RU2806285C2 - ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ НАЦЕЛИВАНИЯ дцРНК - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым химерным белкам, обладающим противоопухолевой активностью, и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает химерный рекомбинантный белок, способный нацеливать дцРНК на клетку, сверхэкспрессирующую антиген PSMА. Указанный белок может быть применим в медицинской практике в качестве терапевтического средства при лечении рака предстательной железы. 11 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/383466, поданной 4 сентября 2016, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предложены рекомбинантные химерные белки, содержащие домен, связывающий двухцепочечную РНК (дцРНК), и домен, нацеливающий на раковые клетки, для нацеливания дцРНК на раковые клетки. Также предложены способы применения описанных химерных белков.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак предстательной железы является вторым по частоте диагностирования видом рака в мире, на его долю приходится более 25% новых случаев рака, ежегодно диагностируемых у мужчин в США (1). В случае метастатического рака предстательной железы пациентов в основном лечат с применением антиандрогенной терапии (ADT).

Несмотря на то, что эти терапия позволяет достичь краткосрочной ремиссии, у пациентов обычно развивается кастрационно-резистентный рак предстательной железы (КРРПЖ). Существует значительная потребность в новых видах терапии для пациентов с КРРПЖ, поскольку такие пациенты редко отвечают на существующие виды терапии, и медиана выживания у них составляет приблизительно 3 года (1-3).

На сегодняшний день большинство видов нацеленной (таргетной) терапии рака задерживают, но редко предотвращают прогрессирование опухоли. Поскольку опухолевые клетки являются геномно нестабильными, они в конечном итоге приобретают мутации и генетические изменения, которые позволяют им уклоняться от терапии и развивать резистентность. Степень уничтожения, которую вызывают нацеленные агенты, является слишком низкой, в результате этого опухоли имеют достаточно времени для адаптации к постоянному давлению, которое оказывает на них терапия. Помимо этого, опухоли являются гетерогенными и включают ряд различных субпопуляций. Разновидности нацеленной терапии обычно нацелены лишь на некоторые из этих субпопуляций, не действуя на другие, и, соответственно, нельзя ожидать, что они устранят всю опухоль.

Метастатический КРРПЖ обычно презентирует уникальную поверхностную молекулу клетки, которую можно использовать для нацеленной терапии: простатический специфический мембранный антиген (PSMA, ПСМА). PSMA сверхэкспрессируется на уровнях, повешенных до 1000 раз согласно суммарному показателю по Глисону (4), при этом сверхэкспрессия увеличивается при прогрессировании опухоли (5, 6). Несмотря на гетерогенную природу заболевания, первичные опухоли или метастазы, которые полностью PSMA-отрицательны, являются редкими (7). Хотя вышеприведенные результаты подтверждают мнение о том, что PSMA является весьма перспективной терапевтической мишенью, в настоящее время отсутствуют PSMA-нацеленные виды терапии, которые одобрены для клинического применения. Однако несколько агентов проходят клинические исследования (8-11).

Соответственно, все еще существует потребность в нацеленной терапии КРРПЖ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем документе описан улучшенный подход к нацеливанию дцРНК на раковые клетки, а именно, получение молекулы химерного белка, которая может доставить дцРНК к клеткам, сверхэкспрессирующим PSMA.

Настоящий документ относится к химерному рекомбинантному белку и кодирующим его нуклеиновым кислотам, который содержит домен, связывающий двухцепочечную РНК (дцРНК); и фрагмент, связывающий мишень, который связывается с простатическим специфическим мембранным антигеном (PSMA).

Дополнительно описан комплекс, который содержит химерный рекомбинантный белок и дцРНК. Также описаны варианты применения описанных комплексов в лечении рака предстательной железы или ингибировании роста новой сосудистой сети опухоли и соответствующим способам лечения рака предстательной железы или ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, которые включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества описанного комплекса.

Вышеизложенные и другие задачи, признаки и преимущества будут очевидны на основании следующего подробного описания, после которого представлены ссылки и прилагаемые фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигуры 1A-1D: GFP-SCP связывается и селективно интернализуется в клетки, сверхэкспрессирующие PSMA. Фигура 1А: Схематическое изображение GFP-SCP. Фигура 1В: клетки линий LNCaP, РС3 и MCF7 инкубировали с 25 нМ GFP-SCP в течение 5 ч. Клетки фиксировали, окрашивали антителом к GFP (Су3) и 4,6-диамидино-2-фенилиндолом и визуализировали с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Фигура 1С: клетки линий LNCaP и MCF7 инкубировали с GFP-SCP и затем исследовали методом проточной цитометрии. Фигура 1D: Верхняя панель: клетки линии LNCaP контролировали с помощью лазерной конфокальной микроскопии через 0-72 мин после добавления 200 нМ GFP-SCP. Сульфородамин В добавляли в среду непосредственно перед добавлением GFP-SCP, чтобы пометить клетки снаружи. На нижней панели показана интенсивность флуоресценции GFP внутри клетки, измеренная с использованием ImageJ.

Фигура 2А-2С: Дизайн, экспрессия и очистка dsRB-SCP. Фигура 2А: Схематическое представление dsRB-SCP. Фигура 2В: Экспрессия и очистка dsRB-SCP: L: осветленный лизат, М: маркер молекулярной массы, Е1: элюат после IMAC (колонка с носителем никель-сефароза), Е2: очищенный dsRB-SCP, элюированный из IEX (ионообменная колонка). Пунктирные линии указывают на место, где изображение геля было вырезано и реорганизовано. Фигура 2С: Связывание dsRB-SCP с дцРНК: dsRB-SCP (0,5-3 мкг) предварительно инкубировали с дцРНК длиной 500 п.о. и подвергали электрофорезу на 2% агарозном геле. М: маркер молекулярной массы ДНК с шагом 100 п.о.

Фигуры 3А-3С: dsRB-SCP/полиIC селективно индуцирует апоптоз клеток, сверхэкспрессирующих PSMA. Фигура 3А: клетки высевали в трех постораз, выращивали в течение ночи и обрабатывали, как указано, в течение 100 ч. Жизнеспособность определяли количественно с использованием количественного люминесцентного исследования для оценки жизнеспособности клеток CellTiter-Glo^® (Promega). Фигура 3В: Клеточный цикл выживших клеток был необратимо остановлен. Клетки высевали в трех повторах, выращивали в течение ночи и обрабатывали, как указано. Среду заменяли, и жизнеспособность количественно определяли через 100/172/344 ч с использованием CellTiter-Glo^®. (Контрольные клетки не были способны к пролиферации после 2,5 удвоений, поскольку они достигли полной конфлюентности). Фигура 3С: клетки линии LNCaP обрабатывали dsRB-SCP/полиIC или полиIC по отдельности в течение указанных периодов времени, лизировали и исследовали методом Вестерн-блоттинга для выявления полноразмерной и расщепленной каспазы-3 и PARP.

Фигура 4A-4D: dsRB-SCP/полиIC приводит к секреции провоспалительных цитокинов и привлечению мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Фигуры 4А и 4В: клетки линии LNCaP обрабатывали, как указано, в течение 48 ч, после этого среду собирали и количественно определяли цитокины IP-10 и RANTES с помощью ИФА. Фигура 4С: клетки линии LNCaP обрабатывали, как указано, в течение 4 ч, и транскрипцию ИФН-β измеряли с помощью кПЦР в режиме реального времени. Фигура 4D: dsRB-SCP/полиIC индуцировал хемотаксис МКПК. Клетки линии LNCaP выращивали и обрабатывали, как указано. Через 48 ч после обработки клеточную среду переносили в нижнюю камеру планшета для оценки хемотаксиса Transwell. МКПК добавляли в верхнюю камеру, и планшеты инкубировали в течение 3,5 ч. Затем в нижней камере собирали среду, и определяли количество лимфоцитов, которые мигрировали в нижнюю камеру, методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).

Фигуры 5А-5В: dsRB-SCP/полиIC индуцирует непосредственный и МКПК-опосредуемый эффект «свидетеля». Фигура 5А: клетки линии LNCaP-Luc/GFP обрабатывали, как указано. Через 24 ч в исследуемые лунки добавляли МКПК (черные столбики), а в контрольные лунки добавляли среду (серые столбики). Выживаемость клеток линии LNCaP-Luc/GFP измеряли с использованием системы для количественного определения люциферазы (Promega). Фигура 5В: клетки РС3-Luc/GFP+LNCaP: LNCaP обрабатывали, как указано. Через 24 ч в культуру добавляли клетки РС3-Luc/GFP. Спустя 6 ч в культуру добавляли МКПК (черные столбики) или среду (заштрихованные столбики). Ростовую среду РС3-Luc/GFP:LNCaP обрабатывали, как указано. Через 24 ч добавляли клетки РС3-Luc/GFP и спустя 6 ч добавляли МКПК (черные столбики) или среду (заштрихованные столбики). Выживаемость клеток РС3-Luc/GFP измеряли с использованием системы для анализа люциферазы (Luciferase Assay System, Promega). T-тест указывает на высокую достоверность (***Р≤0,001).

Фигуры 6А-6В: Обработка dsRB-SCP/полиIC совместно с МКПК приводит к разрушению сфероидов LNCaP. Фигура 6А: сфероиды с R=300-400 мкм обрабатывали следующим образом: (а) без обработки, (b) 400 нМ dsRB-SCP, (с) 2,5 мкг/мл полиIC, (d) 400 нМ dsRB-SCP+2,5 мкг/мл полиIC. Сфероиды обрабатывали четыре раза на 1, 2, 4 и 5 день и затем культивировали в течение 10 дополнительных дней. Изображения сфероидов получали с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии в указанные периоды времени; для каждого варианта обработки представлен один типичный сфероид. Следует отметить заметное отделение клеток от обработанного сфероида (красные стрелки). На 15 день сфероиды помечали кальцеином-АМ (живые клетки, зеленые) и йодидом пропидия (мертвые клетки, красные). Максимальные значения площади сфероидов, измеренные с использованием ImageJ, представлены на графике (среднее значение и стандартное отклонение среднего). Фигура 6В: Верхняя панель: сфероиды LNCaP-Luc/GFP, обработанные, как указано. Через 24 часа к сфероидам добавляли 8×10⁴ МКПК, меченых CellTracker™ Violet BMQC (Molecular Probes Life Technologies). Нижняя панель: к сфероидам добавляли бесклеточную среду от МКПК. Изображения сфероидов на обеих панелях получали с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии через 0, 72, 96, 168 ч после начала обработки. Живые клетки детектировали на основании флуоресценции GFP в них. Как показано на нижней панели, йодид пропидия (PI) добавляли к сфероидам, чтобы выделить мертвые клетки. В верхней панели окрашивание PI не показано, поскольку невозможно различить мертвые клетки линии LNCaP-Luc/GFP и мертвые МКПК.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, представленные в настоящем документе, показаны с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и трехбуквенных кодов для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Представлена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но следует понимать, что комплементарная цепь включена с помощью любой ссылки на представленную цепь. Перечень последовательностей предоставлен в виде текстового файла в формате ASCII, озаглавленного SeqList_3152_1_2.txt, который создан 12 декабря 2016 года и имеет размер около 21 КБ, который включен в настоящий документ посредством ссылки. В Перечне последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность белка GFP-SCP.

SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок GFP-SCP.

SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность белка dsRB-SCP.

SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок dsRB-SCP.

SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность линкерного пептида Arg9.

SEQ ID NO: 6 и 7 представляют собой прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для количественного определения ИФН-β.

SEQ ID NO 8 и 9 представляют собой прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для количественного определения GAPDH.

SEQ ID NO: 10 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера SCP-N.

SEQ ID NO: 11 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера SCP-C.

SEQ ID NO: 12 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера GFP-N.

SEQ ID NO: 13 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера GFP-C.

SEQ ID NO: 14 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера dsRB-N.

SEQ ID NO: 15 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера dsRB-C.

SEQ ID NO: 16 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера 9ARG1.

SEQ ID NO: 17 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты праймера 9ARG2.

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность дцРНК PKR.

SEQ ID NO: 19 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты дцРНК PKR.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность ScFvJ591.

SEQ ID NO: 21 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты ScFvJ591.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Термины

Если не указано иное, технические термины используются в настоящем документе в значении, соответствующем обычному пониманию специалиста в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Термины, указывающие на единственное число («а», «an» и «the» в исходном тексте на английском языке) включают указание на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Аналогичным образом, подразумевается, что слово «или» включает «и», если из контекста явно не следует иное. Также следует понимать, что все размеры, указанные в парах оснований, или размеры, указанные как количество аминокислот, и значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и приведены с целью описания. Несмотря на то, что для реализации или тестировании настоящего изобретения можно применять методы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны выше, подходящие методы и материалы описаны ниже. Термин «содержит» означает «включает». Сокращение «e.g.» происходит от латинского exempli gratia и используется в настоящем документе для обозначения неограничивающего примера. Соответственно, сокращение «e.g.» является синонимом термина «например».

В случае противоречия преимущественную силу будет иметь настоящее описание, включая пояснения терминов. Помимо этого, все материалы, способы и примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Введение: введение композиции субъекту с помощью выбранного пути введения. Введение активного соединения или композиции можно осуществлять любым путем, известным в данной области техники. Введение может быть локальным или системным. Примеры локального введения включают, но не ограничиваются ими, местное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, интратекальное введение. Кроме того, локальное введение включает пути введения, обычно используемые для системного введения, например, путем направления внутрисосудистого введения к артериальному кровотоку для конкретного органа. Соответственно, в конкретных вариантах реализации, локальное введение включает внутриартериальное введение и внутривенное введение, если такое введение нацелено на сосудистую сеть, снабжающую конкретный орган. Локальное введение также включает встраивание активных соединений и агентов в имплантируемые устройства или конструкции, такие как сосудистые стенты или другие резервуары, которые высвобождают активные агенты и соединения в течение длительных интервалов времени, чтобы обеспечить пролонгированные терапевтические эффекты.

Системное введение включает любой путь введения, предназначенный для широкого распределения активного соединения или композиции по всему организму через систему кровообращения. Соответственно, системное введение включает, но не ограничивается ими, внутриартериальное и внутривенное введение. Системное введение также включает, но не ограничивается ими, местное введение, подкожное введение, внутримышечное введение или введение путем ингаляции, если такое введение направлено на всасывание и распределение по всему организму через систему кровообращения.

Антитело: полипептидный лиганд, содержащий по меньшей мере вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи иммуноглобулина, который специфически распознает и связывает эпитоп антигена, такого как PSMA. Антитела состоят из тяжелой цепи и легкой цепи, каждая из которых имеет вариабельную область, называемую вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL). Вместе область VH и область VL ответственны за связывание антигена, распознаваемого антителом. В настоящем документе термин «антитело» включает интактные иммуноглобулины, а также их варианты и части, хорошо известные в данной области техники, такие как фрагменты Fab', фрагменты F(ab)'₂, белки одноцепочечных Fv («scFv») и дисульфид-стабилизированные белки Fv («dsFv»). Термин также включает рекомбинантные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела) и гетероконъюгированные антитела (такие как биспецифические антитела).

Химера: последовательность нуклеиновой кислоты, аминокислотная последовательность или белок, которая (который) содержит последовательность нуклеиновой кислоты, аминокислотную последовательность или белок из двух или более источников, например, аминокислотную последовательность из двух или более различных видов. В целом, химерные последовательности являются результатом генной инженерии.

Последовательности, контролирующие экспрессию: Последовательности нуклеиновых кислот, которые регулируют экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, с которыми она функционально соединена, например, экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей химерные рекомбинантные белки, описанные в настоящем документе. Последовательности, контролирующие экспрессию, функционально соединены с последовательностью нуклеиновой кислоты, если последовательности, контролирующие экспрессию, контролируют и регулируют транскрипцию и, в зависимости от конкретного случая, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты. Соответственно, последовательности, контролирующие экспрессию, могут включать соответствующие промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовый кодон (ATG) перед геном, кодирующим белок, сигнал сплайсинга для интронов, поддержание корректной рамки считывания этого гена, чтобы обеспечить правильную трансляцию мРНК, и стоп-кодоны.

Функциональные фрагменты и варианты полипептида: в объем настоящего изобретения включены те фрагменты и варианты, которые сохраняют одну или более функций исходного полипептида. Признано, что ген или кДНК, кодирующие полипептид, могут быть значительно мутированы, без фактического изменения одной или более из функций полипептида, включая варианты, последовательности которых на 60%-99% идентичны последовательности полипептида дикого типа или исходного полипептида. Во-первых, общеизвестно, что генетический код является вырожденным, и поэтому разные кодоны кодируют одни и те же аминокислоты. Во-вторых, даже если введена замена аминокислоты, мутация может быть консервативной и может не оказывать фактического влияния на существенные функции белка. В-третьих, часть полипептидной цепи может быть удалена без нарушения или устранения всех его функций. В-четвертых, могут быть сделаны вставки или добавления в полипептидной цепи, например, путем добавления эпитопных меток, без нарушения или устранения его функций. Функциональные фрагменты и варианты могут иметь различную длину. Например, некоторые фрагменты содержат по меньшей мере 10, 25, 50, 75, 100 или 200 остатков аминокислот. Таблицы консервативных замен аминокислот, в которых представлены функционально сходные аминокислоты, хорошо известны специалисту в данной области техники. Следующие шесть групп являются примерами аминокислот, которые считаются консервативными заменами друг друга:

1) аланин (А), серин (S), треонин (Т);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); и

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Линкер: один или более нуклеотидов или аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты или двумя пептидами.

Миметик: миметик представляет собой молекулу, которая имитирует активность другой молекулы, например, биологически активной молекулы. Биологически активные молекулы могут содержать химические структуры, которые имитируют биологическую активность соединения.

Функционально соединенный: первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально соединена со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально соединен с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Обычно функционально соединенные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости, соединяют две кодирующие белок области в одной рамке считывания.

Фармацевтически приемлемые носители: Фармацевтически приемлемые носители, которые можно применять в настоящем изобретении, являются общепринятыми. В Remington's Pharmaceutical Sciences, под. ред. Е.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, подходящие для фармацевтической доставки соединений согласно настоящему изобретению.

Обычно основные свойства носителя будут зависеть от конкретного применяемого способа введения. Например, парентеральные составы обычно содержат инъецируемые жидкости, которые включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический солевой раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или тому подобное в качестве среды. В дополнение к биологически нейтральным носителям фармацевтические композиции, подлежащие введению, могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты и рН-забуферивающие агенты и т.п., например, ацетат натрия или монолаурат сорбита.

Идентичность последовательностей: сходство между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями, которое выражено как сходство между последовательностями или иногда называется идентичностью последовательностей. Идентичность последовательностей часто измеряется как процент идентичности (или сходства или гомологии); чем выше процент, тем больше сходство двух последовательностей.

Субъект: живые многоклеточные организмы, включая позвоночные организмы, категория, которая включает как млекопитающих, так и человека.

Терапевтически эффективное количество: Количество соединения, достаточное для достижения желательного эффекта у субъекта, которого лечат. Эффективное количество соединения можно вводить в виде однократной дозы или в виде нескольких доз, например, ежедневно, в течение курса лечения. Однако эффективное количество будет зависеть от применяемого соединения, субъекта, подлежащего лечению, степени тяжести и типа поражения и способа введения соединения.

II. Обзор нескольких вариантов реализации

Настоящее изобретение относится к химерному рекомбинантному белку, который содержит домен, связывающий двухцепочечную РНК (дцРНК); и фрагмент, связывающий мишень, который связывается с простатическим специфическим мембранным антигеном (PSMA).

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения химерный рекомбинантный белок дополнительно содержит спейсерный пептид между доменом, связывающим дцРНК, и фрагментом, связывающим мишень.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения домен, связывающий дцРНК, химерного рекомбинантного белка содержит по меньшей мере один мотив, связывающий двухцепочечную РНК (dsRBM), такой как dsRBM из дцРНК-зависимой протеинкиназы (PKR), TRBP, PACT, Staufen, NFAR1, NFAR2, SPNR, RHA или NREBP. В одном примере по меньшей мере один dsRBM содержит полипептидную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотам 1-197 PKR человека, представленным в SEQ ID NO: 18.

В отдельных вариантах реализации химерного рекомбинантного белка фрагмент, связывающий мишень, представляет собой полипептид, антитело, фрагмент антитела или миметик антитела.

Согласно другим конкретным вариантам реализации химерного рекомбинантного белка спейсерный пептид выбран из олигопептида, содержащего последовательность распознавания протеазы; гомоолигопептида из положительно заряженной аминокислоты; и их комбинации. В одном примере спейсерный пептид представляет собой гомоолигопептид аргинина.

