JPH04501708A - 細胞膜ブレンディング剤を含む分子共役体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞膜ブレンディング剤を含む分子共役体背景 ある植物及び微生物毒素等の多くのタンパク質は、ガンやその他の疾病を治療す るための潜在的な非常に強力な治療剤である。核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）も、ウ ィルス性疾病及び細菌性疾病を治療するための潜在的な非常に可変性のある治療 剤である。これらの巨大分子は、細胞内成分に作用することによってそれらの細 胞の死、細胞活動の停止及び特定の調節に関する効果が得られるようになってい るため、治療的効力は、これらの分子の、細胞内へ入る能力によって決まる。

タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む一部の巨大分子は細胞に入ることができる とわかっている。洋種ヤマゴボウ抗ウイルスペプチド等のタンパク質、リシンＡ 鎖及びその他の植物毒素を細胞で培養する確立されている試験管内実験では、ど ういうわけかタンパク質の一部分が細胞原形質膜を通過して、一定の合成経路を 阻害するため、細胞に異常が生じて死に至る。核酸分子も、はっきりとはわかっ ていないが一定の条件下で細胞に入ることができる。通常の感染過程では、細胞 を特定の遺伝子のＤＮＡとインキュベーションすると、特定の遺伝子変化が生じ る。腫瘍遺伝子のＤＮＡは細胞に入って宿主ゲノム内に侵入し、細胞を形質変換 させることができる。アンチセンスＲＮＡは細胞に入って、特定の遺伝子の発現 を阻害する。二重鎖ＤＮＡまたは不整合二重鎖ＲＮＡも細胞に入って、インター フェロン産出を含む一定の抗ウイルス効果を誘起する。

様々な巨大分子がどのようにして細胞に入るかは完全に解明されていない。一部 の植物毒素の場合、細胞表面との結合及び膜を横切る転座機構が含まれている。

例えば、Ａ及びＢ鎖の２つの鎖からなる自然のままのりシンが細胞と反応した場 合、Ｂ鎖が細胞膜の表面上の一定の炭水化物部分と結合して、ある未確認機構に よってＡ鎖が細胞に入るのを助ける。Ａ鎖はりボゾームを不活性化して、タンパ ク質合成経路を阻害するため、細胞を死に至らせる。Ａ鎖だけでも細胞に貫入す ることができるが、その能力は非常に弱く、（自然のままのりシン分子に較べて ）濃度を非常に高くする必要がある。核酸分子の場合、リン酸カルシウムまたは ポリエチレングリコールによる沈降によってそれらの細胞への貫入を促進するこ とができる。

タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡが細胞に入る正確な機構は十分に理解されていな いが、細胞膜との会合が細胞への貫入を促進していようである。さらに、飲用用 が重要な役割をしていると言われており、分子が細胞膜と会合することによって 細胞による分子の自己食作用が促進されることがわかっている。

最近では、ジョージ他が、診断及び治療に使用できる試剤を細胞表面上に導入す る手段を提案している（１９８８年マイアミ、バイオ／テクノロジー冬季シンポ ジウム会報第３３ページ、ワシントンＤ、　Ｃ１のＩＲＬプレス発行）。細胞膜 に貫入することができるチトクロームｂ５のカルボキシ末端部分の固有の能力を 利用して、著者たちはこのペプチドセグメントを他のタンパク質と結合させるこ とによってそれらにこの特性を持たせることを提案している。

発明の概要 本発明は、薬剤の効力を向上させるため、巨大分子薬剤と細胞膜との会合を促進 すると共に、巨大分子薬剤を細胞に会合させてそれに進入させることを促進する 改良組成物及び方法に関するものである。特に、本発明は、細胞膜の脂質二重層 に貫入できる膜ブレンディング剤と結合させた巨大分子薬剤（例えばタンパク質 または核酸）を有する分子共役体に関するものである。膜ブレンディング剤はブ ロック剤と結合しており、ブロック剤は、脱離するまで、膜ブレンディング剤の 膜貫入能力を阻害する。膜ブレンディング剤とブロック剤との結合は、適当な条 件において開裂可能である。ブロック剤が脱離すると、膜ブレンディング剤が活 性化して、分子共役体を細胞膜に貫入させる。膜ブレンディング剤は、細胞膜に 貫入できる一定のタンパク質の適当な領域などのペプチドにすることができる。

