ES2322975T3 - Componente direccionador biespecifico que comprende un anticuerpo contra el antigeno carcinoembrionario (cea) y la region de union a ligando de la subunidad alfa del receptor de il-13. - Google Patents
Componente direccionador biespecifico que comprende un anticuerpo contra el antigeno carcinoembrionario (cea) y la region de union a ligando de la subunidad alfa del receptor de il-13. Download PDFInfo
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Abstract
Un componente direccionador que comprende un producto de conjugación de un anticuerpo enlazado a una región de unión a ligando de la subunidad {alpha} del receptor de la interleucina 13 (IL-13R{alpha}), anticuerpo que es específico para el antígeno carcinoembrionario.
Description
Componente direccionador biespecífico que
comprende un anticuerpo contra el antígeno carcinoembrionario
(CEA) y la región de unión a ligando de la subunidad alfa del receptor de IL-13.
(CEA) y la región de unión a ligando de la subunidad alfa del receptor de IL-13.
El presente invento se refiere a un componente
direccionador ("targeting") que comprende un producto de
conjugación de un anticuerpo enlazado a una región de unión a
ligando de la subunidad \alpha del receptor de la interleucina 13
(IL-13R\alpha), un kit que comprende dicho
componente direccionador, y el uso de dicho componente
direccionador.
Hay ahora una cantidad bastante grande y
creciente de experiencia en el uso de anticuerpos monoclonales
(mAbs; del inglés, monoclonal antibodies) para
terapia tumoral. Diversos estudios dirigidos a diferentes antígenos
han mostrado resultados prometedores. En estos estudios se han usado
mAbs radiomarcados y, en menor grado, productos de conjugación de
mAb-toxina.
Los mAbs usados en el diagnóstico y la terapia
tumorales difieren en su capacidad para unirse a antígenos afines y
resultar internalizados. Por ejemplo, el CD22 presenta una
internalización eficaz así como la reexpresión de este antígeno
después de la internalización. Sin embargo, adolece de niveles de
expresión relativamente bajos en ciertas malignidades de células B;
por ejemplo, se expresa sólo en el 30-50% de los
casos de leucemia linfocítica de células B (B-CLL;
del inglés, B-cell lymphocytic
leukemia).
Otros antígenos de la superficie celular tales
como HLA-DR y el antígeno CD20, por contraste con el
antígeno CD22, son antígenos de células B bastante expresados que
se expresan en una gran diversidad de malignidades de células B que
van desde la leucemia linfocítica aguda (ALL; del inglés,
acute lymphocytic leukemia) hasta las más
diferenciadas leucemia linfocítica de células B
(B-CLL) y linfoma no hodgkiniano (NHL; del inglés,
non-Hodgkin's lymphoma), e incluso hasta la
leucemia de células pilosas (HCL; del inglés, hairy
cell leukemia). Estos antígenos se expresan
generalmente en las células con una elevada densidad antigénica en
la inmensa mayoría de los casos de estas malignidades. Una
desventaja importante de estos antígenos es que se internalizan
lentamente. Esta característica va significativamente en contra del
direccionamiento a HLA-DR y CD20 para la terapia
basada en toxinas.
Un problema más con HLA-DR y
CD20 es el hecho de que las malignidades de células B, en
comparación con las células de tumores que no son linfomas,
presentan una disociación más rápida de los mAbs
anti-HLA-DR y
anti-CD20 unidos, de la superficie. Esto sugiere
que una terapia que se dirija un antígeno limitado a células B,
particularmente a los antígenos caracterizados por una
internalización lenta, podría ser mejorada al enfrentarse a estos
problemas.
Se ha examinado una diversidad de construcciones
de mAb-toxina en experimentos preliminares in
vitro y pruebas humanas. Estos estudios han demostrado los
potentes y específicos efectos de estos reactivos. La mayoría de
las moléculas de toxina que han sido utilizadas proceden de fuentes
vegetales o bacterianas y, por lo tanto, producen respuestas de
anticuerpos anti-toxina neutralizantes en los
pacientes. Esto limita en gran medida la duración de la
terapia.
La solicitud de patente internacional WO
93/019163 se refiere a genes quiméricos que contienen un primer
segmento que codifica un dominio Fv (fragmento variable) de cadena
única de un anticuerpo específico, y un segundo segmento que
codifica al menos los dominios transmembranal y citoplásmico de una
molécula desencadenadora de células inmunes, tal como las
subunidades de un receptor de células T, un complejo de receptor de
células T-CD3, un receptor Fc o un receptor de
IL-2.
La solicitud de patente internacional WO
98/16254 se refiere a un producto de conjugación de una toxina y
una citocina, y a una proteína de fusión que comprende un anticuerpo
biespecífico que tiene una primera especificidad por un marcador
celular específico de una célula maligna y una segunda especificidad
por una región de IL-15a, cada uno de los cuales
comprende además opcionalmente un radionucleido, que son reactivos
terapéuticos útiles para el tratamiento de leucemias y
linfomas.
J. A. MacLean et al. [J. A. MacLean et
al.,
"Anti-CD2:anti-IL-2-receptor-bispecific
mAb-mediated immunomodulation. Low systemic
toxicity, differential effect on lymphoid tissue, and inhibition of
cell-mediated hypersensitivity", Journal of
Immunology (1 de Octubre de 1995) 155 (7): 3674-82]
describen el uso de un anticuerpo monoclonal biespecífico dirigido
contra CD3 específico de células T y la subunidad p55 del receptor
IL-2R.
Por lo tanto, un objeto del presente invento es
proporcionar métodos más eficaces para el diagnóstico y/o la
terapia del cáncer y de enfermedades infecciosas o inmunológicamente
mediadas.
Otro objeto del invento es mejorar el valor de
los antígenos superficiales de internalización lenta como dianas
antigénicas.
\newpage
Un objeto más del invento es reducir la
tendencia de los anticuerpos unidos a la superficie de células
tumorales a disociarse de la superficie de las células.
Estos y otros objetos del invento se alcanzan al
proporcionar un componente direccionador que comprende un producto
de conjugación de un anticuerpo enlazado a una región de unión a
ligando de la subunidad \alpha del receptor de la interleucina
13, anticuerpo que es específico para el antígeno
carcinoembrionario. El componente direccionador puede comprender un
producto de conjugación covalente en que el anticuerpo está
covalentemente enlazado a la región de unión al ligando, una
proteína de fusión del anticuerpo y la región de unión al ligando,
o un anticuerpo biespecífico que tiene una primera especificidad por
el antígeno carcinoembrionario y una segunda especificidad por un
complejo receptor de internalización rápida que es
IL-13R\alpha. También se proporciona una
composición que comprende un componente direccionador de acuerdo con
el invento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se proporciona un kit que comprende un producto
de conjugación de IL-13 enlazado a un fármaco, un
radionucleido o una toxina, y un componente direccionador que
comprende un anticuerpo específico para un marcador celular
específico de una célula diana, que es el antígeno
carcinoembrionario, enlazado a la región de unión a ligando
de
IL-13R\alpha.
IL-13R\alpha.
El invento proporciona un método para el
tratamiento del cáncer, que comprende administrar primero a un
sujeto que necesita dicho tratamiento un componente direccionador
que comprende un anticuerpo específico para un antígeno específico
de una célula diana, que es el antígeno carcinoembrionario, enlazado
a la región de unión a ligando de
IL-13R\alpha y luego, después de un intervalo predeterminado de tiempo, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto de conjugación de IL-13 enlazado a un fármaco, un radionucleido o una toxina.
