CN102625696B - 改进的脂质制剂 - Google Patents

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秦晓君
威廉·坎特里
穆希亚·曼努哈兰
卡兰特赫塔西尔·G·拉吉夫
杰雅帕卡什·K·娜瑞安纳尔
穆图萨米·贾亚拉曼
陈建新
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Abstract

本发明表征式(I)的阳离子脂质、包含式I的阳离子脂质的改进的脂质制剂和相应的使用方法，其中式I为

Description

改进的脂质制剂
优先权要求
本申请要求于2009年6月10提交的美国第61/185,800号申请和2009年9月22日提交的美国第61/244,834号申请的优先权，其中每个专利申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及利用脂质颗粒递送治疗剂的领域。具体地，本发明提供了有利于核酸的体内递送的阳离子脂质和含有此类脂质的脂质颗粒，以及适合用于体内治疗用途的核酸-脂质颗粒组合物。此外，本发明提供了制备此类组合物的方法以及利用此类组合物将核酸引入细胞的方法，例如用于多种疾病症状的治疗。
背景技术
治疗性核酸包括例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒和免疫刺激性核酸。此类核酸通过多种机制起作用。对于siRNA或miRNA，此类核酸可通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平。在将siRNA或miRNA引入细胞质后，此类双链RNA构建体可结合称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链在RISC复合物中被取代，从而在RISC内提供了可识别和结合具有与所结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA的模板。在结合互补mRNA后，RISC复合物切割mRNA并且释放切割的链。RNAi可通过编码蛋白质合成的相应mRNA的靶向特异性破坏来提供特定蛋白质的下调。
RNAi的治疗性应用极其广泛，因为siRNA和miRNA构建体可用针对靶蛋白质的任何核酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体在体外和体内模型中都已显示出特异性下调靶蛋白质的能力。此外，目前正在临床研究中评估siRNA构建体。
然而，目前siRNA或miRNA构建体面临的两个问题是：首先，它们在血浆中对核酸酶消解的易感性，其次，它们有限的进入细胞内区室(当以游离siRNA或miRNA形式全身性施用时它们可在所述区室中结合RISC)的能力。这些双链构建体可通过将化学修饰的核苷酸连接子例如硫代磷酸酯基团掺入分子内来进行稳定。然而，这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶消解的保护作用并且可降低构建体的活性。siRNA或miRNA的细胞内递送可通过使用载体系统(例如聚合物、阳离子脂质)或通过化学修饰构建体(例如通过胆固醇分子的共价结合)来进行促进。然而，需要改进的递送系统来增加siRNA和miRNA分子的效能并且减少或消除对化学修饰的需要。
反义寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻译成蛋白质。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白质mRNA的序列互补的序列并且可按照沃森-克里克碱基配对结合mRNA。该结合阻止靶mRNA的翻译和/或触发mRNA转录体的RNA酶H降解。结果，反义寡核苷酸具有作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)的巨大潜力。迄今为止，此类化合物已表明在几种体外和体内模型(包括炎性疾病、癌症和HIV的模型)中具有希望(于Agrawal，Trendsin Biotech.14：376-387(1996)中介绍)。反义链也可通过与染色体DNA的特异性杂交影响细胞活性。目前正在进行几种反义药物的人晚期临床评估。此类药物的靶点包括bcl2和载脂蛋白B基因以及mRNA产物。
免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。对于脱氧核糖核酸，已显示某些序列或基序引发哺乳动物的免疫刺激。此类序列或基序包括CpG基序、富含嘧啶的序列和回文序列。脱氧核糖核酸中的CpG基序相信可被内体受体、即toll-样受体9(TLR-9)特异性识别，所述受体随后触发先天性和获得性免疫刺激途径。还报导了某些免疫刺激核糖核酸序列。此类RNA序列据认为通过结合toll-样受体6和7(TLR-6和TLR-7)触发免疫活化。此外，还报导了双链RNA具有免疫刺激性并且据认为通过结合TLR-3而活化。关于治疗性核酸的用途的一个公知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间键合的稳定性和该连接子对核酸酶的易感性。血清中外切核酸酶和内切核酸酶的存在导致具有磷酸二酯连接子的核酸的快速降解，从而，治疗性核酸在血清存在的情况下或在细胞内具有极短的半衰期。(Zelphati，O.等人，Antisense.Res.Dev.3：323-338(1993)；和Thierry，A.R.等人，第147-161页，Gene Regulation：Biologyof Antisense RNA and DNA(编辑Erickson，RP和Izant，JG；Raven Press，NY(1992))。由于这些和其他已知的问题，目前正在开发的治疗性核酸不使用在天然核酸中发现的基本磷酸二酯化学物质。
该问题已通过减少血清或细胞内降解的化学修饰得到部分克服。已测试核苷酸间磷酸二酯桥上(例如，使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键合)、核苷酸碱基上(例如，5-丙炔基-嘧啶)或糖上(例如，2′-修饰的糖)的修饰(Uhlmann E.等人Antisense：Chemical Modifications.Encyclopedia of Cancer，第X卷，pp 64-81 Academic Press Inc.(1997))。其他研究人员已试图利用2′-5′糖键合提高稳定性(参见，例如美国专利No.5,532,130)。已尝试其他改变。然而，这些解决方法中没有一个已证明完全令人满意，并且体内游离治疗性核酸仍然只具有有限的功效。
此外，如上文中关于siRNA和miRNA所指出的，问题仍然在于有治疗性核酸穿过细胞膜的有限能力(参见，Vlassov等人，Biochim.Biophys.Acta1197：95-1082(1994))和在于与全身性毒性例如补体介导的过敏反应、改变的凝血性质和血细胞减少(Galbraith等人，Antisense Nucl.Acid Drug Des.4：201-206(1994))相关的问题。
为了尝试提高功效，研究者也已利用基于脂质的载体系统递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。在Zelphati，O和Szoka，F.C.，J.Contr.Rel.41：99-119(1996)中，作者提及阴离子(常规的)脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质/反义聚集体的用途。类似地已以阳离子脂质体形式全身性地施用siRNA，并且已报导此类核酸-脂质颗粒在哺乳动物(包括非人灵长类动物)体内提供了改进的靶蛋白质的下调(Zimmermann等人，Nature 441：111-114(2006))。尽管取得最新的进展，但本领域内仍然存在对适合于常规治疗用途的改进的脂质-治疗性核酸组合物的需要。优选地，此类组合物可以以较高效率封装核酸，具有高药物∶脂质比率，保护封装的核酸在血清中免受降解和清除，适合于全身性递送，并且提供封装的核酸的细胞内递送。此外，此类脂质-核酸颗粒应当是耐受良好的并且提供足够的治疗指数，以便以有效剂量的核酸进行的患者治疗与对患者的显著毒性和/或风险无关。本发明提供了此类组合物、制备所述组合物的方法以及使用所述组合物将核酸引入细胞的方法，包括用于疾病的治疗。
发明内容
本发明提供了新型阳离子脂质以及包含所述脂质的脂质颗粒。此类脂质颗粒还可包含活性剂并且按照本发明的相关方法用于递送活性剂至细胞。
本发明的脂质可包含一种或多种异构形式。此类化合物的所有此类异构形式明确地包括在本发明中。本发明的化合物还可包含可限制键旋转(例如因双键的存在而引起的限制)的键(例如，碳-碳键)或取代基。因此，所有顺式/反式和E/Z异构体明确地包括本发明中。
在一个方面中，本发明提供了包含式I的阳离子脂质的改进的脂质制剂，其中式I为：
式I还可被称为DLin-M-C3-DMA、MC3或M-C3。式I的每一个，DLin-M-C3-DMA、MC3和M-C3具有上文直接提供的式。
脂质制剂通常还包含中性脂质、固醇和PEG或PEG修饰的脂质。
在一个方面，改进的脂质制剂还包含靶向脂质(例如，含有GalNAc和/或叶酸的脂质)。
在一个方面，本发明提供了通过挤出法或在线混合法(in-line mixingmethod)进行的改进的脂质制剂的制备。
在一个方面，本发明还提供了给动物施用包含基于RNA的构建体的改进的脂质制剂和评估靶基因的表达的方法。
在一个方面，本发明中表征的脂质制剂，例如与寡核苷酸例如双链RNA(dsRNA)结合的脂质制剂，可用于在体内或体外改变(例如，减少)肿瘤细胞中靶基因的表达。在某些实施方案中，本发明中表征的脂质制剂可用于改变肿瘤细胞系(包括但不限于HeLa、HCT116、A375、MCF7、B16F10、Hep3b、HUH7、HepG2、Skov3、U87和PC3细胞系)中靶基因的表达。
在另一个方面，本发明提供包含本发明的脂质的脂质颗粒。在某些实施方案中，脂质颗粒还包含中性脂质和能够减少颗粒聚集的脂质。在一个实施方案中，脂质颗粒基本上由(i)至少一种本发明的脂质；(ii)选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质；(iii)固醇，例如胆固醇；和(iv)聚乙二醇-脂质，例如PEG-DMG或PEG-cDMA，以约20-60％阳离子脂质∶5-25％中性脂质：25-55％固醇∶0.5-15％PEG-脂质的摩尔比组成。在一个实施方案中，本发明的脂质是光学纯的。
在其它相关实施方案中，本发明包括还包含治疗剂的本发明的脂质颗粒。在一个实施方案中，治疗剂是核酸。在一个实施方案中，该核酸是质粒、免疫刺激性寡核苷酸、单链寡核苷酸例如反义寡核苷酸、antagomir；双链寡核苷酸例如siRNA、适体或核酶。
在另一个实施方案中，本发明包括一种包含本发明的脂质颗粒和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。
在其他相关实施方案中，本发明还包括调节靶基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括给细胞提供本发明的脂质颗粒或药物组合物。靶基因可以是野生型基因。在另一个实施方案中，靶基因包含一个或多个突变。在具体的实施方案中，该方法包括特异性调节含有一个或多个突变的靶基因的表达。在具体的实施方案中，脂质颗粒包含选自免疫刺激性寡核苷酸、单链寡核苷酸例如反义寡核苷酸，antagomir；双链寡核苷酸例如siRNA、适体、核酶的治疗剂。在一个实施方案中，核酸是编码siRNA、反义寡核苷酸、适体或核酶的质粒。
在本发明的一个方面，靶基因选自因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、SORT1基因、XBP1基因、肿瘤抑制基因的突变、p53肿瘤抑制基因及其组合。
在另一个实施方案中，核酸是编码多肽或其功能变体或片段的质粒，这样，多肽或其功能变体或片段的表达得以增加。
在另一个相关实施方案中，本发明包括治疗以受治疗者体内多肽的过表达为特征的疾病或失调的方法，包括给受治疗者提供本发明的脂质颗粒或药物组合物，其中治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中siRNA、微RNA或反义RNA包含特异性结合编码多肽的多核苷酸或其补体的多核苷酸。
在另一个相关实施方案中，本发明包括治疗以受治疗者体内多肽的表达不足为特征的疾病或失调的方法，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码多肽或其功能变体或片段的质粒。
在其他实施方案中，本发明提供了诱导受治疗者体内免疫应答的方法，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂为免疫刺激性寡核苷酸。在具体的实施方案中，将药物组合物与疫苗或抗原组合在一起提供给患者。
在相关实施方案中，本发明包括疫苗，该疫苗包含本发明的脂质颗粒和与疾病或病原体相关的抗原。在一个实施方案中，脂质颗粒包含免疫刺激性核酸或寡核苷酸。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤抗原。在另一个实施方案中，抗原是病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。
本发明还包括制备本发明的脂质颗粒和药物组合物的方法及用于制备此类脂质颗粒和药物组合物的试剂盒。
在另一个方面，本发明提供了评估包含试剂(例如治疗剂或诊断剂)和本发明的脂质的组合物的方法。
附图说明
图1为描绘小鼠模型中包含DLin-M-C3-DMA的脂质制剂对FVII的沉默的影响的条形图。
图2为描绘对于多种脂质组合物，MC3在大鼠体内的剂量反应的条形图。
图3为显示包含MC3的制剂的功效的ApoE依赖性的条形图。野生型但非ApoE基因敲除小鼠显示出FVII蛋白水平的剂量依赖性降低。图2也描绘了证明MC3脂质体制剂的ApoE依赖性的图和使用MC3的ApoE KO小鼠的沉默的缺乏可通过与ApoE预混合而被有效拯救。
图4为显示脂质制剂中MC3的摩尔百分比的变化的效应以及还有中性脂质的变化(例如，利用DSPC、DMPC和DLPC的改变中性脂质)的效应的条形图。
图5为显示增加PEG遮蔽减少小鼠中非-GalNAc-介导的沉默的条形图。
图6为显示增加PEG遮蔽减少大鼠中非-GalNAc-介导的沉默的条形图。
图7为显示具有不同摩尔百分比的MC3并具有和不具有GalNAc的脂质体制剂的功效的条形图。
图8为显示GalNAc-靶向脂质体的活性在无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)敲除小鼠中被消除的条形图。
图9为百分比残留FVII与实施例17中制备的制剂的剂量(mg/kg)的剂量反应曲线。
图10为如实施例18中测定的式I的阳离子脂质的pKa滴定曲线。
具体实施方式
本文中提供了改进的脂质制剂，其可用作例如将试剂例如基于核酸的试剂，例如基于RNA的构建体递送至细胞或受治疗者。本文中还描述了给动物施用包含基于RNA的构建体的改进的脂质制剂，并且在某些实施方案中，评估靶基因的表达的方法。在某些实施方案中，改进的脂质制剂包括靶向脂质(例如，本文中描述的靶向脂质例如含有GalNAc或叶酸的脂质)。
脂质
本发明提供了包含式I的阳离子、中性脂质、固醇和PEG或PEG修饰的脂质的改进的脂质制剂，其中式I为
在一个实施方案中，脂质为外消旋混合物。
在一个实施方案中，脂质富集于一种非对映异构体，例如脂质具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％的非对映过量。
在一个实施方案中，脂质是手性纯的，例如为单一异构体。
在一个实施方案中，脂质富集于一种异构体。
在一个实施方案中，本发明的制剂被捕获至少75％、至少80％或至少90％。在一个实施方案中，制剂包含按摩尔计约25％至约75％，例如按摩尔计约35至约65％、约45至约65％、约60％、约57.5％，约50％或约40％的式I的阳离子脂质。
在一个实施方案中，制剂包含按摩尔计约0.5％至约15％，例如按摩尔计约3至约12％、约5至约10％或约15％、或约10％或约7.5％的中性脂质。
在一个实施方案中，制剂包含按摩尔计约5％至约50％(例如，按摩尔计约15至约45％、约20至约40％或约40％、约38.5％、约35％或约31％)的固醇。在一个实施方案中，固醇为胆固醇。
在一个实施方案中，制剂包含按摩尔计约0.5％至约20％(例如，按摩尔计约0.5至约10％、约0.5至约5％、约1.5％、约0.5％、约1.5％或约3.5％或约5％)的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计25-75％的式I的阳离子脂质、0.5-15％的中性脂质、5-50％的固醇和0.5-20％的PEG或PEG-修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计35-65％的式I的阳离子脂质、3-12％的中性脂质、15-45％的固醇和0.5-10％的PEG或PEG-修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计45-65％的式I的阳离子脂质、5-10％的中性脂质、25-40％的固醇和0.5-10％的PEG或PEG-修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计约60％的式I的阳离子脂质、约7.5％的中性脂质、约31％的固醇和约1.5％的PEG或PEG-修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇以及PEG脂质是PEG-DMG(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在其他实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质包含平均分子量低于2,000，例如约1,500Da、约1,000Da或约500Da的PEG分子。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为下列式VI的化合物：
其中PEG分子的平均分子量为2,000Da。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSG，在本文中也称为PEG-C18或C18-PEG)。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计约50％的式I的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约38.5％的固醇和约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇以及PEG脂质是PEG-DMG(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质是PEG-二苯乙烯基甘油(PEG-DSG，在本文中也称为PEG-C18或C18-PEG)。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质是PEG-DPG(PEG-二棕榈酰甘油)。在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含按摩尔计约50％的式I的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约35％的固醇、约4.5％的PEG或PEG修饰的脂质和约0.5％的靶向脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇，PEG脂质是PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSG，在本文中也称为PEG-C18或C18-PEG)，靶向脂质为GalNAc3-PEG-DSG。
在一个实施方案中，本发明的制剂包括按摩尔计约50％的式I的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约35％的固醇、约4.5％的PEG或PEG修饰的脂质和约0.5％的靶向脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇，PEG脂质是PEG-DMG(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)。
在一个实施方案中，本发明的制剂包括按摩尔计约40％的式I的阳离子脂质、约15％的中性脂质、约40％的固醇和约5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇，PEG脂质是PEG-DMG(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)。
在一个实施方案中，本发明的制剂包括按摩尔计约50％的式I的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约35％的固醇和约5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇，PEG脂质是PEG-DMG(在本文中也称为PEG-C14或C14-PEG)。
在一个实施方案中，本发明的制剂包括按摩尔计约57.2％的式I的阳离子脂质、约7.1％的中性脂质、约34.3％的固醇、约1.4％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DPPC，固醇是胆固醇，PEG脂质是PEG-cDMA(PEG-cDMA进一步描述于Heyes等人(J.Controlled Release，107，276-287(2005)中)。
GalNAc3-PEG-DSG，在一个实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为式VI或PEG-DSG的化合物，其中PEG分子具有2,000Da的平均分子量。
在一个实施方案中，本发明的制剂包括按摩尔计约57.5％的式I的阳离子脂质、约7.5％的中性脂质、约31.5％的固醇以及约3.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，阳离子脂质是式I的化合物，中性脂质是DSPC，固醇是胆固醇以及PEG脂质是PEG-DMG。
在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比为至少约0.5∶1、至少约1∶1、至少约2∶1、至少约3∶1、至少约4∶1、至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约8∶1、至少约10∶1、至少约11∶1、至少约12∶1至至少约15∶1。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比为约1∶1至约20∶1、约3∶1至约15∶1、约4∶1至约15∶1、约5∶1至约13∶1。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比为约0.5∶1至约15∶1。
在一个方面，改进的脂质制剂还包括靶向脂质。在某些实施方案中，靶向脂质包括GalNAc部分(即，N-半乳糖胺部分)。例如，包含GalNAc部分的靶向脂质可包括2008年12月4日提交的USSN 12/328,669(其通过引用整体并入本文)中公开的靶向脂质。靶向脂质还可包含本领域内已知的任何其他脂质(例如，靶向脂质)，例如，如USSN 12/328,669或第WO 2008/042973号国际公布(其每一个申请的内容通过引用整体并入本文)中所描述的脂质。在某些实施方案，靶向脂质包含多个GalNAc部分，例如2至3个GalNAc部分。在某些实施方案，靶向脂质包含多个，例如2或3个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在某些实施方案，靶向脂质中的脂质为1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯(即，DSG)。在某些实施方案，靶向脂质包括PEG部分(例如，具有至少约500Da，例如约1000Da、1500Da、2000Da或更大的分子量的PEG部分)，例如，通过PEG部分将靶向部分连接至脂质。
在某些实施方案，靶向脂质包含叶酸部分。例如，包含叶酸部分的靶向脂质可包括2008年12月4日提交的USSN 12/328,669(其通过引用整体并入本文)中公开的靶向脂质。在另一个实施方案中，包含叶酸部分的靶向脂质可包括式V的化合物。
示例性靶向脂质由下列式L表示：
(靶向基团)n-L-脂质
式L
其中
靶向基团是本领域技术人员已知的和/或本文中描述的任何靶向基团(例如，细胞表面受体)；
n为1至5的整数，(例如，3)
L为连接基团；并且
脂质为脂质例如本文中描述的脂质(例如，中性脂质例如DSG)。
在某些实施方案，连接基团包括PEG部分。
在某些实施方案，靶向脂质为如下文中提供的化合物2、3、4或5：
在某些实施方案中，靶向脂质以按摩尔计约0.001％至约5％(例如，约0.005％、0.15％、0.3％、0.5％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％或5％)的量存在于制剂中。在某些实施方案中，靶向脂质以约0.005％至约1.5％的量存在于制剂中。在某些实施方案，靶向脂质包含于本文中描述的制剂中。
在某些实施方案，脂质制剂还包含抗氧化剂(例如，自由基捕获剂)。抗氧化剂可以以例如约0.01％至约5％的量存在于制剂中。抗氧化剂可以是疏水性的或亲水性的(例如，可溶于脂质或可溶于水的)。在某些实施方案，抗氧化剂为酚化合物，例如，二叔丁基对甲酚、白藜芦醇、辅酶Q10或其他黄酮类或维生素，例如，维生素E或维生素C。其他示例性抗氧化剂包括硫辛酸、尿酸、胡萝卜素例如β-胡萝卜素或视黄醇(维生素A)、谷胱苷肽、褪黑激素、硒和泛醇。
在某些实施方案，靶向脂质(例如，含有GalNAc的脂质)的受体为无唾液酸糖蛋白受体(即，ASGPR)。
在一个实施方案中，通过挤出法或在线混合法生产本发明的制剂。
挤出法(也称为预成形法或分批法)是其中首先制备空脂质体(即，无核酸)，然后将核酸加入空脂质体的方法。将脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或非对称陶瓷膜挤出导致相对界限清楚的粒径分布。通常，使悬浮液循环通过膜一次或多次直至获得所希望的脂质体复合物大小分布。脂质体可被相继通过孔更小的膜挤出，从而获得脂质体大小的逐渐减小。在某些情况下，可使用形成的脂质-核酸组合物而无需任何按大小分类。此类方法公开于US5,008,050；US 4,927,637；US 4,737,323；Biochim Biophys Acta.1979 Oct 19；557(1)：9-23；Biochim Biophys Acta.1980 Oct 2；601(3)：559-7；Biochim BiophysActa.1986 Jun 13；858(1)：161-8；和Biochim.Biophys.Acta 1985 812，55-65(这些文献通过引用整体并入本文)中。