В отдельном варианте реализации описанного химерного рекомбинантного белка домен, связывающий двухцепочечную РНК (дцРНК), представляет собой по меньшей мере один дцРНК-связывающий домен из PKR человека, представленный в SEQ ID NO: 18, или его функциональный вариант, спейсерный пептид представляет собой ARG9, представленный в SEQ ID NO: 5, или его функциональный вариант, и фрагмент, связывающий мишень, представляет собой одноцепочечное антитело к PSMA, представленное в SEQ ID NO: 20, или его функциональный вариант.

Согласно другому конкретному варианту реализации настоящего изобретения химерный рекомбинантный белок содержит полипептид, который по меньшей мере на 70% идентичен последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение также относится к комплексу, который содержит описанный химерный рекомбинантный белок и дцРНК, такую как дцДНК, содержащую цепь полиинозиновой кислоты и цепь полицитидиловой кислоты (полиIС).

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные комплексы применяют в лечении рака предстательной железы или ингибировании роста новой сосудистой сети опухоли, например, в способах лечения рака предстательной железы или ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, которые включают введение субъекту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества описанного комплекса, что обеспечивает лечение рака или ингибирование роста новой сосудистой сети опухоли.

В некоторых вариантах реализации описанных способов комплекс вводят системно или локально. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способы дополнительно включают введение субъекту эффективного количества мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют любой из описанных химерных рекомбинантных белков.

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот оптимизированы для экспрессии в бактериальной или растительной клетке-хозяине.

III. Химерные полипептиды для нацеливания дцРНК на клетки, экспрессирующие PSMA

Настоящее изобретение относится к химерным рекомбинантным полипептидам, которые можно применять для нацеливания дцРНК на клетку, экспрессирующую простатический специфический мембранный антиген (PSMA). Описанные химерные рекомбинантные полипептиды содержат по меньшей мере домен, связывающий дцРНК, и домен (также называемый в настоящем документе фрагментом), который специфично нацелен на PSMA. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные полипептиды также содержат линкер между доменом, связывающим дцРНК, и доменом, связывающим мишень. В настоящем документе также описаны функциональные варианты химерных рекомбинантных полипептидов.

Домены, связывающие дцРНК, могут быть легко идентифицированы в пептидной последовательности с использованием способов, доступных специалисту в данной области техники. Домен, связывающий дцРНК, любого из описанных рекомбинантных белков может содержать один или более мотивов, связывающих двухцепочечную РНК (dsRBM), таких как альфа-бета-бета-бета-альфа-складка.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения один или более dsRBM выбраны из dsRBM дцРНК-зависимой протеинкиназы (PKR), TRBP, PACT, Staufen, NFAR1, NFAR2, SPNR, RHA или NREBP. В частности, домен, связывающий дцРНК, может содержать два dsRBM из PKR, необязательно соединенных гибким линкером.

В отдельном варианте реализации настоящего изобретения домен, связывающий дцРНК, представляет собой домен, связывающий дцРНК, из дцРНК-зависимой протеинкиназы (PKR) человека или его функциональный вариант, включая полипептид, последовательность которого приблизительно на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 18.

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения фрагмент, связывающий мишень, любого из рекомбинантных белков, описанных в настоящем документе, включает: (i) лиганд к рецептору клеточной поверхности; (ii) антитело, такое как гуманизированное антитело; антитело человека; функциональный фрагмент антитела; однодоменное антитело, такое как нанотело; рекомбинантное антитело; и одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv); или (iii) миметик антитела, такой как молекула аффитела; аффилин; аффимер; аффитин; альфатело; антикалин; авимер; DARPin; финомер; пептид домена Куница; и монотело.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения фрагмент, связывающий мишень, представляет собой лиганд простатического специфического мембранного антигена (PSMA), такой как DUPA или его аналог; антитело к PSMA, такое как scFv к PSMA или гуманизированное антитело или антитело человека к PSMA (например, полноразмерное антитело J591); аффитело к PSMA.

В отдельном варианте реализации нацеливающий на PSMA фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело к PSMA, ScFvJ591, или его функциональный вариант, включая полипептид, последовательность которого приблизительно на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 19.

Описанный спейсерный пептид может представлять собой любой олигопептид, известный в данной области техники, для соединения двух функциональных доменов химерного полипептида. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения спейсерный пептид (линкер) включает олигопептид, содержащий последовательность распознавания протеазы; или гомоолигопептид из положительно заряженной аминокислоты (при физиологическом рН), такой как аргинин.

В отдельном варианте реализации настоящего изобретения линкер (спейсерный пептид) между доменом, связывающим дцРНК, и фрагментом, связывающим мишень, представляет собой пептид ARG9 или его функциональный вариант, включая полипептид, последовательность которого приблизительно на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5.

В отдельном варианте реализации настоящего изобретения химерный рекомбинантный полипептид представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или его функциональный вариант, включая пептид, последовательность которого приблизительно на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентична SEQ ID NO: 4.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения отклонение от описанной последовательности может представлять собой консервативные замены, которые, согласно ожиданиям специалиста, не будут значительно изменять форму или заряд полипептида. Описанные полипептиды также включают те полипептиды, последовательности которых на 100% идентичны указанным последовательностям, но которые отличаются посттрансляционными модификациями от нативной или вырабатываемой в нативных условиях последовательности.

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные рекомбинантные полипептиды представлены в виде отдельных биомолекул. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения описанные полипептиды представляют собой домен более крупного полипептида, такой как независимо свернутый структурный домен, или доступный для окружающей среды функциональный домен.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к комплексу, который содержит любой из описанных рекомбинантных белков и дцРНК. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения дцРНК комплекса представляет собой PKR-активирующую дцРНК, такую как дцРНК, содержащая цепь полиинозиновой кислоты и цепь полицитидиловой кислоты (полиIС). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полиIС содержит по меньшей мере 22 рибонуклеотида в каждой цепи, например, 85-300 рибонуклеотидов в каждой цепи. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения дцРНК комплекса содержит по меньшей мере одну последовательность миРНК, направленную против проонкогенного белка, такого как, но не ограничиваясь ими, Bcl-x1, Bcl-2, Mcl-1, Stat3, Pkb/Akt.

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные комплексы являются компонентом фармацевтической композиции, которая включает фармацевтически приемлемый носитель, описанный выше.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим описанные химерные рекомбинантные полипептиды, например, к нуклеиновой кислоте, представленной в SEQ ID NO: 4.

Следует понимать, что вследствие вырожденности генетического кода последовательности описанных нуклеиновых кислот могут значительно отличаться от последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, но без какого-либо изменения в кодируемом полипептиде. Другие и/или дополнительные мутации в описанных полипептидах, такие как консервативные мутации аминокислот, также могут быть включены без заметного различия. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации, описанные нуклеиновые кислоты на 60%-100% идентичны последовательности SEQ ID NO: 4, например, идентичны на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98%. В конкретном примере последовательность нуклеиновой кислоты скорректирована для учета природного предпочтительного использования кодонов в конкретном организме, таком как бактериальная или растительная клетка. Такие корректировки известны в данной области техники и могут быть найдены (12).

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные последовательности нуклеиновых кислот содержатся в плазмидах для экспрессии и/или клонирования ДНК, которые являются стандартными в данной области техники. Следует понимать, что для экспрессии описанных нуклеиновых кислот, кодирующих химерный полипептид, можно применять любую стандартную плазмиду для экспрессии. Такие плазмиды будут содержать по меньшей мере точку начала репликации, селективную последовательность (такую как, но не ограничиваясь этим, ген устойчивости к антибиотику) и последовательности, контролирующие экспрессию, функционально соединенные с нуклеиновой кислотой. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения плазмиды для экспрессии содержат посттрансляционные последовательности (например, сигнальные последовательности для направления процессинга и экспорта полипептидов), которые кодируются в одной рамке считывания с описанными нуклеиновыми кислотами. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения последовательности, контролирующие экспрессию, представляют собой те, которые известны в данной области техники для оптимизированного контроля экспрессии в бактериальном или растительном хозяине.

Конкретные неограничивающие примеры бактериальных плазмид для экспрессии включают индуцируемые IPTG плазмиды, индуцируемые арабинозой плазмиды и тому подобное. Другие неограничивающие примеры индукции экспрессии включают индукцию светом, индукцию температурой, индукцию питательными веществами и аутоиндукцию плазмид для экспрессии ДНК, специфичных для растений и млекопитающих. Изготовленные на заказ плазмиды для экспрессии коммерчески доступны от поставщиков, таких как New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США) и DNA 2.0 (Менло-парк, Калифорния, США).

В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения описанные полипептиды могут быть изготовлены для немедленного высвобождения, в этом случае они немедленно доступны для окружающей среды, что обеспечивает эффективное количество активного (ых) агента (ов) при введении субъекту и до того момента, как доза будет метаболизирована субъектом.

В еще одном варианте реализации настоящего изобретения описанные полипептиды могут быть представлены в составе или системе с пролонгированным высвобождением. В таких составах терапевтические агенты вводят (применяют) в течение продолжительного периода времени, такого как 1, 2, 3, 4 или более дней, включая 1-72 часа, 24-48 часов, 16-36 часов, 12-24 часа и любой промежуток времени между ними. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения составы с пролонгированным высвобождением немедленно доступны после введения, обеспечивают эффективную дозу терапевтической композиции и остаются доступными в эффективной дозе в течение продолжительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения составы с пролонгированным высвобождением не являются немедленно доступными у субъекта и становятся доступными, обеспечивая терапевтически эффективное количество активного (ых) соединения (й), после того, как препарат метаболизируется или разложится так, чтобы высвободить активное (ые) соединение (я) в окружающую среду.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения можно применять насос. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения составы с пролонгированным высвобождением включают полимерные материалы, обычно используемые в данной области техники, такие как имплантаты, гели, капсулы и тому подобное.

Терапевтические препараты будут содержать терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного активного ингредиента, предпочтительно в очищенной форме, совместно с подходящим количеством носителя так, чтобы обеспечить правильное введение пациенту. Состав должен соответствовать способу введения.

