002353.2)基因序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因和人TR OP2基因的人结肠直肠腺癌HCT15细胞系。所述细胞系被命名为HCT15-hPDL1-hTROP2。将细胞使用补充有10％FBS加1μg/ml嘌呤霉素和100ug/ml潮霉素的RPMI1640培养基在37℃下在5％CO2下培养。
动物
将严重免疫缺陷型B-NDG小鼠在CRO公司(Beijing,China)的无特定病原体(SPF)级动物护理设施中圈养和维持。将实验开始时8-10周龄的小鼠用标准实验室食物和随意饮水维持。所有动物实验获得批准并均根据公司的机构动物护理指南进行。
体内治疗功效研究
对于细胞系来源的异种移植物(CDX)模型，将悬浮于100μL PBS中的1×106个HCT15-hPDL1-hTROP2细胞皮下注射到B-NDG雌性小鼠的右侧腹中。当肿瘤体积达到80-120mm3时，将小鼠按相似平均肿瘤体积和体重分组并以表29中描述的剂量静脉内注射样品。分组和给药当天表示为第0天。在整个研究持续时间内每周两次测量肿瘤体积。根据下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度×宽度2)×0.5。
所有实验的数据均通过Graphpad Prism 8.0软件呈现为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的统计学显著性使用双因素ANOVA、随后学生t检验确定。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
表29.HCT15-hPDL1-hTROP2 CDX模型的剂量汇总表
结果和结论
使用HCT15-hPDL1-hTROP2 CDX模型的体内治疗功效研究的结果显示在图22中。体内治疗功效研究表明，Ab5D-CD-1的长期肿瘤抑制作用优于Ab5C-CD-1，表明双特异性抗体的Fc区中的uPA裂解位点也提高了体内功效。
实施例15.通过CpG ODN-接头进行的体外TLR9激活
细胞培养
HEK-BlueTMhTLR9细胞是稳定共表达人TLR9和NF-kB诱导型SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因的经工程化的HEK293细胞。HEK-BlueTM检测测定允许通过读取655nm处的光密度(OD)来检测TLR9激活后的SEAP产生。
HEK-BlueTMhTLR9细胞获自InvivoGen。按照制造商的说明将细胞在补充有4.5g/l葡萄糖、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/mlNormocinTM、10mg/ml杀稻瘟素和100mg/ml ZeocinTM的DMEM培养基中在37℃下在含5％CO2的潮湿空气中培养。
HEK-BlueTMhTLR9细胞对CpG ODN-接头的响应
在HEK-BlueTM检测中将HEK-Blue hTLR9细胞以2×105个细胞/孔的密度接种到96孔板上。HEK-BlueTM检测是允许检测SEAP的细胞培养基，因为报告蛋白是由细胞分泌的。用最终浓度为0.6mg/mL的CpG ODN CpGB、CpG ODN-接头CpGC、CpGD、CpGE和CpGF刺激HEK-BlueTMhTLR9细胞。孵育16小时后，使用微板读取仪在655nm波长下测量样品的光密度(OD)。将数据用未处理的细胞归一化为零。每个数据点代表两次重复试验的平均值和标准偏差。
结果和结论
HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞对不同CpG ODN-接头的响应显示在图23中。在0.6mg/ml的相同浓度下，CpG ODN-接头CpGE和CpG ODN CpGB具有相似的体外效力，优于CpG ODN-接头CpGC、CpGD和CpGF。
实施例16.通过抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)进行的体外TLR9激活
细胞系构建和培养条件
使用具有人PDL1基因(NM_014143)序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因的HEK-BlueTMhTLR9细胞系。所构建的细胞系被命名为HEK-Blue hTLR9-hPDL1。将细胞使用补充有4.5g/l葡萄糖、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1μg/ml嘌呤霉素和10ug/ml杀稻瘟素的DMEM培养基在37℃下在5％CO2下培养。
HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞对抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)的响应
在HEK-BlueTM检测中将HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到96孔板上。HEK-BlueTM检测是允许检测SEAP的细胞培养基，因为报告蛋白是由细胞分泌的。然后将HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞用如所示的不同浓度的Ab3A AOC处理，其中CpG ODNCpGB和抗体Ab2B分别作为阳性对照和阴性对照。孵育18小时后，使用微板读取仪在655nm波长下测量样品的光密度(OD)。将数据用未处理的细胞归一化为零。每个数据点代表两次重复试验的平均值和标准偏差。
结果和结论