在线混合法是将脂质和核酸二者并行加入混合室的方法。混合室可以是简单T形连接器(T-connector)或本领域技术人员已知的任何其他混合室。
这些方法公开于美国专利no.6,534,018和US 6,855,277；US公布2007/0042031和Pharmaceuticals Research，第22卷，No.3，Mar.2005，p.362-372(所述文献通过引用整体并入本文)中。
还应理解，可利用本领域普通技术人员已知的任何方法制备本发明的制剂。
在其他实施方案中，包含式I的化合物代表性制剂示于表1中。
表1
在一个实施方案中，包含式I的化合物的具体制剂描述如下：
脂质的比率(以摩尔百分比表示)
脂质∶siRNA比率
50/10/38.5/1.5(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA～11
40/15/40/5(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/35/4.5/0.5％(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DSG(C18-PEG)∶GalNAc3-PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/30/9.5/0.5％(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DSG∶GalNAc3-PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/35/5％(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/38.5/1.5(MC3∶DPPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA～11
40/15/40/5(MC3∶DPPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/35/4.5/0.5％(MC3∶DPPC∶胆固醇∶PEG-DSG∶GalNAc3-PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/30/9.5/0.5％(MC3∶DPPC∶胆固醇∶PEG-DSG∶GalNAc3-PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/35/5％(MC3∶DPPC∶胆固醇∶PEG-DSG)
脂质∶siRNA比率～11
50/10/38.5/1.5(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA～7
50/10/38.5/1.5(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DSG)
脂质∶siRNA～10
50/10/38.5/1.5(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA～12
50/10/35/5％(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA比～8
50/10/35/5％(MC3∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG)
脂质∶siRNA比～10
在一个实施方案中，本发明的制剂被捕获至少75％、至少80％或至少90％。
在一个实施方案中，本发明的制剂还包含载脂蛋白。如本文中所使用的，术语“载脂蛋白”或“脂蛋白”是指本领域内技术人员已知的载脂蛋白和及其变体和片段以及指下文中描述的载脂蛋白激动剂、其类似物或片段。
适当的载脂蛋白包括但不限于ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V和ApoE，和其活性多态形式、异构体、变体和突变体以及片段或截短形式。在某些实施方案中，载脂蛋白是含巯基的载脂蛋白。“含巯基的载脂蛋白”是指包含至少1个半胱氨酸残基的载脂蛋白、变体、片段或异构体。最常见的含巯基的载脂蛋白为ApoA-I Milano(APOA-IM)和ApoA-I Paris(ApoA-Ip)，其包含一个半胱氨酸残基(Jia等人，2002，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：206-13；Bielicki和Oda，2002，Biochemistry 41：2089-96)。ApoA-II、ApoE2和ApoE3也是含巯基的载脂蛋白。分离的ApoE和/或其活性片段和多肽类似物，包括其重组产生的形式，描述于美国专利No.5,672,685；5,525,472；5,473,039；5,182,364；5,177,189；5,168,045；5,116,739中；所述专利的公开内容通过引用并入本文。ApoE3公开于Weisgraber等人，“Human E apoproteinheterogeneity：cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of theapo-E isoforms”，J.Biol.Chem.(1981)256：9077-9083；和Rail等人，“Structuralbasis for receptor binding heterogeneity of apo-E from type IIIhyperlipoproteinemic subjects”，Proc.Nat.Acad.Sci.(1982)79：4696-4700中。也参见GenBank登录号K00396。
在某些实施方案中，载脂蛋白可以以其成熟形式、以其载脂蛋白前体(preproapolipoprotein)形式或以其载脂蛋白形式存在。ApoA-I原和ApoA-I成熟体(Duverger等人，1996，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.16(12)：1424-29)、ApoA-I Milano(Klon等人，2000，Biophys.J.79：(3)1679-87；Franceschini等人，1985，J.Biol.Chem.260：1632-35)、ApoA-I Paris(Daum等人，1999，J.Mol.Med.77：614-22)、ApoA-II(Shelness等人，1985，J.Biol.Chem.260(14)：8637-46；Shelness等人，1984，J.Biol.Chem.259(15)：9929-35)、ApoA-IV(Duverger等人，1991，Euro.J.Biochem.201(2)：373-83)和ApoE(McLean等人，1983，J.Biol.Chem.258(14)：8993-9000)的同和异二聚体(在可行的情况下)也可用于本发明的范围内。
在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的片段、变体或异构体。术语“片段”是指具有比天然载脂蛋白的氨基酸序列更短的氨基酸序列(并且该片段保持了天然载脂蛋白的活性，包括脂质结合活性)的任何载脂蛋白。“变体”意指载脂蛋白的氨基酸序列的置换或改变，所述置换或改变(例如氨基酸残基的添加和缺失)并没有破坏包括脂质结合特性在内的天然载脂蛋白的活性。因此，变体可包括具有与本文中提供的天然载脂蛋白基本上相同的氨基酸序列(在所述氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基已被化学上相似的氨基酸保守置换)的蛋白质或肽。保守置换的实例包括至少一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水性氨基酸。同样地，本发明涉及例如至少一个亲水性残基的置换，例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及甘氨酸与丝氨酸之间的置换(参见例如美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166)。术语“异构体”是指具有相同、更大或部分功能以及相似、相同或部分序列的蛋白质，其可以是或可以不是相同基因的产物并且通常是组织特异性的(参见Weisgraber 1990，J.lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson和Powers 1991，J.lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner等人，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等人，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等人，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等人，1987，Cell 50(6)：831-40；Aviram等人，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等人，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等人，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等人，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz and Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等人，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等人，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sacre等人，2003，FEBS Lett.540(1-3)：181-7；Weers，等人，2003，Biophys.Chem.100(1-3)：481-92；Gong等人，2002，J.Biol.Chem.277(33)：29919-26；Ohta等人，1984，J.Biol.Chem.259(23)：14888-93美国专利No.6,372,886)。
在某些实施方案中，本发明的方法和组合物包括载脂蛋白的嵌合结构的使用。例如，载脂蛋白的嵌合结构可由具有与包含缺血再灌注保护性质的载脂蛋白结构域相关的高脂质结合能力的载脂蛋白结构域组成。载脂蛋白的嵌合结构域可以是包括载脂蛋白内的分隔区域的结构(即，同源结构)或嵌合结构可以是包括不同载脂蛋白之间的分隔区域的结构(即，异源结构)。包含嵌合结构的组合物还可包括片段，所述片段为载脂蛋白变体或区段，其经设计具有特定特征(例如，脂质结合、受体结合、酶促、酶激活、抗氧化性或还原-氧化性)(参见Weisgraber 1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson和Powers 1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner等人，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等人，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等人，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等人，1987，Cell 50(6)：831-40；Aviram等人，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等人，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等人，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等人，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等人，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等人，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sorenson等人，1999，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19(9)：2214-25；Palgunachari 1996，Arterioscler.Throb.Vase.Biol.16(2)：328-38：Thurberg等人，J.Biol.Chem.271(11)：6062-70；Dyer 1991，J.Biol.Chem.266(23)：150009-15；Hill 1998，J.Biol.Chem.273(47)：30979-84)。
本发明中利用的载脂蛋白还包括重组、合成、半合成或纯化的载脂蛋白。本发明利用的用于获得载脂蛋白或其等同物的方法在本领域内是公知的。例如，载脂蛋白可利用例如密度梯度离心或免疫亲和层析从血浆或天然产物分离，或合成、半合成地或利用本领域技术人员已知的重组DNA技术制备(参见，例如Mulugeta等人，1998，J.Chromatogr.798(1-2)：83-90；Chung等人，1980，J.lipid Res.21(3)：284-91；Cheung等人，1987，J.lipid Res.28(8)：913-29；Persson，等人，1998，J.Chromatogr.711：97-109；美国专利No.5,059,528、5,834,596、5,876,968和5,721,114；以及PCT公布WO 86/04920和WO87/02062)。
本发明中利用的载脂蛋白还包括载脂蛋白激动剂，例如模拟ApoA-I、ApoA-I Milano(ApoA-IM)、ApoA-I Paris(ApoA-IP)、ApoA-II、ApoA-IV和ApoE的活性的肽和肽类似物。例如，载脂蛋白可以是美国专利No.6,004,925、6,037,323、6,046,166和5,840,688(所述专利的内容通过引用整体并入本文)中描述的任何载脂蛋白。
可利用本领域内已知的用于肽合成的任何技术(例如美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166中描述的技术)合成或制备载脂蛋白激动剂肽或肽类似物。例如，可利用最初由Merrifield(1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)描述的固相合成技术制备肽。其他肽合成技术可见于Bodanszky等人，Peptide Synthesis，John Wiley & Sons，第2版.(1976)和本领域技术人员可容易获得的其他参考文献中。多肽合成技术的概要可见于Stuart和Young，Solid Phase Peptide.Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.(1984)。肽还可利用如The Proteins，第II卷，第3版，Neurath等人编辑，p.105-237，Academic Press，New York，N.Y.(1976)中描述的溶液法合成。适用于不同肽合成的保护基团描述于上述教科书以及McOmie，Protective Groups in OrganicChemistry，Plenum Press，New York，N.Y.(1973)中。本发明的肽还可通过从例如载脂蛋白A-I的更大部分化学或酶促切割来制备。
在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的混合物。在一个实施方案中，载脂蛋白可以是同源混合物，即，单一类型的载脂蛋白。在另一个实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的异源混合物，即，两种或更多种不同载脂蛋白的混合物。载脂蛋白的异源混合物的实施方案可包括例如来自动物来源的载脂蛋白与来自半合成来源的载脂蛋白的混合物。在某些实施方案中，异源混合物可包括例如ApoA-I与ApoA-I Milano的混合物。在某些实施方案中，异源混合物可包括例如ApoA-I Milano与ApoA-I Paris的混合物。用于本发明的方法和组合物的适当的混合物对于本领域技术人员来说是容易理解的。
如果载脂蛋白获得自天然来源，那么其可获自植物或动物来源。如果载脂蛋白获自动物来源，那么载脂蛋白可来自任何物种。在某些实施方案中，载脂蛋白可获自动物来源。在某些实施方案中，载脂蛋白可获自人类来源。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白来源于与所述载脂蛋白所施用至的个体相同的物种。
在一个实施方案中，靶基因选自包含因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因中的突变、p53肿瘤抑制基因及其组合的群组。在一个实施方案，靶基因是在肝中表达的基因例如因子VII(FVII)基因。通过测量生物样品例如血清或组织样品中的FVII水平来评估靶基因例如FVII表达的效应。例如，可测定血液中FVII的水平，例如通过FVII活性的分析所测定。在一个实施方案中，可评估肝中mRNA的水平。在另一个优选实施方案中，进行至少两种类型的评估，例如进行蛋白质水平(例如，血液中的蛋白质水平)的评估和mRNA水平(例如，肝中的mRNA水平)的测量。
在一个实施方案中，该试剂为核酸例如双链RNA(dsRNA)。
在另一个实施方案中，核酸试剂是单链DNA或RNA或双链DNA或RNA或DNA-RNA杂交体(hybrid)。例如，双链DNA可以是结构基因，包括控制和终止区的基因，或自我复制系统例如病毒或质粒DNA。双链DNA可以是例如dsRNA或另一种RNA干扰试剂。单链核酸可以是例如反义寡核苷酸、核酶、微RNA或三螺旋形成的寡核苷酸。
在另一个实施方案中，在施用候选试剂后不同的时间点上，可从受试对象获取生物样品，例如液体样品例如血液、血浆或血清或组织样品例如肝样品，然后测试所述试剂对靶蛋白质或mRNA表达水平的影响。在一个特别优选实施方案中，候选试剂是以FVII为靶点的dsRNA，并且测试生物样品对因子VII蛋白或mRNA水平的影响。在一个实施方案中，例如通过使用免疫组织化学测定法或生色测定法测定FVII蛋白的血浆水平。在另一个实施方案中，利用测定法例如分支DNA测定法或Northern印迹法或RT-PCR测定法测试肝中FVII mRNA的水平。
在一个实施方案中，对试剂例如包含改进的脂质制剂的组合物的毒性进行评估。在另一个实施方案中，可以例如通过体重或cageside行为的变化监控模型受治疗者的生理效应。
在一个实施方案中，所述方法还包括将试剂例如包含改进的脂质制剂的组合物经历进一步评估。进一步评估可包括例如(i)上述评估的重复，(ii)利用不同数目的动物或利用不同剂量重复上述评估或(iii)利用不同方法例如，在另一种动物模型例如非人灵长类动物中进行的评估。
在另一个实施方案中，取决于观察到的候选试剂对肝蛋白质或mRNA水平的影响，决定是否在进一步的研究例如临床试验中包括试剂和改进的脂质制剂。例如，如果观察到候选dsRNA降低蛋白质或mRNA水平至少20％、30％、40％、50％或更多，那么所述试剂可被考虑用于临床试验。
在另一个实施方案中，取决于观察到的候选试剂和氨基脂质对肝蛋白质或mRNA水平的影响，决定是否在药物组合物中包含试剂和改进的脂质制剂。例如，如果观察到候选dsRNA降低蛋白质或mRNA水平至少20％、30％、40％、50％或更多，那么所述试剂可被考虑用于临床试验。
在另一个方面，本发明表征了评估改进的脂质制剂的用于将治疗剂递送至细胞的适合性的方法。在某些实施方案，本发明表征了评估改进的脂质制剂的用于递送基于RNA的构建体(例如以FVII为靶点的dsRNA)的适合性的方法。所述方法包括提供包含以FVII为靶点的dsRNA和候选氨基脂质的组合物，给啮齿类动物例如小鼠施用组合物，评估作为血液中FVII的水平或肝中FVII mRNA的水平中的至少一个的函数的FVII的表达，从而评估候选氨基脂质。在某些实施方案，方法还包括将靶基因的表达与预选的参照值相比较。
包含含有脂质的成分例如脂质体的组合物，此类组合物更详细地描述于下文中。示例性基于核酸的试剂包括dsRNA、反义寡核苷酸、核酶、微RNA、免疫刺激性寡核苷酸或三螺旋形成的寡核苷酸。此类试剂也更详细地描述于下文中。
“烷基”意指包含1至24个碳原子的直链或支链的、非环状或环状饱和脂肪烃。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”意指在相邻碳原子之间包含至少一个双键的如上定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意指此外在相邻碳之间还包含至少一个三键的如上定义的任何烷基或烯基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”意指其中连接点上的碳被氧基取代的任何烷基、烯基或炔基，如下文中定义的。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。
术语“芳基”是指芳香族单环、双环或三环烃环系统，其中任何环原子可被取代。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和芘基。
“杂环”意指5-至7-元单环或7-至10-元双环的杂环，其为饱和的、不饱和的或芳香族的，并且其可包含1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季铵化，包括其中将上述任一个杂环融合至苯环的双环。可通过任何杂原子或碳原子连接杂环。杂环包括如下定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酸胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的芳基”和“任选取代的杂环”意指，当取代时，至少一个氢原子被取代基取代。对于氧代取代基(＝O)，两个氢原子被取代。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n为0、1或2，RX和Ry相同或不同并且独立地为氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基中的每一个可被氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy的一个或多个进一步取代。
术语“杂芳基”是指具有1-3个杂原子(如果为单环)、1-6个杂原子(如果为双环)或1-9个杂原子(如果为三环)的芳香族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和如果为单环、双环或三环，分别有1-3、1-6或1-9个N、O或S杂原子)，其中任何环原子可被取代。本文中描述的杂芳基还可包含共有共同碳-碳键的稠环。术语“烷基杂环”是指其中环原子的至少一个被烷基、烯基或炔基取代的杂芳基。
术语“取代的”是指给定结构中的一个或多个氢基团被指定取代基的基团取代，所述取代基的基团包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、巯基、烷硫基、氧代、硫氧基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨酰基、烷基胺酰基、芳基胺酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷胺基、芳胺基、烷胺基烷基、芳胺基烷基、氨基烷胺基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧羰烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环和脂肪族基团。应理解取代基可被进一步取代。“卤素”意指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基胺”和“二烷基胺”分别是指-NH(烷基)和-N(烷基)2基团。
术语“烷基磷酸酯”是指-O-P(Q′)(Q″)-O-R，其中Q′和Q″各自独立地为O、S、N(R)2、任选取代的烷基或烷氧基；并且R为任选取代的烷基、ω-氨基烷基或ω-(取代的)氨基烷基。
术语“烷基硫代磷酸酯”是指其中Q′或Q″的至少一个为S的烷基磷酸酯。
术语“烷基膦酸酯”是指其中Q′或Q″的至少一个为烷基的烷基磷酸酯。
术语“羟基烷基”意指-O-烷基基团。
术语“烷基杂环”是指其中至少一个亚甲基已被杂环取代的烷基。
术语“ω-氨基烷基”是指-烷基-NH2基团。术语“ω-(取代的)氨基烷基”是指其中N上的至少一个H已被烷基取代的ω-氨基烷基。
术语“ω-磷酸烷基”是指-烷基-O-P(Q′)(Q″)-O-R，其中Q′和Q″各自独立地为O或S并且R为任选取代的烷基。
术语“ω-硫代磷酸烷基”是指其中Q′或Q″的至少一个为S的ω-磷酸烷基。
在某些实施方案，本发明的方法可能要求使用保护基团。保护基团法对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS，Green，T.W.等人，Wiley-Interscience，New York City，1999)。简而言之，本发明的上下文中保护性基团是减少或消除官能团的不想要的反应性的任何基团。可将保护基团添加至官能团以在某些反应过程中遮蔽其反应性，随后除去以暴露原始官能团。在某些实施方案中，使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是减少或消除醇官能团的不想要的反应性的任何基团。可使用本领域公知的技术加入和除去保护基团。
脂质颗粒
可将用于在本文表征的肝筛查模型中测试的试剂和/或氨基脂质配制在脂质颗粒中。脂质颗粒包括但不限于脂质体。如本文中所使用的，脂质体是具有密封水性内部的含有脂质膜的结构。脂质体可具有一个或多个脂质膜。本发明涉及单层脂质体(其被称为单室)和多层脂质体(其被称为多室)。当与核酸复合时，脂质颗粒也可以是脂质体复合物，其由夹在DNA层之间的阳离子脂质双层组成，如例如Feigner，Scientific American中所描述的。
脂质颗粒还可包含一种或多种另外的脂质和/或其他成分例如胆固醇。其他脂质可包含在脂质体组合物中以用于多种目的，例如防止脂质氧化或将配体连接至脂质体表面上。许多脂质的任一种可存在，包括两亲性脂质、中性脂质、阳离子和阴离子脂质。此类脂质可单独使用或组合使用。可存在的其他脂质成分的具体实例描述于下文中。