IL-13R\alpha y luego, después de un intervalo predeterminado de tiempo, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto de conjugación de IL-13 enlazado a un fármaco, un radionucleido o una toxina.
Otros objetos, características y ventajas del
presente invento resultarán evidentes a partir de la descripción
detallada siguiente. Sin embargo, ha de entenderse que la
descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque
indicativos de realizaciones preferidas del invento, se proporcionan
sólo a modo de ilustración, definiendo las reivindicaciones
adjuntas el alcance de la protección.
Se ha descubierto sorprendentemente que el valor
de los antígenos superficiales como dianas antigénicas puede
resultar significativamente mejorado al enlazarlos funcionalmente a
un sistema receptor de alta afinidad que se internaliza. El
presente invento es particularmente ventajoso en el caso de
antígenos útiles de la superficie celular que se internalizan
lentamente.
El presente invento se basa en una propiedad
fundamental de los receptores de citocinas y factores de
crecimiento; es decir, su capacidad para internalizarse rápida y
eficazmente. Los ejemplos de una rápida internalización del
receptor y el ligando incluyen el transporte intracelular de
nutrientes, como con los receptores de transferrina y lipoproteína
de baja densidad (LDL; del inglés, low-density
lipoprotein). Los receptores de factores de crecimiento tales
como la insulina y el factor de crecimiento epidérmico (EGF; del
inglés, epidermal growth factor), así como
receptores citocínicos tales como IL-1R,
IL-2R e IL-4R, también se
internalizan rápidamente. En todos los casos estudiados, salvo en
el de la transferrina, el ligando experimenta una proteolisis como
consecuencia del tránsito por el compartimento lisosómico de bajo pH
que contiene proteasa/hidrolasa ácida. Moléculas asociadas con los
ligandos, tal como el colesterol unido a LDL, o fármacos, toxinas y
radionucleidos enlazados a otros ligandos, pueden salir a
compartimentos extralisosómicos, donde pueden ejercer sus
efectos.
El destino de un receptor después de la
internalización varía dependiendo del sistema receptor. Por ejemplo,
puede ser reciclado a la superficie celular, como con los
receptores de transferrina y LDL, o puede resultar degradado. Se ha
comunicado la degradación lisosómica de receptores, tal como del
receptor de EGF, y dicha degradación contribuye a la
infrarregulación de receptores y a la desensibilización hasta la
subsiguiente estimulación del ligando.
En ciertos sistemas de ligando/receptor, hay
reexpresión de receptores a través de la síntesis de novo de
mRNAs y proteínas. Por ejemplo, el CD22 se internaliza rápidamente
después de la unión del mAb LL2 afín y se reexpresa en tan sólo 2
horas después de un ciclo completo de unión, con saturación
antigénica, del antígeno afín por el mAb específico seguida de
internalización a 37ºC. Otra evidencia de la reexpresión se
encuentra en la capacidad de una gran variedad de líneas celulares
dependientes de citocinas/factores de crecimiento para mantenerse
durante meses o incluso años, lo que sugiere una resíntesis y una
reexpresión continuas de la requerida unión del ligando así como de
las proteínas de señalización asociadas. Tomadas en conjunto, estas
observaciones muestran que los receptores de citocinas son capaces
de múltiples ciclos rápidos de internalización y reexpresión y, por
lo tanto, tienen una elevada capacidad para la distribución
intracelular de ligandos.
De acuerdo con el presente invento, es posible
provocar una rápida internalización de un antígeno de
internalización lenta poniéndolo en yuxtaposición con un complejo
que se internaliza más rápidamente. Por ejemplo, el sistema
receptor de IL-2 consiste en unas cadenas alfa
(IL-2R\alpha; antiguamente antígeno Tac), beta
(IL-2R\beta) y gamma (\gamma_{C}).
IL-2R\alpha se internaliza lentamente pero, una
vez que llega a asociarse físicamente con
IL-2R\beta y \gamma_{C} por la presencia del
ligando IL-2, el complejo proteico trímero completo
llega a internalizarse a la rápida velocidad intrínseca del dímero
IL-2R\beta/\gamma_{C}. Esto sigue un patrón
recurrente en la bioquímica de citocinas que consiste en que un
receptor funcional consiste en dos o más subunidades, una de las
cuales es típicamente una cadena alfa específica particular. El
sistema IL-6/IL-6R es
particularmente notable ya que el dominio extracelular de la
subunidad alfa tiene la capacidad intrínseca para asociarse con la
molécula de señalización gp130 de modo que, cuando se añade
IL-6 más una forma soluble de
IL-6R\alpha a células que solamente expresan
gp130, se produce una respuesta de señalización. Los sistemas
receptores de IL-2 e IL-6 son
ejemplares de dos principales subunidades de señalización de
citocinas: \gamma_{C} (utilizada por los complejos receptores
para las interleucinas 2, 4, 7, 9 y 15) y gp130 (utilizada por los
complejos receptores para las interleucinas 6 y 11, CNTF, LIF, OSM y
cardiotrofina 1), respectivamente.
Los sistemas receptores pueden ser aprovechados
de acuerdo con el presente invento para proporcionar una
distribución intracelular potenciada de ligandos armados. Se pueden
dirigir receptores de citocinas a la superficie de células que
carecen normalmente de dichos receptores, mediante el uso de
productos de conjugación de mAb-receptor. Por
ejemplo, las cadenas alfa de los receptores de IL-6
y el factor neurotrófico ciliar (CNTF; del inglés, ciliary
neurotrophic factor) han sido dirigidas a la
superficie de células previamente negativas por medio de mAbs
dirigidos contra los antígenos CD34, CD45 y CD64 de la superficie
celular. La adición de dichos productos de conjugación de
mAb-R\alpha a células dependientes de factores
conferían una sensibilidad específica de novo a
IL-6 o CNTF.
Un componente direccionador de acuerdo con el
invento comprende un receptor enlazado a un fragmento de mAb con un
tamaño de hasta F(ab')_{2}. Los fragmentos de anticuerpo
adecuados incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2},
Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo fragmentos híbridos. Son
también útiles los subfragmentos que conservan la región
hipervariable ligante de antígeno de una inmunoglobulina. Estos
incluirán proteínas genéticamente diseñadas y/o recombinantes, de
cadena única o de múltiples cadenas, que llevan incorporado un sitio
de unión al antígeno y que, por lo demás, actúan in vivo
como vehículos direccionadores de una manera sustancialmente igual
que los fragmentos inmunoglobulínicos naturales. En la Patente de
EE.UU. número 4.946.778 se describen moléculas ligantes de cadena
única. Se pueden preparar convenientemente fragmentos Fab' de
anticuerpo por escisión reductora de fragmentos
F(ab')_{2}, los cuales se pueden obtener por digestión de
la inmunoglobulina intacta con pepsina. Se pueden preparar
fragmentos Fab de anticuerpo por digestión de la inmunoglobulina
intacta con papaína bajo condiciones reductoras, o por escisión de
los fragmentos F(ab)_{2} que resultan de una
digestión cuidadosa de la Ig completa con papaína. El fragmento
también se puede producir por ingeniería genética. Cuando aquí se
utiliza el término "anticuerpo", se incluyen en él todos los
tipos anteriores de fragmentos.