IV. Способы лечения PSMA-связанных заболеваний

Экспрессия PSMA связана с раковыми клетками, в частности, с раком предстательной железы и образованием новых сосудов, связанным с опухолью (13). Согласно еще одному дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который характеризуется экспрессией PSMA, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, любого из комплексов или фармацевтической композиции, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения описанный комплекс вводят субъекту в комбинации с другими фармацевтическими агентами для лечения рака, который лечат. Например, в конкретных примерах лечения рака введение можно комбинировать с хирургическим вмешательством, клеточной терапией, химиотерапией и/или лучевой терапией. Один или более видов терапии в комбинации с описанными полипептидами могут быть введены субъекту последовательно (до или после) или одновременно с описанными полипептидами. При необходимости, согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, комбинации активных ингредиентов могут быть введены субъекту в виде одного или нескольких составов и с помощью одного или нескольких путей введения. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения способы лечения включают последовательное или одновременное введение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Количество каждого терапевтического агента для применения в описанных способах, которое будет эффективным, будет зависеть от типа рака, который лечат, а также стадии нарушения или состояния. Терапевтически эффективные количества могут быть определены с помощью стандартных клинических методик. Точная доза, которая будет применена в составе, также будет зависеть от пути введения и должна быть определена в соответствии с мнением практикующего медицинского работника и обстоятельствами для каждого пациента. Конкретный уровень дозы и частота дозирования для каждого конкретного субъекта могут варьироваться и будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного соединения, метаболическую стабильность и длительность действия данного соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, способ и время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных препаратов и степень тяжести состояния хозяина, получающего терапию.

Терапевтические соединения и композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в приблизительно одинаковых дозах на протяжении периода лечения, по схеме с увеличением дозы или схемы с нагрузочной дозой (например, в которой нагрузочная доза в 2-5 раз выше поддерживающей дозы). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения доза варьирует в течение курса лечения в зависимости от состояния субъекта, которого лечат, степени тяжести заболевания или состояния, наблюдаемого ответа на терапию и/или других факторов на основании суждения специалиста в данной области техники. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предусмотрено длительное лечение лекарственным препаратом.

Следующие примеры представлены для иллюстрации некоторых конкретных признаков и/или вариантов реализации. Эти примеры не следует истолковывать как ограничивающие настоящее изобретение конкретными описанными признаками или вариантами реализации.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Методы

Клонирование GFP-SCP и dsRB-SCP

Плазмиды pGFP-SCP (кодирующую GFP, соединенный с помощью Arg₉ с одноцепочечным антителом против PSMA, ScFvJ591; 56 кДа) и psRB-SCP (кодирующую dsRB PKR человека, соединенный с помощью Arg₉ с ScFvJ591; 48 кДа) (Фиг. 1А) конструировали следующим образом:

SCP (одноцепочечное антитело против PSMA, ScFvJ591) амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды SFG-Pz1 (14), используя праймеры SCP-N и SCP-C. GFP амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды pEGFP-N3 (Clontech), используя праймеры GFP-N и GFP-C. DsRB амплифицировали с помощью ПЦР из плазмиды DRBM-DT-EGF (15), используя праймеры dsRB-N и dsRB-C. Для получения линкера Arg₉ (GSRRRRRRRRGRKA; SEQ ID NO: 5) олигонуклеотид 9ARG1 ренатурировали с комплементарным олигонуклеотидом 9ARG2. Использованные олигонуклеотиды перечислены в таблице 1. GFP-SCP конструировали в несколько этапов в бактериальном векторе экспрессии рЕТ28а (Novagen): GFP клонировали после метки His₆ плазмиды рЕТ28а между сайтами рестрикции NdeI и BamHI, SCP клонировали между сайтами HindIII и XhoI, и линкер Arg₉ вставляли между сайтами BamH1 и HindIII, чтобы получить гибрид His₆-GFP-Arg₉-SCP (Фиг. 1А). Для конструирования dsRB-SCP фрагмент GFP заменяли последовательностью dsRB с использованием сайтов рестрикции NdeI и BamHI, чтобы получить гибрид His₆-dsRB-Arg₉-SCP (Фиг. 2А). Ожидаемые последовательности подтверждали в Центре геномных технологий при Еврейском университете в Иерусалиме (см. дополнительные материалы).

Экспрессия GFP-SCP и dsRB-SCP

Химерные белки экспрессировали в клетках штамма Е. coli BL21trxB(DE3) (Novagen), которые были трансформированы плазмидой pRARE, кодирующей тРНК для редких кодонов. Бактерии выращивали при 37°С в среде 2×YT, дополненной 25 мкг/мл хлорамфеникола, 30 мкг/мл канамицина, 100 мкг/мл ампициллина, 1% глюкозы и 5% буфера NPS (1 М KH₂PO₄, 1 М Na₂HPO₄, 0,5 М (NH₄)₂SO₄). Когда культура достигала OD₆₀₀~0,3 добавляли 0,1% глицерина и 0,1 мМ L-глутаминовой кислоты, и переносили культуру в 42°С, чтобы индуцировать экспрессию шаперонов Е. coli и повысить растворимость белка. Когда культура достигала OD₆₀₀~0,9 ее охлаждали на льду и переносили в 14°С. После 10 мин аккомодационного периода добавляли 0,5 ммоль/л IPTG и затем инкубировали в течение 24 ч. Бактерии собирали и осадок хранили при -80°С до очистки.

Очистка GFP-SCP и dsRB-SCP

GFP-SCP: осадок, полученный из 1,2 л E.coli BL21trxB(DE3, pRARE, pGFP-SCP), оттаивали на льду в 60 мл буфера для связывания (буфер А, 30 мМ HEPES, рН=8,3, 0,5 М NaCl, 10% глицерина, 10 мМ имидазола), дополненного коктейлем ингибиторов протеаз, 3 мг/мл лизоцима и ДНКазой, и лизировали с использованием микрофлюидизатора LV1 (Microfluidics). Экстракт осветляли центрифугированием в течение 30 мин (15000×g, 4°С), загружали на колонку с носителем никель-сефароза FF IMAC объемом 8 мл (GE Healthcare) и промывали буфером для связывания, взятом в 10-кратном объеме колонки (CV), затем промывали 6 CV 5% буфера В (30 мМ HEPES, рН=8,3, 0,5 М NaCl, 10% глицерина, 1 М имидазола), 6 CV 10% буфера В и 1 CV 15% буфера В. Белок элюировали 60% буфером В. Фракции, содержащие химеру (в общей сложности 8 мл), загружали на колонку для гель-фильтрации с сефакрилом S-200 объемом 500 мл (GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером GF (30 мМ HEPES, рН=8,3, 0,5 М NaCl, 10% глицерина). Фракции, элюированные после промывания 0,5 CV, объединяли, концентрировали с использованием Vivaspin-20 (НОММ: 30000, GE Healthcare) и загружали на колонку superdex-75 объемом 350 мл. Фракции, элюированные после промывки 0,5 CV, исследовали методом электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивали InstantBlue (Expedeon). Фракции, которые содержали высокоочищенную химеру, объединяли, концентрировали с использованием Vivaspin-20 (GE Healthcare) и хранили в аликвотах при -80°С.

dsRB-SCP: осадок, полученный из 6 л E.coli BL21trxB(DE3, pRARE, pdsRB-SCP), оттаивали в 300 мл буфера для связывания А, дополненного ингибиторами протеаз, лизоцимом и ДНКазой, лизировали и осветляли, как указано выше. Для высвобождения связанных нуклеиновых кислот хозяина, осветленный лизат смешивали с 8 М мочевиной в соотношении 1:1 (об./об.). Смесь инкубировали при 4°С в течение 1,5 ч и затем загружали на колонку с носителем никель-сефароза FF объемом 60 мл, предварительно уравновешенную буфером С (буфер А, дополненный 0,5% твин-80 и 4 М мочевины), и промывали 12,4 CV буфера С. Для повторной ренатурации белка применяли медленный линейный градиент от буфера С к буферу D (буфер А, дополненный 0,5% твин-80), 10 CV и скорость потока 0,8 мл/мин. Колонку промывали 3 CV 10% и 3 CV 25% буфера Е (30 мМ HEPES, рН=8,3, 0,5 М NaCl, 10% глицерина, 500 мМ имидазола, 0,5% твин-80), и белок элюировали 100% буфером Е. Фракции, содержащие химеру, объединяли и разбавляли буфером для разбавления в соотношении 1:1 (30 мМ MES, рН=<…>, 10% глицерина, 0,5% твина). Разбавленный белок осветляли центрифугированием в течение 30 мин (15000×g, 4°С) и загружали на колонку Fracto-gel EMD SO3 IEX объемом 66 мл (Merck). Применяли ручной ступенчатый градиент (7 CV) буфера F (30 мМ MES, рН=<…>, 100 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,001% твина) и 25%, 27%, 30%, 37% и 38% буфера G (30 мМ HEPES, рН=8,3, 2 М NaCl, 10% глицерина, 0,001% твина-80). Образцы элюированных фракций исследовали методом электрофореза в ДСН-ПААГ и окрашивали InstantBlue (Expedeon). Фракции, содержащие очищенную химеру, объединяли, концентрировали и хранили при -80°С, как указано выше.

Клеточные линии

Клетки линии LNCaP культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10 мМ HEPES, рН=7,4 и 1 мМ пирувата натрия. Клетки линии VCaP культивировали в среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко). Клетки линий РС3 и DU145 культивировали в MEM (минимальная поддерживающая среда), дополненной 1% заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES, рН=7,4 и 1% смеси витаминов MEM. Клетки линии MCF7 культивировали в среде RPMI 1640. Все среды для тканевых культур были дополнены пенициллином (100 ед/мл), стрептомицином (100 мг/л) и 10% ФБС (фетальной бычьей сыворотки). Все клеточные линии приобретали в Американской коллекции типовых культур (АТСС), исследовали и показали, что они не заражены микоплазмой.

LNCaP-Luc/GFP и РС3-Luc/GFP получали с использованием лентивирусных векторов, кодирующих гибридный ген люциферазы-GFP (Luc/GFP), как описано ранее (16). МКПК выделяли из свежей периферической крови человека с помощью стандартного центрифугирования в градиенте плотности фиколла (17). Все клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂ в увлажненном инкубаторе. Все реагенты для культивирования клеток приобретали у Biological Industries, Bet Ha'emek и Israel.

Проточная цитометрия

Клетки высевали в 12-луночные планшеты в плотности 1×10⁵ клеток на лунку, выращивали в течение 40 ч и инкубировали с GFP-SCP. После инкубации клетки обрабатывали трипсином, промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), повторно суспендировали в 1 мл холодного ФСБ и исследовали методом проточной цитометрии с использованием BD FACS ARIAIII (BD Biosciences, США), оборудованного 488 нм лазером. Для каждой обработки получали по 10000 клеток. Клетки подвергали селективному пропусканию для включения только живых клеток, и субпопуляцию исследовали для определения уровней GFP. Все данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (Becton Dickinson).