可存在于脂质颗粒中的其他成分包括双层稳定化成分例如聚酰胺寡聚物(参见，例如，美国专利No.6,320,017)、肽、蛋白质、去污剂、脂质-衍生物例如偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG和偶联至神经酰胺的PEG(参见，美国专利No.5,885,613)。在某些实施方案，脂质颗粒包含靶向剂例如本文中描述的靶向脂质。
脂质颗粒可包含第二氨基脂质或阳离子脂质、中性脂质、固醇和在形成过程中被选择用以减少脂质颗粒的聚集的脂质中的一种或多种，该减少脂质颗粒的聚集的效应可能因颗粒的空间位阻稳定机制而产生，该机制可在形成过程中阻止电荷诱导聚集。
如本文中所使用的，术语“阳离子脂质”意指包括具有一个或多个脂肪酸或脂肪烷基链和氨基头基(head group)(包括烷胺基或二烷胺基)的那些脂质，所述脂质可在生理pH下被质子化以形成阳离子脂质。在某些实施方案，阳离子脂质被称为“氨基脂质”。
其他阳离子脂质可包括具有脂肪酸基团和其他二烷胺基之一的阳离子脂质，包括其中烷基取代基不同(例如，N-乙基-N-甲氨基-、N-丙基-N-乙氨基-等)的阳离子脂质。通常地，具有较少饱和酰基链的脂质(例如，阳离子脂质)的大小可更容易调整，特别是当为了过滤灭菌使复合物的大小为约0.3微米以下时。含有具有在C10至C20的范围内的碳链长度的不饱和脂肪酸的阳离子脂质是优选的。其他支架也可用于分隔阳离子脂质的氨基(例如，阳离子脂质的氨基)和脂肪酸或脂肪烷基部分。适当的支架对于本领域技术人员来说是已知的。
在某些实施方案中，阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，以便脂质在处于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，在第二pH，优选为处于或高于生理pH下为中性。此类脂质也被称为阳离子脂质。当然，应当理解，作为pH的函数的质子的添加或去除是个平衡过程，并且提及的带电荷的或中性的脂质是指主要种类的性质并且不需要全部脂质都以带电荷或中性的形式存在。具有超过一个可质子化或可去质子化基团或为两性离子的脂质不被排除用于本发明中。
在某些实施方案中，可质子化的脂质(即，阳离子脂质)具有在约4至约11的范围内的可质子化基团的pKa。最优选的是约4至约7的pKa，因为此类脂质在更低的pH配制阶段为阳离子性的，然而颗粒在约pH 7.4的生理pH下大部分表面(虽然并非全部)被中和。该pKa的益处之一是至少某些与颗粒的外表面结合的核酸将在生理pH下失去其静电相互作用，然后可通过简单的透析除去；从而大大降低了颗粒对清除的易感性。
在形成过程中减少颗粒聚集的脂质的实例包括聚乙二醇(PEG)-修饰的脂质、单唾液酸神经节苷酯Gm1和聚酰胺寡聚物(“PAO”)例如(描述于美国专利No.6,320,017中)。还可将具有在配制过程中防止聚集的不带电荷的、亲水性、空间屏蔽部分的其他化合物如PEG、Gm1或ATTA偶联至脂质以用于本发明的方法和组合物。ATTA-脂质描述于例如美国专利No.6,320,017，并且PEG-脂质缀合物描述于例如美国专利No.5,820,873、5,534,499和5,885,613中。通常，被选择用以减少聚集的脂质成分的浓度为约1至15％(按脂质的摩尔百分比计算)。
减少聚集和/或适合于结合至可用于肝筛查模型的核酸试剂的脂质的实例是聚乙二醇(PEG)修饰的脂质、单唾液酸神经节苷酯Gm1和聚酰胺寡聚物(“PAO”)例如(美国专利No.6,320,017中描述的)。还可将具有在配制过程中防止聚集的不带电荷的、亲水性、空间屏蔽部分的其他化合物如PEG、Gm1或ATTA也可被偶联至脂质以用于本发明的方法和组合物。ATTA-脂质描述于例如美国专利No.6,320,017中，PEG-脂质缀合物描述于例如美国专利No.5,820,873、5,534,499和5,885,613中。通常，被选择用以减少聚集的脂质成分的浓度为约1至15％(按脂质的摩尔百分比计算)。
用于本发明的PEG修饰脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)的特定实例可具有多种“锚定”脂质部分以将PEG部分固定在脂质囊泡的表面。适当的PEG修饰的脂质的实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)(其描述于共同待决的USSN 08/486,214，其通过引用并入本文)、PEG-修饰的二烷基胺和PEG修饰的1，2-二酰氧基丙烷-3-胺类。特别优选的是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。在某些实施方案，颗粒中的PEG脂质的总摩尔百分比为约1.5mol％。例如，当颗粒包含多种本文中描述的PEG脂质例如上文中描述的PEG修饰的脂质和包含PEG的靶向脂质时，当合起来考虑时包含PEG的脂质的总量为约1.5mol％。
在其中将空间上大的部分例如PEG或ATTA结合至脂质锚的实施方案中，脂质锚的选择取决于缀合物将与脂质颗粒所具有的结合类型。众所周知，mePEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)将与脂质体保持结合可能数天，直至颗粒从循环清除。其他缀合物例如PEG-CerC20具有相似的停留能力。然而，在某些测定中，PEG-CerC14在暴露于血清后以短于60分钟的T1/2快速地从制剂交换出来。如美国专利申请SN 08/486,214中举例说明的，至少3个特征影响交换速率：酰基链的长度、酰基链的饱和度和空间屏蔽头基的大小。具有此类特征的适当变化的化合物可用于本发明。对于某些治疗性应用，优选地PEG修饰的脂质在体内可从核酸-脂质颗粒快速失去，从而PEG-修饰的脂质将具有相对短的脂质锚。在其他治疗性应用中，优选地核酸-脂质颗粒展示更长的血浆循环寿命，从而PEG修饰的脂质将具有相对更长的脂质锚。示例性脂质锚包括具有约C14至约C22，优选约C14至约C16的长度的脂质锚。在某些实施方案，PEG部分，例如mPEG-NH2，具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。
应当指出，阻止聚集的化合物不一定需要适当地起作用的脂质缀合物。溶液中游离PEG或游离ATTA可以足以阻止聚集。如果颗粒在配制后是稳定的，那么可在给受治疗者施用之前透析除去PEG或ATTA。
中性脂质，当存在于脂质颗粒中时，可以是众多在生理pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的脂质种类的任一种。此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂类。用于本文中描述的颗粒中的中性脂质的选择通常通过考虑例如脂质体大小和脂质体在血流中的稳定性来指导。优选地，中性脂质成分是具有两个酰基(即，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)的脂质。具有多种酰基链(其具有不同链长度和饱和程度)的脂质是可获得的或可利用公知的技术分离或合成。在另一组实施方案中，含有碳链长度在C1至C22的范围内的饱和脂肪酸的脂质是优选的。在另一组实施方案中，使用具有单或双不饱和脂肪酸(其具有C1至C22的范围内的碳链长度)的脂质。此外，可使用具有饱和或不饱和脂肪酸链的脂质。优选地，用于本发明的中性脂质是DOPE、DSPC、DPPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。用于本发明的中性脂质还可由具有其他头基例如丝氨酸和肌醇的鞘磷脂、二氢鞘磷脂或磷脂类组成。
脂质混合物的固醇化合物，当存在时，可以是常规用于脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制备领域的固醇中的任何固醇。优选固醇为胆固醇。
除了上文中明确描述的阳离子脂质外，还可将在约生理pH下携带净正电荷的其他阳离子脂质包含在本发明的脂质颗粒中。此类阳离子脂质包括但不限于N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N-N-三乙基氯化铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(″DOTAP″)；1，2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(″DOTAP.C1″)；3β-(N-(N′，N′-二甲基胺基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)、N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(″DOSPA″)、二-十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(″DOGS″)、1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(″DOPE″)，1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(″DODAP″)，N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(″DODMA″)和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。此外，可使用阳离子脂质的许多商业制剂例如LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)和LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。在具体的实施方案中，阳离子脂质为氨基脂质。
适合用于本发明的脂质颗粒的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油和连接至中性脂质的其他阴离子修饰基团。
在许多实施方案中，两亲性脂质包括在本发明的脂质颗粒中。“两亲性脂质”是指其中脂质材料的疏水部分指向疏水相，而亲水部分指向水相的任何适当材料。此类化合物包括但不限于磷脂类、氨基脂质和鞘脂类。代表性磷脂类包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱(DMPC)或二亚油酰基磷脂酰胆碱(DLPC)。还可使用其他缺乏磷的化合物例如鞘脂类、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸(acyloxyacid)。此外，可将此类两亲性脂质与其他脂质例如甘油三酯和固醇类容易地混合。
也适合包含在本发明的脂质颗粒中的是可编程控制的融合脂质。此类脂质颗粒在给定的信号事件发生之前几乎不具有与细胞膜融合和递送它们的有效载荷的趋势。这允许脂质颗粒在注射入器官或疾病位置之后，在其开始与细胞融合之前更均匀地分布。该信号事件可以例如是pH、温度、离子环境或时间的变化。在后一种情况下，融合延迟或“遮蔽(cloaking)”组分例如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物可随时间的过去简单地从脂质颗粒膜交换出。示例性脂质锚包括具有约C14至约C22，优选约C14至约C16的长度的脂质锚。在某些实施方案，PEG部分，例如mPEG-NH2，具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。
当脂质颗粒在体内适当地分布时，其已失去充分的遮蔽试剂从而是致融性的(fusogenic)。对于其他信号事件，期望选择与疾病位置或靶细胞相关的信号，例如炎症位置上温度的增加。
结合至核酸的脂质颗粒还可包括靶向部分，例如对细胞类型或组织具有特异性的靶向部分。先前已描述了利用多种靶向部分例如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和单克隆抗体的脂质颗粒的靶向(参见，例如，美国专利No.4,957,773和4,603,044)。示例性靶向部分包括靶向脂质例如本文中描述的靶向脂质。在某些实施方案，靶向脂质为含有GalNAc的靶向脂质例如本文中描述的GalNAc3-DSG和GalNAc3-PEG-DSG。靶向部分可包括完整蛋白质或其片段。靶向机制通常需要将靶向试剂以使靶向部分可有效与靶例如细胞表面受体相互作用的方式置于脂质颗粒的表面上。多种不同的靶向试剂和方法在本领域是已知的并且是可获得的，包括例如Sapra，P.和Allen，TM，Prog.Lipid Res.42(5)：439-62(2003)；以及Abra，RM等人，J.Liposome Res.12：1-3，(2002)中描述的靶向试剂和方法。
具有亲水聚合物链例如聚乙二醇(PEG)链作为表面包衣的脂质颗粒即脂质体用于靶向的用途已被提出(Allen等人，Biochimica et Biophysica Acta 1237：99-108(1995)；DeFrees等人，Journal of the American Chemistry Society 118：6101-6104(1996)；Blume等人，Biochimica et Biophysica Acta 1149：180-184(1993)；Klibanov等人，Journal of Liposome Research 2：321-334(1992)；美国专利No.5,013556；Zalipsky，Bioconjugate Chemistry 4：296-299(1993)；Zalipsky，FEBS Letters 353：71-74(1994)；Zalipsky，in Stealth Liposomes Chapter9(Lasic和Martin，Eds)CRC Press，Boca Raton F1(1995)。在一个方面中，将用于靶向脂质颗粒的配体例如抗体连接至形成脂质颗粒的脂质的极性头基。在另一个方法中，将靶向配体连接至PEG链的末端，从而形成亲水聚合物包衣(Klibanov等人，Journal of Liposome Research 2：321-334(1992)；Kirpotin等人，FEBS Letters 388：115-118(1996))。
可使用用于偶联靶试剂的标准方法。例如，可使用磷脂酰乙醇胺(其可被活化用于连接靶试剂)或衍生的亲脂化合物例如脂质衍生的博来霉素。可使用例如掺入了蛋白质A的脂质体来构建抗体靶向的脂质体(参见，Renneisen等人，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：2448-2451(1990)。抗体缀合物的其他实例公开于美国专利No.6,027,726中，其教义通过引用并入本文。靶向部分的实例还可包括特异于细胞成分(包括与赘生物或肿瘤相关的抗原)的其他蛋白质。可将用作靶向部分的蛋白质通过共价键连接至脂质体(参见，Heath，Covalent Attachment of Proteinsto Liposomes，149 Methods in Enzymology 111-119(Academic Press，Inc.1987))。其他靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白系统。
在一个示例性实施方案中，脂质颗粒包括本发明的阳离子脂质、中性脂质(除了阳离子脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和PEG修饰的脂质(例如，PEG-DMG或PEG-cDMA)的混合物。在某些实施方案中，脂质混合物由或基本上由本发明的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质组成。在进一步优选实施方案中，脂质颗粒由或基本上由约20-70％DLin-M-C3-DMA∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％PEG修饰的脂质的摩尔比的上述脂质混合物组成。
在具体的实施方案中，脂质颗粒由或基本上由例如约20-60％DLin-M-C3-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-DMG或PEG-cDMA的摩尔比的DLin-M-C3-DMA、DSPC、Chol和PEG-DMG或PEG-cDMA组成。在具体的实施方案中，摩尔脂质比为约40/10/40/10(DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的摩尔百分比)、35/15/40/10(DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDM的摩尔百分比A)或52/13/30/5(DLin-M-C3-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的摩尔百分比)。
在另一组实施方案中，此类组合物中的中性脂质DSPC被POPC、DPPC、DOPE或SM取代。
治疗剂-脂质颗粒组合物和制剂
本发明包括包含本发明的脂质颗粒和活性剂的组合物，其中所述活性剂与脂质颗粒结合。在具体的实施方案中，活性剂是治疗剂。在具体的实施方案中，活性剂被封装在脂质颗粒的水性内部中。在其他实施方案中，活性剂存在于脂质颗粒的一个或多个脂质层内。在其他实施方案中，活性剂结合至脂质颗粒的外脂质表面或内脂质表面。
如本文中所使用的“完全封装的”表示颗粒中的核酸在暴露于可显著降解游离DNA的血清或核酸酶测定后未被显著降解。在完全封装的系统中，优选少于25％的颗粒核酸在通常降解100％的游离核酸的处理中被降解，更优选地少于10％和最优选少于5％的颗粒核酸被降解。可选择地，完全封装可利用Oligreen测定法来测定。Oligreen是用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA的超灵敏荧光核酸染色剂(可从Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA获得)。完全封装还表示颗粒是血清稳定的，即，它们在体内施用后不会快速分解成它们的组成部分。
如本文中所使用的活性剂包括能够对细胞、组织、器官或受治疗者产生所需效应的任何分子或化合物。此类效应可以是例如生物学、生理学或美容效应。活性剂可以是任何类型的分子或化合物，包括例如核酸、肽和多肽，包括例如抗体，例如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；人源化抗体、重组抗体、重组人抗体和PrimatizedTM抗体、细胞因子、生长因子、细胞凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体和它们的配体；激素；和小分子，包括有机小分子或化合物。
在一个实施方案中，活性剂是治疗剂或其盐或衍生物。治疗剂衍生物可以是其本身在治疗上具有活性的或它们可以是前体药物，所述前体药物在进一步修饰后变得具有活性。因此，在一个实施方案中，治疗剂衍生物与未修饰的试剂相比较保留一定或全部治疗活性，然而在另一个实施方案中，治疗试剂衍生物缺乏治疗活性。
在多个实施方案中，治疗剂包括任何治疗上有效的试剂或药物，例如抗炎化合物、抗抑郁剂、兴奋剂、镇痛药、抗生素、避孕药(birth control medication)、退热剂、血管扩张剂、抗血管生成药(anti-angiogenics)、细胞血管剂(cytovascularagents)、信号传导抑制剂、心血管药物例如抗心律不齐药、血管收缩剂、激素类和类固醇类。
在某些实施方案中，治疗剂是肿瘤学药物(oncology drug)，其还可被称为抗肿瘤药、抗癌药、肿瘤药、抗癌剂等。可根据本发明使用的肿瘤药物的实例包括但不限于阿霉素、爱克兰、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲、araC、三氧化二砷、硫唑嘌呤、贝沙罗汀、biCNU、博来霉素、静脉内用白消安、口服白消安、卡培他滨(希罗达)、卡铂、卡莫司汀、CCNU、塞来考昔、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环孢素A、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷、柔红霉素、环磷酰胺、柔红霉素、地塞米松、右雷佐生、多烯紫衫醇、多柔比星、多柔比星、DTIC、表柔比星、雌氮芥、磷酸依托泊苷、依托泊苷和VP-16、依西美坦、FK506、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、吉西他滨(健择)、吉姆单抗-奥佐米星、醋酸戈舍瑞林、羟基脲(hydrea)、羟基尿素(hydroxyurea)、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素、伊立替康(Camptostar、CPT-111)、来曲唑、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、克拉立平、亮丙瑞林、左旋咪唑、阿利维A酸、甲地孕酮(megastrol)、美法仑、L-PAM、美司钠、氨甲蝶呤、甲氧沙林、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉酚、帕米磷酸盐、培加酶、喷司他丁、卟吩姆钠、泼尼松、利妥昔单抗(rituxan)、链脲菌素、STI-571、他莫昔芬、泰素帝(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷、VM-26、抑拓扑酶素(Hycamtin)、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、长春碱(velban)、长春碱、长春新碱、VP16和长春瑞滨。可根据本发明使用的肿瘤药物的其他实例为椭圆玫瑰树碱(ellipticin)和椭圆玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素、细胞内激酶抑制剂和喜树碱。
核酸-脂质颗粒
在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒与核酸结合，从而导致核酸-脂质颗粒。在具体的实施方案中，核酸被完全封装在脂质颗粒中。如本文中所使用的，术语“核酸”意欲包括任何寡核苷酸或多核苷酸。包含多达50个核苷酸的片段通常称为寡核苷酸，并且更长的片段称为多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸在长度上为20-50个核苷酸。
在本发明的说明书中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷酸或核苷单体的多聚体或寡聚体。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括包含功能上相似的非天然存在的单体或其部分的多聚体或寡聚体。由于性质例如增强的细胞摄入和在核酸酶存在的情况下增加的稳定性的原因，此类修饰的或取代的寡核苷酸与天然形式相比较，通常是优选的。
寡核苷酸被分类为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，所述5-碳糖在该糖的5′和3′碳上与磷酸共价连接，从而形成交替的未分支的聚合物。核糖核苷酸由其中5-碳糖为核糖的相似重复结构组成。
存在于根据本发明的脂质-核酸颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文中使用的核酸可以是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交体。双链DNA的实例包括结构基因、包括控制区和终止区的基因以及自我复制系统例如病毒或质粒DNA。双链RNA的实例包括siRNA和其他RNA干扰试剂。单链核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、微RNA和三螺旋形成的寡核苷酸。
本发明的核酸可以具有不同长度，这通常取决于核酸的具体形式。例如，在具体的实施方案中，质粒或基因在长度上可以为从约1,000至100,000个核苷酸残基。在具体的实施方案中，寡核苷酸在长度上可在约10至100个核苷酸的范围内变化。在多个相关的实施方案中，寡核苷酸(单链、双链和三链的)在长度上可在约10至约50个核苷酸，在长度上约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、约20至约30个核苷酸的范围内变化。
在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸(或其链)与靶多核苷酸特异性杂交或与其互补。“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表示充足的互补性程度(以便在DNA或RNA靶与所述寡核苷酸之间发生稳定且特异性的结合)的术语。应理解，寡核苷酸不必与其可特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当寡核苷酸与靶的结合干扰靶分子的正常功能以引起功能或表达从其丧失时，寡核苷酸是可特异性杂交的，并且存在充足的互补性程度以避免寡核苷酸在其中期望特异性杂交的条件下(即就体内测定或治疗性治疗而言为在生理条件下；或就体外测定而言，为在其中进行测定的条件下)与非靶序列的非特异性结合。因此，在其他实施方案中，与其靶向或其可特异性杂交的基因或mRNA序列的区域相比较，该寡核苷酸包括1、2或3个碱基置换。
RNA干扰核酸
在具体的实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒与RNA干扰(RNAi)分子结合。利用RNAi分子的RNA干扰法可用于中断基因或目的多核苷酸的表达。在最近5年中，小干扰RNA(siRNA)基本上已取代反义ODN和核酶作为处于开发中的新一代靶向寡核苷酸药物。SiRNA为通常21-30个核苷酸长的RNA双链体，其可与称为RNA诱导沉默结合体(RISC)的细胞质多蛋白质复合物结合。载有siRNA的RISC介导同源mRNA转录物的降解，从而siRNA可被设计用来以高度特异性敲低蛋白质表达。与其他反义技术不同，siRNA通过已进化的通过非编码RNA控制基因表达的天然机制起作用。这通常被认为是为什么它们的活性在体外和体内比反义ODN或核酶的任一种更有效的原因。多种RNAi试剂(包括以临床上相关的靶为靶点的siRNA)目前正处于药物开发中，如例如Fougerolles，A.等人，Nature Reviews 6：443-453(2007)中描述的。
虽然第一描述的RNAi分子是包含RNA有义和RNA反义链的RNA:RNA杂交体，但现已证明DNA有义:RNA反义杂交体、RNA有义:DNA反义杂交体和DNA:DNA杂交体能够介导RNAi(Lamberton，J.S.and Christian，A.T.(2003)Molecular Biotechnology 24：111-119)。因此，本发明包括使用包含任何这些不同类型的双链分子的RNAi分子。此外，应理解，可以以多种形式使用RNAi分子和将其引入细胞。因此，如本文中所使用的，RNAi分子包括任何和所有能够在细胞中诱导RNAi反应的分子，包括但不限于包含两条分开的链即有义链和反义链的双链多核苷酸，例如小干扰RNA(siRNA)；包含互补序列的发夹环的多核苷酸，其形成双链区域，例如，shRNAi分子，和表达一个或多个能够单独地或与另一个多核苷酸组合形成双链多核苷酸的多核苷酸的表达载体。