例えば、紡錘形遺伝子（＋ｕｓｏｇｅｎｉｃ）ポリペプチド、イオンチャンネル 形成ポリペプチド及びその他の膜ポリペプチドがある。膜ブレンディング剤は長 鎖脂肪酸でもよい。例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）、パルミチン酸（ ヘキサデカン酸）または様々な長さのその他の脂肪酸がある。ブロック剤は、膜 ブレンディング剤と結合した時、膜ブレンディング剤が細胞の原形質膜に貫入で きないようにする。それは親水基または荷電基である。ブロック剤は第２の目的 で機能させることもできる。それは、分子共役体を所望の細胞または細胞集団へ 向かわせるターゲツティング剤（例えば抗体または細胞表面レセプタのための配 位子）にすることもできる。例えば、腫瘍細胞上に表出した腫瘍関連細胞表面抗 原に特異な、またはウィルス感染細胞の表面上に表出したウィルス特異抗原に特 異な単一クローン抗体がある。その他の例として、インターロイキン−２レセプ タと結合するインターロイキン−２、及びピリオン及び旧Ｖ−１感染細胞の表面 上に表出した旧Ｖ−ｔのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０と結合する組換え 可溶性ＣＤ４抗原がある。

ブロック剤にそれ以外の目的がない場合、ブロック剤は、アミノ酸または短ペプ チド等、小さいものが好ましい。短ペプチドはＣ７ｓ−ＧｌｕまたはＣｙｓ−Ｇ ｌｕ−Ｇｌｕでよい。

本発明はさらに、膜ブレンディング剤自体の治療的用法にも関している。このた めには、膜ブレンディング剤は、所望の活動部位で脱離するまでそれの活動を阻 害するブロック剤と開裂可能に結合できるようにする。また、２つ以上の膜ブレ ンディング剤を治療共役体として互いに結合させることもできる。

図面の簡単な説明 図１は、膜ブレンディング剤を用いた共役体の組成に用いられる成分の概略記号 を示している。

図２は、膜ブレンディング剤が活動または不活動（前駆物質）状態にある共役体 の代表的構造を示している。

図３は、潜在的治療剤として膜ブレンディング剤を含有している代表的分子共役 体を示している。

図４は、膜ブレンディング剤と官能結合基とからなるクロスリンカ−の様々な形 式を示している。

発明の詳細な説明 本発明の分子共役体は、 ａ、巨大分子薬剤と、 ｂ、巨大分子薬剤と結合して、細胞膜に貫入できる膜ブレンディング剤と、Ｃ０ 膜ブレンデイング剤と結合して、膜ブレンディング剤が細胞膜に貫入できないよ うにするブロック剤とを有している。

共役体において、膜ブレンディング剤は一般的に薬剤と不可逆的に結合している 。

ブロック剤は、開裂可能に膜ブレンディング剤と結合しており、適当な状態下に おいて脱離し、そのように脱離した時、膜ブレンディング剤が活性化して細胞膜 へ貫入できるようになる。分子共役体の成分及びそれらの相対的機能について以 下に詳細に説明する。分子共役体は主に細胞への貫入性を向上させるように設計 されているが、共役体の構造及び意図されている生物学的効果によっては細胞へ の貫入性は必ずしも必要ではない。分子共役体が実際に細胞内へ入らなくても、 分子共役体が細胞膜に付着することによって一定の生物学的及び治療的効果をあ げることができる。

１、　巨大分子薬剤 本発明の分子共役体の巨大分子薬剤成分はタンパク質、糖タンパク質、核酸及び その他の大きい有機分子、例えばトリカセカム（ｌｒｉｃｘｌｈｅｅｕｍｓ）に することかで　。