Los fragmentos de mAb, tal como el fragmento de
anticuerpo de cadena única (scF; del inglés, single
chain fragment), tienen las ventajas añadidas de un
rápido aclaramiento de sangre y de órganos y una penetración
mejorada en nódulos tumorales, y, en una realización preferida, se
enlaza el scF, de un mAb hacia un antígeno diana deseado, con la
región de unión a ligando de un receptor. Para producir el fragmento
variable de cadena única (scF_{V}), se pueden utilizar técnicas
de ingeniería molecular para mAbs. Esta molécula puede ser
producida clonando los segmentos V_{H} y V_{L} del mAb de
interés y cortándolos y empalmándolos conjuntamente con una corta
región conectora interpuesta entre ellos. Estas moléculas, después
de un diseño y una renaturalización apropiados, conservan la
actividad ligante de antígeno del mAb particular y se pueden
expresar con niveles elevados en sistemas de expresión de insecto o
mamífero basados en E. coli. Estas construcciones pueden
proporcionar luego una plataforma para la construcción de moléculas
bifuncionales de cadena única que pueden unir un segundo componente
(un receptor o un segundo anticuerpo de cadena única) al primero
para redirigir moléculas o células receptoras.
Se pueden utilizar mezclas de anticuerpos, así
como anticuerpos híbridos. Los híbridos pueden tener dos
especificidades; por ejemplo, un brazo que se une a un antígeno de
la célula diana y otro brazo que se une a otro antígeno de la
diana, o un brazo podría poseer una región de unión a ligando de una
subunidad receptora. Se pueden preparar fragmentos de anticuerpos
híbridos con especificidades dobles, análogamente a los híbridos de
marcadores antitumorales descritos en la Patente de EE.UU. nº
4.361.544. En, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 4.479.895, la
Patente de EE.UU. nº 4.474.893, la Patente de EE.UU. nº 4.714.681, y
Milstein et al., Immunol. Today 5: 299 (1984), se describen
otras técnicas para preparar anticuerpos híbridos. Lo precedente es
meramente ilustrativo, y se pueden concebir otras combinaciones de
especificidades que caigan también dentro del alcance del invento
como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
El anticuerpo es enlazado al dominio
extracelular de un receptor. Puesto que el dominio extracelular
entero es grande, se pueden utilizar versiones truncadas del
dominio que contengan el sitio que se une al ligando. Se puede
formar el producto de conjugación de anticuerpo/receptor enlazando
covalentemente el anticuerpo al receptor, directamente o por medio
de un componente conector corto o largo, por medio de uno o más
grupos funcionales del anticuerpo y/o la enzima, tales como, por
ejemplo, los grupos amina, carboxilo, fenol, tiol e hidroxilo, para
formar un producto de conjugación covalente. Se pueden utilizar
diversos conectores convencionales, tales como, por ejemplo,
diisocianatos, diisotiocianatos, ésteres de
bis(hidroxisuccinimida), carbodiimidas, bismaleimidas,
ditioles, ésteres de maleimida-hidroxisuccinimida,
glutaraldehído y similares. La construcción de anticuerpo puede
unir un brazo a la región de unión al ligando o a un sitio que esté
alejado del sitio de unión al ligando, dependiendo de si el ligando
se empleará en una aplicación dada.
Un método sencillo es mezclar el anticuerpo con
la región de unión al ligando en presencia de glutaraldehído para
formar el producto de conjugación de anticuerpo/receptor. Los
enlaces de base de Schiff iniciales pueden ser estabilizados
mediante, por ejemplo, reducción con borohidruro hasta aminas
secundarias. Este método se utiliza convencionalmente para
preparar, por ejemplo, productos de conjugación de
peroxidasa-anticuerpo para usos inmunohistoquímicos
o para inmunoensayos. En lugar de glutaraldehído, se puede utilizar
un diisotiocianato, un éster de bishidroxisuccinimida, carbodiimida
u otro agente entrecruzante bifuncional.
Se puede conseguir un enlace más selectivo
usando un conector heterobifuncional tal como un éster de
maleimida-hidroxisuccinimida. La reacción del
último con una región de unión a ligando de los receptores
derivatizará grupos amina del receptor, y el derivado puede ser
luego hecho reaccionar con, por ejemplo, un fragmento Fab de
anticuerpo con grupos sulfhidrilo libres (o un fragmento mayor con
un grupo sulfhidrilo añadido mediante, por ejemplo, el reactivo de
Traut).
Resulta ventajoso enlazar la región de unión a
ligando de la subunidad receptora con un sitio del anticuerpo
alejado del sitio de unión al antígeno. Esto puede ser llevado a
cabo mediante, por ejemplo, un enlace con grupos sulfhidrilo
intercatenarios escindidos, como se indicó anteriormente. Otro
método implica hacer reaccionar un anticuerpo cuya porción de
hidrato de carbono ha sido oxidada, con una región de unión a
ligando que tiene al menos un grupo amino primario libre. Esto da
lugar a un enlace de base de Schiff (imina) inicial que es
preferiblemente estabilizado por reducción hasta una amina
secundaria mediante, por ejemplo, reducción con borohidruro, para
formar el producto de conjugación final.
Alternativamente, el producto de conjugación de
anticuerpo/receptor comprende un producto de conjugación de
anticuerpo biespecífico que está inmunológicamente enlazado con la
región de unión a ligando de un receptor. El anticuerpo o fragmento
de anticuerpo biespecífico tiene una primera especificidad por un
antígeno celular específico de una célula diana, que es el antígeno
carcinoembrionario, y una segunda especificidad por una región
extracelular de la subunidad de unión al ligando o de otra subunidad
del complejo receptor.
Muy preferiblemente, el producto de conjugación
de anticuerpo/receptor comprende una proteína de fusión, en que una
secuencia de fusión que comprende un anticuerpo enlazado a una
región de unión a ligando del receptor se expresa en un sistema de
expresión recombinante de mamífero, basado en un virión, o en otro
sistema de expresión de mamífero, insecto o levadura o basado en
E. coli. Los conectores adecuados para enlazar el anticuerpo
con la región de unión al ligando son, por ejemplo,
(GGSGS)_{3} y el conector de 23 aminoácidos descrito por
Kurucz et al., J. Immunol. 154: 4576-4582
(1995).
Cualquiera de los productos de conjugación de
anticuerpo/receptor puede ser directamente marcado con, o conjugado
o adaptado para conjugación con, un radioisótopo o un agente
potenciador de imágenes por resonancia magnética. En una
realización preferida, la construcción bifuncional de
anticuerpo/receptor está sin marcar. Se administra y luego, después
de un intervalo predeterminado suficiente para la localización en el
sitio diana y también para el aclaramiento del sistema circulatorio
del mamífero, se administra el ligando afín "armado". Esto es
particularmente importante cuando se utilizan terapéuticamente
complejos de boro. Alternativamente, el producto de conjugación es
etiquetado con un marcador, por ejemplo, un radiomarcador, un
marcador fluorescente o similar, que permite su detección y
cuantificación en fluidos corporales, por ejemplo, en sangre y
orina, para que se pueda medir y/o inferir el direccionamiento y/o
el aclaramiento.