Иммуноцитохимия

Клетки линий LNCaP, РС3 и MCF7 выращивали в течение 48 ч и инкубировали с 25 нМ GFP-SCP в течение 5 ч при 37°С. После инкубации клетки фиксировали 4% параформальдегидом, дважды промывали ФСБ, пермеабилизировали и окрашивали козьим антителом к GFP (1:1000, Abcam ab5450) с последующей инкубацией с конъюгированным с DyLight 488 вторичным антителом к антителу козы (1:300, Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для окрашивания ДНК использовали 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Окрашенные образцы исследовали с помощью конфокального микроскопа (FLUOVIEW FV-1000, Olympus, Япония).

Визуализация живых клеток

Локализацию GFP-SCP наблюдали в живых клетках линии LNCaP с помощью цейтраферной конфокальной микроскопии (FluoView FV-1000, Olympus, Япония). Клетки линии LNCaP выращивали в течение 48 ч в 8-луночных предметных микростеклах (Ibidi, каталожный номер 80826). После замены среды 200 нМ GFP-SCP добавляли непосредственно в камеру, клетки немедленно исследовали, и последующие изображения получали каждые 6 минут в течение 72 мин. Изображения анализировали с использованием программного обеспечения FLUOVIEW Viewer (версия 4.2).

Количественное исследование сдвига электрофоретической подвижности дцРНК (EMSA)

ДцРНК длиной 500 п.о., транскрибированную с контрольной матрицы набора MEGAscript^® RNAi (AM 1626), помечали с использованием набора реагентов для введения метки в нуклеиновые кислоты Label IT^® (Mirus). По 1 мкг меченой дцРНК инкубировали в течение 30 минут с повышающимися количествами очищенного dsRB-SCP (0,5-3 мкг), и смесь исследовали методом электрофореза на 2% агарозном геле. Гель визуализировали путем окрашивания бромидом этидия.

Получение комплекса dsRB-SCP/полиIС

ПолиIС, использованный для всех экспериментов, представлял собой низкомолекулярный (НМ) полиIС (Invivogen). Для всех экспериментов dsRB-SCP/полиIС, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности получали в буфере для связывания (30 мМ HEPES, рН=8,3, 0,5 М NaCl, 10% глицерина) в концентрациях, указанных в тексте, и предварительно инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре перед добавлением к клеткам.

Количественное исследование выживаемости

Клетки линий LNCaP, VCaP, РС3 и MCF7 высевали в 96-луночные планшеты в трех повторах (5000 клеток/лунку) и выращивали в течение ночи. К клеткам добавляли dsRB-SCP/полиIC, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности и затем инкубировали в течение еще 100 ч. Выживаемость измеряли с использованием набора для люминесцентного количественного исследования жизнеспособности клеток CellTiter-Glo^® (Promega).

Для эксперимента по оценке восстановления клетки линии LNCaP высевали (5000 клеток/лунку) в три 96-луночных планшета, предварительно покрытых полилизином. Для каждого планшета обработки повторяли в трех лунках, и клетки выращивали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIС, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности. Первый планшет количественно исследовали для определения выживаемости через 100 ч. Среду во втором планшете заменяли через 100 ч, и выживаемость количественно исследовали через 172 ч. Среду в третьем планшете заменяли через 100 ч и затем снова через 172 ч, и выживаемость количественно исследовали через 344 ч.

Иммуноблоты

Клетки линии LNCaP высевали в 6-луночные планшеты (1×10⁶ клеток/лунку), выращивали в течение ночи и обрабатывали dsRB-SCP/полиIС или полиIС по отдельности в указанных концентрациях. Через 7, 16 или 24 ч клетки лизировали с использованием кипящего буфера Лэммли для образцов (10% глицерина, 50 ммоль/л Трис-HCl, рН=6,8, 3% ДСН и 5% 2-меркаптоэтанола), после этого лизаты исследовали методом Вестерн-блоттинга (18). Расщепление PARP и каспазы-3 контролировали с помощью антитела к PARP (каталожный номер 95425), антитела к каспазе-3 (каталожный номер 96625) и антитела к расщепленной каспазе-3 (каталожный номер 96615) (все от Cell Signaling Technology). В качестве внутреннего контроля для нормирования количества белка, наносимого на каждую дорожку, блоты также инкубировали с антителами к GAPDH (Santa Cruz, sc-25778).

Детектирование секретированных хемокинов (IP-10 и RANTES) методом ИФА Клетки линии LNCaP высевали в 96-луночные планшеты в трех повторах и выращивали в течение ночи (10000 клеток/лунку). Затем клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIС или полиIС по отдельности в указанных концентрациях. Через 48 ч среду собирали и измеряли концентрации IP-10 и RANTES с использованием коммерческого набора для ИФА (PeproTech).

Выделение РНК, синтез кДНК и количественная ПЦР в режиме реального времени

Клетки линии LNCaP высевали в 24-луночные планшеты (500000 клеток на лунку) и выращивали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIС, полиIC по отдельности или dsRB-SCP по отдельности в указанных концентрациях в течение 4 ч. Клетки лизировали, и общую РНК экстрагировали с использованием набора EZ-10 DNA Away RNA-Miniprep (Bio Basic). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). Уровни экспрессии гена ИФН-β сравнивали с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени и нормировали к уровню экспрессии GAPDH с использованием способа ΔΔ СТ. Праймеры, использованные для количественного определения ИФН-β, включали: прямой: 5' ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC 3' (SEQ ID NO: 6) и обратный: 5' GCTCATGGAAAGAGCTGTAGTG 3' (SEQ ID NO: 7). Праймеры для количественного определения GAPDH включали: прямой: 5' GAGCCACATCGCTCAGAC 3' (SEQ ID NO: 8) и обратный: 5' CTTCTCATGGTTCACACCC 3' (SEQ ID NO: 9).

Хемотаксис МКПК

Клетки линии LNCaP высевали в 24-луночные планшеты, предварительно покрытые полилизином (250000 клеток/лунку) и выращивали в течение ночи. Затем среду заменяли средой с низким содержанием сыворотки (0,15% ФБС), и клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIС в указанных концентрациях. Через 48 ч кондиционированную среду от клеток собирали и помещали на дно лунки 24-луночной системы Transwell (микропористая поликарбонатная мембрана (0,5 мкм) Corning; Costar). Свежевыделенные МКПК (1×10⁶) в среде с низким содержанием сыворотки (0,15% ФБС) добавляли в верхнюю камеру. Через 3,5 ч среду из нижней камеры собирали, и мигрировавшие клетки количественно оценивали методом FACS, пропущенную популяцию лимфоцитов представляли на графике разброса точек данных.

Исследование эффекта «свидетеля» в системах совместного культивирования

Чтобы измерить жизнеспособность одной клеточной линии в совместной культуре с другими клетками, получали клетки, которые экспрессировали люциферазу (либо LNCaP-Luc/GFP, либо РС3-Luc/GFP).

Опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля» исследовали с использованием клеток LNCaP-Luc/GFP, совместно культивированных с МКПК: клетки линии LNCaP-Luc/GFP высевали в трех повторах в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые полилизином (10000 клеток/лунку) и выращивали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIC, полиIC по отдельности или dsRB-SCP по отдельности в указанных концентрациях. Через 24 ч к культуре добавляли с веже выд е ленны е МКПК (1×10⁵ на лунку). Через 48 ч выживаемость клеток LNCaP-Luc/GFP измеряли на основании активности люциферазы с помощью системы для количественного определения люциферазы (Promega).

Комбинированный непосредственный и опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля» исследовали с использованием клеток линии LNCaP, совместно культивированных с РС3-Luc/GFP и МКПК: клетки линии LNCaP высевали в трех повторах в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые полилизином (6000 клеток/лунку) и выращивали в течение ночи, затем клетки обрабатывали dsRB-SCP/полиIC, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности. Через 16 ч к культуре добавляли клетки линии РС3-Luc/GFP (4000 клеток/лунку). Через 24 ч после обработки в культуру добавляли свежевыделенные МКПК (1×10⁵ на лунку). Через 48 ч выживаемость клеток линии РС3-Luc/GFP измеряли на основании активности люциферазы с использованием системы для количественного определения люциферазы (Promega).

Модель на основе опухолевых сфероидов

Опухолевые сфероиды получали с использованием покрытых агаром планшетов. 96-луночные планшеты покрывали 50 мкл/лунку агара (1,5% (масс./об.), растворенного в RPMI) в соответствии с (19). Клетки линий LNCaP или LNCaP-Luc/GFP высевали (2000 клеток на лунку) и инкубировали. Через 97 ч в каждой лунке образовался один круглый сфероид с R=300-400 мкм.

Для измерения сфероидов LNCaP после обработки dsRB-SCP/полиIС сфероиды индивидуально переносили в 96-луночный планшет (1 сфероид/лунку), предварительно покрытый очень тонким равномерным слоем полиНЕМА (120 мг/мл, растворенный в 95% этаноле). Чтобы перенести сфероиды, сначала каждый сфероид поднимали с 200 мкл его среды и переносили в 96-луночный планшет (с U-образными лунками). Планшет центрифугировали в течение 10 минут при 220g и среду заменяли 80 мкл свежей среды. Затем сфероид переносили вместе с 80 мкл среды в покрытый полиНЕМА планшет. dsRB-SCP/полиIС, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности добавляли в указанных концентрациях. Обработку продолжали в течение 5 дней. На 1, 2, 4 и 5 день половину среды в каждой лунке удаляли и заменяли свежей средой, содержащей соответствующую обработку. На 15 день сфероиды окрашивали кальцеином-АМ (1:1000, Molecular Probes с3099) и 0,5 мкг/мл йодида пропидия. Сфероиды контролировали с помощью конфокальной микроскопии, и размер измеряли с помощью программного обеспечения Image J.

Чтобы исследовать опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля» на опухолевые сфероиды, сфероиды LNCaP-Luc/GFP обрабатывали один раз dsRB-SCP/полиIC, полиIС по отдельности или dsRB-SCP по отдельности в указанных концентрациях непосредственно на покрытом агаром планшете. Через 24 ч свежие МКПК метили с использованием 1 мкМ CellTracker™ Violet BMQC (Molecular Probes - Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. 8×10⁴ МКПК добавляли к культуре сфероидов. Совместное культивирование контролировали с помощью конфокальной микроскопии.