如本文中使用的“单链siRNA化合物”是由单个分子组成的siRNA化合物。其可包括通过链内配对形成的双链区域，例如，其可以是或包括发夹或锅柄样结构。单链siRNA化合物相对于靶分子可以是反义的。
单链siRNA化合物可以足够长，以便其可进入RISC并且参与RISC介导的靶mRNA的切割。单链siRNA化合物在长度上为至少14个核苷酸，并且在其他实施方案中为至少15、20、25、29、35、40或50个核苷酸。在某些实施方案中，其在长度上少于200、100或60个核苷酸。
发夹siRNA化合物可具有等于或至少17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双链体区域。双链体区域在长度上可等于或少于200、100或50个核苷酸对。在某些实施方案中，双链体区域的范围在长度上为15-30个、17至23个、19至23个和19至21个核苷酸对。发夹可具有单链悬突或末端未配对的区域。在某些实施方案中，悬突在长度上为2-3个核苷酸。在某些实施方案，悬突处于发夹的有义侧并且在某些实施方案中处于发夹的反义侧。
如本文中所使用的“双链siRNA化合物”为siRNA化合物，其包含超过1个，在某些情况下2个其中链间杂交可形成双链体结构的区域的链。
双链siRNA化合物的反义链在长度上可等于或为至少14、15、16、17、18、19、25、29、40或60个核苷酸。其在长度上可等于或少于200、100或50个核苷酸。范围在长度上可以为17至25个、19至23个和19至21个核苷酸。如本文中所使用的，术语“反义链”意指与靶分子例如靶RNA充分互补的siRNA化合物的链。
双链siRNA化合物的有义链可在长度上等于或为至少14、15、16、17、18、19、25、29、40或60个核苷酸。其在长度上可等于或少于200、100或50个核苷酸。范围在长度上可为17至25个、19至23个和19至21个核苷酸。
双链siRNA化合物的双链部分在长度上可等于或为至少14、15、16 17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40或60个核苷酸对。其在长度上可等于或少于200、100或50个核苷酸对。范围在长度上可为15-30、17至23、19至23和19至21个核苷酸对。
在许多实施方案中，siRNA化合物充分大，其可被内源分子例如被Dicer切割以产生更小的siRNA化合物，例如siRNA试剂。
可这样选择有义和反义链以便双链siRNA化合物在分子的一个或两个末端上包括单链或未配对区域。因此，双链siRNA化合物可包含这样的有义链和反义链，所述有义链和反义链经配对包含悬突，例如一个或两个5′或3′悬突，或1-3个核苷酸的3′悬突。悬突可以是一条链比另一条链长的结果，或两条相同长度的链交错的结果。某些实施方案可具有至少一个3′悬突。在一个实施方案中，siRNA分子的两个末端都可具有3′悬突。在某些实施方案，悬突为2个核苷酸。
在某些实施方案中，双链体区域的长度在长度上为15至30个核苷酸，或18、19、20、21、22和23个核苷酸，例如在上文中论述的ssiRNA化合物范围内。ssiRNA化合物在长度和结构上可与来自长dsiRNA的天然Dicer加工的产物相似。也包括其中将ssiRNA化合物的两条链连接，例如共价连接的实施方案中。发夹或提供需要的双链区域和3′悬突的其他单链结构也在本发明的范围内。
本文中描述的siRNA化合物，包括双链siRNA化合物和单链siRNA化合物，可介导靶RNA例如mRNA，例如编码蛋白质的基因的转录物的沉默。为方便起见，此类mRNA在本文中也称为待沉默的mRNA。这样的基因也被称为靶基因。一般地，待沉默的RNA是内源基因或病原体基因。此外，除了mRNA外的RNA，例如tRNA和病毒RNA也可作为靶点。
如本文中所使用的，短语“介导RNAi”是指以序列特异性的方式沉默靶RNA的能力。然而不希望受理论束缚，据认为沉默使用RNAi机制或过程和引导RNA例如21至23个核苷酸的ssiRNA化合物。
在一个实施方案中，siRNA化合物与靶RNA，例如靶mRNA“充分互补”，以便siRNA化合物沉默由靶mRNA编码的蛋白质的产生。在另一个实施方案中，siRNA化合物与靶RNA“完全互补”，例如，靶RNA与siRNA化合物黏着，例如以在完全互补的区域中形成完全由沃尔森-克里克碱基对组成的杂交体。“充分互补的”靶RNA可包括与靶RNA完全互补的内部区域(例如，至少10个核苷酸的区域)。此外，在某些实施方案中，siRNA化合物可明确区分单个核苷酸的差异。在该情况下，siRNA化合物只有当在单核苷酸差异的区域(例如，在其的7个核苷酸内)中发现完全互补才介导RNAi。
RNA干扰(RNAi)可用于特异性抑制靶多核苷酸的表达。可根据本发明，通过将dsRNA、siRNA或shRNA引入细胞或生物体来实现双链RNA介导的基因和核酸表达的抑制。SiRNA可以是双链RNA或包含RNA或DNA例如一条RNA链和一条DNA链的杂交分子。已显示siRNA至细胞的直接引入可在哺乳动物细胞中触发RNAi(Elshabir，S.M.等人Nature 411：494-498(2001))。此外，哺乳动物细胞中的抑制在RNA水平上发生并且特异于靶向基因，在RNA与蛋白质抑制之间存在强相关性(Caplen，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9746-9747(2001))。此外，已显示许多细胞系(包括HeLa S3、COS7、293、NIH/3T3、A549、HT-29、CHO-KI和MCF-7细胞)对一定水平的siRNA的沉默是易感的(Brown，D.等人TechNotes 9(1)：1-7，可在www.dot.ambion.dot.com/techlib/tn/91/912.html上的互联网上获得(9/1/02))。
可按照本领域内已知的方法容易地制备靶向特定多核苷酸的RNAi分子。已鉴定了有效siRNA分子的结构特征。Elshabir，S.M.等人(2001)Nature411：494-498和Elshabir，S.M.等人(2001)，EMBO 20：6877-6888。因此，本领域技术人员将理解可使用许多不同的siRNA分子靶向特定的基因或转录物。在某些实施方案中，根据本发明的siRNA分子是双链的并且在长度上为16-30或18-25个核苷酸，包括其间的每一个整数。在一个实施方案中，siRNA在长度上为21个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA具有为0-7个核苷酸的3′悬突或为0-4个核苷酸的5′悬突。在一个实施方案中，siRNA分子具有为2个核苷酸的3′悬突。在一个实施方案中，siRNA在长度上为21个核苷酸，具有2个核苷酸的3′悬突(即，它们在有义链和反义链之间包含19个核苷酸的互补区)。在某些实施方案中，悬突为UU或dTdT 3′悬突。
通常，siRNA分子与靶DNA分子的一条链完全互补，因为已显示即使单个碱基错配也减少沉默。在其他实施方案中，siRNA可具有修饰的主链成分，例如2′-脱氧-或2′-O-甲基修饰。然而，在优选实施方案中，siRNA的整个链不用2′脱氧或2′-O-修饰的碱基来制备。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含用于抑制基因在细胞中表达的载体的细胞。所述载体包含与编码本发明的dsRNA之一的至少一条链的核苷酸序列有效连接的调控序列。
在一个实施方案中，通过扫描靶mRNA转录物序列以确定AA二核苷酸序列的存在来选择siRNA靶位点。与邻近3′的约19个核苷酸组合的每一个AA二核苷酸序列是潜在的siRNA靶位点。在一个实施方案中，siRNA靶位点优选不位于5′和3′非翻译区(UTR)或起始密码子附近(约75个碱基内)的区域内，因为结合调控区的蛋白质可干扰siRNP内切核酸酶复合物的结合(Elshabir，S.等人Nature 411：494-498(2001)；Elshabir，S.等人EMBO J.20：6877-6888(2001))。此外，可将潜在的靶位点与适当的基因组数据库(例如可在www.ncbi.nlm上的NCBI服务器上获得的BLASTN 2.0.5)和与其他被消除的编码序列具有显著同源性的潜在靶序列相比较。
在具体的实施方案中，短发夹RNA构成本发明的核酸-脂质颗粒的核酸成分。短发夹RNA(shRNA)是能够序列特异性地减少靶基因的表达的发夹RNA的形式。短发夹RNA可在抑制基因表达方面提供优于siRNA的有利方面，因为它们在细胞环境中通常更稳定并且对降解不太易感。已确定此类短发夹RNA-介导的基因沉默在多种正常和癌细胞系和在哺乳动物细胞(包括小鼠和人细胞)中起作用。Paddison，P.等人，Genes Dev.16(8)：948-58(2002)。此外，已产生了具有编码工程shRNA的染色体基因的转基因细胞系。此类细胞能够组成性地合成shRNA，从而促进可传递至后代细胞的长效或组成性基因沉默。Paddison，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(3)：1443-1448(2002)。
ShRNA包含茎环结构。在某些实施方案中，它们可包含可变的茎长度，通常在长度上为19至29个核苷酸，或其间的任何数目。在某些实施方案中，发夹包含19至21个核苷酸的茎，然而在其他实施方案中，发夹包含27至29个核苷酸的茎。在某些实施方案中，环的大小在长度上为4至23个核苷酸，虽然环的大小可大于23个核苷酸而不会显著影响沉默活性。ShRNA分子可包含错配例如shRNA茎的两条链之间的G-U错配而不减少效能。事实上，在某些实施方案中，shRNA经设计在发夹茎中包含1个或若干个G-U配对以例如在细菌的增殖过程中稳定发夹。然而，结合靶mRNA(反义链)的茎的部分与mRNA之间的互补性通常是必需的，并且该区域中即使单个碱基对错配也可能消除沉默。5′和3′悬突不是必需的，因为它们对于shRNA的功能似乎不是至关重要的，虽然它们可存在(Paddison等人(2002)Genes & Dev.16(8)：948-58)。
微RNA
微RNA(miRNA)是一类高度保守的小RNA分子，所述小RNA分子从植物和动物的基因组中的DNA转录但不翻译成蛋白质。经加工的miRNA是约17-25个核苷酸(nt)的单链RNA分子，其可被整合入RNA-诱导的沉默复合体(RISC)并且已被鉴定为发育、细胞增殖、细胞凋亡和分化的关键调节剂。它们据认为通过结合特定mRNA的3′非翻译区在基因表达的调控中起作用。RISC通过翻译抑制、转录物切割或两者兼有介导基因表达的下调。RISC也在种类繁多的真核生物的细胞核中参与转录沉默。
迄今为止鉴定的miRNA序列的数目非常巨大并且在不断地增加，其示例性实例可见于例如：“miRBase：微RNA sequences，targets and genenomenclature”Griffiths-Jones S，GrocockRJ，van Dongen S，Bateman A，EnrightAJ.NAR，2006，34，Database Issue，D140-D144；“The microRNA Registry″Griffiths-Jones S.NAR，2004，32，Database Issue，D109-D111中；并且也见于microrna.dot.sanger.dot.ac.dot.uk/sequences/上的互联网上。
反义寡核苷酸
在一个实施方案中，核酸是针对靶多核苷酸的反义寡核苷酸。术语“反义寡核苷酸”或简单地“反义”意在包括与靶向多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸是与所选序列互补的DNA或RNA的单链。就反义RNA的而言，它们通过与其结合阻止互补RNA链的翻译。反义DNA可用于靶向特定的互补(编码或非编码)RNA。如果结合发生，那么该DNA/RNA杂交体可被酶RNA酶H降解。在具体的实施方案中，反义寡核苷酸包含约10至约50个核苷酸，更优选约15至约30个核苷酸。该术语还包括可以与所需的靶基因不完全互补的反义寡核苷酸。因此，可在其中对于反义未发现非靶特异性活性的情况下，或包含与靶序列的一个或多个错配的反义序列对于特殊应用是最优选的情况下使用本发明。
已证明反义寡核苷酸是蛋白质合成的有效靶向抑制剂，因此其可用于通过靶向基因特异性抑制蛋白质合成。反义寡核苷酸抑制蛋白质合成的功效已得到充分确定。例如，多聚半乳糖醛酸酶和毒蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们各自的mRNA序列的反义寡核苷酸抑制(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829)。此外，反义抑制的实例已由核蛋白细胞周期蛋白、多药抗性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择素、STK-1、纹状体GABAA受体和人EGF所证明(Jaskulski等人，Science.1988 Jun 10；240(4858)：1544-6；Vasanthakumar和Ahmed，Cancer Commun.1989；1(4)：225-32；Peris等人，Brain Res Mol BrainRes.1998 Jun 15；57(2)：310-20；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5,610,288)。此外，也已描述了抑制和可用于治疗多种异常细胞增殖例如癌症的反义构建体(美国专利5,747,470；美国专利5,591,317和美国专利5,783,683)。
生产反义寡核苷酸的方法在本领域内是已知的并且可容易地适应于生产靶向任何多核苷酸序列的反义寡核苷酸。特异于给定的靶序列的反义寡核苷酸序列的选择基于所选择的靶序列的分析和二级结构的确定、Tm、结合能和相对稳定性。可基于它们相对不能形成二聚体、发夹或其他二级结构来选择反义寡核苷酸，所述二聚体、发夹或其他二级结构在宿主细胞中可减弱或阻止与靶mRNA的特异性结合。mRNA的高度优选的靶区域包括在AUG翻译起始密码子处或其附近的那些区域和与mRNA的5′区域基本上互补的那些序列。可以通过例如使用OLIGO引物分析软件的第4版(Molecular BiologyInsights)和/或BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul等人，Nucleic Acids Res.1997，25(17)：3389-402)进行此类二级结构分析和靶位点选择的考虑。
Antagomirs
Antagomirs是RNA样寡核苷酸，其包含用于RNA酶保护和药物性质例如增强的组织和细胞摄入的各种修饰。它们与常见RNA的不同在于例如糖的完全2′-O-甲基化、硫代磷酸酯主链和例如3′-末端上的胆固醇部分。Antagomirs可用于通过形成包含antagomir和内源miRNA的双链体(从而阻止miRNA诱导的基因沉默)来有效地沉默内源miRNA。antagomir-介导的miRNA沉默的实例是Krutzfeldt等人，Nature，2005，438：685-689(其通过引用明确地整体并入本文)中描述的miR-122的沉默。Antagomir RNA可使用标准固相寡核苷酸合成方案来合成。参见第11/502,158和11/657,341号美国专利申请系列(其每一个的公开内容通过引用并入本文)。
Antagomir可包括配体缀合的单体单元和用于寡核苷酸合成的单体。示例性单体描述于2004年8月10日提交的第10/916,185号美国申请。Antagomir可具有ZXY结构，例如如2004年3月8日提交的第PCT/US2004/07070号PCT申请中描述的。可将antagomir与两亲性部分复合。与寡核苷酸试剂一起使用的示例性两亲性部分描述于2004年3月8日提交的第PCT/US2004/07070号PCT申请中。
适体
适体是以高亲和力和特异性结合特定目的分子的核酸或肽分子(Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)；Ellington和Szostak，Nature 346：818(1990))。已成功地生产了结合从大蛋白质至小有机分子的许多不同实体的DNA或RNA适体。参见，Eaton，Curr.Opin.Chem.Biol.1：10-16(1997)，Famulok，Curr.Opin.Struct.Biol.9：324-9(1999)以及Hermann和Patel，Science 287：820-5(2000)。适体可以是基于RNA或DNA的，并且可包括核糖开关(riboswitch)。核糖开关是可直接结合小靶分子并且其与靶的结合影响基因活性的mRNA分子的一部分。因此，取决于其靶核酸的存在或不存在，包含核开关的mRNA直接参与其自身活性的调节。通常，通过重复的循环的体外选择或等同地SELEX(指数富集配体系统进化)改造适体以结合多种分子靶例如小分子、蛋白质、核酸和甚至细胞、组织和生物体。适体可利用任何已知的方法(包括合成、重组和纯化方法)来制备，并且可单独使用或与其他特异于相同靶的适体组合使用。此外，如本文中更全面描述的，术语“适体”特别地包括包含通过比较两个或更多个已知的针对给定靶的适体而产生的共有序列的“二级适体(secondaryaptamer)”。
核酶
根据本发明的另一个实施方案，将核酸-脂质颗粒与核酶结合。核酶是拥有具有内切核酸酶活性的特定催化域的RNA-蛋白质复合体(Kim和Cech，ProcNatl Acad Sci USA.1987 Dec；84(24)：8788-92；Forster和Symons，Cell.1987 Apr24；49(2)：211-20)。例如，许多核酶以高度的特异性(通常只切割寡核苷酸底物的几个磷酸酯之一)加速磷酸酯转移反应(Cech等人，Cell.1981 Dec；27(3 Pt2)：487-96；Michel和Westhof，J Mol Biol.1990 Dec 5；216(3)：585-610；Reinhold-Hurek和Shub，Nature.1992 May 14；357(6374)：173-6)。该特异性已被归因于底物在化学反应之前通过特异性碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合的要求。
目前已知至少6个天然存在的酶促RNA的基本种类。每一个种类可在生理条件下反式催化RNA磷酸二酯键的水解(从而可切割其他RNA分子)。通常，酶促核酸通过首先结合靶NRA来起作用。此类结合可在整个保持与用于切割靶RNA的分子的酶促部分十分靠近的酶促核酸的靶结合部分上发生。因此，酶促核酸首先识别，随后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确的位点结合，发挥酶促切割靶RNA的作用。这样的靶RNA的策略切割将破坏其指导编码的蛋白质合成的能力。在酶促核酸已结合并且切割其RNA靶后，其从该RNA释放以寻找另一个靶并且可重复结合并且切割新靶。
酶促核酸分子可在例如锤头、发夹、丁型肝炎病毒、I组内含子或RNA酶P RNA(与RNA引导序列结合的)或链孢霉(Neurospora)VS RNA基序中形成。锤头基序列的具体实例由Rossi等人Nucleic Acids Res.1992 Sep 11；20(17)：4559-65描述。发夹基序的实例由Hampel等人(第EP 0360257号欧洲专利申请公布)，Hampel和Tritz，Biochemistry 1989 Jun 13；28(12)：4929-33；Hampel等人，Nucleic Acids Res.1990 Jan 25；18(2)：299-304和美国专利5,631,359描述。丁型肝炎病毒基序的实例由Perrotta和Been，Biochemistry.1992 Dec 1；31(47)：11843-52描述；RNA酶P基序的实例由Guerrier-Takada等人，Cell.1983 Dec；35(3 Pt 2)：849-57描述；链孢霉VS RNA核酶基序由Collins(Saville和Collins，Cell.1990 May 18；61(4)：685-96；Saville和Collins，Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct 1；88(19)：8826-30；Collins和Olive，Biochemistry.1993 Mar 23；32(11)：2795-9)描述；以及I组内含子的实例描述于美国专利4,987,071中。根据本发明使用的酶促核酸分子的重要特征是它们具有特定的底物结合位点(所述底物结合位点与一个或多个靶基因DNA或RNA区域互补)，并且它们在底物结合位点内或其周围具有赋予分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此核酶构建体不必限定于本文中提及的特定基序。
生产靶向任何多核苷酸序列的核酶的方法在本领域内是已知的。可如第WO 93/23569号国际专利申请公布和第WO 94/02595号国际专利申请公布(其各自明确地引用并入本文)中所述设计核酶，并且合成其以如本文中所描述的进行体外和体内测试。
可通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有修饰的核酶来优化核酶活性，所述修饰可阻止它们被血清核糖核酸酶降解(参见，例如，第WO 92/07065号国际专利申请公布；第WO 93/15187号国际专利申请公布；第WO 91/03162号国际专利申请公布；第92110298.4号欧洲专利申请公布；美国专利5,334,711；和第WO 94/13688号国际专利申请公布，所述专利申请公布和专利描述了可对酶促RNA分子的糖部分进行的多种化学修饰)、增强它们在细胞中的功效和除去茎II碱基以缩短RNA合成时间和减少化学药品需要。
适合用于本发明的组合物和方法的寡核苷酸(ODN)的另外的特定核酸序列描述于美国专利申请60/379,343、第09/649,527号美国专利申请系列、第WO 02/069369号国际公布、第WO 01/15726号国际公布、美国专利No.6,406,705和Raney等人，Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics，298：1185-1192(2001)中。在某些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的ODN具有磷酸二酯(″PO″)主链或硫代磷酸酯(″PS″)主链，和/或至少一个甲基化胞嘧啶存在于CpG基序中。
核酸修饰
在20世纪90年代，基于DNA的反义寡核苷酸(ODN)和核酶(RNA)代表了用于药物设计和开发的令人振奋的新范例，但它们的体内应用因内切和外切核酸酶活性以及缺乏成功的细胞内递送而受到阻碍。在对防止寡核苷酸(oligo)药物被核酸酶识别但不抑制它们的作用机制的化学修饰进行深入研究后，降解问题被有效克服。该研究如此成功以至当今开发的反义ODN药物目前在体内保持完整达数天，而未修饰的分子则只能保持几分钟(Kurreck，J.2003.Antisense technologies.Improvement through novel chemical modifications.Eur J Biochem 270：1628-44)。然而，细胞内递送和作用机制问题迄今仍限制反义ODN和核酶成为临床制品。
RNA双链体在本质上比单链DNA或RNA更耐核酸酶，并且与反义ODN不同，一旦未修饰的siRNA进入细胞质，它们就显示良好的活性。即便如此，但也已将开发用以稳定反义ODN和核酶的化学修饰系统地用于siRNA来确定化学修饰可被耐受的程度以及是否可增强药物代谢动力学和药效学的活性。由siRNA双链体产生的RNA干扰需要具有不同功能的反义和有义链。两条链都是使得siRNA能够进入RISC所必需的，但一旦载入，两条链分开并且有义链被降解，然而反义链保留以引导RISC靶向mRNA。进入RISC是结构上不如靶mRNA的识别和切割严格的过程。因此，有义链的许多不同化学修饰是可能的，但只有有限的变化被反义链耐受(Zhang等人，2006)。
如本领域中已知的，核苷是碱基-糖组合。核苷酸是还包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基的核苷。对于包含戊呋喃糖基糖的那些核苷，可将磷酸基连接至糖的2′、3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸中，磷酸基与相邻的核苷相互共价连接以形成线性多聚体化合物。反过来，还可将该线性多聚体结构的各末端连接起来以形成环状结构。在寡核苷酸结构内，磷酸基通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的常见连接或主链是3′至5′磷酸二酯键。
用于根据本发明的脂质-核酸颗粒的核酸包括已知的任何形式的核酸。因此，核酸可以是先前用于增强核酸酶抗性和血清稳定性的类型的修饰的核酸。然而，令人惊讶地，还可通过使用本发明的方法从核酸(其对天然核酸多聚体的磷酸二酯键没有修饰)配制脂质-核酸颗粒来制备可接受的治疗性产品，并且未修饰的磷酸二酯核酸(即其中所有键合都是磷酸二酯键合的核酸)的使用是本发明的优选实施方案。
主链修饰
用于本发明的反义、siRNA和其他寡核苷酸包括但不限于含有修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的主链的寡核苷酸包括主链上保留磷原子的和主链上不具有磷原子的那些寡核苷酸。在其核苷间主链上不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可被认为是寡核苷。修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、甲基膦酸酯或O-烷基磷酸三酯键合和具有正常3′-5′键合的硼烷磷酸酯及此类连接的2′-5′连接的类似物，以及其中相邻的核苷单元对以3′-5′对5′-3′或2′-5′对5′-2′连接的反极性的那些类似物。可存在于根据本发明的核酸中的特定修饰的特定非限制性实例示于表2中。
还包括多种盐、混合的盐和游离酸形式。教导上述键合的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361和5,625,050。
在某些实施方案中，在其中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子与烷基或环烷基核苷间键合或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的主链。此类主链包括例如具有吗啉代键(部分从核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基(methylene formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；含烯烃的主链；氨基磺酸盐主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2构成部分的其他主链。描述上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437和5,677,439。