HEK-Blue hTLR9-hPDL1细胞对AOC的响应显示在图24中。Ab3A AOC是抗体Ab3A与CpG ODN-接头CpGE的缀合物。体外TLR9激活研究结果揭示，在6μM的相同浓度下，Ab3A AOC分别具有优于抗体Ab2B和CpG ODN CpGB的效力。
实施例17.使用MC38-hPDL1小鼠同系肿瘤模型的体内治疗功效研究
细胞系
使用具有人PDL1基因(NM_014143)序列的慢病毒质粒产生了稳定表达外源性人PDL1基因的鼠结肠腺癌MC38细胞系。所述细胞系被命名为MC38-hPDL1。将细胞使用补充有10％FBS、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基在37℃下在5％CO2下培养。
动物
将表达人PD-L1的转基因C57BL/6J小鼠系统C57BL/6-hPDL1小鼠在CRO公司(Shanghai,China)的无特定病原体(SPF)级动物护理设施中圈养和维持。将实验开始时6-8周龄的小鼠用标准实验室食物和随意饮水维持。所有动物实验获得批准并均根据公司的机构动物护理指南进行。
体内治疗功效研究
对于同系肿瘤小鼠模型，将悬浮于100μL PBS中的1×106个MC38-hPDL1细胞皮下注射到C57BL/6-hPDL1雌性小鼠的右侧腹中。当肿瘤体积达到100-150mm3时，将小鼠按相似平均肿瘤体积和体重分组并以表30中描述的剂量静脉内注射样品。分组和给药当天表示为第0天。在整个研究持续时间内每周两次测量肿瘤体积。根据下式确定肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长度×宽度2)×0.5。
所有实验的数据均通过Graphpad Prism 8.0软件呈现为平均值±标准偏差(SD)。两组之间的统计学显著性使用双因素ANOVA、随后学生t检验确定。小于0.05的p值被认为是统计学上显著的。
表30.MC38-hPDL1小鼠同系肿瘤模型的剂量汇总表
结果和结论
使用MC38-hPDL1小鼠同系肿瘤模型的体内治疗功效研究的结果显示在图25中。与媒介物相比，抗体Ab2B和AOC Ab3A AOC表现出更好的肿瘤抑制作用。与抗体Ab2B相比，AOCAb3A AOC显示出更好的肿瘤抑制。
序列表

Claims (58)

1.一种包含靶向部分和效应分子的靶向缀合物，其中所述效应分子经由缀合位点缀合至所述靶向部分，其中所述效应分子可经由裂解从所述靶向缀合物释放。
2.如权利要求1所述的靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含以下结构：
其中：
A1是第一靶向部分；
A2是第二靶向部分；
P1是第一裂解位点；
P2是第二裂解位点；
P3是第三裂解位点；
C是所述缀合位点
L是接头；
D是所述效应分子；
x＝0或1；
y＝0或1；
z＝0或1；
v＝0或1；
u＝0或1；
a＝1-20；并且
b＝1-20。
3.如权利要求1或2所述的靶向缀合物，其中所述靶向部分包含靶向肽或抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的靶向缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、纳米抗体、scFv、scFab、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段和dsFv。
5.如权利要求3-4所述的靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含抗体-肽融合蛋白。
6.如权利要求1-5中任一项所述的靶向缀合物，其中所述靶向部分特异性地结合至靶部位处的靶分子。
7.如权利要求1-6中任一项所述的靶向缀合物，其中所述裂解由针对所述靶向部分的靶部位处的条件触发。
8.如权利要求7所述的靶向缀合物，其中所述靶部位处的条件选自由以下组成的组：蛋白酶、pH变化、氧化还原变化、缺氧、氧化应激、高热和细胞外ATP浓度。
9.如权利要求7或8所述的靶向缀合物，其中所述靶部位是疾病部位。
10.如权利要求9所述的靶向缀合物，其中所述疾病是肿瘤。
11.如权利要求1-10中任一项所述的靶向缀合物，其中所述裂解是通过蛋白酶进行的。
12.如权利要求11所述的靶向缀合物，其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、豆荚蛋白、纤溶酶、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS6、MMP1、MMP2、MMP-3、MMP-9、MMP-8、MMP-14、MT1-MMP、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14、TACE、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、成纤维细胞相关蛋白、蛋白裂解酶、PSMA和PSA。
13.如权利要求1-12中任一项所述的靶向缀合物，其中所述效应分子选自由以下组成的组：治疗剂、寡核苷酸和可检测标记。
14.如权利要求13所述的靶向缀合物，其中所述效应分子是治疗剂。
15.如权利要求14所述的靶向缀合物，其中所述效应分子选自由以下组成的组：基于蛋白质的药物、小分子药物、细胞毒性剂、毒素、免疫调节剂、抗炎剂、抗感染剂和表观遗传调节剂。
16.如权利要求13所述的靶向缀合物，其中所述效应分子是寡核苷酸。
17.如权利要求16所述的靶向缀合物，其中所述寡核苷酸是约2至约100个核苷酸长。