きる。例えば、潜在的治療剤には、リシン（Ａ鎖）、アブリン（Ａ鎖）、洋種ヤ マゴボウ抗ウイルスペプチド、サポリン及びゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）等の植 物毒素、微生物毒素、シュードモナス菌外毒素Ａ１及びジブセリア（ｄｉｐｔｈ ｅｒｉａｌ毒素がある（１．パスタン（Ｐａ＋ｔａｎ）他の「細胞」第４７号、 ６４１〜６４８頁（１９８６年）に概説されている）。これらの物質の多くは免 疫共役体の組成に用いられており、例えばＧ、ビオシン（Ｖｉｏｓｉｎ）他の米 国特許第４．３４０．５３５号（１９８２年）、Ｙ、マスホ他の米国特許第４． ３７９．１４５号（１９８３年）、Ｆ、Ｋ。ジャンセン山ｎ５ｅｎ）他の米国特 許第４．４１４．１４８号（１９８３年）、■、パスタン他の米国特許第４．５ ４５．９８５号（１９８５年）、Ｐ、カセラス（Ｃａｓｅｌｌａｓ）他の米国特 許第４．６４３．８９５号（１９８７年）、Ｊ、Ｗ。

ウーア（ｌｉｌｕ）及びＥ、Ｓ、ビテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）の米国特許第４． ６６４．９１１号（１９８７年）、Ｒ，Ｊ、ニアリア（Ｃｏｌｌｉｅｒ）及びＳ 、　Ｆ、キャロル（Ｃａｏｏｌｌ）の米国特許第４、７０９．０１７号（１９８ ７年）を参照されたい。

核酸に１れ二重鎖ＤＮＡまたは不整合二重鎖ＲＮＤが含まれる。これらの物質は 、インターフェロン誘発物質、抗ウィルス剤または抗腫瘍剤として用いられてき た。

治療用核酸には、遺伝子転移または遺伝子治療のための特定の遺伝子のＤＮＡセ グメントも含まれる。アンチセンスＲＮＡも、特定の遺伝子の発現の阻害に使用 することができる。

２、　細胞表面または膜に対して親和性がある膜ブレンディング割膜ブレンディ ング剤は、ペプチド、脂肪酸、または細胞原形質膜に貫入できる親和性を備えた その他の分子にすることができる。好適な膜ブレンディング剤はペプチド、ペプ チドセグメント及び脂肪酸である。

タンパク質分子の幾種類かのペプチドセグメントまたは合成ペプチドが細胞原形 質膜に会合することが知られている。一般的に、これらのペプチドは疎水性アミ ノ酸残基を含有している。ペプチドは、細胞原形質膜の脂質二重層に貫入または 入り込むことができる。これらのペプチドまたはペプチドセグメントは、次の形 式のペプチドから得ることができる。

Ａ）紡錘形遺伝子ペプチドニ一定のエンベロープ形ウィルスが標的細胞を汚染す ると、感染した細胞間及び感染した細胞と未感染細胞との間で融合が発生して、 融合細胞と呼ばれる巨大な多核細胞を形成する。様々な実験から、ピリオン粒子 及び感染細胞の表面に表出したタンパク質の媒介によって融合することがわかっ ている。Ｗ、Ｒ，ガラバー（Ｃ＋ａｌｌａｈｅｒ）他の「細胞」第５０号、３２ ７〜３２８頁（１９８７年）、Ｊ、ホワイト他の四季報「生物物理学」第１６号 、１５１〜１９５頁（１９８３年）、Ｍ、ゲッシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）他の「 Ｊ、細胞生物学」第１０２号、１１〜２３頁（１９８６年）を参照されたい。融 合タンパク質の突然変異によって、ウィルスの感染力及びそれらの融合細胞形成 能力をなくすことができる。融合タンパク質をコードする遺伝子を細胞内−・ト ランスフェクションすることによってこれらの細胞を融合することができる。突 然変異分析及びトランスフェクションの研究から、融合に関係するペプチドセグ メントが識別されている。紡錘形遺伝子ペプチドセグメントを代表する合成ペプ チドが融合を阻害することができる。ウィルスを形成している様々な融合細胞の 融合タンパク質問でのアミノ酸配列の分析から、ペプチドセグメントは１０〜３ ０アミノ酸残基の長さであり、疎水性であることがわかっている。

それらは、融合タンパク質のポリペプチド内のアミノ末端またはその内部に位置 している。幾つかのウィルスの融合タンパク質は、非極性アミノ酸残基をＸで表 した時、Ｐｌ＋ｅ−Ｘ−ＧＩ７配列の繰り返しを含む。