Пример 2. Конструирование и количественное исследование химерных белков, нацеливающих на PSMA

ScFvJ591 селективно нацелен на клетки рака предстательной железы, сеерхэкспрессирующие PSMA, и эффективно доставляет свой груз в клетки

Сначала исследовали, действительно ли одноцепочечное антитело ScFvJ591 можно применять в качестве лиганда хоуминга в виде части химерного белка. Получали pGFP-Arg₉-ScFvJ591, кодирующий GFP в качестве маркера отслеживания, гибридизованный с одноцепочечным антителом против PSMA, ScFvJ591, посредством линкера, содержащего последовательность высвобождения из эндосомы (Фиг. 1А). Рекомбинантный белок массой 56 кДа, GFP-SCP (GFP-Arg₉-ScFvJ591), экспрессировали в Е. coli и очищали в трехэтапном процессе очистки, включающем аффинную очистку с последующей двухэтапной гель-фильтрацией (см. Способы).

Исследовали селективность GFP-SCP с помощью конфокальной микроскопии. Химерный белок инкубировали с клетками линии LNCaP, которые сверхэкспрессируют PSMA, и исследовали связывание через 5 ч. Клетки линий РС3 и MCF7, которые не экспрессируют PSMA, служили в качестве отрицательных контролей. Изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа, продемонстрировали, что GFP-SCP связывался с клетками LNCaP и селективно интернализировался, в то время как в клетках линий РС3 или MCF7 связывание не наблюдали (Фиг. 1В). Далее сравнили поглощение GFP-SCP в клетки линий LNCaP и MCF7 с использованием проточной цитометрии. Использовали две дозы GFP-SCP (200 нМ, 400 нМ) в течение двух периодов времени (30 мин, 60 мин). Накопление GFP-SCP измеряли на основании полученного в результате сдвига флуоресценции. Как и ожидалось, наблюдаемые уровни флуоресценции коррелировали с концентрацией GFP-SCP и инкубационным периодом (Фиг. 1С). Эти результаты указывают на зависимость интернализации GFP-SCP от времени и дозы. Напротив, в клетках линии MCF7, в которых PSMA отсутствует, накопление GFP-SCP не наблюдалось (Фиг. 1С). Чтобы контролировать локализацию GFP-SCP, клетки линии LNCaP инкубировали с GFP-SCP и наблюдали за ними с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. Первоначально, флуоресценция GFP-SCP ограничивалась областью клеточной поверхности, и свободная диффузия не наблюдалась (Фиг. 1D). Через несколько минут GFP-SCP проник в клетку за счет эндоцитоза, о чем свидетельствует появление небольших внутриклеточных точечных структур (Фиг. 1D). Со временем количество этих структур увеличилось. Кроме того, наблюдали повышенную внутриклеточную диффузную точечную флуоресценцию (Фиг. 1D), это указывает на то, что GFP покинул эндосому и диффундировал в цитозоль. Накопление GFP внутри клетки линейно увеличивалось в течение 40 минут после связывания (Фиг. 1D).

Разработка, экспрессия и очистка химерного белка, который может переносить и селективно интернализовать полиIС в клетки рака предстательной железы, сверхэкспрессирующие PSMA

Основываясь на структуре химеры GFP-SCP, конструировали химерный белок, который сможет специфически доставить полиIС в клетки, сверхэкспрессирующие PSMA. Фрагмент GFP заменяли дцРНК-связывающими доменами из PKR (dsRBD) (Фиг. 2А). Химерный белок массой 48 кД, dsRB-SCP (dsRB-9Arg-ScFvJ591), экспрессировали в Е. coli и очищали с использованием стадий разворачивания и сворачивания (Фиг. 2В), как описано в примере 1. Оценивали связывание очищенного белка с дцРНК. dsRB-SCP инкубировали с дцРНК определенной длины (500 п.о.), и смесь подвергали электрофорезу на агарозном геле (Фиг. 2С). Контрольная дцРНК в чистом виде достигла ожидаемого положения в геле (Фиг. 2С). Электрофоретическая подвижность дцРНК, которую инкубировали с dsRB-SCP, замедлялась в зависимости от дозы (Фиг. 2С), это подтверждает то, что химерный белок связывал дцРНК.

dsRB-SCP в комплексе с полиIC селективно уничтожает клетки, сверхэкспрессирующие PSMA, за счет индукции апоптоза

Оценивали цитолитическое действие комплекса dsRB-SCP/полиIС, используя четыре линии клеток: LNCaP и VCaP, которые сверхэкспрессируют PSMA, и MCF7 и РС3, которые не экспрессируют PSMA. dsRB-SCP селективно доставлял полиIС в клетки, сверхэкспрессирующие PSMA (LNCaP и VCAP), вызывая гибель до 80% клеток (Фиг. 3А). Клетки, которые не экспрессируют PSMA (MCF7 и РС3), не погибали в результате обработки (Фиг. 3А). Как полагают, клеточный цикл оставшихся 20% клеток линии LNCaP был блокирован, поскольку не наблюдали повторное размножение через 250 ч после вымывания химеры (через 350 ч после обработки) (Фиг. 3В). dsRB-SCP/полиIС индуцировал гибель клеток за счет активации апоптотических путей, на что указывает расщепление каспазы-3 и PARP (Фиг. 3С). В клетках, обработанных только полиIС, расщепление каспазы-3 или PARP не детектировалось (Фиг. 3С).

Обработка dsRB-SCP/полиIC индуцирует секрецию цитокинов и хемотаксис иммунных клеток

Присутствие дцРНК внутри клетки активирует выработку противопролиферативных и проапоптотических цитокинов и хемокинов (20). Чтобы определить, может ли dsRB-SCP/полиIС запускать сходные эффекты, исследовали выработку трех основных цитокинов в клетке: IP-10 и RANTES, которые оба участвуют в хемоаттракции иммунных клеток и ИФН-β, который играет ключевую роль в дифференцировке иммунных клеток (21). ПолиIС по отдельности частично индуцировал секрецию IP-10 и RANTES в среду, согласно результатам измерения с помощью ИФА, как сообщалось ранее (22). Обработка dsRB-SCP/полиIС привела к дополнительному двукратному увеличению секреции IP-10 и RANTES (Фиг. 4А-В). ПолиIС или dsRB-SCP по отдельности не оказывали влияния на экспрессию ИФН-β, однако обработка dsRB-SCP/полиIС привела к очень сильной индукции экспрессии ИФН-β, измеренной с помощью кПЦР в режиме реального времени (Фиг. 4С).

Чтобы исследовать, привлекают ли секретируемые цитокины иммунные клетки, оценивали индукцию хемотаксиса свежевыделенных МКПК под действием среды от клеток LNCaP, обработанных dsRB-SCP/полиIС. На Фиг. 4D показано, что увеличенное количество МКПК мигрировало к кондиционированной среде от клеток, обработанных dsRB-SCP/полиIС, по сравнению со средой от необработанных клеток.

Эффект «свидетеля», индуцированный dsRB-SCP/полиIC

Затем исследовали, могут ли привлеченные иммунные клетки вызывать опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля». Клетки линии LNCaP-Luc/GFP, которые стабильно экспрессируют люциферазу, обрабатывали низкой дозой dsRB-SCP/полиIС и затем инкубировали совместно с МКПК. Активность люциферазы применяли в качестве меры выживаемости клеток линии LNCaP-Luc/GFP. Результаты указывали на эрадикацию клеток линии LNCaP-Luc/GFP (Фиг. 5А). Напротив, в отсутствие МКПК уровень люциферазы изменялся очень незначительно. Эти результаты свидетельствуют о том, что dsRB-SCP/полиIС индуцировал мощный опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля».

Чтобы оценить, может ли dsRB-SCP/полиIС непосредственно индуцировать эффект «свидетеля», клетки линии LNCaP совместно инкубировали с клетками РС3-Luc/GFP, которые не экспрессируют PSMA. Обработка dsRB-SCP/полиIС привела к уничтожению до 60% клеток линии РС3-Luc/GFP (Фиг. 5В). Поскольку клетки линии РС3-Luc/GFP не являются мишенью для dsRB-SCP/полиIC (Фиг. 5В), был сделан вывод о том, что гибель этих клеток является результатом непосредственного эффекта «свидетеля», вызванного клетками LNCaP, на которые нацелен dsRB-SCP/полиIC. Добавление МКПК человека к этой совместной культуре привело к значительному увеличению количества уничтоженных клеток РС3-Luc/GFP (Фиг. 5В), что указывает на дополнительное вовлечение опосредуемого иммунными клетками эффекта «свидетеля» в этих условиях. dsRB-SCP/полиIC разрушает опухолевые сфероиды

Затем оценивали эффективность dsRB-SCP/полиIC в трехмерной модели опухолевых сфероидов. 3D-модели in vitro очень сходны с архитектурой опухолей человека (23) и характеризуются высокой устойчивостью к противораковым препаратам (24). Получали сфероиды LNCaP и обеспечивали им время для достижения 300-400 мкм в диаметре. Затем сфероиды переносили в планшет, обработанный полиНЕМА, и многократно обрабатывали dsRB-SCP/полиIC (400 нМ dsRB-SCP, 2,5 мкг/мл полиIС) в течение 5 дней. К 5 дню сфероиды, которые были обработаны dsRB-SCP/полиIС, стали сжиматься и отделять мертвые клетки, в то время как необработанные сфероиды увеличивались в размере (Фиг. 6А). На 15 день сфероиды окрашивали кальцеином-АМ и йодидом пропидия для контроля жизнеспособности (Фиг. 6А). Сфероиды, обработанные dsRB-SCP/полиIС, продемонстрировали значительные структурные повреждения и содержали большое количество мертвых клеток (Фиг. 6А). Напротив, необработанные сфероиды и сфероиды, обработанные только полиIС или только dsRB-SCP, сохраняли типичную интактную структуру (11), в которой клетки на поверхности были живыми, а клетки в ядре были некротическими (Фиг. 6А).