Para marcar estos productos de conjugación de
anticuerpo/receptor, es generalmente adecuado cualquier método
convencional de radiomarcación que sea adecuado para marcar
proteínas para uso in vivo. Esto se puede llevar a cabo por
marcación directa con, por ejemplo, I-131,
I-124 o I-123. La marcación con
I-131, I-124 o
I-123 se efectúa fácilmente utilizando un
procedimiento oxidativo mediante el cual se trata una mezcla de
yoduro potásico o sódico radiactivo y el anticuerpo con cloramina T,
como, por ejemplo, comunicaron Greenwood et al., Biochem. J.
89: 114 (1963), y modificaron McConahey et al., Int. Arch.
Allergy Appl. Immunol. 29: 185 (1969). Esto da lugar a la
sustitución directa de átomos de hidrógeno de la molécula de
anticuerpo, probablemente de restos de tirosina sobre todo, también
posiblemente de restos de triptófano e incluso de restos de
fenilalanina, dependiendo de las proporciones de los reactivos y de
las condiciones de la reacción, por átomos de yodo.
Alternativamente, se pueden utilizar métodos basados en Iodogen,
como describen Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
80: 849-857, 1978, o la yodación con
lactoperoxidasa, como describen Feteanu, supra, página 303, y
las referencias allí citadas.
En lugar de con I-131,
I-124 o I-123, el producto de
conjugación puede ser marcado por metalación con, por ejemplo,
iones de Cu o Tc-99m o similares, mediante técnicas
convencionales, o fijando un agente quelante para un ion
radiometálico o paramagnético. Dichos agentes quelantes y sus modos
de fijación a anticuerpos son bien conocidos por el técnico
experto.
El producto de conjugación de
anticuerpo/receptor actúa como un componente direccionador de
acuerdo con el invento cuando se administra a un paciente. Esto va
seguido de un intervalo de direccionamiento y aclaramiento que
permite la unión del componente direccionador a las previstas
células diana y su aclaramiento de los tejidos normales, tras lo
cual se administra el ligando armado. El ligando armado comprende el
ligando afín para el receptor del componente direccionador,
conjugado con un radionucleido, un fármaco o una toxina. El
radionucleido puede ser un radionucleido diagnóstico o
terapéutico.
Los ejemplos de radionucleidos diagnósticos
incluyen yodo-123, yodo-124,
yodo-131, indio-111,
galio-67, galio-68,
rutenio-97, tecnecio-94,
tecnecio-99m, cobre-64,
cobre-67, cobalto-57,
cobalto-58, cromo-51,
hierro-59, itrio-86,
selenio-75, talio-201 e
iterbio-169. Los ejemplos de radionucleidos
terapéuticos incluyen emisores alfa, tales como, por ejemplo,
bismuto-212 y ástato-211; emisores
beta, tales como, por ejemplo, itrio-90,
renio-186, renio-188,
cobre-67 y yodo-131; y,
alternativamente, radionucleidos de captura electrónica o que emiten
electrones de conversión Auger, tales como
yodo-125, indio-111 y
galio-67. Preferiblemente, el radionucleido emitirá
en el intervalo de 10-5000 keV, más preferiblemente
en el intervalo de 50-1500 keV, y muy
preferiblemente en el intervalo de 50-500 keV. Los
radionucleidos se pueden incorporar al anticuerpo específico
mediante las técnicas de marcación anteriormente discutidas, así
como mediante otras técnicas convencionales bien conocidas en este
campo técnico.
Se conocen muchos fármacos y toxinas que ejercen
un efecto citotóxico sobre células tumorales o sobre microorganismos
que pueden afectar a seres humanos y, en general, a mamíferos. Se
van a hallar en compendios de fármacos y toxinas, tales como el
Índice Merck y similares. Una toxina preferida es una ribonucleasa
tal como la onconasa. La onconasa es una RNasa de origen no
mamífero, purificada a partir de ovocitos de Rana pipiens. Se
ha mostrado que tiene actividad antitumoral frente al cáncer
pancreático humano en pruebas clínicas, pero se ha hallado que
tiene una mínima actividad antitumoral frente a malignidades de
células B tales como la leucemia o el linfoma de células B.
La adición del ligando armado da lugar a la
formación de un complejo trímero que comprende las subunidades de
cadenas \beta/\gamma_{C} presentes en la superficie de la
célula diana y la subunidad de cadena \alpha del receptor, que se
fija a la superficie de la célula diana por medio del producto de
conjugación de anticuerpo/receptor. Esto conduce a una rápida
internalización de la toxina y/o el radionucleido en las células
diana. Después de la adición de IL-13 se ensambla
un complejo dímero o trímero análogo. Aunque no es necesaria la
internalización para que un radionucleido terapéutico sea eficaz,
estos complejos multímeros proporcionan una unión más fuerte y
estable del ligando a las células diana y facilitan además las
internalizaciones.
Se puede armar el mismo ligando con
radionucleido, fármaco y toxina, o se pueden armar diferentes
ligandos con radionucleido, fármaco y toxina. Cuando se utilizan
diferentes ligandos armados con radionucleido, fármaco y toxina,
aquellos se pueden administrar conjunta o secuencialmente.
El producto de conjugación de
anticuerpo/receptor y el producto de conjugación de ligando armado
se administran en una composición con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. A este respecto, un vehículo farmacéuticamente aceptable
es un material que se puede utilizar como vehículo para administrar
la proteína de fusión o el ligando armado porque el material es
inerte o, en cualquier caso, médicamente aceptable, así como
compatible con la proteína de fusión o el ligando armado.
Los sistemas receptores de alta afinidad y que
se internalizan preferidos a los que se puede enlazar el anticuerpo
incluyen los sistemas del receptor de IL-13.
El sistema de IL-13/receptor de
IL-13 es un buen candidato para abordar tumores
sólidos a causa de su amplia capacidad de expresión y señalización
en cánceres de origen epitelial (preponderantemente CEA+, así como
en importantes cánceres CEA-epiteliales tales como
el carcinoma de células renales). El sistema de
IL-13/receptor de IL-13 comparte
varias características en común con el sistema de
IL-4/receptor de IL-4.
Estructuralmente, los ligandos de IL-4 e
IL-13 muestran una homología de secuencias
proteínicas de aproximadamente 30%, que es la mayor entre las
interleucinas. Ambos receptores poseen los cuatro canónicos restos
conservados de cisteína en la mitad N-terminal de
sus dominios extracelulares, así como un motivo WSXWS en la región
yuxtamembranal de sus dominios extracelulares, y son miembros de la
superfamilia de la hematopoyetina. IL-13R\alpha
tiene un menor tamaño global que IL-4R\alpha,
pero tiene un dominio extracelular algo mayor y un dominio
intracelular correspondientemente más corto.
IL-13 e IL-4
tienen también una considerable similitud funcional. Ambos suprimen
la producción de citocinas proinflamatorias por macrófagos, son
coestimulantes para la proliferación de células B y provocan el
cambio de isotipos inmunoglobulínicos. Ambos provocan la
suprarregulación tanto de CD23 como de la clase II del MHC en
monocitos y células B. IL-13 e IL-4
se unen a células no hematopoyéticas, tales como líneas celulares de
carcinoma, con elevada afinidad y ejercen efectos biológicos sobre
ellas. En forma no modificada, la IL-4 inhibe el
crecimiento de estas líneas celulares de cáncer epitelial tanto
in vitro como in vivo. La IL-13 no
modificada también ejerce efectos inhibidores del crecimiento in
vitro sobre líneas celulares de carcinoma de mama y, de esta
manera, comparte esta propiedad.