Ｂ）両親媒性イオンチャンネル形成ペプチド：　イオンチャンネル形成タンパク 質の膜透過ペプチドセグメントは、独特のＬ字形螺旋構造をしている。すべての チャネルは、４〜５個のそのような相同ドメインで形成されている。これらのペ プチドセグメ〉・トには、極性または非極性残基が含まれている。極性残基は、 螺旋の一面上に並んでいる。前記のように構成された螺旋のこれらの極性側部は 、イオン移送用のチャネルを形成している。螺旋のその他の側部は相互間及び脂 質二重層と作用し合う。Ｈ，Ｒ，ガイ（Ｇｕｙ）の「生物物理学Ｊ、Ｊ第４５号 、２４９頁（１９８４年）、Ｊ、ファイナームーア（Ｆｉｎｅ＋−Ｍｏｏｒ）及 びＲ，ストラウド（Ｓｈｒｏｕｄ）の米国の国立科学協会の会報第１号、１５５ 頁（１９８４年）、Ｒ，Ｅ、グリーンブラット（Ｇｒｅｅｎｂｍｊ）他のｒＦＥ ＢＳレター」第１９３号、１２５頁（１９８５年）を参照されたい。最近では、 ２１個のアミノ酸長さで構造が、１１２　Ｎ−（Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｌｅｕ−３ｅｔ−ｔｅａ）３−　ＣＯＮＨ２のペプチドが合成されており、 機能的イオンチャンネルを形成することがわかっている。Ｊ、Ｄ、リヤ（Ｌｃａ ＋）他の「サイエンス」第２４０号、１１７７〜＋１８１頁（１９８８年）を参 照されたい。

膜ブレンディング剤自体が治療剤として使用されていない場合、重要であるのは イオンチャンネル形成または膜融合特性ではなく、細胞膜の脂質二重膜に貫入ま たは入り込む特性が重要であることを指摘することが重要である。実際に、作動 物質すなわち治療剤はあまり強く膜と会合しないで、転座過程で細胞内へ脱離で きることが好ましい。このため、イオンチャンネル形成ペプチドのセグメントだ けを用いれば十分である。例えば、１０のアミノ酸残基のペプチドセグメント） ＩＮ２−Ｌｅｕ−５ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｃｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− ３ｅ＋−Ｌｅｕ−ＣＯＮＨ２がある。

Ｃ）膜脂質に対して親和性がある他のペプチド：　他の一部のペプチドのペプチ ドセグメントは、タンパク質を細胞膜の脂質二重層に入り込むことができるよう にすることが知られている。例えば、（前述の）チトクロームｂ５の疎水性Ｃ− 末端ペプチドセグメントがある。Ｓ、ジョージ（Ｇｅｏ＋ｇｅ）他の１９８８年 マイアミ、ノスイオ／テクノロジー冬季シンポジウム会報第３３頁（ワシントン Ｄ、　Ｃ，のＩＲＬプレス発行）を参照されたい。これらのペプチドは、ペプチ ドの特性によって膜に入り込む。この過程には酵素に媒介された触媒作用は含ま れていない。はとんどの膜内在性にタンパク質の膜透過領域には、疎水性の非極 性残基が含まれている。これらのペプチドセグメントを用いることもできる。例 えば、膜結合１ｇＥの膜透過領域のセグメントがある。適当なセグメントは、１ １のアミノ酸残基の長さのセグメント、 Ｈ２Ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−ＩＬ！−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｂｅ− １１ｅ　−Ｔｂ＋−Ｌｔｕ−ＣＯＮＨ２がある。

Ｄ）一部の長鎖脂肪酸、例えばバルミチン酸（ヘキサデカン酸；Ｍ、シュレシン ガ（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）の年会報「バイオケム」第５０号、１９３〜２ ０６頁（１９８１年）。

Ａ、マギー（Ｍａｇｅｅ　）他の「バイオケミ力、バイオフィジカ、アクタ」第 ７９８号、１５６〜１６６頁（１９８４年）参照）、及びミリスチン酸（テトラ デカン酸、Ｃ，Ｈ。