Чтобы более точно имитировать условия in vivo и исследовать опосредуемый иммунными клетками эффект «свидетеля», к обработанным сфероидам добавили МКПК. Сфероиды LNCaP-Luc/GFP однократно обрабатывали dsRB-SCP/полиIС и через 24 ч к культуре добавляли свежевыделенные МКПК. Даже при самой низкой дозе dsRB-SCP/полиIС расформирование сфероида было очевидным уже через 72 ч после начала обработки или через 48 ч после добавления МКПК (Фиг. 6В). При более высоких дозах полное разрушение сфероида наблюдали через 96 ч после начала обработки. Спустя еще 72 ч наблюдали только мертвые клетки без флуоресценции GFP (Фиг. 6В). В качестве контроля аналогичную обработку проводили в отсутствие МКПК. В конечной точке (168 ч) обработка привела к видимой гибели клеток и расформированию сфероида (нижняя панель на Фиг. 6В), однако эффект был слабее по сравнению с уровнями, наблюдаемыми в присутствии МКПК. Соответственно, dsRB-SCP/полиIС оказывает сильное влияние на сфероиды, и это влияние значительно усиливается за счет добавления иммунных клеток.

Ссылки

1. Luo, J., Beer, Т.M., and Graff, J.N. (2016) Treatment of Nonmetastatic Castration-Resistant Prostate Cancer, Oncology (Williston Park) 30, 336-344.

2. Attard, G., Sarker, D., Reid, A., Molife, R., Parker, C., and de Bono, J.S. (2006) Improving the outcome of patients with castration-resistant prostate cancer through rational drug development, British journal of cancer 95, 767-774, 10.1038/sj.bjc.6603223.

3. Javidan, J., Deitch, A.D., Shi, X.В., and de Vere White, R.W. (2005) The androgen receptor and mechanisms for androgen independence in prostate cancer, Cancer investigation 23, 520-528, 10.1080/07357900500202721.

4. Akhtar, N.H., Pail, O., Saran, A., Tyrell, L., and Tagawa, S.T. (2012) Prostate-specific membrane antigen-based therapeutics, Advances in urology 2012, 973820, 10.1155/2012/973820

5. Sweat, S.D., Pacelli, A., Murphy, G.P., and Bostwick, D.G. (1998) Prostate-specific membrane antigen expression is greatest in prostate adenocarcinoma and lymph node metastases, Urology 52, 637-640.

6. Wright, G.L., Jr., Grob, В.M., Haley, C., Grossman, K., Newhall, K., Petrylak, D., Troyer, J., Konchuba, A., Schellhammer, P.F., and Moriarty, R. (1996) Upregulation of prostate-specific membrane antigen after androgen-deprivation therapy, Urology 48, 326-334.

7. Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J.A., King, D., and Mehes, G. (2009) Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis,Pathology oncology research: FOR 15, 167-172, 10.1007/s 12253-008-9104-2.

8. Tagawa, S.Т., Milowsky, M.I., Morris, M., Vallabhajosula, S., Christos, P., Akhtar, N.H., Osborne, J., Goldsmith, S.J., Larson, S., Taskar, N.P., Scher, H.I., Bander, N.H., and Nanus, D.M. (2013) Phase II study of Lutetium-177-labeled anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer, Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 19, 5182-5191, 10.1158/1078-0432.CCR-13-0231.

9. Galsky, M.D., Eisenberger, M., Moore-Cooper, S., Kelly, W.K., Slovin, S.F., DeLaCruz, A., Lee, Y., Webb, I.J., and Scher, H.I. (2008) Phase I trial of the prostate-specific membrane antigen-directed immunoconjugate MLN2704 in patients with progressive metastatic castration-resistant prostate cancer, Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 26, 2147-2154, 10.1200/JCO.2007.15.0532.

10. van Leeuwen, P.J., Strieker, P., Hruby, G., Kneebone, A., Ting, F., Thompson, В., Nguyen, Q., Но, В., and Emmett, L. (2016) (68) Ga-PSMA has a high detection rate of prostate cancer recurrence outside the prostatic fossa in patients being considered for salvage radiation treatment, BJU international 117, 732-739, 10.1111/bju. 13397.

11. Phung, Y.Т., Barbone, D., Broaddus, V.C., and Ho, M. (2011) Rapid generation of in vitro multicellular spheroids for the study of monoclonal antibody therapy, Journal of Cancer 2, 507-514.

12. Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A., and Garcia-Vallve, S. (2007) OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences, Nucleic acids research 35, W126-131, 10.1093/nar/gkm219.

13. Rajasekaran, A.K., Anilkumar, G., and Christiansen, J.J. (2005) Is prostate-specific membrane antigen a multifunctional protein?

American journal of physiology. Cell physiology 288, C975-981, 10.1152/ajpcel1.00506.2004

14. Gong, M.C., Latouche, J.В., Krause, A., Heston, W.D., Bander, N.H., and Sadelain, M. (1999) Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membrane antigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines in response to prostate-specific membrane antigen,Neoplasia 1, 123-127.

15. Edinger, N., Lebendiker, M., Klein, S., Zigler, M., Langut, Y., and Levitzki, A. (2016) Targeting polyIC to EGFR over-expressing cells using a dsRNA binding protein domain tethered to EGF, PloS one 11, e0162321, 10.1371/journal.pone.0162321.

16. Zigler, M., Shir, A., Joubran, S., Sagalov, A., Klein, S., Edinger, N., Lau, J., Yu, S.F., Mizraji, G., Globerson Levin, A., Sliwkowski, M.X., and Levitzki, A. (2016) HER2-Targeted Polyinosine/Polycytosine Therapy Inhibits Tumor Growth and Modulates the Tumor Immune Microenvironment, Cancer immunology research 10.1158/2326-6066.CIR-15-0203.

17. Shir, A., Ogris, M., Roedl, W., Wagner, E., and Levitzki, A. (2011) EGFR-homing dsRNA activates cancer-targeted immune response and eliminates disseminated EGFR-overexpressing tumors in mice, Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 17, 1033-1043, 10.1158/1078-0432.CCR-10-1140.

18. Mizrachy-Schwartz, S., Cohen, N., Klein, S., Kravchenko-Balasha, N., and Levitzki, A. (2011) Up-regulation of AMP-activated protein kinase in cancer cell lines is mediated through c-Src activation, The Journal of biological chemistry 286, 15268-15277, 10.1074/jbc.M110.211813.

19. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., and Kunz-Schughart, L.A. (2009) Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach, Nature protocols 4, 309-324, 10.1038/nprot.2008.226.

20. Der, S.D., and Lau, A. S. (1995) Involvement of the double-stranded-RNA-dependent kinase PKR in interferon expression and interferon-mediated antiviral activity, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 8841-8845.

21. Kumar, A., Zhang, J., and Yu, F.S. (2006) Toll-like receptor 3 agonist poly(I:C)-induced antiviral response in human corneal epithelial cells, Immunology 117, 11-21, 10.1111/j.1365-2567.2005.02258.x.

22. Galli, R., Starace, D., Busa, R., Angelini, D.F., Paone, A., De Cesaris, P., Filippini, A., Sette, C., Battistini, L., Ziparo, E., and Riccioli, A. (2010) TLR stimulation of prostate tumor cells induces chemokine-mediated recruitment of specific immune cell types,./ Immunol 184, 6658-6669, 10.4049/jimmunol.0902401.

23. Kim, J.B. (2005) Three-dimensional tissue culture models in cancer biology, Seminars in cancer biology 15, 365-377, 10.1016/j.semcancer.2005.05.002.

24. Takagi, A., Watanabe, M., Ishii, Y., Morita, J., Hirokawa, Y., Matsuzaki, Т., and Shiraishi, T. (2007) Three-dimensional cellular spheroid formation provides human prostate tumor cells with tissue-like features, Anticancer research 27, 45-53.

Ввиду многих возможных вариантов реализации, к которым могут быть применены принципы раскрытого изобретения, следует понимать, что проиллюстрированные варианты реализации являются лишь предпочтительными примерами настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Предпочтительно, объем настоящего изобретения определяется следующей формулой изобретения. Соответственно, в объем настоящего изобретение включено все, что относится к объему и сущности данной формулы изобретения.

--->

Перечень последовательностей

<110> Alex Levitzki Management and Holdings, Ltd

<120> Химерные белки для нацеливания дцРНК

<130> 3152/1.2

<150> 62/383,466

<151> 2016-09-04

<160> 21

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 517

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полипептид

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

20 25 30

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe

35 40 45

Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr

50 55 60

Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr

65 70 75 80

Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro

85 90 95

Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly

100 105 110

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys

115 120 125

Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

130 135 140

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His

145 150 155 160

Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp

165 170 175

Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile

180 185 190

Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro

195 200 205

Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr

210 215 220

Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val

225 230 235 240

Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu

245 250 255

Leu Tyr Lys Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg

260 265 270

Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

275 280 285

Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr

290 295 300

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser

305 310 315 320

His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly

325 330 335

Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val

340 345 350

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser

355 360 365

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr

370 375 380

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

405 410 415

Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile

420 425 430

Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln

435 440 445

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

450 455 460

His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

465 470 475 480

Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr

485 490 495

Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Met Leu Asp Leu Lys

515

<210> 2

<211> 1554

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полинуклеотид

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 120

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 180

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 240

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 300

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 360

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 420

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 480

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 540

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 600

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 660

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 720

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagaaa 780

agcggcggtg gcggatcccg tcgtcgccgt cgtcgccgtc gcggccgcaa agcttccgca 840

gaggtgcagc tgcagcagtc aggacctgaa ctggtgaagc ctgggacttc agtgaggata 900

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatatacca tacactgggt gaagcagagc 960

catggaaaga gccttgagtg gattggaaac atcaatccta acaatggtgg taccacctac 1020

aatcagaagt tcgaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag tacagcctac 1080

atggagctcc gcagcctaac atctgaggat tctgcagtct attattgtgc agctggttgg 1140

aactttgact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg aggtggatca 1200

ggtggaggtg gatctggtgg aggtggatct gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc 1260

atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc atcatctgta aggccagtca agatgtgggt 1320

actgctgtag actggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttattgg 1380

gcatccactc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagac 1440

ttcactctca ccattactaa tgttcagtct gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa 1500

tataacagct atcccctcac gttcggtgct gggaccatgc tggacctgaa ataa 1554

<210> 3

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полипептид

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Met Ala Gly Asp Leu Ser Ala Gly Phe Phe Met

20 25 30

Glu Glu Leu Asn Thr Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Val Val Leu Lys Tyr

35 40 45

Gln Glu Leu Pro Asn Ser Gly Pro Pro His Asp Arg Arg Phe Thr Phe

50 55 60

Gln Val Ile Ile Asp Gly Arg Glu Phe Pro Glu Gly Glu Gly Arg Ser

65 70 75 80

Lys Lys Glu Ala Lys Asn Ala Ala Ala Lys Leu Ala Val Glu Ile Leu

85 90 95

Asn Lys Glu Lys Lys Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr Asn

100 105 110

Ser Ser Glu Gly Leu Ser Met Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Ile Asn Arg