En diversos tipos celulares,
IL-13 compite con IL-4 por la unión
y viceversa, lo que indica que IL-4 e
IL-13 comparten componentes receptores. Además, una
forma mutante de IL-4, Y124D, es capaz de inhibir
respuestas biológicas tanto de IL-4 como de
IL-13 en tipos celulares linfoides y no linfoides.
Los tipos celulares no linfoides son predominantemente negativos
para \gamma_{C}, mientras que todos estos tipos celulares
expresan cantidades variables de IL-13R\alpha e
IL-4R\alpha. Tanto IL-4R\alpha
como IL-13R\alpha, cuando se expresan solos, se
unen a sus ligandos afines con una afinidad elevada similar, con
K_{3}s de aproximadamente 10^{10} M^{-1}. Se ha mostrado que
la forma soluble de IL-4R\alpha conserva esta
capacidad para unirse al ligando. Se ha mostrado recientemente que
formas solubles de IL-13R\alpha conservan la
capacidad para unirse al ligando tanto in vitro como in
vivo. Cuando se coexpresan IL-4R\alpha e
IL-13R\alpha, son capaces de formar un complejo
que puede experimentar el impacto de ambos ligandos así como de
ligandos antagonistas tales como
IL-4-Y124D.
Una diversidad de líneas celulares
hematopoyéticas y epiteliales expresan
IL-13R\alpha humana, tanto a nivel de mRNA como
de proteína, con niveles bajos o moderados. Se ha mostrado que, en
células de carcinoma de colon, se producen procesos de señalización
específicos, es decir, la activación de la tirosina cinasa Jak2,
conjuntamente con efectos biológicos de IL-4.
La actividad citotóxica mostrada por las
moléculas de fusión IL-4-exotoxina
de Pseudomonas (IL-4-PE) e
IL-13-PE proporciona más evidencia
sobre la eficaz internalización de estos sistemas receptores ya que
una gran variedad de líneas celulares de carcinoma son bastante
sensibles a estas citotoxinas. Se han preparado diversas
construcciones de IL-4-PE diferentes
que son activas in vitro y en un modelo de xenoinjerto de
ratón, y se ha mostrado que construcciones de
IL-13-PE análogas poseen una
actividad igualmente potente in vitro. Asimismo, proteínas
de fusión de toxina de difteria-IL-4
(por ejemplo, DAB_{389}-IL-4)
presentan actividad citotóxica in vitro.
Los efectos de IL-13 son
comparables a los de IL-4, tanto en la forma no
modificada como en la enlazada a PE. Sin embargo, la
IL-13 no modificada se puede administrar en mayores
dosis que IL-4, e
IL-13-PE muestra menos toxicidad
hacia células hematopoyéticas que
IL-4-PE. Las
IL-13-toxinas reconocen y matan
líneas celulares de cáncer epitelial tan fácilmente como las
correspondientes IL-4-toxinas, lo
que indica que el complejo receptor de IL-13 se
internaliza tan eficazmente como el complejo receptor de
IL-4. A diferencia de IL-4,
IL-13 no ejerce efecto biológico alguno sobre
células T. Por estas razones, se prefiere el sistema receptor de
IL-3 al sistema receptor de IL-4
para los usos diagnóstico y terapéutico in vivo.
De acuerdo con el invento, se utiliza el sistema
receptor de IL-13 junto con un anticuerpo funcional,
preferiblemente un mAb de cadena única (scF_{V}), contra el
antígeno carcinoembrionario (CEA; del inglés,
carcinoembryonic antigen). El CEA representa
una diana antigénica atractiva por varias razones. Es un antígeno
tumoralmente asociado que es poco o nada expresado por tejidos
normales y muy expresado por la inmensa mayoría de los carcinomas
de colon, pulmón, mama, páncreas, estómago y ovario y de origen
tiroideo medular. La elevada incidencia y los altos índices de
mortalidad de estos cánceres, junto con unas opciones diagnósticas y
terapéuticas subóptimas, dan lugar a un problema grave y
persistente de salud pública global.
El CEA es una proteína glicosilada de la
superficie celular, de aproximadamente 180 kDa, y es un antígeno de
tumores sólidos que ha sido ampliamente estudiado en la clínica como
un marcador tumoral circulante y como una diana antigénica de mAbs
radiomarcados para formación de imágenes y terapia. Diversos
anticuerpos anti-CEA han estado bajo estudio en
pruebas clínicas diagnósticas y terapéuticas de las fases
I-III. El mAb MN-14 es un mAb
anti-CEA ejemplar. Se ha construido y expresado una
versión humanizada de este mAb, hMN-14, en que
regiones estructurales ("framework") y constantes humanas
sustituyen a las correspondientes secuencias de ratón, y es el mAb
utilizado en estas pruebas clínicas. Un fragmento Fab' marcado con
^{99m}Tc de otro mAb anti-CEA relacionado,
Immu-4, ha recibido la aprobación del FDA para la
detección y graduación del cáncer de colon.
Aunque prometedores como agentes para formación
de imágenes, los mAbs anti-CEA radiomarcados han
producido previamente pocas respuestas en el modo terapéutico.
Resultaba un índice de respuesta bajo incluso cuando se
coadministraban mAb anti-CEA y un mAb
anti-TAG-72, que reconoce un segundo
y distinto antígeno tumoralmente asociado y muy expresado, junto
con IFN-\alpha, que suprarregula ambos antígenos,
a un grupo de pacientes con cáncer metastásico de colon. Asimismo,
el cáncer avanzado de colon ha resultado bastante resistente a
todas las combinaciones quimioterapéuticas probadas hasta la
fecha.
El presente invento busca superar estas barreras
terapéuticas, que son comunes a la mayoría de los tumores sólidos,
potenciando la internalización del CEA. Se administra un componente
direccionador anti-CEA, tal como la proteína de
fusión shIL-13R\alpha-scF_{V}
anti-CEA, a un sujeto y, una vez que se ha
localizado el componente direccionador en los sitios tumorales, se
distribuye el ligando IL-13 armado con un componente
terapéutico o diagnóstico. Este sistema proporciona opciones
diagnósticas y terapéuticas para la gran cantidad de malignidades
CEA+, incluyendo los cánceres de pulmón, colon, mama, estómago,
ovario y páncreas, la mayoría de los cuales expresan tanto CEA como
componentes del receptor de IL-13. Los componentes
del receptor de IL-13 permiten la rápida
internalización del ligando armado para distribuir selectivamente
niveles elevados de agentes citotóxicos a un gran grupo de tumores.
El direccionamiento de un antígeno muy expresado, tal como CEA, con
una molécula de fusión
sIL-13R\alpha-scF_{V}
anti-CEA aumenta el número típicamente bajo de
receptores citocínicos en hasta dos órdenes de magnitud.
Mediante una selección cuidadosa de los
componentes, se pueden obtener sistemas de distribución con una
inmunogenicidad mínima. Se pueden adaptar el ligando armado, el
componente R-\alpha y el scF_{V} de mAb para que
se ajusten a las características de la enfermedad concreta.