ストロウリ（Ｓｊ＋ｅｕｌｉ）及びＢ、　Ｅ、グリッツイン（ＧｒＨＩｉｎ）の 「ネーチャー」第３２６号、６１９〜６２２頁（１９８７年）、Ｍ、チョウ（Ｃ ｈｏｖ）他の「ネーチャー」第３２７号、４８２〜４８６頁（１９８７年）参照 ）がタンパク質分子と共役化することがわかった。脂肪を添加したタンパク質の 変化がタンパク質を細胞膜に会合し易くしているのであろうと言われている（Ｄ 、ペルマン（ｐ＠ｌ１ｍｇｎ）他の「ネーチャー」第３１４号、３７４〜３７７ 頁（１９８５年）参照）。このように、脂肪酸は本発明の分子共役体において膜 ブレンディング剤として作用することができる。以下に記載するように長鎖脂肪 酸に結合基を導入する科学的変化を加えることもできる。

３、不活性すなわち「前駆物質」状態の膜ブレンディングペプチドと巨大分子と の結合 膜ブレンディング剤は、膜ブレンディング剤に内在する官能基を介して、または 膜ブレンディング剤または薬剤内に導入された官能基を介して巨大分子薬剤と結 合させることができる。一般的に、膜ブレンディング剤は不可逆的に薬剤と結合 する（一定の環境では結合は分裂可能である）。例えば、膜ブレンディングペプ チドは、Ｎｌ２またはＳＨ等のタンパク質分子上の多くの官能基を利用してタン パク質分子と結合させることができる。核酸は、膜ブレンディング剤を結合させ る活性基を含有するように変化させることができる。あるいは、遺伝子工学的方 法を用いて、膜ブレンディングペプチドをタンパク性巨大分子薬剤と結合させる こともできる。ペプチドを遺伝学的に薬剤と融合させることができる。膜ブレン ディングペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、治療性タンパク質をコー ドする遺伝子と（末端または内部のいずれかで）結合させることができる。その 複合遺伝子を適当な宿主系で発現して、膜ブレンディングペプチドを含むタンパ ク質共役体を産出することができる。

腫瘍に対する細胞毒素のようなほとんどの治療性巨大分子薬剤は、一定の組織を 標的にするように設計されているので、薬剤は標的組織または細胞に達した時だ け細胞膜に会合できる能力を持つことが望ましい。薬剤を活性状態の膜ブレンデ ィングペプチドと共役化すると、この共役体は、患者に投与された後、非選択的 に細胞と会合するかもしれない。例えば、その共役体は血液内や血管内の細胞と 会合する可能性がある。さらに、露出した膜ブレンディングペプチドは、循環中 にタンパク質加水分解による開裂を生じ易い。これらの問題により、薬剤の治療 効力が低下し、毒素効果が増大する。

これらの問題を軽減するため、膜ブレンディング剤が活性化していない状態の膜 ブレンディングペプチドに巨大分子を結合させる。分子共役体を不活性すなわ、 ち「前駆物質」状態にするには、膜ブレンディング剤の「マスキング」を行って 、それが細胞原形質膜に貫入することを阻害できるようにすればよい。これには 、膜ブレンディング剤の１つの端部を薬剤と結合させて、膜ブレンディング剤の 別の部分をマスキングすなわちブロック剤に開裂可能に結合させればよい。ブロ ック剤は、かさが大きい部分または荷電部分にすることができる。それはアミノ 酸、ペプチドまたはタンパク質でもよい。ブロック剤は人に免疫反応を生じない ことが好ましい。かさが大きい部分または荷電部分が膜ブレンディング剤に付着 することによって、それが細胞膜に貫入できなくなり、共役体が細胞膜と会合で きなくなるように設計されている。

ブロック剤は第２の目的で機能するように設計することもできる。ブロック剤は 、分子共役体を適当な標的に選択的に向かわせるターゲツティング剤にすること もできる。例えば、ターゲツティング剤は、腫瘍細胞やウィルス感染細胞等の痢 患細胞の単一の抗原決定基に特異な抗体でもよい。■、パスタン他の「細胞」第 ４７号、６４１〜６４８頁（１９８６年）、Ｅ、Ｓ、ビテッタ他の「サイエンス 」第２３８号、１０９８〜１１０４頁（１９８７年）を参照されたい。ターゲツ ティング剤は、細胞表面レセプタ（例えばホルモンまたは成長因子）またはウィ ルス抗原に対する可溶性レセプタに対する配位子でもよい。