硫代磷酸酯主链修饰(表3，#1)(其中磷酸二酯键中的非桥接氧被硫取代)是用来稳定核酸药物抗核酸酶降解的最早且最常用的方法之一。通常，似乎可对两条siRNA链广泛地进行PS修饰而对活性无明显影响(Kurreck，J.，Eur.J.Biochem.270：1628-44，2003)。然而，已知PS寡核苷酸与蛋白质非特异性紧密结合，从而导致毒性，特别在静脉内注射后。因此，PS修饰通常被限制在3′和5′末端上的1或2个碱基。硼烷磷酸酯连接子(表3，#2)是明显比PS更稳定的最新修饰，其增强siRNA活性并且具有低毒性(Hall等人，NucleicAcids Res.32：5991-6000，2004)。
表3.用于siRNA和其他核酸的化学修饰
其他有用的核酸衍生物包括其中桥氧原子(形成磷酸酯键合的桥氧原子)已被-S-、-NH-、-CH2-等取代的那些核酸分子。在某些实施方案中，所使用的对反义、siRNA或其他核酸的改变将不完全影响与核酸相关的负电荷。因此，本发明涉及其中部分键被例如中性甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键取代的反义、siRNA和其他核酸。当使用中性键时，在某些实施方案中，低于80％的核酸键被这样取代，或低于50％的键被这样取代。
碱基修饰
碱基修饰不如对主链和糖的修饰普遍。表3的3-6中显示的修饰全都显示使抗核酶的siRNA稳定并且对活性几乎无影响(Zhang，H.Y.，Du，Q.，Wahlestedt，C，Liang，Z.2006.RNA Interference with chemically modified siRNA.Curr Top Med Chem 6：893-900)。
因此，寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域内通常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如本文中使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
某些核碱基对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用，包括5-取代的嘧啶类、6-氮杂嘧啶类和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤类，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体的稳定性0.6-1.2℃。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，Antisense Research and Applications 1993，CRC Press，Boca Raton，第276-278页)。在具体的实施方案中，可将此类修饰与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合。教导此类修饰的核碱基中的某些核碱基以及其他修饰的核碱基的制备的美国专利包括但不限于上文中指出的美国专利No.3,687,808以及美国专利No.4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617和5,681,941。
糖修饰
糖基的大多数修饰发生在RNA糖环的2′-OH上，该位点提供了方便的化学反应位点(Manoharan，M.2004.RNA interference and chemically modifiedsmall interfering RNAs.Curr Opin Chem Biol 8：570-9；Zhang，H.Y.，Du，Q.，Wahlestedt，C，Liang，Z.2006.RNA Interference with chemically modified siRNA.Curr Top Med Chem 6：893-900)。2′-F和2′-OME(表3中的#7和8)是常见的并且两者都增强稳定性，2′-OME修饰不减弱活性，只要其被限制在少于4个核苷酸/链(Holen，T.，Amarzguioui，M.，Babaie，E.，Prydz，H.2003.Similarbehaviour of single-strand and double-strand siRNAs suggests they act through acommon RNAi pathway.Nucleic Acids Res 31：2401-7)。当修饰的碱基被限制在分子的中间区域时，2′-O-MOE(表3中的#9)在siRNA中是最有效的(Prakash，T.P.，Allerson，C.R.，Dande，P.，Vickers，T.A.，Sioufi，N.，Jarres，R.，Baker，B.F.，Swayze，E.E.，Griffey，R.H.，Bhat，B.2005.Positional effect of chemicalmodifications on short interference RNA activity in mammalian cells.J Med Chem48：4247-53)。经发现稳定siRNA而无活性损失的其他修饰示于表3中的#10-14中。
修饰的寡核苷酸可包含一个或多个取代的糖部分。例如，本发明包括在2′位置包含如下之一的寡核苷酸：OH；F；O-、S-或N-烷基、O-烷基-O-烷基、O-、S-或N-烯基或O-、S-或N-炔基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。其他优选的寡核苷酸在2′位置包含如下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药物代谢动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效性质的基团和具有相似性质的其他取代基。一种修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta 1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基。其他修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基，也称为2′-DMAOE和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(2′-DMAEOE)。
其他修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可在寡核苷酸的其他位置，特别是3′末端核苷酸上或2′-5′连接的寡核苷酸中的糖的3′位置上和5′末端核苷酸的5′位置上产生相似的修饰。寡核苷酸也可具有糖模拟物例如环丁基部分取代戊呋喃糖基糖。教导此类修饰的糖结构的制备的美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920。
在其他寡核苷酸模拟物中，核苷单位的糖和核苷间键即主链可用新型基团取代，虽然碱基单位保持与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已显示具有优良的杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-主链被包含酰胺的主链、特别是氨基乙基甘氨酸主链取代。核碱基得到保留并且直接或间接地连接至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331和5,719,262。PNA化合物的其他教导可见于Nielsen等人(Science，1991，254，1497-1500)中。
本发明的具体实施方案是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，特别是上述参考美国专利No.5,489,677的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯键表示为-O-P-O-CH2-)，和上述参考的美国专利No.5,602,240的酰胺主链。也优选的是具有上述参考的美国专利No.5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸。
糖部分还可包含一个或多个具有与核糖中对应的碳的立体化学构型相反的立体化学构型的碳。因此，寡核苷酸可包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。单体可在糖的1′位置上具有α键合，例如α-核苷类。寡核苷酸还可包含“无碱基”糖，其在C-1′上缺乏核碱基。此类无碱基糖还可进一步在一个或多个组成糖原子上包含修饰。寡核苷酸还可包含以L型存在的一个或多个糖，例如L-核苷。
嵌合寡核苷酸
不必对给定化合物的所有位置都进行均匀修饰，事实上，超过1个上述修饰可被整合在单个化合物中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷上。本发明的某些优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的说明书中，“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是包含2个或更多个化学上不同的区域(各自由至少一个核苷酸组成)的寡核苷酸。此类寡核苷酸通常包含修饰的核苷酸的至少一个区域(其赋予一种或多种有益性质(例如，增强的核酸酶抗性、增加的至细胞内的摄入、增加的对RNA靶的结合亲和力))和作为RNA酶H切割的底物的区域。
在一个实施方案中，嵌合寡核苷酸包含至少一个经修饰以增加靶结合亲和力的区域。寡核苷酸对于其靶的亲和力通过测量寡核苷酸/靶对的Tm(其为寡核苷酸与靶离解所处的温度)来常规地测定；可通过分光光度法检测离解。Tm越高，寡核苷酸对靶的亲和力越大。在一个实施方案中，经修饰以增加靶mRNA结合亲和力的寡核苷酸区域在糖的2′位置上包含至少一个修饰的核苷酸，最优选2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟-修饰的核苷酸。此类修饰可被常规地整合入寡核苷酸并且已显示针对给定的靶，此类寡核苷酸具有比2′-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶结合亲和力)。此类增加的亲和力的效应是大大增强寡核苷酸对靶基因表达的抑制。
在另一个实施方案中，嵌合寡核苷酸包含用作RNA酶H的底物的区域。当然，应当理解，寡核苷酸可包含本文中描述的各种修饰的任意组合。
本发明的寡核苷酸的另一个修饰包括将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入的一个或多个部分或缀合物化学连接至寡核苷酸。此类缀合物和制备其的方法在本领域内是已知的。
本领域技术人员将认识到，对于体内实用，例如治疗功效，合理的经验法则是如果序列的巯基化型以游离形式起作用，那么相同序列、任何化学药品的封装颗粒也是有效的。封装的颗粒也可具有更广阔的体内实用范围，在还未知会对反义疗法作其他反应的条件和模型中显示了功效。本领域技术人员了解，通过应用本发明，他们可发现现在对反义疗法作出反应的旧模型。此外，他们可再访被弃去的反义序列或化学药品并且通过应用本发明发现功效。
根据本发明使用的寡核苷酸可通过公知的固相合成的技术方便且常规地进行制备。用于这样的合成的设备由几个供应商(包括Applied Biosystems)出售。也可使用用于这样的合成的任何其他方法；寡核苷酸的实际合成完全在墨守成规者的能力之内。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物也是众所周知的。
免疫刺激性寡核苷酸
与本发明的脂质颗粒结合的核酸可以是免疫刺激性的，包括当给受治疗者施用时能够引发免疫应答的免疫刺激性寡核苷酸(ISS；单链或双链的)，所述受治疗者可以是哺乳动物或其他患者。ISS包括例如导致发夹二级结构的某些回文序列(参见Yamamoto S.等人(1992)J.Immunol.148：4072-4076)，或CpG基序以及其他已知的ISS特征(例如多-G结构域，参见WO 96/11266)。
免疫应答可以是先天性或适应性免疫应答。免疫系统被分成更具先天性的免疫系统和脊椎动物的获得的适应性免疫系统，其后者被进一步分成体液细胞组分。在具体的实施方案中，免疫应答可以是粘膜的。
在具体的实施方案中，免疫刺激性核酸只有当与脂质颗粒组合施用时才是免疫刺激性的，并且当以其“游离形式”施用时不是免疫刺激性的。根据本发明，这样的寡核苷酸被认为是免疫刺激性的。
免疫刺激性核酸，当不需要它们特异性结合靶多核苷酸并且减少靶多核苷酸的表达以引发免疫应答时，被认为是非序列特异性的。因此，某些免疫刺激性核酸可包含对应于天然存在的基因或mRNA的区域的序列，但它们仍然可被认为是非序列特异性免疫刺激性核酸。
在一个实施方案中，免疫刺激性核酸或寡核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸。寡核苷酸或CpG二核苷酸可以未被甲基化或可被甲基化。在另一个实施方案中，免疫刺激性核酸包含至少一个具有甲基化的胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个实施方案中，核酸包含单个CpG二核苷酸，其中所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶被甲基化。在特定的实施方案中，核酸包含序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′。在可选择的实施方案中，核酸包含至少2个CpG二核苷酸，其中至少一个CpG二核苷酸中的胞嘧啶被甲基化。在另一个实施方案中，存在序列中的CpG二核苷酸中的每一个胞嘧啶被甲基化。在另一个实施方案中，核酸包含多个CpG二核苷酸，其中所述CpG二核苷酸的至少一个包含甲基化的胞嘧啶。
在一个特定的实施方案中，核酸包含序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGT 3′。在另一个特定的实施方案中，核酸序列包含序列其中以粗体标示的2个胞嘧啶被甲基化。在具体的实施方案中，ODN选自由ODN #1、ODN #2、ODN #3、ODN#4、ODN #5、ODN #6、ODN #7、ODN #8和ODN #9组成的一组ODN，如下文中所示。
表4.示例性免疫刺激性寡核苷酸(ODN)
“Z”表示甲基化胞嘧啶残基。ODN 14为15-聚寡核苷酸并且ODN 1是具有添加在5′末端上使ODN 1成为16-mer的胸苷的相同寡核苷酸。未检测到ODN 14与ODN 1之间的生物活性差异，并且两者都展示相似的免疫刺激活性(Mui等人，2001)
适合用于本发明的组合物和方法的寡核苷酸(ODN)的另外的特定核酸序列描述于Raney等人，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，298：1185-1192(2001)中。在某些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的ODN具有磷酸二酯(″PO″)主链或硫代磷酸酯(″PS″)主链，和/或在CpG基序中具有至少一个甲基化的胞嘧啶。
诱饵寡核苷酸
因为转录因子可识别它们的相对短的结合序列(甚至在周围基因组DNA不存在的情况下)，所以具有特定转录因子的共有结合序列的短寡核苷酸可用作在活细胞中操作基因表达的工具。该策略包括此类“诱饵寡核苷酸”的细胞内递送，所述“诱饵寡核苷酸”随后被靶因子识别和结合。转录因子的DNA结合位点被诱饵占据使得转录因子随后不能与靶基因的启动子区域结合。诱饵可用作治疗剂，以抑制被转录因子激活的基因的表达，或上调通过转录因子的结合而被抑制的基因。诱饵寡核苷酸的应用的实例可见于Mann等人，J.Clin.Invest.，2000，106：1071-1075，所述文献通过引用明确地整体并入本文。
Supermir
Supermir是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或其修饰的单链、双链或部分双链的寡聚体或多聚体，其具有与miRNA基本上相同并且相对于其靶为反义的核苷酸序列。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间(主链)键组成，并且包含至少一个功能相似的非天然存在部分的寡核苷酸。所述修饰的或取代的寡核苷酸因由于所需的性质例如增强的细胞摄入、增强的对核酸靶的亲和力和在核酸酶存在的情况下增加的稳定性而优于天然形式。在优选实施方案中，supermir不包括有义链，并且在另一个优选实施方案中，supermir不会自我杂交至显著的程度。本发明中表征的supermir可具有二级结构，但其在生理条件下基本上是单链的。基本上为单链的supermir气单链程度为少于50％(例如，少于约40％、30％、20％、10％或5％)的supermir与其本身形成双链体。Supermir可以包含发夹区段，例如，序列，优选在3′末端上可自我杂交并且形成双链体区域，例如至少1、2、3或4个，优选少于8、7、6或n个核苷酸，例如5个核苷酸的双链体区域。双链化区域可通过连接子例如核苷酸连接子(例如，3、4、5或6个dT，例如修饰的dT)连接。在另一个实施方案中，supermir例如在supermir的3′和5′末端中的一个或两个末端上或在一个末端上和在非末端或中间与长度上为例如5、6、7、8、9或10个核苷酸的更短的寡聚物形成双链体。
miRNA模拟物
miRNA模拟物代表一类可用于模拟一个或多个miRNA的基因沉默能力的分子。因此，术语“微RNA模拟物”是指合成的非编码RNA(即，不通过从内源miRNA的来源纯化获得miRNA)，其能够进入RNAi途径并且调节基因表达。miRNA模拟物可被设计为成熟分子(例如，单链的)或模拟前体(例如，pri-或pre-miRNA)。miRNA模拟物可由包括寡核苷酸的核酸(修饰的或修饰的核酸)组成，所述核酸包含但不限于RNA、修饰的RNA、DNA、修饰的DNA、锁核酸或2′-O、4′-C-亚甲基-桥接核酸(ENA)或上述的任意组合(包括DNA-RNA杂交体)。此外，miRNA模拟物可包含可影响递送、细胞内区室化、稳定性、特异性、功能性、链应用和/或效能的缀合物。在一个设计中，miRNA模拟物是双链分子(例如，在长度上具有约16至约31个核苷酸的双链区域)并且包含与给定miRNA的成熟链具有同一性的一个或多个序列。修饰可在分子的一条或两条链上包含2′修饰(包括2′-O甲基修饰和2′F修饰)和核苷酸间修饰(例如硫代磷酸酯修饰)，所述修饰增强核酸稳定性和/或特异性。此外，miRNA模拟物可包含悬突。悬突可由任一链的3′或5′末端上的1-6个核苷酸组成并且可被修饰以增强稳定性或功能性。在一个实施方案中，miRNA模拟物包含16至31个核苷酸的双链体区域和一个或多个下列化学修饰模式：有义链包含核苷酸1和2(从有义寡核苷酸的5′末端开始计数)和全部C和U的2′-O-甲基修饰；反义链修饰可包含全部C和U的2′F修饰，寡核苷酸的5′末端的磷酸化和与2个核苷酸的3′悬突连接的稳定的核苷酸间键。
Antimir或miRNA抑制剂
术语“antimir”、“微RNA抑制剂”、“miR抑制剂”或“抑制剂”是同义的并且是指具有干扰特定miRNA的能力的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸。通常，抑制剂是天然的核酸或修饰的核酸，包括寡核苷酸，包括RNA、修饰的RNA、DNA、修饰的DNA、锁核酸(LNA)或上述的任意组合。修饰包括可影响递送、稳定性、特异性、细胞内区室化或效能的2′修饰(包括2′-O烷基修饰和2′F修饰)和核苷酸间修饰(例如，硫代磷酸酯修饰)。此外，miRNA抑制剂可包含可影响递送、细胞内区室化、稳定性和/或效能的缀合物。抑制剂可采用许多种构型，包括单链的、双链的(RNA/RNA或RNA/DNA双链体)和发夹设计，通常地，微RNA抑制剂包含与待靶向的miRNA的成熟链(或链)互补或部分互补的一个或多个序列或序列部分，此外，miRNA抑制剂还可包含位于作为成熟miRNA的反向互补序列的5′和3′上的额外序列。所述额外序列可以是与成熟miRNA所源自的pri-miRNA中的成熟mRNA相邻的序列的反向互补序列，或额外序列可以是任意序列(具有A、G、C或U的混合物)。在某些实施方案中，额外序列的一个或两个是能够形成发夹的任意序列。因此，在某些实施方案中，作为miRNA的反向互补序列的序列在5′侧上和在3′侧上侧翼连接有发夹结构。微-RNA抑制剂，当为双链时，可在相对链上的核苷酸之间包含错配。此外，可将微-RNA抑制剂连接至缀合物部分以促进抑制剂至细胞内的摄入。例如，可将微-RNA抑制剂连接至胆固醇基5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-3羟基戊基氨基甲酸酯)，其允许微-RNA抑制剂至细胞内的被动摄入。微-RNA抑制剂，包括发夹miRNA抑制剂，详细地描述于Vermeulen等人，“Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of PotentInhibitors of RISC Function”RNA 13：723-730(2007)以WO2007/095387和WO2008/036825(其各自通过引用整体并入本文)中。本领域技术人员可从数据库选择所需miRNA的序列并且设计用于本文中公开的方法的抑制剂。
U1接头
U1接头抑制polyA位点并且是具有与靶基因的末端外显子和′U1结构域′中的位点互补的靶结构域的双功能寡核苷酸，所述′U1结构域′结合U1 snRNP的U1更小的核RNA成分(Goraczniak，等人，2008，Nature Biotechnology，27(3)，257-263，所述参考文献通过引用明确地整体并入本文)。U1 snRNP是主要用于通过与前mRNA外显子-内含子边界结合来指导在剪接体形成过程中的早期步骤的核糖核蛋白复合体(Brown和Simpson，1998，Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol 49：77-95)。U1 snRNA碱基对的5′末端的核苷酸2-11结合前mRNA的5′单链。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸为U1接头。在一个实施方案中，可将U1接头与至少一种其他iRNA试剂组合施用。
寡核苷酸修饰
未修饰的寡核苷酸可能在某些应用中不是最适合的，例如，未修饰的寡核苷酸可易于被例如细胞核酸酶降解。核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。然而，寡核苷酸的化学修饰可赋予改善的性质，并且例如可使寡核苷酸对核酸酶更稳定。
由于寡核苷酸是亚单位或单体的聚合物，因此下文中描述的许多修饰可在寡核苷酸内重复的位置上进行，例如，碱基、糖、磷酸部分或磷酸部分的非桥接氧的修饰。对于给定的寡核苷酸中的所有位置不必均匀地修饰，事实上超过一个上述修饰可被整合在单个寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷上。
在某些情况下，修饰可在寡核苷酸的全部主体位置上发生，但在许多，事实上大多数情况下，其将不会发生。例如，修饰可能只在3′或5′末端位置上发生，可只在内部区域中发生，可只在末端区域中例如在末端核苷酸上的位置上或在寡核苷酸的最后2、3、4、5或10个核苷酸中发生。修饰可在双链区域、单链区域或两者中发生。
修饰可只在双链寡核苷酸的双链区域中发生或可只在双链寡核苷酸的单链区域中发生。例如，非桥接氧位置上的硫代磷酸酯修饰可只在一个或两个末端上发生，可只在末端区域(例如在末端核苷酸上的位置上或在一个链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中)发生，或可在双链和单链区域中，特别在末端上发生。5′末端可被磷酸化。
本文中描述的修饰可以是唯一修饰，或包含在多个核苷酸上的唯一类型的修饰，或可将修饰与本文中描述的一个或多个其他修饰组合。本文中描述的修饰还可被组合入寡核苷酸，例如寡核苷酸的不同核苷酸具有本文中描述的不同修饰。
在某些实施方案中，特别地优选地是例如增强稳定性，在悬突中包含特殊的核碱基，或在单链悬突中(例如在5′或3′悬突中，或两者中)包含修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可能需要在悬突中包含嘌呤核苷酸。在某些实施方案中，可以例如用本文中描述的修饰来修饰3′或5′悬突中的全部或一些碱基。修饰可包括例如，核糖的2′OH基上的修饰的使用，例如脱氧核糖核苷酸例如脱氧胸苷替代核糖核苷酸的使用，以及磷酸基中的修饰，例如硫代硫酸酯修饰。悬突不必与靶序列同源。
具体修饰在下文中更详细地论述。
磷酸基
磷酸基是带负电荷的种类。电荷均匀地分布在两个非桥接氧原子上。然而，磷酸基可通过用不同的取代基取代所述氧之一来进行修饰。对RNA磷酸主链的该修饰的一个结果可以是增加的寡核糖核苷酸对核水解降解的抗性。因此不希望受理论束缚，在某些实施方案中可能需要引入导致不带电荷的连接子或具有非对称电荷分布的带电荷的连接子的改变。
修饰的磷酸基的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在某些实施方案中，磷酸主链部分中非桥接磷酸氧原子之一可被任何下列基团取代：S、Se、BR3(R为氢、烷基、芳基)、C(即烷基、芳基等)、H、NR2(R为氢、烷基、芳基)或OR(R为烷基或芳基)。未修饰的磷酸基中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子的组之一取代非桥接氧之一使得磷原子能够成为手性的；换句话说，以该方式修饰的磷酸基的磷原子是同分异构中心(stereogeniccenter)。同分异构磷原子可具有″R″构型(在本文中为Rp)或″S″构型(在本文中为Sp)。
二硫代磷酸酯的两个非桥接氧被硫取代。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，其排除了寡核糖核苷酸非对映体的形成。因此，不希望受理论束缚，对两个非桥接氧的修饰消除了手性中心，例如二硫代磷酸酯构造可以是合适的，因为它们不能产生非对映体混合物。因此，非桥接氧可以独立地为S、Se、B、C、H、N或OR(R为烷基或芳基)之一。
还可通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)，硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)取代桥接氧(即将磷酸连接至核苷的氧)来修饰磷酸连接子。取代可在任一连接氧或或两个连接氧上发生。当桥接氧为核苷的3′-氧时，利用碳的取代是优选的。当桥接氧为核苷的5′-氧时，利用氮的取代是优选的