El presente invento se diseña para proporcionar
mayores relaciones de tumor/no tumor, como las que se pueden
alcanzar con sistemas tradicionales de predireccionamiento en que se
usan avidina o estreptavidina y biotina, mientras se eliminan
ciertos problemas asociados con estos sistemas. Aunque el sistema de
avidina-biotina presenta una afinidad muy elevada,
la experiencia clínica ha mostrado que aproximadamente el
20-30% de los pacientes genera una respuesta de
anticuerpos contra la avidina y hasta el 70% produce anticuerpos
contra la estreptavidina. El presente invento evita la
inmunogenicidad de la avidina y la biotina. Se puede implementar un
procedimiento de tres etapas usando un mAb antiidiotípico, WI2, que
es reactivo con respecto al sitio de MN-14 que se
combina con el antígeno, y por ello cualquier versión humanizada de
MN-14. Los mAbs WI2 han sido galactosilados, lo que
permite un rápido aclaramiento sanguíneo del reactivo basado en
MN-14, no marcado, a través del receptor de la
asialoglicoproteína hepática. Estos procedimientos de
predireccionamiento procuran el máximo aclaramiento del agente
predireccionador no marcado de la primera etapa, de la sangre y los
órganos, antes de que se administre el reactivo armado de la etapa
segunda o tercera, con objeto de minimizar la exposición de tejidos
normales a agentes diagnósticos o terapéuticos armados y maximizar
las relaciones tumor/tejido normal del agente armado.
En resumen, el procedimiento del presente
invento ofrece alternativas potencialmente beneficiosas a los
procedimientos actuales por diversas razones. En primer lugar, se
utilizan agentes con inmunogenicidad disminuida. Los fragmentos de
mAb tienen una inmunogenicidad inherentemente más pequeña,
particularmente el hMN-14mAb que ha sido humanizado.
Los componentes del receptor y el ligando son nativos y no
inmunogénicos. En segundo lugar, en el invento se usa una
estrategia de predireccionamiento que permite una mayor distribución
específica del ligando armado a sitios tumorales o a poblaciones
celulares patógenas. En tercer lugar, en el invento se maximiza la
internalización del ligando para permitir una mayor concentración
intracelular del ligando armado y mejores efectos diagnósticos o
terapéuticos. En cuarto lugar, el invento permite un procedimiento
terapéutico con combinaciones o secuencias con diversos agentes que
incluyen fármacos, toxinas, radionucleidos y reactivos antisentido y
antigenes. Para llevar esto a cabo, se utilizan diferentes formas
armadas del mismo ligando. Finalmente, en el presente invento se
usan citocinas que parecen favorables en cuanto a sus perfiles de
toxicidad y pueden ser aplicadas a una gran variedad de
enfermedades
Los ejemplos siguientes son ilustrativos del
presente invento, pero no han de ser considerados restrictivos.
Se produjo MN-14scF_{V} por
multiplicación, mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR; del inglés, polymerase chain reaction),
de cDNA procedente del transfectoma MN-14
humanizado. El conector usado para MN-14scF_{V}
era un conector de 15 aminoácidos [(GGSGS)_{3}], y la
orientación era
V_{L}-conector-V_{H}. Después
de la confirmación de las secuencias de DNA, la construcción de
cadena única fue subclonada en un plásmido de expresión
apropiadamente restringido, utilizado para otros scF_{V}s. Esta
construcción fue luego subclonada en E. coli
BL21(\gammaDE3) para su expresión.
La proteína fue solubilizada y vuelta a
naturalizar a partir de cuerpos de inclusión y fue purificada por
cromatografías sucesivas de intercambio aniónico y filtración en
gel. Después de su evaluación funcional, el fragmento scF_{V} fue
ligado a un fragmento de DNA que codifica PE40. Se mostró que esta
inmunotoxina presenta citotoxicidad específica para líneas
celulares CEA+.
También se preparó otra construcción de cadena
única. Ésta se realizó con la orientación 5'-3'
opuesta de las cadenas pesada y ligera, se ensambló en pCANTABE5E
(Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, EE.UU.) y se expresó en
fago. La unión específica del fago recombinante que expresa esta
scF_{V} fue demostrada mediante un ensayo de inmunoabsorción con
enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked
immunosorption assay).
Se utiliza la secuencia
V_{L}-conector-V_{H} para la
construcción de la proteína de fusión
IL-13R\alpha-MN-14,
como se esquematiza más adelante. Se utiliza un conector de 23
aminoácidos entre shIL-13R\alpha y el scF_{V},
como utilizan Kurucz et al. (1995). Alternativamente, se
utiliza el conector (GGSGS)_{3} que se utilizó en la
construcción del MN-14scF_{V} anteriormente
descrito. La configuración de esta proteína de función es:
shIL-s13R\alpha-conector-
-V_{L}-(GGSGS)_{3}-
-V_{H}
El fragmento de DNA que codifica el dominio
extracelular soluble de IL-13R\alpha se obtiene
mediante multiplicación a partir de líneas celulares positivas,
actualmente Caki-1, HuT 102B2 y A549, por PCR. Se
sintetizan pares de cebadores de PCR para RT-PCR,
incluyendo un par de cebadores para clonación. Los pares de
cebadores abarcan casi el dominio extracelular completo del
receptor.
Los cebadores incluyen sitios únicos para
enzimas de restricción, para permitir la clonación direccional en
el vector de expresión, pSinrep5. Este vector es parte de un sistema
de expresión de mamífero de alto nivel, basado en el virus Sindbis
(Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.). El plásmido
recombinante incluirá la secuencia señal de tipo silvestre y, por
lo tanto, puede ser secretado al medio para cultivo celular. Se
prevé que la región que se une al ligando esté situada en la mitad
N-terminal de la molécula, a considerable distancia
de los dominios de scF_{V}, y, de esta manera, se seleccionó la
configuración anterior. Para permitir la plegadura no impedida de
los dominios individuales, se incluye un conector de 23 aminoácidos,
como se ha descrito para una proteína biespecífica de cadena única,
es decir, una fusión de dos scF_{V}s.
Con objeto de conservar secuencias
potencialmente importantes para las interacciones de
IL-13R con parejas proteínicas tales como
IL-4R, es preferible conservar el dominio WSXWS y
todos los restos de cisteína conservados, junto con casi todo el
dominio extracelular. Esto maximiza la posibilidad de interacción
con proteínas asociadas de la membrana, lo que facilita la unión e
internalización del complejo de IL-13/receptor de
IL-13.
Se exploran clones bacterianos que contengan
plásmidos pSinRep5 recombinantes y, para la expresión, se utilizan
aquellos con secuencias correctas. Se producen viriones
recombinantes para obtener una mayor expresión y una reserva
estable y reutilizable para transducciones múltiples. Esto se lleva
a cabo por cotransfección de RNA transcrito in vitro, a
partir del plásmido recombinante más un molde de DNA de virus
auxiliar deficiente en cuanto a la replicación (siguiendo las
instrucciones del fabricante). Alternativamente, se utiliza un
sistema de expresión basado en E. coli, similar al utilizado
para la producción de MN-14scF_{V}.