膜ブレンディング剤は、開裂可能な結合によってブロック剤に結合される。ブロ ック剤は適当な条件（例えば標的部位に存在している状態）下において脱離し、 この脱離によって膜ブレンディング剤が活性化する。

好適な開裂可能な結合はジスルフィド結合である。ジスルフィド結合は、タンパ ク質分子のＣ７ｓ残機のＳＨ基と、膜ブレンディング剤に導入された活性求電子 Ｓ原子との間に見られる。例えば請求電子Ｓ原子としてはＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰＤＰ）がある。標的組織部 位では、Ｓ−Ｓ結合が開裂して、順次減少する。開裂可能な結合は、標的組織の わずかな酸性ｐＨを利用する構成にすることもできる。少量の放射に敏感な結合 を構成することもできる。治療時には、膜ブレンディング剤を不活性状態で含む 分子共役体を投与して、結合を開裂する時に一定の放射を行うようにする。

本発明の分子共役体を図面の概略的表示によってさらに説明する。図１は、分子 共役体を説明するために用いられる記号を示している。図２は、４種類の分子共 役体を示している。共役体■及び■は、活性状態（阻害されていない）で膜ブレ ンディングペプチドを含んでいるのに対して、共役体■及び■は本発明の原理に 従った不活性前駆物質状態で膜ブレンディングペプチドを含んでいる。後者の２ つの共役体では、膜ブレンディングペプチドが薬剤（作働治療斉りと不可逆的に 結合していると共に、ブロック剤と開裂可能に結合している。

４、　作動物質またはラベリング剤としての膜ブレンディング割膜ブレンディン グ剤自体を治療に（または診断に）用いることができる。１つの潜在的治療用法 は、痢患細胞の排除である。例えば、ある細胞を標的とする膜ブレンディング剤 は隣接の標的細胞同士を融合させて多核融合細胞を形成することにより、それら を死に到らせる。別の可能性として、それらがイオンチャンネルを形成して、致 死イオン透過性を生じる方法がある。

膜ブレンディング剤をターゲツティング剤と同時に治療剤としても使用する時、 標的組織内のすべての細胞がターゲツティング抗原またはレセプタを表出する必 要はない。膜ブレンディング剤は、標的組織へ運ばれてから離脱する。それらは 、ターゲツティング抗原またはレセプタには関係なく、その場の細胞と反応する 。

この考えに沿って、抗原性が高い単一ペプチド等の一般的ラベリングまたはター ゲツティング剤を標的組織内のすべての細胞と反応させることができる。この段 階が治療または生体内診断過程で完了した後、（治療用の）免疫毒素または（放 射線像進用の）放射性アイソトープまたは（核磁気共鳴像造用の）常磁性成分と 共役化した、ラベリング剤に特異な抗体を投与する。この方法の利点は、すべて の痢患細胞に対する治療剤または診断剤が同一であることである。

膜ブレンディング剤での治療には、図３に示されている幾つかの代表的分子共役 体を用いることができる。各共役体において、膜ブレンディング剤は不活性の「 前駆物質」状態にある。共役体ｖ１及び■に示されているように、２つの膜ブレ ンディング剤を開裂可能または開裂できないように相互結合させることができる 。

それらの膜ブレンディング剤は同一種類でも別の種類でもよい。例えば、２つの 紡錘形遺伝子ペプチドを結合させたり、１つの紡錘形遺伝子ペプチドとイオンチ ャンネル形成ペプチドとを結合させることができる。共役体の水溶性を増大する ため、一連の極性アミノ酸残基を２つの膜ブレンディングペプチドの間に配置す ることができる。ｖｌや■等の共役体は、２つの隣接細胞と反応する特性を獲得 できる。この点において、デキストラン等の多分岐分子から形成された共役体も 重要である。

５、二官能または多官能結合基を持つ膜ブレンディング剤以上に説明した概念に 基づいて、膜ブレンディング剤が不活性の前駆物質状態にある共役体（すなわち 共役体■〜■）の作成について説明する。一般的に、これには膜ブレンディング 剤の両端部に結合することが含まれる。本発明の分子共役体を構成するため、膜 ブレンディング剤は２つの端部に適当な官能リンカ−を備えて作成できる。これ らの構成は図４に示されている。クロスリンカ−■形では、３つの結合基が導入 されている。前述したように、クロスリンカ−■及び■の２つの膜ブレンディン グペプチドは、同一種類でも別の種類でもよい。また、結合基は不可逆的でも開 裂可能のものでもよく、リンカ−も同一種類でも別の種類でもよく、共役体の作 成要件及び共役体の意図する薬理学的効果によって決まる。