18.如权利要求16或17中任一项所述的靶向缀合物，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA、反义RNA、小干扰RNA、微小RNA、短发夹RNA(shRNA)和CpG寡核苷酸。
19.如权利要求18所述的靶向缀合物，其中所述寡核苷酸是CpG寡核苷酸。
20.如权利要求1-19中任一项所述的靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含具有5'氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN的结构的部分，其中间隔子是(CH2)n-(PEG)m，P是裂解位点，并且其中h、n和m是整数，h＝0或1，n≥1，并且m≥0。
21.如权利要求1-19中任一项所述的靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含具有3'氨基修饰剂-间隔子-Ph-CpG ODN的结构的部分，其中间隔子是(CH2)n-(PEG)m，P是裂解位点，并且其中h、n和m是整数，h＝0或1，n≥1，并且m≥0。
22.如权利要求1-21中任一项所述的靶向缀合物，其中所述靶向缀合物包含两个或更多个效应分子。
23.如权利要求2-22中任一项所述的靶向缀合物，其中z是0。
24.如权利要求2-22中任一项所述的靶向缀合物，其中z是1。
25.如权利要求2-24中任一项所述的靶向缀合物，其中y是0。
26.如权利要求2-24中任一项所述的靶向缀合物，其中y是1。
27.如权利要求2-26中任一项所述的靶向缀合物，其中x是0。
28.如权利要求2-26中任一项所述的靶向缀合物，其中x是1。
29.如权利要求2-28中任一项所述的靶向缀合物，其中u是0。
30.如权利要求2-28中任一项所述的靶向缀合物，其中u是1。
31.如权利要求2-30中任一项所述的靶向缀合物，其中v是0。
32.如权利要求2-30中任一项所述的靶向缀合物，其中v是1。
33.如权利要求2-32中任一项所述的靶向缀合物，其中a是1-20。
34.如权利要求2-33中任一项所述的靶向缀合物，其中b是1-20。
35.如权利要求2-34中任一项所述的靶向缀合物，其中a是2-10。
36.如权利要求2-35中任一项所述的靶向缀合物，其中b是2-10。
37.如权利要求2-36中任一项所述的靶向缀合物，其中A1是第一靶向肽或识别第一靶分子的第一抗体或其抗原结合片段，并且其中A2是第二靶向肽或识别第二靶分子的第二抗体或其抗原结合片段。
38.如权利要求37所述的靶向缀合物，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是相同的。
39.如权利要求37所述的靶向缀合物，其中所述第一靶分子和所述第二靶分子是不同的。
40.如权利要求37-39中任一项所述的靶向缀合物，其中A1连接至C的N末端，并且其中A2连接至C的C末端。
41.如权利要求1-40中任一项所述的靶向缀合物，其中所述缀合位点是共价缀合位点。
42.如权利要求41所述的靶向缀合物，其中所述缀合位点是转谷氨酰胺酶缀合位点。
43.如权利要求1-42中任一项所述的靶向缀合物，其中所述缀合位点包含彼此串联融合的多个含谷氨酰胺标签。
44.如权利要求1-40中任一项所述的靶向缀合物，其中所述缀合位点是非共价缀合。
45.如权利要求43所述的靶向缀合物，其中所述缀合位点是寡核苷酸结合多肽的结合位点。
46.如权利要求2-45中任一项所述的靶向缀合物，其中L由下式表示：SH2-间隔子、MAL-间隔子、NH2-间隔子或Osu-间隔子。
47.如权利要求2-46中任一项所述的靶向缀合物，其中L由式(G ly)n-(PEG)m-VC-PAB-(DMAE)k或(Gly)n-(PEG)m-Val-Ala-PAB-(DMAE)k表示，其中n、m和k是整数，n≥1，m≥2，并且k是0或1。
48.如权利要求2-46中任一项所述的靶向缀合物，其中L由下式表示：(Gly)n-(PEG)m-P-PAB-(DMAE)k，其中n、m和k是整数，≥1，m≥2，并且k是0或1，P是裂解位点。
49.如权利要求14所述的靶向缀合物，其中所述治疗剂选自由式(1)-(7)的化合物组成的组。
50.一种包含靶向部分的靶向缀合物，所述靶向部分缀合至具有选自由式(1)-(7)的化合物组成的组的式的治疗剂。
51.一种组合物，所述组合物包含多个如权利要求1-50中任一项所述的靶向缀合物。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述组合物中的所述效应分子与所述靶向部分的平均比率是至少约1:1。
53.如权利要求51或52所述的组合物，其中所述组合物中的至少两种所述靶向缀合物包含不同数量的效应分子。
54.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中所述效应分子是治疗剂或寡核苷酸，并且其中所述组合物是药物组合物。
55.一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求54所述的药物组合物。
56.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中所述效应分子是可检测标记，并且其中所述组合物是诊断组合物。
57.一种诊断个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求56所述的诊断组合物，其中检测到所述可检测标记表明存在所述疾病。
58.一种制备如权利要求1-50中任一项所述的靶向缀合物的方法，其中所述方法包括将所述效应分子缀合至所述靶向部分。
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