磷酸基的取代
磷酸基可被非含磷连接子取代。然而不希望受理论束缚，据认为，由于带电荷的磷酸二酯基团是核溶解性降解中的反应中心，因此其被中性结构模拟物的取代应当赋予增强的核酸酶稳定性。再次地，然而不希望受理论束缚，但在某些实施方案中，希望引入其中带电荷的磷酸基被中性部分取代的改变。
可取代磷酸基的部分的实例包括膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷连接子、磺酸酯、磺酰胺、硫代醛基(thioformacetal)、醛基(formacetal)、肟、亚甲基亚胺基、亚甲基甲基亚胺基、亚甲基肼撑、亚甲基二甲基肼撑和亚甲基氧甲基亚胺基。优选取代包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
其中至少一个连接至磷酸的氧已被取代或磷酸基已被非磷基团取代的修饰的磷酸键合也称为“非磷酸二酯主链键合”。
核糖磷酸(Ribophosphate)主链的取代
还可构建寡核苷酸模拟支架，其中磷酸连接子和核糖被抗核酸酶的核苷或核苷酸取代物取代。然而不希望受理论束缚，据认为重复带电荷的主链的不存在消除了对识别聚阴离子的蛋白质(例如，核酸酶)的结合。再次地，不希望受理论束缚，在某些实施方案中可能希望引入其中碱基被中性取代主链连接的改变。实例包括吗啉代(mophilino)、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷取代物。优选取代物为PNA取代物。
末端修饰
可修饰寡核苷酸的3′和5′末端。此类修饰可以在分子的3′末端、5′末端或两端上。它们可包括整个末端磷酸或磷酸基的一个或多个原子的修饰或取代。例如，可将寡核苷酸的3′和5′末端缀合至其他功能分子实体例如标记部分，例如荧光基团(例如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(基于例如硫、硅、硼或酯)。可将功能分子实体通过磷酸基和/或连接子连接至糖。连接子的末端原子可连接至或取代磷酸基的连接原子或糖的C-3′或C-5′O、N、S或C基团。可选地，连接子可连接至或取代核苷酸取代物(例如，PNA)的末端原子。
当连接子/磷酸-功能分子实体-连接子/磷酸阵列插入dsRNA的双链之间时，该阵列可取代发夹型RNA试剂中的发夹RNA环。
用于调节活性的末端修饰包括利用磷酸或磷酸类似物的5′末端的修饰例如，在优选实施方案中，dsRNA的反义链被5′磷酸化或在5′引物末端上包含磷酰基类似物。5′-磷酸基修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的修饰。适当的修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)以及任何修饰的或非修饰的核苷酸帽结构(N-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5′-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)、5′-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5′)；氧/硫取代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其他组合(例如，5′-α-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5′、(HO)(NH2)(O)P-O-5′)、5′-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-、(OH)2(O)P-5′-CH2-)、5′-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-)。
末端修饰还可用于监控分布，并且在这样的情况下待加入的优选基团包括荧光基团，例如荧光素或Alexa染料，例如Alexa 488。末端修饰还可用于增强摄入，为了该目的有用修饰包括胆固醇。末端修饰还可用于将RNA试剂交联至另一个部分；用于该目的修饰包括丝裂霉素C。
核碱基
腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中发现的最常见的碱基。可修饰或取代这些碱基以提供具有改善的性质的RNA。例如，可利用这些碱基或利用合成和天然核碱基(例如，肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟嘌呤核苷或杀结核菌素)和上述修饰之任一个来制备抗核酸酶的寡核苷酸。可选地，可使用任何上述碱基的取代的或修饰的类似物，例如本文中描述的“稀有碱基”、“修饰碱基”、“非天然碱基”和“通用碱基”。实例包括但不限于2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤代、氨基、巯基、硫烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶类、6-氮杂嘧啶类和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤类(包括2-氨基丙基腺嘌呤)、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、N6，N6-二甲基腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1，2，4-三唑类、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-乙酰基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化碱基。其他嘌呤类和嘧啶类包括美国专利No.3,687,808中公开的嘌呤类和嘧啶类，ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz，J.I.编辑John Wiley & Sons，1990中公开的嘌呤类和嘧啶类，以及由Englisch等人，Angewandte Chemie，国际版，1991，30，613公开的嘌呤类和嘧啶类。
阳离子基团
对寡核苷酸的修饰还可包括一个或多个阳离子基团至糖、碱基和/或磷原子的连接，所述磷原子为磷酸或修饰的磷酸主链部分的磷原子。可将阳离子基团连接至能够在天然、稀有或通用碱基上取代的任何原子。优选位置是不干扰杂交，即不干扰碱基配对所必需的氢键相互作用的位置。可以例如通过环状或非环糖取代物中糖的C2′位置或类似位置连接阳离子基团。阳离子基团可包括例如质子化的氨基，其衍生自例如O-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)；氨基烷氧基，例如O(CH2)nAMINE、(例如，AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)；氨基(例如，NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；或NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)。
寡核苷酸内的连接方式
可将某些修饰优选地在特定的位置上(例如在链的内部位置或寡核苷酸的5′或3′末端上)包含于寡核苷酸中。寡核苷酸上修饰的优选位置可对试剂赋予优选性质。例如，特定修饰的优选位置可赋予最佳基因沉默性质，或增加的对内切核酸酶或外切核酸酶活性的抗性。
寡核苷酸的一个或多核苷酸可具有2′-5′键合。寡核苷酸的一个或多个核苷酸可具反向键合，例如3′-3′、5′-5′、2′-2′或2′-3′键合。
双链寡核苷酸可包含至少一个5′-尿苷-腺嘌呤-3′(5′-UA-3′)二核苷酸，其中尿苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-尿苷-鸟嘌呤-3′(5′-UG-3′)二核苷酸，其中5′-尿苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-胞苷-腺嘌呤-3′(5′-CA-3′)二核苷酸，其中5′-胞苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-尿苷-尿苷-3′(5′-UU-3′)二核苷酸，其中5′-尿苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-胞苷-胞苷-3′(5′-CC-3′)二核苷酸，其中5′-胞苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-胞苷-尿苷-3′(5′-CU-3′)二核苷酸，其中5′-胞苷为2′-修饰的核苷酸，或末端5′-尿苷-胞苷-3′(5′-UC-3′)二核苷酸，其中5′-尿苷为2′-修饰的核苷酸。包括此类修饰的双链寡核苷酸针对内切核酸酶活性特别稳定。
一般参考文献
根据本发明使用的寡核糖核苷酸和寡核糖核苷可使用固相合成法合成，参见例如“Oligonucleotide synthesis，a practical approach”，编者M.J.Gait，IRLPress，1984；″Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach″，Ed.F.Eckstein，IRL Press，1991(特别是第1章，寡脱氧核糖核苷酸合成的现代机器辅助法，第2章，寡核糖核苷酸合成，第3章，2′-O-甲基寡核糖核苷酸-s：合成和应用，第4章，硫代磷酸酯寡核苷酸，第5章，寡核苷酸二硫代磷酸酯的合成，第6章，寡聚-2′-脱氧核糖核苷甲基膦酸酯的合成，和第7章，包含修饰的碱基的寡脱氧核糖核苷酸。其他特别有用的合成方法、试剂、封闭基团和反应条件描述于Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，1992，48，2223-2311以及Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron，1993，49，6123-6194，或本文中提及的参考文献中。本文中可使用WO 00/44895、WO01/75164或WO02/44321中描述的修饰。将本文中所列的全部公布、专利和公布的专利申请的公开内容通过引用并入本文。
磷酸基参考文献
亚膦酸酯寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.5,508,270中。烷基膦酸酯寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.4,469,863中。亚磷酰胺寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.5,256,775或美国专利No.5,366,878。磷酸三酯寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.5,023,243中。硼烷磷酸酯寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.5,130,302和5,177,198中。3′-脱氧-3′-氨基氨基磷酸酯寡核糖核苷酸的制备描述于美国专利No.5,476,925中。3′-脱氧-3′-亚甲基膦酸酯寡核糖核苷酸描述于An，H等人J.Org.Chem.2001，66，2789-2801中。硫桥接的核苷酸的制备描述于Sproat等人NucleosidesNucleotides 1988，7，651和Crosstick等人Tetrahedron Lett.1989，30，4693中。
糖基参考文献
对2′修饰的修饰可见于Verma，S.等人Annu.Rev.Biochem.1998，67，99-134和本文中所有参考文献。对核糖的特殊修饰可见于下列参考文献中：2′-氟(Kawasaki等人，J.Med.Chem.，1993，36，831-841)、2′-MOE(Martin，P.Helv.Chim.Acta 1996，79，1930-1938)、″LNA″(Wengel，J.Ace.Chem.Res.1999，32，301-310)。
磷酸基的取代的参考文献
亚甲基甲基亚胺基连接的寡核糖核苷，在本文中也鉴定为MMI连接的寡核糖核苷，亚甲基二甲基肼撑连接的寡核糖核苷，在本文中也被鉴定为MDH连接的寡核糖核苷，且亚甲基羰基氨基连接的寡核苷，在本文中也被鉴定为酰胺-3连接的寡核糖核苷，且亚甲基氨基羰基连接的寡核苷，在本文中也被鉴定为酰胺-4连接的寡核糖核苷，以及具有例如交替的MMI和PO或PS键的混合主链化合物可如美国专利No.5,378,825、5,386,023、5,489,677和公布的PCT申请PCT/US92/04294和PCT/US92/04305(分别公布为WO 92/20822和WO 92/20823)中所述进行制备。醛基(Formacetal)和硫代醛基(thioformacetal)连接的寡核糖核苷可如美国专利No.5,264,562和5,264,564中所述进行制备。环氧乙烷连接的寡核糖核苷可如美国专利No.5,223,618中所述进行制备。硅氧烷取代描述于CormierJ.F.等人Nucleic Acids Res.1988，16，4583中。碳酸酯取代描述于Tittensor，J.R.J.Chem.Soc.C 1971，1933中。羧甲基取代描述于Edge，M.D.等人J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 1972，1991中。氨基甲酸酯取代描述于Stirchak，E.P.Nucleic Acids Res.1989，17，6129中。
磷酸-核糖主链的取代的参考文献
环丁基糖取代化合物可如美国专利No.5,359,044中所述进行制备。吡咯烷糖取代物可如美国专利No.5,519,134中所述进行制备。吗啉代糖取代物可如美国专利No.5,142,047和5,235,033以及其他相关专利公开内容中所述进行制备。肽核酸(PNA)本身是已知的并且可按照Peptide Nucleic Acids(PNA)：Synthesis，Properties and Potential Applications，Bioorganic & MedicinalChemistry，1996，4，5-23中提及的多种方法中的任何方法来制备。还可根据美国专利No.5,539,083制备它们。
末端修饰的参考文献
末端修饰描述于Manoharan，M.等人Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment 12，103-128(2002)和其中的参考文献中。
核碱基的参考文献
N-2取代的嘌呤核苷amidite可如美国专利No.5,459,255中所述进行制备。3-脱氮嘌呤核苷amidite可如美国专利No.5,457,191中所述进行配制。5，6-取代的嘧啶核苷amidite可如美国专利No.5,614,617中所述进行制备。5-丙炔基嘧啶核苷amidite可如美国专利No.5,484,908中所述进行制备。
连接子
术语“连接子”意指连接化合物的两个部分的有机部分。连接子通常包括直接键或原子例如氧或硫、单元例如NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子的链例如取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂环芳基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、可切割的连接基团、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环中断或终结；其中R1为氢、酰基、脂族或取代的脂族基团。
在一个实施方案中，连接子是-[(P-Q-R)q-X-(P′-Q′-R′)q′]q″-T-，其中：P、R、T、P′、R′和T对于每一次出现各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O；NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CH＝N-O、
或杂环基；
Q和Q′对于每一次出现各自独立地为不存在、-(CH2)n-、-C(R1)(R2)(CH2)n-、-(CH2)nC(R1)(R2)-、-(CH2CH2O)mCH2CH2-或-(CH2CH2O)mCH2CH2NH-；
X不存在或为可切割的连接基团；
Ra为H或氨基酸侧链；
R1和R2对于每一次出现各自独立地为H、CH3、OH、SH或N(RN)2；
RN对于每一次出现独特地为H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或苄基；
q、q′和q″对于每一次出现各自独立地为0-20并且其中重复单元可相同或不同；
n对于每一次出现独立地为1-20；和
m对于每一次出现独立地为0-50。
在一个实施方案中，连接子包含至少一个可切割的连接基团。
在某些实施方案中，连接子是分支连接子(branched linker)。分支连接子的分支点可以是至少3价，但可以是四价、五价或六价原子或提供这样的多个化合价的基团。在某些实施方案中，分支点为-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q对于每一次出现独立地为H或任选取代的烷基。在其他实施方案中，分支点为甘油或甘油衍生物。
可切割的连接基团
可切割的连接基团是在细胞外足够稳定，但在进入靶细胞后被切割以释放被连接子结合在一起的两个部分的连接基团。在优选实施方案中，可切割的连接基团在靶细胞中或在第一参照条件(所述条件可以例如被选择用以模拟或代表细胞内环境)下被切割的速度比在受治疗者的血液中或在第二参照条件下(所述条件可以例如被选择用以模拟或代表血液或血清中发现的条件)快至少10倍或更多倍，优选至少100倍。
可切割的连接基团对切割因子例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在易感。通常，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍存在或以更高的水平或活性发现于细胞内。此类降解试剂的实例包括：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂例如硫醇，其可通过还原降解可氧化还原可切割的连接基团；酯酶类；内体或可产生酸性环境的试剂，例如导致pH为5或更低的试剂；可通过用作广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割的连接基团的酶。
可切割的连接基团例如二硫键可以对pH易感。人血清的pH为7.4，然而平均细胞内pH略微更低，在约7.1至7.3的范围内变化。内体具有在5.5-6.0的范围内的更酸的pH，溶酶体具有甚至更酸的pH，为约5.0。某些连接子可具有可切割的连接基团，其在优选pH下被切割，从而从细胞内的配体释放阳离子脂质或将其释放进入所需的细胞区室。
连接子可包括可被特定酶切割的可切割的连接基团。掺入连接子的可切割的连接基团的类型可视待靶向的细胞而定。例如，可通过包含酯基团的连接子将肝靶向配体与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，从而连接子在肝细胞内将比在酯酶不丰富的细胞类型中更有效地被切割。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
靶向富含肽酶的细胞类型例如肝细胞和滑膜细胞时，可使用包含肽键的连接子。
一般地，候选可切割的连接基团的适合性可通过测试降解试剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估。还期望也测试候选可切割的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抗切割的能力。因此可测定第一与第二条件之间对切割的相对易感性，其中所述第一条件被选择用以表示靶细胞中的切割并且所述第二条件被选择用以表示其他组织或生物液体例如血液或血清中的切割。可在无细胞系统中、细胞中、细胞培养物中、器官或组织培养物中或在完整动物中进行评估。在无细胞或培养条件中进行初步评估，然后通过在完整动物中进一步评估来进行确认可能是有用的。在优选实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以用模拟细胞内条件的体外条件下)被切割的速度比在血液或血清中(或在被选择用以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少2、4、10或100倍。
氧化还原可切割的连接基团
一类可切割的连接基团是氧化还原可切割的连接基团，它们由于还原或氧化被切割。可还原切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割的连接基团是否是适当的“可还原切割的连接基团”或例如适合与特定的iRNA部分和特定的靶向试剂一起使用，可求助于本文中描述的方法。例如，可使用本领域已知的试剂，通过将候选物与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起温育来评估候选剂，这模拟可在细胞例如靶细胞中观察到的切割速度。还可在被选择用以模拟血液或血清条件的条件下评估候选物。在优选实施方案中，候选化合物在血液中被切割至多10％。在优选实施方案中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择用以模拟细胞内条件的体外条件下)被降解的速度比在血液(或在被选择用以模拟细胞外条件的体外条件下)中快至少2、4、10或100倍。可在被选择用以模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学测定法测定候选化合物的切割速率并且将其与被选择以用模拟细胞外介质的条件相比较。
基于磷酸的可切割的连接基团
基于磷酸的可切割的连接基团被降解或水解磷酸基的试剂切割。在细胞中切割磷酸基的试剂的实例为细胞中的酶例如磷酸酶。基于磷酸的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选实施方案为-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选实施方案为-O-P(O)(OH)-O-。可使用与上文中描述的方法类似的方法评估此类候选物。
酸可切割的连接基团
酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在优选实施方案中，酸可切割的连接基团在具有pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中被切割，或被可用作广义酸的试剂例如酶切割。在细胞中，特定的低pH细胞器例如内体和溶酶体可提供酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙类、酯类和氨基酸的酯类。酸可切割的基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。当碳被连接至酯的氧(烷氧基)时，优选实施方案为芳基、取代的烷基或叔烷基例如二甲基戊基或叔-丁基。可使用与上文中描述的方法类似的方法评估此类候选物。
基于酯的连接基团
基于酯的可切割的连接基团被细胞中的酶例如酯酶类和酰胺酶类切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于烯烃基(alkylene)、亚烯基和亚炔基的酯类。酯可切割的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此类候选物可使用与上文中描述的方法类似的方法来评估。
基于肽的切割基团
基于肽的可切割的连接基团被细胞中的酶例如肽酶类和蛋白酶类切割。基于肽的可切割的连接基团是氨基酸之间形成的产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可形成于任何烯烃基、亚烯基或亚炔基之间。肽键是氨基酸之间形成的产生肽和蛋白质的酰胺键的特殊类型。基于肽的可切割的基团通常限定于氨基酸之间形成的产生肽和蛋白质的肽键(即，酰胺键)并且不包括完整的酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基。可使用与上文中描述的方法类似的方法评估此类候选物。
配体
可将许多种实体偶联至本发明的寡核苷酸和脂质。优选的部分为偶联的配体，所述偶联优选直接共价或通过间插系链(intervening tether)间接共价。
在优选实施方案中，配体改变被整合入其中的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施方案中，配体对所选择的靶(例如分子、细胞或细胞类型、区域例如细胞或器官区室、组织或器官或身体的区域)提供增强的亲和力，比如与缺乏这样的配体的种类相比较。对于所选择的靶提供增强的亲和力的配体也称为靶向配体。用于缀合至本发明的脂质的优选的配体是靶向配体。
某些配体可具有溶内体(endosomolytic)性质。溶内体(endosomolytic)配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其成分从细胞的内体至细胞质的转运。溶内体(endosomolytic)配体可以是显示pH依赖的(pH-dependent)膜活性和致融性(fusogenicity)的聚阴离子肽或肽模拟物。在某些实施方案中，溶内体(endosomolytic)配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中溶内体(endosomolytic)配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其成分从细胞的内体至细胞质的转运的构象。示例性溶内体(endosomolytic)配体包括GALA肽(Subbarao等人，Biochemistry，1987，26：2964-2972)、EALA肽(Vogel等人，J.Am.Chem.Soc，1996，118：1581-1586)和它们的衍生物(Turk等人，Biochem.Biophys.Acta，2002，1559：56-68)。在某些实施方案中，溶内体(endosomolytic)成分可包含化学基团(例如，氨基酸)，该化学基团将响应pH的变化而经历电荷或质子化的改变。溶内体(endosomolytic)成分可以是线性的或分支的。基于肽的溶内体(endosomolytic)配体的示例性一级序列示于表5中。
表5：具有溶内体活性的肽的列表。
n，正亮氨酸
参考文献
1.Subbarao等人，Biochemistry，1987，26：2964-2972.