以下の実験に基づいて本発明をさらに説明する。

実験 実験１：　１つの膜ブレンディングペプチドと２つの官能リンカ−とを構成する クロスリンカ−の作成 人免疫不全ウィルス（旧Ｖ）と標的細胞との融合に関係あると言われている旧Ｖ のＨＴＬＶ−１１１Ｂ菌株のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０のペプチドセグ メントを用いた膜ブレンディングクロスリンカ−０このクロスリンカ−は、図４ に示されている形式Ｉである。その配列はｇｐ１２Ｇからの２０のアミノ酸残基 （１５０８〜５２７）を有しており、さらにＣ−末端にリシン残基を有している 。リシン５１３はアルギニンと置換される。リシン残基を設けるのは、結合基を 導入できるようにするためである。

クロスリンカ−は以下のようにして合成される。

段階Ｉ Ｆｍｏｃ−保護ペプチド： Ｆｍｏｃ−ＲＥＲＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＫ−ＣＯＮＨ２（Ｉ　） を合成。

段階２ Ｆｍｏｃ−保護ブレンディングペプチドをＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリ ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させる。　ｐＨ９〜１０Ｆｍｏ ｃ−ＲＥＲＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＫ−ＣＯＮ）Ｉ２＋　５ＰＤＰ 　−〉段階３ ■を５０％ジエチルアミン／ＤＭＳＯと反応させてＮ−末端Ｒの保護を解除する 。

段階４ ■を過剰の同種二官能スクシンイミジルと、またはスクシンイミジル及び光活性 化官能基を備えた異種二官能クロスリンカ−と反応させる。いずれのクロスリン カ−もジスルフィド結合を含む。

（ジチオ　ビス（スルホスクシンイミジル　プロピオネート）実験２：　治療剤 、ターゲツティング剤及び膜ブレンディング剤を構成する分子共役体の作成 本実験では、実験１で作成されたクロスリンカ−（クロスリンカ−ＩＶａ）を用 いて、洋種ヤマゴボウ抗ウイルスペプチド（ＰＡＰ）　と、ＨＴＬＶ−１１１Ｂ のｇｐ１２０に特異な単一クローン抗体ＢＡＴＩ２３との複合体を作る。この分 子共役体を適用すると、旧ｖ−１感染細胞を殺すことができる。

クロスリンカ−ＩＶａは次のように略記される、段階１：　クロスリンカ−ＩＶ ａをＰＡＰと反応させる。

ｐＨ７，８〜８．０ 段階２：　ＢＡＴＩ２３単一クローン抗体を２イミドチオレーン（トラウド（Ｔ ｒｘｕりの試薬）と反応させる。

ＤＡＴ１２３　８ＡＴＩ２３−　ＳＨ（ＶＩ）２イミドチオレーン 段階３：　ｖを■と反応させる。

ｐＨ９，０ 当業者であれば、通常の実験を用いて上記の本発明の特定の実施例に様々な変更 を加えることができるであろう。そのような変更は本発明の範囲に入るものとす る。

ｌ刀Ｉ 刃λ ／Ｂ３ 尖樅４．Ｖｆ 弁板＃■ ／コｔ ゛りＤ：ｌ’／ンｊｌ−１７ｎ、ｚタンカー１国ａｔ＠審−牛 ｌ１１１齢崗−＾−−詐−Ｎ・　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３５３２国際調査報告 ＵＳ　８９０３５３２ ＳＡ　３０８６８