Cuando se usan viriones Sindbis recombinantes,
la transcripción del RNA se lleva a cabo a partir del plásmido
recombinante (preparado a partir de los plásmidos pSinRepS
iniciales) y un plásmido de virus auxiliar que se incluye en un kit
estándar (Invitrogen, Inc., San Diego, California, EE.UU.). Se
evalúan las producciones de RNA mediante electroforesis en gel de
agarosa y se utilizan luego los RNAs para cotransfectar la línea
celular BHK. Esto se realiza utilizando liposomas catiónicos y/o
electroporación. Después de 3 días en cultivo, se recoge el
sobrenadante de la transfección y se utiliza para transducir células
BHK frescas para evaluar el título vírico y evaluar el nivel de
expresión de proteína recombinante. Para todas las transducciones,
se siembran inicialmente las células en medio que contiene suero de
ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf
serum). Después de aproximadamente 20 horas, se cambia el
medio por medio exento de suero. Después de 3 días, se recogen los
sobrenadantes de los testigos recombinantes y no recombinantes y se
concentran partes alícuotas por ultrafiltración centrífuga para la
determinación de la proteína total (Coomassie Plus^{TM}, Pierce,
Rockford, Illinois, EE.UU.).
Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; del inglés,
sodium
dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), se fraccionan partes alícuotas del sobrenadante concentrado. El gel es dividido para tinción con Coomassie y para electrotransferencia sobre PVDF para transferencia Western. La expresión de sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V} se detecta con anti-IgG humana generado en cabra/peroxidasa, para la detección de secuencias de hMN-14, y desarrollo por quimioluminiscencia. Después de la exposición a una película fotográfica, se examina la transferencia en cuanto a una banda específicamente teñida de aproximadamente 70 kDa.
dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), se fraccionan partes alícuotas del sobrenadante concentrado. El gel es dividido para tinción con Coomassie y para electrotransferencia sobre PVDF para transferencia Western. La expresión de sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V} se detecta con anti-IgG humana generado en cabra/peroxidasa, para la detección de secuencias de hMN-14, y desarrollo por quimioluminiscencia. Después de la exposición a una película fotográfica, se examina la transferencia en cuanto a una banda específicamente teñida de aproximadamente 70 kDa.
Una vez que se ha confirmado la expresión, se
pasan las transducciones a una escala superior. Para ensayos de
expresión a gran escala, el esquema de purificación incluye
intercambio aniónico, filtración en gel y/o otros modos de
cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés,
high performance liquid chromatography),
con determinación de la recuperación y la pureza finales. En las
construcciones genéticas iniciales, se añadirá una hexahistidina
C-terminal o una relacionada secuencia inerte de
etiqueta de afinidad para facilitar la purificación
\vskip1.000000\baselineskip
El
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
purificado es marcado con ^{125}I mediante el método Iodogen
(Pierce) hasta aproximadamente 185-370 kBq/\mug.
Se utiliza la línea celular LS174T para los estudios de unión ya
que expresa niveles elevados de CEA y presenta una unión a
IL-13 de baja a moderada.
Se suspende una cantidad de 1 x 10^{6} células
LS174T lavadas/tubo en 100 \mul de tampón de unión (RPMI 1640/FCS
al 10%). Se añade
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
solo y marcado, en una concentración 10 nM, o
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
marcado en una concentración 10 nM junto con un exceso molar de 200
veces de la proteína no marcada a tubos duplicados. Se evalúa la
capacidad global para unirse al antígeno utilizando concentraciones
trazadoras (50-200 pM) de la proteína de fusión
marcada y mayores cantidades de células LS174T. La fracción unible
debería tener un exceso de antígeno superior a 50%.
La capacidad de unión a IL-13 se
evalúa utilizando ^{125}I-IL-13
(marcada como antes con Iodogen). Se añade la proteína de fusión no
marcada o tampón a tubos duplicados que contienen 1 x 10^{6}
células LS174T. Después de 30-40 minutos a 4ºC, se
lavan las células y se añade
^{125}I-IL-13 en presencia o
ausencia de IL-13 fría. Un incremento positivo
significativo en la unión específica a IL-13 indica
un componente IL-13R\alpha funcional.
\vskip1.000000\baselineskip
Se radioyoda
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
hasta una actividad específica de aproximadamente
185-370 kBq/\mug. Se añade ligando 10 nM a tubos
duplicados con 2,5 x 10^{5} células LS174T/tubo y se realiza una
incubación a 4ºC durante una hora. Las células son lavadas dos
veces con tampón de unión y son sembradas en placas de 24 pocillos.
A algunos tubos se añade un exceso molar de 200 veces de ligando
frío para evaluar la unión específica. A otros tubos se añade
rhIL-13 no marcada 1 nM para evaluar los efectos
sobre la internalización y el procesamiento.
Se toman sobrenadantes en múltiples puntos
temporales y se llevan a TCA al 10% para que precipite intacto el
marcador, con objeto de distinguir el marcador que se disocia del
marcador que resulta internalizado, catabolizado y liberado. Se
lavan tres veces las placas con tampón de unión. Se solubilizan las
células con 0,4 ml de NaOH 2 N para la cuenta.
Se estudia la biodistribución de
IL-13 en ratones inmunodeficientes ("nude")
portadores de tumores CEA+, utilizando el sistema modelo LS174T o
HT-29. Se inyectan 5 x 10^{6} células de la línea
celular LS174T o HT-29, que son líneas celulares de
cáncer de colon, a hembras de ratón inmunodeficiente de cinco
semanas de edad, lo que da lugar al desarrollo de tumores
subcutáneos. Se compara la biodistribución de
^{125}I-IL-13 en ratones a los
que se ha inyectado simultáneamente MN-14scF_{V} o
MN-14Fab' marcado con ^{131}I, que tienen K_{d}s
y pesos moleculares similares.
Se han llevado a cabo experimentos de
biodistribución doble de marcadores utilizando IL-13
radioyodada con IL-4 y Fab' de
MN-14 como testigos, tanto en el sistema modelo
LS174T como en el HT-29 de xenoinjertos tumorales,
para evaluar la incorporación de estos agentes a tumores y órganos
normales. Los valores de incorporación observados eran coherentes
tanto con la masa molecular de los agentes como con el nivel de
expresión de las correspondientes proteínas ligantes en el tumor
(proteínas receptoras afines para las citocinas, y CEA para
MN-14Fab'). En resumen, la incorporación de
IL-13 a estos tumores de colon estaba típicamente en
el intervalo de 0,2-1,0 por ciento de la dosis
inyectada/gramo de tejido (% de DI/g), mientras que los
correspondientes valores de incorporación para
MN-14Fab' eran 4,0-7,5 en los
tumores HT-29 y de 7,0 a >20 en los tumores
LS174T. La IL-4 testigo se comportaba similarmente a
la IL-13. Estos resultados son coherentes con los
bajos niveles de receptor citocínico afín en estos dos tumores
(según se evaluó mediante la unión del radiotrazador a células
tumorales recolectadas), los niveles intermedios de CEA en
HT-29 y los niveles elevados de CEA en LS174T. Los
valores de incorporación tumoral eran máximos para ambas citocinas y
el Fab' a las 5 horas después de la inyección, lo que es coherente
con sus rápidos aclaramientos que son una consecuencia de sus bajas
masas moleculares. La incorporación renal de todos los agentes era
elevada y alcanzaba también el máximo a las 1-5
horas, lo que es coherente con el conocido mecanismo de aclaramiento
renal de dichos agentes. El hígado mostraba la mayor incorporación
de IL-14 e IL-14 entre los otros
órganos normales, lo que es coherente con la conocida
hepatotoxicidad preclínica y clínica que se ve con dosis mayores de
estos agentes.