2.Vogel等人，J.Am.Chem.Soc，1996，118：1581-1586
3.Turk，M.J.，Reddy，J.A.等人(2002).Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhancesdrug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs.Biochim.Biophys.Acta 1559，56-68.
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5.Mastrobattista，E.，Koning，G.A.等人(2002).Functional characterization of an endosome-disruptivepeptide and its application in cytosolic delivery of immunoliposome-entrapped proteins.J.Biol.Chem.277，27135-43.
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优选配体可改善转运、杂交和特异性性质并且也可改善所获得的天然或修饰的寡核糖核苷酸或包含本文中描述的单体和/或天然或修饰的核糖核苷酸的任意组合的聚合物分子的核酸酶抗性。
配体一般可包括治疗性调节剂，例如用于增加摄入；诊断性化合物或信息基团例如，用于监控分布；交联剂；和赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、聚胺类和肽模拟物。
配体可包括天然存在的物质例如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉(pullulan)、壳多糖、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物例如，合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如，适体)。聚氨基酸的实例包括为聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸的聚氨基酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、(L-丙交酯-乙交酯)共聚物、乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或或聚磷腈。聚胺类的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树状聚胺(dendrimerpolyamine)、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季铵盐或α螺旋肽。
配体还可包括靶向基团，例如细胞或组织靶向试剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体，所述试剂结合特定细胞类型例如肾细胞。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素细胞激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。表6显示靶向配体和它们的相关受体的某些实例。
表6：靶向配体和它们的相关受体
配体的其他实例包括染料、嵌入试剂(例如吖啶类)、交联剂(例如psoralene、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳香烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人造内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂分子例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸(adamantane acetic acid)、1-芘丁酸、双氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、牻牛儿基氧己基、十六烷基甘油、龙脑、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如，触角足(antennapedia)肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运促进剂/吸收促进剂(absorption facilitator)(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白或肽，例如，对于协同配体(co-ligand)具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合指定的细胞类型例如癌细胞、内皮细胞或骨细胞的抗体。配体还可包括激素和激素受体。它们还可包括非肽种类例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖或适体(aptamers)。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，所述物质可通过例如通过破坏细胞骨架(例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间纤维)来增加iRNA试剂至细胞内的摄入的物质。所述药物可以是例如taxon、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林(latrunculin)A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine或myoservin。
配体可以例如通过激活炎症应答增加iRNA试剂至细胞内的摄入。可具有这样的效应的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNF α)、白细胞介素-1β或γ干扰素。
在一个方面，配体是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。HAS结合配体允许缀合物(conjugate)至靶组织，例如身体的非肾靶组织的分布。例如，靶组织可以是肝，包括肝的实质细胞。可结合HAS的其他分子也可用作配体。例如，可使用萘普生或阿斯匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)增加缀合物(conjugate)对降解的抗性，(b)增加靶向或至靶细胞或细胞膜内的转运，和/或(c)可用于调节与血清蛋白质例如HAS的结合。
基于脂质的配体可用于调节，例如控制缀合物(conjugate)至靶组织的结合。例如，更强地结合HAS的脂质或基于脂质的配体将不太可能被靶向肾，从而不太可能从身体清除。不太强地结合HAS的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物(conjugate)靶向肾。
在优选实施方案中，基于脂质的配体结合HAS。优选地，其以充足的亲和力结合HAS以便缀合物(conjugate)可被优选地分配至非肾组织。然而，优选地，亲和力未强到不能逆转HAS-配体结合的程度。
在另一个优选实施方案中，基于脂质的配体微弱地结合或根本不结合HAS，以便缀合物(conjugate)可被优选地分配至肾。靶向肾细胞的其他部分也可用于取代基于脂质的配体，或除了基于脂质的配体外，还可使用所述部分。
在另一个方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞吸收的部分例如维生素。此类配体对于治疗特征在于不希望的细胞增殖例如，恶性或非恶性类型例如癌细胞的增殖的障碍是特别有用的。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被癌细胞吸收的其他维生素或营养物。还包括的是HAS、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。
在另一个方面，配体是细胞-渗透剂，优选螺旋细胞-渗透剂。优选，试剂是两性的。示例性试剂是肽例如tat或触角足蛋白(antennopedia)。如果试剂是肽，那么其可被修饰，包括肽模拟物、invertomer、非肽或假肽键合以及使用D-氨基酸。螺旋试剂优选为α螺旋试剂，其优选具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡聚肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的确定的三维结构的分子。肽或肽模拟物部分可以为约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长(参见表7，例如)。
表7.示例性细胞穿透肽。
肽或肽模拟物可以是例如细胞穿透肽(cell permeation peptide)、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树枝状肽(dendrimer peptide)、限制性肽(constrained peptide)或交联肽(crosslinkedpeptide)。在另一个备选方案中，肽部分可包括疏水性膜转位序列(MTS)。示例性疏水的含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP的RFGF。含有疏水MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP)也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可运送大极性分子包括肽、寡核苷酸和蛋白质穿过细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列能够用作递送肽。肽或肽模拟物可由DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库鉴定的肽(Lam等人，Nature，354：82-84，1991)。优选地，通过合并的单体单元(incorporated monomer unit)连接至iRNA试剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分在长度上可在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内变化。肽部分可具有结构修饰(，以致增加稳定性或直接构象性质(direct conformational properties)。可利用下文中描述的任何结构修饰。
RGD肽部分可用于靶向肿瘤细胞例如内皮肤细胞瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann等人，Cancer Res.，62：5139-43，2002)。RGD肽可促进iRNA试剂至多种其他组织包(括肺、肾、脾或肝)的肿瘤的靶向(Aoki等人，Cancer GeneTherapy 8：783-787，2001)。优选，RGD肽将促进iRNA试剂至肾的靶向。RGD肽可以是线性的或环状的，并且可被修饰，例如糖基化或甲基化以促进至特定组织的靶向。例如，糖基化RGD肽可将iRNA试剂递送至表达αvβ3的肿瘤细胞(Haubner等人，Jour.Nucl.Med.，42：326-336，2001)。
可使用靶向标记的肽，该标记在正在增殖的细胞中富集。例如，包含肽和肽模拟物的RGD可靶向癌细胞，特别是展示αvβ3整联蛋白的细胞。因此，可使用RGD肽、含RGD的环肽、包含D-氨基酸的RGD肽以及合成RGD模拟物。除了RGD外，可使用靶向αvβ3整联蛋白配体的其他部分。通常，此类配体可用于控制正在增殖的细胞和血管新生(angiogeneis)。靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因(例如本文中描述的癌基因)的该类型配体的优选缀合物(conjugates)。
“细胞穿透肽”能够穿过细胞，例如微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞例如人细胞。微生物细胞穿透肽可以是例如α螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin PI)、含二硫键的肽(例如，α-防卫素、β-防卫素或bactenecin)或只包含1个或2个优势氨基酸(dominating amino acid)的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞穿透肽还可包含核定位信号(NLS)。例如，细胞穿透肽可以是二分两亲性肽(bipartite amphipathic peptide)例如MPG，其可衍生自HIV-1 gp41与SV40大T抗原的NLS的融合肽结构域(fusion peptide domain)(Simeoni等人，Nucl.Acids Res.31：2717-2724，2003)。
在一个实施方案中，连接至iRNA试剂和/或载体寡聚物的靶向肽可以是两亲性α螺旋肽。示例性两亲性α螺旋肽包括但不限于抗菌肽(cecropins)、lycotoxin、paradaxin、buforin、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、cathelicidin、ceratotoxin、柄海鞘(S.clava)肽、八目鳗类鱼肠抗微生物肽(HFIAP)、马加宁(magainines)、brevinins-2、dermaseptins、蜂毒肽类、pleurocidin、H2A肽类、非洲爪蟾肽、esculentinis-1和caerin。许多因素优选地被考虑用来维持螺旋稳定性的完整性。例如，将利用最大数目的螺旋稳定化残基(例如，leu、ala或lys)，和将利用最小数目的螺旋去稳定化残基(例如，脯氨酸或环状单体单元)。可考虑加帽残基(capping residue)(例如Gly是示例性N-加帽残基(capping residue)和/或C-末端酰胺化可用于提供额外氢键以稳定螺旋。间隔i±3或i±4个位置的具有相反电荷的残基之间的盐桥的形成可提供稳定性。例如，阳离子残基例如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸可与阴离子性残基谷氨酸或天冬氨酸形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括这样的配体，所述配体具有天然存在或修饰的肽例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽(azapeptide)；具有一个或多个酰胺的肽，即，用一个或多个尿素、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲连接连接取代的肽；或环肽。
靶向肽可以是能够靶向特定受体的任何配体。实例为：叶酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖的簇例如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇或适体(apatamer)。簇为两个或更多个糖单位的组合。靶向配体还包括整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素(serotonin)受体配体、PSMA、内皮缩血管肽(endothelin)、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。配体还可基于核酸例如适体(aptamer)。适体(aptamer)可被修饰或可具有本文中公开的修饰的任意组合。
内体释放试剂包括咪唑类、多聚或寡聚咪唑类、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子(polyacation)、遮蔽的寡聚或多聚阳离子或阴离子、缩醛类、聚缩醛(polyacetal)、缩酮/聚缩酮(polyketyal)、原酸酯、具有遮蔽的或未遮蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有遮蔽的或未遮蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂代表药物代谢动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂(lipophiles)，胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯类、二酰基甘油酯、磷脂类、鞘脂类、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。也已知包含许多硫代磷酸酯键合的寡核苷酸结合血清蛋白质，从而在主链中包含多个硫代磷酯键合的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也顺应本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。
此外，结合血清成分(例如，血清蛋白质)的适体(aptamers)也顺应本发明作为PK调节配体。
顺应本发明的其他配体描述于2004年8月10日提交的共同未决的申请USSN：10/916,185；2004年9月21日提交的USSN：10/946,873；2007年8月3日提交的USSN：10/833,934；2005年4月27日提交的USSN：11/115,989和2007年11月21日提交的USSN：11/944,227中，为了所有目的将所述申请通过引用整体并入本文。
当存在两个或更多个配体时，配体可全都具有相同的性质，全部都具有不同的性质或某些配体具有相同性质然而其他配体具有不同性质。例如，配体可具有靶向性质，具有溶内体(endosomolytic)活性或具有PK调节性质。在优选实施方案中，全部配体具有不同的性质。
可将配体偶联至寡核苷酸的多个位置，例如3′末端、5′末端和/或内部位置。在优选实施方案中，通过间插系链(intervening tether)将配体连接至寡核苷酸。配体或连接的配体可存在于单体上，当所述单体被合并入正在生长的链时。在某些实施方案，在所述“前体”单体被合并入正在生长的链后，可通过偶联至“前体”单体来整合配体。例如，具有例如端氨基系链(即，不具有结合的配体)的单体例如TAP-(CH2)nNH2可被合并入正在生长的有义或反义链。在随后的操作中，即，在前体单体合并入链后，随后可通过将配体的亲电基团与前体单体的系链(tether)的末端亲核基团偶联来将具有亲电基团例如五氟苯基酯或醛基的配体连接至前体单体。
对于双链寡核苷酸，可将配体连接至一条或两条链。在某些实施方案中，双链iRNA试剂包含缀合至有义链的配体。在其他实施方案中，双链iRNA试剂包含缀合至反义链的配体。
在某些实施方案，可将配体缀合至核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键合(internucleosidic linkages)。至嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可在任何位点(包括内环和外环原子)上发生。在某些实施方案，将嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位置连接至缀合物部分。至嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可在任何位置上发生。在某些实施方案，嘧啶核碱基的2-、5-和6-位置可用缀合物部分来取代。至核苷的糖部分的缀合可在任何碳原子上发生。可被连接至缀合物部分的糖部分的示例性碳原子包括2′、3′和5′碳原子。也可将1′位置连接至缀合物部分，例如无碱基残基中。核苷间键合也可具有缀合物部分。对于含磷键合(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)，可将缀合物部分直接连接至磷原子或与磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键合(例如，PNA)，可将缀合物部分连接至胺或酰胺的氮原子或连接至相邻的碳原子。
存在许多用于制备寡聚化合物的缀合物的方法。通常，通过将寡聚化合物上的反应性基团(例如，OH、SH、胺、羧基、醛等)与缀合物部分上的反应性基团接触来将寡聚化合物连接至缀合物部分。在某些实施方案，一个反应性基团是亲电的并且另一个是亲核的。
例如，亲电基团可以是含羰基的官能度并且亲核基团可以是胺或巯基。利用和不利用连接基团缀合核酸与相关寡聚化合物的方法详尽地描述于文献例如Manoharan in Antisense Research and Applications，Crooke和LeBleu编辑，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1993，第17章，所述文献通过引用整体并入本文。
教导寡核苷酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,149,782；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,672,662；5,688,941；5,714,166；6,153,737；6,172,208；6,300,319；6,335,434；6,335,437；6,395,437；6,444,806；6,486,308；6,525,031；6,528,631；6,559,279；每一篇所述专利通过引用并入本文。
定义
为方便起见，下面提供本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的意义。如果在本说明书的其他部分中术语的用法与其在本部分中提供的意义之间存在明显矛盾，以该部分中的定义为准。
″G″、″C″、″A″和″U ″各自通常代表分别包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指修饰的核苷酸，作为进一步的详细内容见后面，或替代物替代部分。本领域技术人员十分了解鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分替代而基本上不改变包含具有这样的替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如，但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的的核苷酸碱基配对。因此，在本发明的核苷酸序列中，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被包含例如肌苷的核苷酸替代。包含此类替代部分的序列是本发明的实施方案。
如本文中所使用的“因子VII”意指因子VII mRNA、蛋白质、肽或多肽。术语“因子VII”也是本领域内已知，例如：AI132620、Cf7、凝血因子VII前体、凝血因子VII、FVII、血清凝血酶原转变加速因子、FVII凝血蛋白和依他凝血素α。
如本文中所使用的，“靶序列”是指在基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
如本文中所使用的，术语“包括序列的链”是指包括由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸的链的寡核苷酸。