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞膜に貫入することができる外因性膜プレンディング剤に結合した巨大分 子薬剤を有しており、該膜プレンディング剤がそれの細胞膜貫入能力を阻害する ブロッキング剤と開裂可能に結合していることを特徴とする分子共役体。
2. ２．薬剤は、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、または核酸であること を特徴とする請求項１の分子共役体。
3. ３．細胞膜に貫入することができる膜プレンディング剤は、紡錘形遺伝子ペプチ ドまたはその一部分であることを特徴とする請求項１の分子共役体。
4. ４．紡錘形遺伝子ペプチドのアミノ酸配列がＲＥＲＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ ＧＡＡＬＫであることを特徴とする請求項３の分子共役体。
5. ５．細胞膜に貫入することができる膜プレンディング剤は、イオンチャンネル形 成タンパク質または糖タンパク質の膜透過ペプチドセグメントまたはその一部分 であることを特徴とする請求項１の分子共役体。
6. ６．ペプチドの組成式が、 ＨＮ２−（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）３−Ｃ ＯＮＨ２であることを特徴とする請求項５の分子共役体。
7. ７．細胞膜に貫入することができる膜プレンディング剤は、長鎖脂肪酸であるこ とを特徴とする請求項１の分子共役体。
8. ８．脂肪酸は、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）であることを特徴とする請求項 ７の分子共役体。
9. ９．プロッキング剤は、ターゲッティング剤でもあることを特徴とする請求項１ の分子共役体。
10. １０．ターゲッティング剤は、細胞表面抗原に特異な抗体であることを特徴とす る請求項９の分子共役体。
11. １１．ターゲッティング剤は、細胞表面レセプタに対する配位子であることを特 徴とする請求項９の分子共役体。
12. １２．膜プレンディング剤とプロッキング剤との間の開裂可能な結合は、ジスル フィド結合であることを特徴とする請求項１の分子共役体。
13. １３．別の分子に不可逆的または開裂可能に結合するための少なくとも１つの結 合基を持つ、細胞膜に貫入することができる膜プレンディング剤。
14. １４．２つの結合基を持ち、該結合基のそれぞれが末端に配置されていることを 特徴とする請求項１３の膜プレンディング剤。
15. １５．紡錘形遺伝子ペプチドであることを特徴とする請求項１３の膜プレンディ ング剤。
16. １６．紡錘形遺伝子ペプチドのアミノ酸配列がＲＥＲＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦ ＬＧＡＡＧＫであることを特徴とする請求項１５の膜プレンディング剤。
17. １７．イオンチャンネル形成タンパク質または糖タンパク質の膜透過ペプチドセ グメントであることを特徴とする請求項１３の膜プレンディング剤。
18. １８．ペプチドの組成式が、 ＨＮ２−（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）３−Ｃ ＯＮＨ２であることを特徴とする請求項１７の膜プレンディング剤。
19. １９．細胞膜に貫入することができる膜プレンディング剤を有しており、該膜プ レンディング剤がそれの細胞膜貫入能力を阻害するプロッキング剤と開裂可能に 結合していることを特徴とする分子共役体。
20. ２０．膜プレンディング剤は、紡錘形遺伝子ペプチドであることを特徴とする請 求項１９の分子共役体。
21. ２１．紡錘形遺伝子ペプチドのアミノ酸配列がＲＥＲＲＡＶＧＩＧＡＬＦＧＦＬ ＧＡＡＧＫであることを特徴とする請求項２０の分子共役体。
22. ２２．膜プレンディング剤は、イオンチャンネル形成タンパク質または糖タンパ ク質の膜透過ペプチドセグメントまたはその一部分であることを特徴とする請求 項１９の分子共役体。
23. ２３．ペプチドの組成式が、 ＨＮ２−（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ）３−Ｃ ＯＮＨ２であることを特徴とする請求項２２の分子共役体。
24. ２４．ブロック剤は、ターゲッティング剤でもあることを特徴とする請求項１９ の分子共役体。
25. ２５．ターゲッティング剤は、細胞表面抗原に特異な抗体であることを特徴とす る請求項２４の分子共役体。
26. ２６．ターゲッティング剤は、細胞表面レセプタの配位子であることを特徴とす る請求項２４の分子共役体。
27. ２７．細胞膜に貫入することができる２つの連結する膜プレンディング剤を有し ていることを特徴とする分子共役体。
28. ２８．膜プレンディング剤は、紡錘形遺伝子ペプチド、イオンチャンネル形成ペ プチドまたは脂肪酸から選択されることを特徴とする請求項２７の分子共役体。
29. ２９．膜プレンディング剤は、それの細胞膜貫入能力を阻害するブロック剤と開 裂可能に結合していることを特徴とする請求項２７の分子共役体。