Se llevó a cabo una serie paralela de
experimentos utilizando el modelo Ramos de xenoinjerto tumoral de
células B usando IL-15 radioyodada, con
IL-2 como testigo citocínico y Fab' de LL2 (que
reconoce el antígeno CD22 de células B) como su testigo. Los
resultados globales fueron similares en este sistema modelo salvo
por que los valores de incorporación hepática eran menores con
estas citocinas en comparación con IL-13 e
IL-14. Estos experimentos confirmaron el esperado
comportamiento farmacocinético y farmacodinámico de los agentes
citocínicos IL-4, IL-13,
IL-2 e IL-15. Los resultados indican
que la incorporación tumoral refleja el bajo nivel basal de
expresión de los receptores citocínicos afines en ambos carcinomas
CEA+ así como en linfomas, que pueden ser aumentados direccionando
primero proteínas de fusión de anticuerpo-R\alpha
a los tumores. Se prevé que, una vez direccionado este agente
bifuncional, la administración de una citocina armada afín dé lugar
a una incorporación mayor que la que tendría lugar con el
anticuerpo o la citocina sin el predireccionamiento del agente de
anticuerpo-R\alpha.
Se construye genéticamente una proteína de
fusión que consiste en IL-13 y onconasa siguiendo
procedimientos esbozados por Rybak [Tumor Targeting 1:
141-147 (1995)] para la producción de proteínas de
fusión de mAb-onconasa. En resumen, un fragmento de
secuencia confirmada que corresponde a la proteína
IL-13 madura es ligado a la secuencia de onconasa,
con la secuencia de IL-13 extendiéndose en 5',
aunque también se puede evaluar la otra orientación. Los genes de
la onconasa son clonados a partir de dos o más especies de rana. Los
fragmentos auténticos que representan la secuencia de fusión son
subclonados en el vector pET21d utilizando de nuevo una etiqueta
C-terminal de hexahistidina. La secuencia completa
que codifica la proteína de fusión entera de
IL-13/onconasa es confirmada en el vector pET, en la
cepa XL1Blue, como antes. Se multiplican los clones apropiados para
producir un plásmido para la transformación de la cepa de expresión
AD494 (DE3) de E. coli.
Los clones transformados son recogidos y
desarrollados en un cultivo a pequeña escala, inducidos con IPTG,
lisados en tampón para muestras con SDS y separados en un gel de
SDS-PAGE para tinción con Coomassie y transferencia
para detección tanto con anticuerpos
anti-IL-13 como con anticuerpos
anti-onconasa. El aislamiento y el lavado de los
cuerpos de inclusión, y su solubilización, renaturalización y
subsiguiente purificación se llevan a cabo utilizando las
operaciones anteriormente esbozadas. El producto final es examinado
en cuanto a su capacidad para unirse al receptor de
IL-13 mediante marcación con ^{121}I y su
comparación con concentraciones equimolares de
IL-13 similarmente marcada, en el ensayo de unión
celular anteriormente descrito. Los productos de conjugación con
capacidad para unirse a IL-13 son examinados en
cuanto a su citotoxicidad sobre líneas celulares conocidas por
expresar receptores para IL-13.
El producto de conjugación es examinado en
presencia y ausencia de la proteína de fusión
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
para determinar la toxicidad y la capacidad para unirse a, e
internalizar, mayores cantidades de la inmunotoxina. Se genera una
curva de dosis-respuesta para cada condición
experimental y testigo.
Se infunde intravenosamente una disolución
estéril y exenta de pirógenos que contiene la proteína de fusión
sIL-13R\alpha-MN-14scF_{V}
en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate-buffered saline), preparada de
acuerdo con los Ejemplos 1 y 2, a un paciente que tiene un carcinoma
de colon, pulmón, páncreas, estómago, ovario, mama, o tiroideo
medular. Se deja tiempo para que la proteína de fusión se una a las
células tumorales malignas y se aclare sustancialmente de la
circulación del paciente.
Luego se infunde intravenosamente al paciente,
siguiendo un programa predeterminado, una disolución estéril y
exenta de pirógenos que contiene IL-13
radioisotópicamente marcada o conjugada con fármaco, o el producto
de conjugación inmunotoxínico de IL-13/onconasa
preparado de acuerdo con el Ejemplo 6. Luego se usan los
subsiguientes métodos radiológicos o de radioinmunodetección para
evaluar las respuestas antitumorales.
Aunque el invento ha sido descrito con detalle
en relación con realizaciones preferidas particulares, ha de
entenderse que dicha descripción se presenta a modo de ilustración y
no de limitación y que el alcance del presente invento se define
mediante las reivindicaciones adjuntas.
Claims (13)
1. Un componente direccionador que comprende un
producto de conjugación de un anticuerpo enlazado a una región de
unión a ligando de la subunidad \alpha del receptor de la
interleucina 13 (IL-13R\alpha), anticuerpo que es
específico para el antígeno carcinoembrionario.
2. Un componente direccionador de acuerdo con la
Reivindicación 1, que comprende un producto de conjugación
covalente en que el anticuerpo está covalentemente enlazado a la
región de unión al ligando.
3. Un componente direccionador de acuerdo con la
Reivindicación 1, que comprende una proteína de fusión del
anticuerpo y la región de unión al ligando.
4. Un componente direccionador de acuerdo con la
Reivindicación 1, que comprende un anticuerpo biespecífico que
tiene una primera especificidad por el antígeno carcinoembrionario y
una segunda especificidad por la subunidad receptora
IL-13R\alpha.
5. Una composición que comprende un componente
direccionador de acuerdo con la Reivindicación 1 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
6. Un kit que comprende (i) un producto de
conjugación de interleucina 13 (IL-13) enlazada a un
fármaco, un radionucleido o una toxina, y (ii) un componente
direccionador que comprende un anticuerpo específico para el
antígeno carcinoembrionario, enlazado a la región de unión a ligando
de la subunidad \alpha del receptor de la interleucina 13
(IL-13R\alpha).
7. Uso de un componente direccionador que
comprende un anticuerpo específico para el antígeno
carcinoembrionario, enlazado a la región de unión a ligando de la
subunidad \alpha del receptor de la interleucina 13
(IL-13R\alpha), y un producto de conjugación de
interleucina 13 (IL-13) enlazada a un fármaco, un
radionucleido o una toxina, en la preparación de un medicamento
para el tratamiento del cáncer.
8. Un componente direccionador de acuerdo con la
Reivindicación 1, en que dicho anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en
F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab y Fv.
9. Un componente direccionador de acuerdo con la
Reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo híbrido que
presenta dos especificidades.
10. Un componente direccionador de acuerdo con
la Reivindicación 1, en que el anticuerpo es un anticuerpo de
cadena única scFv.
11. Un kit de acuerdo con la Reivindicación 6,
en que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado
del grupo que consiste en F(ab')_{2},
F(ab)_{2}, Fab', Fab y Fv.
12. Un kit de acuerdo con la Reivindicación 6,
en que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo híbrido que
presenta dos especificidades.
13. Un componente direccionador de acuerdo con
la Reivindicación 1, en que dicho anticuerpo es un anticuerpo de
cadena única scFv.
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