115 120 125

Ile Ala Gln Lys Lys Arg Leu Thr Val Asn Tyr Glu Gln Cys Ala Ser

130 135 140

Gly Val His Gly Pro Glu Gly Phe His Tyr Lys Cys Lys Met Gly Gln

145 150 155 160

Lys Glu Tyr Ser Ile Gly Thr Gly Ser Thr Lys Gln Glu Ala Lys Gln

165 170 175

Leu Ala Ala Lys Leu Ala Tyr Leu Gln Ile Leu Ser Glu Ser Gly Gly

180 185 190

Gly Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser

195 200 205

Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

210 215 220

Thr Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu

225 230 235 240

Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp

245 250 255

Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys

260 265 270

Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

275 280 285

Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

290 295 300

Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

305 310 315 320

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr

340 345 350

Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val

355 360 365

Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

370 375 380

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg

385 390 395 400

Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn

405 410 415

Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser

420 425 430

Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 1338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный полинуклеотид

<400> 4

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgatggctg gtgatctttc agcaggtttc ttcatggagg aacttaatac ataccgtcag 120

aagcagggag tagtacttaa atatcaagaa ctgcctaatt caggacctcc acatgatagg 180

aggtttacat ttcaagttat aatagatgga agagaatttc cagaaggtga aggtagatca 240

aagaaggaag caaaaaatgc cgcagccaaa ttagctgttg agatacttaa taaggaaaag 300

aaggcagtta gtcctttatt attgacaaca acgaattctt cagaaggatt atccatgggg 360

aattacatag gccttatcaa tagaattgcc cagaagaaaa gactaactgt aaattatgaa 420

cagtgtgcat cgggggtgca tgggccagaa ggatttcatt ataaatgcaa aatgggacag 480

aaagaatata gtattggtac aggttctact aaacaggaag caaaacaatt ggcggccaaa 540

ctggcctatc tgcagatctt atcggagagc ggcggtggcg gatcccgtcg tcgccgtcgt 600

cgccgtcgcg gccgcaaagc ttccgcagag gtgcagctgc agcagtcagg acctgaactg 660

gtgaagcctg ggacttcagt gaggatatcc tgcaagactt ctggatacac attcactgaa 720

tataccatac actgggtgaa gcagagccat ggaaagagcc ttgagtggat tggaaacatc 780

aatcctaaca atggtggtac cacctacaat cagaagttcg aggacaaggc cacattgact 840

gtagacaagt cctccagtac agcctacatg gagctccgca gcctaacatc tgaggattct 900

gcagtctatt attgtgcagc tggttggaac tttgactact ggggccaagg gaccacggtc 960

accgtctcct caggtggagg tggatcaggt ggaggtggat ctggtggagg tggatctgac 1020

attgtgatga cccagtctca caaattcatg tccacatcag taggagacag ggtcagcatc 1080

atctgtaagg ccagtcaaga tgtgggtact gctgtagact ggtatcaaca gaaaccagga 1140

caatctccta aactactgat ttattgggca tccactcggc acactggagt ccctgatcgc 1200

ttcacaggca gtggatctgg gacagacttc actctcacca ttactaatgt tcagtctgaa 1260

gacttggcag attatttctg tcagcaatat aacagctatc ccctcacgtt cggtgctggg 1320

accatgctgg acctgaaa 1338

<210> 5

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигопептид

<400> 5

Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 6

atgaccaaca agtgtctcct cc 22

<210> 7

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 7

gctcatggaa agagctgtag tg 22

<210> 8

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 8

gagccacatc gctcagac 18

<210> 9

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 9

cttctcatgg ttcacaccc 19

<210> 10

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 10

tttactcgag cggaggtgca gctgcagc 28

<210> 11

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 11

ttttgctcag cgccgttaca ggtccagcca tg 32

<210> 12

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 12

ttttcatatg gtgagcaagg gcg 23

<210> 13

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 13

taaggatccg ccaccgccgc ttttcttgta cagc 34

<210> 14

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 14

tttcatatga tggctggtga tc 22

<210> 15

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 15

ttaggatccg ccaccgccgc tctccgataa gatctgcag 39

<210> 16

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 16

gatcccgtcg tcgccgtcgt cgccgtcgcg gccgcaa 37

<210> 17

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 17

agctttgcgg ccgcgacggc gacgacggcg acgacgg 37

<210> 18

<211> 169

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Met Ala Gly Asp Leu Ser Ala Gly Phe Phe Met Glu Glu Leu Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Val Val Leu Lys Tyr Gln Glu Leu Pro

20 25 30

Asn Ser Gly Pro Pro His Asp Arg Arg Phe Thr Phe Gln Val Ile Ile

35 40 45

Asp Gly Arg Glu Phe Pro Glu Gly Glu Gly Arg Ser Lys Lys Glu Ala

50 55 60

Lys Asn Ala Ala Ala Lys Leu Ala Val Glu Ile Leu Asn Lys Glu Lys

65 70 75 80

Lys Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr Asn Ser Ser Glu Gly

85 90 95

Leu Ser Met Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Ile Asn Arg Ile Ala Gln Lys

100 105 110

Lys Arg Leu Thr Val Asn Tyr Glu Gln Cys Ala Ser Gly Val His Gly

115 120 125

Pro Glu Gly Phe His Tyr Lys Cys Lys Met Gly Gln Lys Glu Tyr Ser

130 135 140

Ile Gly Thr Gly Ser Thr Lys Gln Glu Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Leu Gln Ile Leu Ser Glu

165

<210> 19

<211> 507

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 19

atgatggctg gtgatctttc agcaggtttc ttcatggagg aacttaatac ataccgtcag 60

aagcagggag tagtacttaa atatcaagaa ctgcctaatt caggacctcc acatgatagg 120

aggtttacat ttcaagttat aatagatgga agagaatttc cagaaggtga aggtagatca 180

aagaaggaag caaaaaatgc cgcagccaaa ttagctgttg agatacttaa taaggaaaag 240

aaggcagtta gtcctttatt attgacaaca acgaattctt cagaaggatt atccatgggg 300

aattacatag gccttatcaa tagaattgcc cagaagaaaa gactaactgt aaattatgaa 360

cagtgtgcat cgggggtgca tgggccagaa ggatttcatt ataaatgcaa aatgggacag 420

aaagaatata gtattggtac aggttctact aaacaggaag caaaacaatt ggcggccaaa 480

ctggcctatc tgcagatctt atcggag 507

<210> 20

<211> 237

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полипептид

<400> 20

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly

145 150 155 160

Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe

180 185 190

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val

195 200 205

Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr

210 215 220

Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys

225 230 235

<210> 21

<211>

<212> 711

ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический полинуклеотид

<400> 21

gaggtgcagc tgcagcagtc aggacctgaa ctggtgaagc ctgggacttc agtgaggata 60

tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatatacca tacactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggaaac atcaatccta acaatggtgg taccacctac 180

aatcagaagt tcgaggacaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag tacagcctac 240

atggagctcc gcagcctaac atctgaggat tctgcagtct attattgtgc agctggttgg 300

aactttgact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg aggtggatca 360

ggtggaggtg gatctggtgg aggtggatct gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc 420

atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc atcatctgta aggccagtca agatgtgggt 480

actgctgtag actggtatca acagaaacca ggacaatctc ctaaactact gatttattgg 540

gcatccactc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagac 600

ttcactctca ccattactaa tgttcagtct gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa 660

tataacagct atcccctcac gttcggtgct gggaccatgc tggacctgaa a 711

<---

Claims (20)

1. Химерный рекомбинантный белок для нацеливания дцРНК на клетку, экспрессирующую простатический специфический мембранный антиген (PSMA), указанный белок содержит:

связывающий домен, который связывает двухцепочечную РНК (дцРНК), причем указанный домен, связывающий двухцепочечную РНК (дцРНК), представляет собой по меньшей мере один связывающий дцРНК домен PKR человека согласно SEQ ID NO: 18;

связывающий фрагмент, который связывает мишень, при этом указанная мишень представляет собой простатический специфический мембранный антиген (PSMA), и указанный фрагмент, который связывает мишень, представляет собой одноцепочечное антитело к PSMA, представленное в SEQ ID NO: 20, и

спейсерный пептид между доменом, связывающим дцРНК, и фрагментом, связывающим мишень, причем указанный спейсерный пептид представляет собой ARG₉, представленный в SEQ ID NO: 5.

2. Химерный рекомбинантный белок по п. 1, содержащий полипептид, который идентичен последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.

3. Комплекс для нацеливания дцРНК на клетку, экпрессирующую простатический специфический мембранный антиген (PSMA), указанный комплекс содержит химерный рекомбинантный белок по любому из пп. 1, 2 и дцРНК.

4. Комплекс по п. 3, отличающийся тем, что указанная дцРНК содержит цепь полиинозиновой кислоты и цепь полицитидиловой кислоты (полиIC).

5. Нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок по любому из пп. 1, 2.

6. Плазмида для экспрессии, содержащая точку начала репликации, селективную последовательность и последовательность, контролирующую экспрессию, функционально связанные с нуклеиновой кислотой по п. 5.

7. Применение химерного рекомбинантного белка по любому из пп. 1, 2 для лечения рака предстательной железы, экспрессирующего PSMA.

8. Применение комплекса по п. 3 или 4 для лечения рака предстательной железы, экспрессирующего PSMA.

9. Применение химерного рекомбинантного белка по любому из пп. 1 или 2 для ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, экспрессирующей PSMA.

10. Применение комплекса по п. 3 или 4 для ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, экспрессирующей PSMA.

11. Способ лечения рака предстательной железы, экспрессирующего PSMA, включающий:

введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комплекса по п. 3 или 4, что обеспечивает лечение указанного рака.

12. Способ ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, экспрессирующей PSMA, включающий:

введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комплекса по п. 3 или 4, что обеспечивает ингибирование роста новой сосудистой сети указанной опухоли.

13. Способ по п. 11 или 12, характеризующийся тем, что указанный комплекс вводят системно или локально.

14. Способ лечения рака предстательной железы, экспрессирующего PSMA, указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комплекса по п. 3 или 4 и дополнительно введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

15. Способ ингибирования роста новой сосудистой сети опухоли, экспрессирующей PSMA, указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комплекса по п. 3 или 4 и дополнительно введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Images