如本文中所使用的，并且除非另外指出，术语“互补的”，当在核苷酸配对的上下文中使用时，意指经典的沃尔森-克里克配对，即GC、AT或AU。其也扩展至经典的沃尔森-克里克配对，其中一个或两个核苷酸是如本文中所描述的被修饰了的，例如：利用核糖修饰或磷酸主链(backpone)修饰。其还可包括与肌苷或基本上不改变碱基配对性质的其他实体的配对。
如本文中所使用的，并且除非另外指出，术语“互补的”，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，应当为本领域技术人员所理解的。互补性可包括在生理条件下，例如在生物体内可能遇到的生理相关条件下，允许杂交的完全互补、基本上互补和充分互补。完全互补是指在第一和第二序列的所有配对上的如上文中针对单个配对所定义的互补性。当序列与本文中的第二序列“基本上互补”时，两个序列可以完全互补，或它们可在杂交后可形成一个或多个，但通常不超过4、3或2个错配的碱基对，同时保持在与它们最终的应用最相关的条件下杂交的能力。基本上互补也可被定义为在严格条件下杂交，其中严格条件可包括：400mM NaCl，40mM PIPES，pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下进行12-16小时，然后进行洗涤。本领域技术人员能够根据杂交的核苷酸的最终用途确定最适合于两个序列的互补性的测试的调整条件。
然而，当设计两个寡核苷酸以在杂交后形成一个或多个单链悬突时，此类悬突在互补性的确定方面不应当被当作错配。例如，包含在长度上为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个在长度上为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中更长的寡核苷酸包含与更短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，对于本发明的目的，仍然可被称为“完全互补”。
如本文中所使用的“互补”序列，在关于它们杂交的能力的上述要求得以满足的范围内，还可包括或完全形成自非沃尔森-克里克碱基对和/或非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对。
在生理条件下，例如在如可在生物体内遇到的生理相关条件下，允许杂交的术语“互补”、“完全互补”、“基本上互补”和充分互补可在本文中用于指代dsRNA的有义链与反义链之间或dsRNA的反义链与靶序列之间的碱基配对，这可从它们的用途的上下文中得到理解。如本文中所使用的，多核苷酸的“互补”(例如：与信使RNA(mRNA)的至少部分的基本互补)是指多核苷酸与与所关心的的mRNA(例如，编码因子VII)的连续部分的互补(例如基本互补)。例如，如果序列与编码因子VII的mRNA的非中断部分基本上互补，那么多核苷酸与至少一部分因子VII mRNA互补。
如本文中所使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子或核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反向平行且基本上互补的(如上定义的)核酸链的双链体结构。形成双链体结构的两条链可以是一个大RNA分子的不同部分，或它们可以是分开的RNA分子。当两条链是一个大分子的部分，从而通过形成双链体结构的一条链的3′末端与另一条链的5′末端之间的连续核苷酸链连接时，连接RNA链称为“发夹环”。当两条链通过除了形成双链体的一条链的3′末端与另一条链的5′末端之间连续核苷酸链外的方法共价连接时，连接结构称为“连接体”。RNA链可具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸的数目。除了双链体结构外，dsRNA可包含一个或多个核苷酸悬突。如本文中所使用的dsRNA也称为“小抑制RNA”、“siRNA”、“siRNA试剂”、“iRNA试剂”或“RNAi试剂”。
如本文中所使用的，“核苷酸悬突”是指未配对的核苷酸，或者当dsRNA的一条链的3′末端延伸至另一条链的5′末端之外或反之亦然时，从dsRNA的双链体结构突出的核苷酸。“钝”或“平端”意指在dsRNA的该末端上不存在未配对的核苷酸，即无核苷酸悬突。“平端”dsRNA是在其整个长度上为双链(即，在分子的任一末端上无核苷酸悬突)的dsRNA。
术语“反义链”是指包含与靶序列基本上互补的区域的dsRNA的链。如本文中所使用的，术语“互补的区域”是指反义链上与序列(例如如本文中定义的靶序列)基本上互补的区域。当互补的区域与靶序列不完全互补时，在末端区域中的错配最可被耐受，并且，如果存在，通常在末端区域中或者区域，例如在5′和/或3′末端的6、5、4、3或2个核苷酸内。
如本文中所使用的术语“有义链”是指包含与反义链的区域基本上互补的区域的dsRNA的链。
术语“同一性”是两个或更多个核苷酸序列之间的关系，例如通过比较序列测定的。同一性还表示多核苷酸序列之间的序列亲缘关系的程度，例如如通过此类序列的字符串(string)之间的匹配测定的。虽然存在许多测量两个多核苷酸序列之间的同一性的方法，但术语对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress(1987)；和Sequence Analysis Primer，Gribskov.，M.和Devereux，J.编辑，M.Stockton Press，New York(1991))。如本文中所使用的，“基本上同一的”意指在dsRNA的有义链与靶基因的对应部分之间存在非常高的同源性程度(优选100％的序列同一性)。然而，具有超过90％或95％的序列同一性的dsRNA可用于本发明，从而可能预期归因于基因突变、株系多态性或进化趋异的序列变异可被耐受。虽然100％的同一性是优选的，但dsRNA在RNA与靶基因之间可包含单个或多个碱基-对随机错配。
“引入细胞”，当涉及dsRNA时，意指促进至细胞内的摄入或吸收，如由本领域技术人员所理解的一样。dsRNA的吸收或摄入可通过未受协助的扩散或主动细胞过程，或利用辅助剂或装置来进行。该术语的意义不限于体外细胞；dsRNA也可以是“引入细胞”，其中所述细胞是活生物体的部分。在这样的情况下，至细胞内的引入可包括至生物体的递送。例如，对于体内递送，可将dsRNA注射进入组织位点或全身性施用。至细胞内的体外引入包括本领域内已知的方法例如电穿孔或脂转染。
术语“沉默”和“抑制......的表达”，就它们涉及因子VII基因而言，在本文中是指因子VII基因的表达的至少部分抑制，例如：通过因子VII基因的mRNA的量的减少表现，所述因子VII基因可从第一细胞或细胞的组分离，在所述细胞或细胞的组中因子VII基因被转录并且所述细胞或细胞的组已被处理以便因子VII基因的表达与第二细胞或细胞的组相比较被抑制，所述第二细胞或细胞的组与所述第一细胞或细胞的组实质上相同但未被处理(对照细胞)。抑制的程度通常以下式表示：
可选地，抑制的程度可以以与因子VII基因转录功能上相关的参数减小的形式给出，例如由细胞分泌的因子VII基因编码的蛋白质的产量或展示特定表型(例如细胞凋亡)的细胞的数目。原则上，因子VII基因沉默可以在任何表达靶细胞中测定，既可以是结构的、或通过基因组工程、或任何适当的测定法。然而，当参照需要用来确定给定的siRNA是否抑制因子VII基因的表达达到特定程度，并且从而包括在本发明中时，下文中实施例中提供的测定法用作这样的参照。
例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基因的表达被抑制至少约20％、25％、35％、40％或50％。在一个实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基因被抑制至少60％、70％或80％。在更优选实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基团被抑制至少85％、90％或95％。
术语“治疗”、“医治”等是指疾病或障碍的缓解或减轻。在本发明的说明书中，在其涉及本文下文中引述的其他状态中的任何状态(例如，除了血栓形成障碍外的因子VII介导的状态)的本发明的范围内，术语“治疗”、“医治”等意指减轻或缓解至少一个与这样的状态相关的症状，或减慢或逆转这样的状态的进展。
“治疗上相关的”组合物当以适当的剂量施用时，可缓解疾病或障碍，或疾病或障碍的症状。
如本文中所使用的，术语“因子VII介导的状态或疾病”和相关术语及短语是指特征在于不适当的状态或障碍，例如超过正常的因子VII活性的。不适当的因子VII功能活性可能因因子VII在通常不表达因子VII的细胞中表达或增加的因子VII表达(导致，例如病毒性出血热或血栓的症状)而产生。因子Vll介导的状态或疾病可以完全或部分由不适当的因子VII功能活性介导。然而，因子VII介导的状态或疾病是其中因子VII的调节对基础状态或障碍产生一定效应(例如，因子VII抑制剂导致至少一些患者的患者健康的一定改善)的状态或疾病。
“出血热”包括由病毒感染引发的疾病的组合。发热和胃肠道症状通常随后伴有毛细血管出血。
“凝血病”是受治疗者的凝血机制的任何缺陷。
如本文中所使用的，“血栓形成障碍”是包括特征在于不希望的血液凝固的任何障碍，优选因不希望的FVII表达引起的任何障碍。。
如本文中所使用的，短语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在治疗、预防或处理病毒性出血热或此类障碍的明显症状(例如，出血、发热、虚弱、肌肉疼痛、头痛、炎症或循环休克)中提供治疗益处的量。治疗上有效的具体量可由普通医学从业人员容易地确定，并且可视本领域内已知的因素例如血栓形成障碍的类型、患者的病历和年龄、疾病的分期以及其他试剂的施用而变化。
如本文中所使用的，“药物组合物”包括药理学有效量的dsRNA和药学上可接受的载体。如本文中所使用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简单地“有效量”是指有效地产生期望的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。例如，如果当与疾病或障碍相关的可测量参数减小至少25％时，给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量是导致该参数的至少25％的减小所必需的量。
术语“药学上可接受的载体”是指用于施用治疗剂的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其组合。术语明确地排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适当的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙和乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是适当的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂，如果存在，通常为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。必要时，可用材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包覆片剂以延迟在胃肠道的吸收。
如本文中所使用的，“转化的细胞”是已将dsRNA分子可从其表达的载体引入其中的细胞。
核酸-脂质颗粒的特征
在某些实施方案中，本发明涉及用于产生脂质-封装的核酸颗粒的方法和组合物，在所述颗粒中核酸被封装在脂质层内。此类包含siRNA寡核苷酸的核酸-脂质颗粒被利用多种生物物理学参数表征，参数包括：(1)药物脂质比；(2)封装效率；和(3)粒径。高药物脂质比、高封装效率、良好的核酸酶抗性和血清稳定性以及可控制的粒径(直径通常小于200nm)是所需的。此外，核酸聚合物的性质是非常重要的，因为为了赋予核酸酶抗性而进行的核酸的修饰增加了治疗剂的成本，而在许多情况下仅提供有限的抗性。除非另外的指出，否则在本说明书中如下计算这些标准：
核酸脂质比是确定体积的制剂中核酸的量除以相同体积中脂质的量。这可基于摩尔/摩尔或重量/重量，或基于重量/摩尔。对于最终的即可施用的制剂，核酸∶脂质比率的计算是在已利用透析、层析和/或酶(例如，核酸酶)降解除去尽可能多的外来核酸后。封闭效率是指起始混合物的药物脂质比除以最终的施用感受态制剂(administration competent formulation)的药物脂质比。这是相对效率的量度。为了测量绝对效率，也可计算加入至起始混合物(该混合物终于施用感受态制剂)的核酸的总量。也可计算配制过程中脂质损失的量。效率是制剂的损失(wastage)和消费的量度；和
大小表示形成的颗粒的大小(直径)。可在Nicomp Model 370亚微米粒度分析仪上使用准弹性光散射(QELS)来测定粒径分布。200nm以下的颗粒对于新血管的(渗漏的)组织(例如肿瘤和炎症位置)的分布是优选的。
制备脂质颗粒的方法
本发明的方法和组合物利用某些阳离子脂质，其合成、制备和表征描述于下文中和所附实施例中。此外，本发明提供了制备脂质颗粒的方法，包括脂质颗粒与治疗剂(例如核酸)的结合。在本文中描述的方法中，将脂质的混合物与核酸的缓冲水溶液组合以产生包含封装在脂质颗粒中的核酸的中间混合物，其中封装的核酸以约3wt％至约25wt％，优选5至15wt％的核酸/脂质比存在。中间混合物可任选地筛分以获得其中脂质部分是单层囊泡(优选具有30至150nm，更优选约40至90nm的直径)的脂质-封装的核酸颗粒。随后升高pH以中和脂质-核酸颗粒上的至少部分表面电荷，从而提供至少部分表面中和的脂质封装的核酸组合物。
如上所述，此类阳离子脂质中的几种是在低于氨基的pKa的pH下带电荷并且在高于pKa的pH下基本上中性的氨基脂质。此类阳离子脂质称为可滴定的阳离子脂质并且可使用两步法将其用于本发明的制剂。首先，可在核酸存在的情况下利用可滴定的阳离子脂质和其他小囊泡成分在较低的pH下形成脂质囊泡。这样，小囊泡可封装和捕获核酸。接着，可通过将介质的pH升高至高于存在的可滴定的阳离子脂质的pKa，即升高至生理pH或更高，来中和新形成的小囊泡的表面电荷。该方法的特别有利的方面包括既使任何表面吸附的核酸温和去除，又使所得的核酸递送媒介物具有中性表面。预期具有中性表面的脂质体或脂质颗粒避免从循环快速清除和避免与阳离子脂质体制剂相关的特定毒性。关于此类可滴定的阳离子脂质在核酸-脂质颗粒的配制中的用途的其他详细内容提供于美国专利6,287,591和美国专利6,858,225中，通过引用并入本文。
还要指出的是，以该方式形成的小囊泡提供了具有高核酸含量的均一囊泡大小的制剂。此外，小囊泡具有约30至150nm，更优选约30至约90nm的大小范围。
不希望受任何特定理论束缚，据认为非常高的核酸封装效率是低pH下静电相互作用的结果。在酸性pH(例如，pH 4.0)下，小囊泡表面带电荷并且通过静电相互作用结合核酸的一部分。当外部酸性缓冲液被更换为更中性的缓冲液(例如，pH 7.5)时，脂质颗粒或脂质体的表面被中和，从而允许任何外部核酸被除去。关于配制方法的更详细的信息提供了多个公布(例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)。
根据上述内容，本发明提供了制备脂质/核酸制剂的方法。在本文中描述的方法中，将脂质的混合物与核酸的缓冲水溶液组合以产生包含封装在脂质颗粒中的核酸的中间混合物，例如，封装的核酸以约10wt％至约20wt％的核酸/脂质比存在。中间混合物可任选地筛分以获得其中脂质部分是单层囊泡(具有30至150nm，更优选约40至90nm的直径)的脂质-封装的核酸颗粒。随后升高pH以中和脂质-核酸颗粒上的至少一部分表面电荷，从而提供至少部分表面-中和的脂质-封装的核酸组合物。
在某些实施方案中，脂质的混合物包括至少两种脂质成分：本发明的第一氨基脂质成分选自具有使脂质在低于pKa的pH下为阳离子并且在高于pKa的pH下为中性的pKa的脂质，所述第二脂质成分选自在脂质-核酸颗粒形成过程中阻止颗粒聚集的脂质。在具体的实施方案中，氨基脂质是本发明的新型阳离子脂质。
在制备本发明的核酸-脂质颗粒中，脂质的混合物通常是脂质的有机溶剂溶液。该脂质混合物然后被干燥以形成薄膜或被冻干以形成粉剂，然后用水性缓冲液水化以形成脂质体。可选地，在优选方法中，可将脂质混合物溶解在能与水混溶的醇例如乙醇中，然后将该乙醇溶液加入至水性缓冲液，从而导致自发脂质体形成。在大多数实施方案中，以其中其可商购获得的形式使用所述醇。例如，乙醇可以使用无水乙醇(100％)，或使用95％乙醇，其余为水。该方法更详细地描述于美国专利5,976,567中。
在一个示例性实施方案中，脂质的混合物为醇溶剂中的阳离子脂质、中性脂质(除了阳离子脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和PEG修饰的脂质(例如，PEG-DMG或PEG-cDMA)的混合物。在优选实施方案中，脂质混合物基本上由阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质在醇(更优选乙醇)中组成。在其他优选实施方案中，第一溶液由以约20-70％阳离子脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％PEG修饰的脂质的摩尔比的上述脂质混合物组成。在进一步的优选实施方案中，第一溶液基本上由选自表1的脂质、DSPC、Chol和PEG-DMG或PEG-cDMA，更优选以约20-60％阳离子脂质∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-DMG或PEG-DMA的摩尔比组成。在具体的实施方案中，摩尔比为约50/10/38.5/1.5(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG，PEG-DSG或PEG-DPG的mol％)、57.2/7.1/34.3/1.4(阳离子脂质/DPPC/Chol/PEG-cDMA)、40/15/40/5(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG的mol％)、50/10/35/4.5/0.5(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DSG或GalNAc3-PEG-DSG的mol％)、50/10/35/5(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG的mol％)、40/10/40/10(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)、35/15/40/10(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)或52/13/30/5(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)。另一组优选实施方案中，此类组合物的中性脂质被POPC、DPPC、DOPE或SM替代。根据本发明，将脂质混合物与可包含核酸的缓冲水溶液组合。缓冲水溶液通常是其中缓冲剂具有低于脂质混合物中可质子化脂质的pKa的pH的溶液。适当的缓冲剂的实例包括柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和MES。特别优选的缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。优选缓冲液在1-1000mM的阴离子范围内，这取决于待封装的核酸的化学性质，并且缓冲液浓度的最优化对于获得高加载水平是很重要的(参见，例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)。可选地，用氯化物、硫酸盐等酸化至pH 5-6的纯水可以是有用的。在该情况下，其可适合于加入5％葡萄糖，或另一种非离子溶质，所述溶质，当使颗粒透析以除去乙醇，增加pH或与药学上可接受的载体例如生理盐水混合时，将平衡跨颗粒膜的渗透势。缓冲液中核酸的量可变化，但通常为约0.01mg/mL至约200mg/mL，更优选约0.5mg/mL至约50mg/mL。
组合脂质和治疗性核酸的缓冲水溶液的混合物以提供中间混合物。中间混合物通常是具有封装的核酸的脂质颗粒的混合物。此外，中间混合物还可包含核酸的某些部分，所述核酸附着至脂质颗粒(脂质体或脂质囊泡)的表面，由于带负电荷的核酸与脂质颗粒表面上的带正电荷脂质(组成可质子化的第一脂质成分的氨基脂质或其他脂质在具有低于脂质上的可质子化基团的pKa的pH的缓冲液中带正电荷)的离子吸引。在一组优选实施方案中，脂质的混合物是脂质的醇溶液，并且调整每一种溶液的体积以便在组合后，所得的醇含量为按体积计约20％至按体积计约45％。组合混合物的方法可包括多种方法中的任何方法，通常取决于所产生的制剂的规模。例如，当总体积为约10-20mL或更小时，可在试管中组合溶液并且利用涡旋混合器搅拌在一起。可在适当的生产规模玻璃器具中进行大规模方法。
任选，可筛分通过将脂质混合物与治疗剂(核酸)的缓冲水溶液组合产生的脂质-封装的治疗剂(例如，核酸)复合物以获得所需的大小范围和相对窄的脂质颗粒大小的分布。优选，筛分本文中提供的组合物至约70至约200nm，更优选约90至约130nm的平均直径。几种技术可用于筛分脂质体至所需的大小。一种筛分方法描述于美国专利No.4,737,323，通过引用并入本文中。利用浴槽式或探头超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生下降至尺寸小于约0.05微米的小单层囊泡(SUV)的逐渐大小减小。匀化(Homogenization)是依赖于剪切能将大脂质体片段化成更小的脂质体的另一种方法。在典型的匀化方法中，将多层脂囊通过标准乳剂匀化器再循环直至观察到通常为约0.1至0.5微米的选择的脂质大小。在两个方法中，可利用常规激光束粒度测定监控粒度分布。对于本文中的某些方法，使用挤出获得匀一小囊泡大小。
脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜的挤出导致相对清晰可辨的粒径分布。一般地，将悬浮物通过膜循环1次或多次直至获得所需脂质体复合物粒径分布。可将脂质体通过连续更小的孔膜挤出，以获得脂质体大小的逐步减小。在某些情况下，可使用形成的脂质-核酸组合物而不进行任何筛分。
在具体的实施方案中，本发明的方法还包括中和脂质-核酸组合物的脂质部分上的至少一些表面电荷的步骤。通过至少部分中和表面电荷，未封装的核酸从脂质颗粒表面游离并且可利用常规技术从组合物中除去。优选，未封装的和表面吸附的核酸可通过缓冲液的交换从所得的组合物除去。例如，用HEPES-缓冲盐水(HBS，pH约7.5)溶液替换柠檬酸盐缓冲液(pH约4.0，用于形成组合物)导致脂质表面的中和以及核酸从表面释放。随后可通过使用标准方法进行层析除去释放的核酸，然后转移至具有高于所使用脂质的pKa的pH的缓冲液中。
任选地，脂质囊泡(即，脂质颗粒)可通过在水性缓冲液中水化形成，并且在添加核酸之前使用上面描述的方法中的任何方法进行筛分。如上所述，水性缓冲液应当具有低于氨基脂质的pKa的pH。随后向这些已筛分的形成的小囊泡中加入核酸溶液。为了使得能够将核酸封装进入“预形成的”小囊泡，混合物应当包含醇例如乙醇。在乙醇的情况下，其应当以约20％(w/w)至约45％(w/w)的浓度存在。此外，取决于脂质囊泡的组成和核酸的性质，可能必须在水性缓冲液-乙醇混合物中加温预形成的小囊泡和核酸的混合物至约25℃至约50℃的混合温度。对于本领域技术人员很明显的是以在脂质囊泡中获得所需水平的核酸的最优化封装方法将需要操作变量例如乙醇浓度和温度。用于核酸封装的适当条件的实例提供于实施例中。一旦将核酸封装在形成的囊泡内，就可增加外部pH(external pH)以至少部分中和表面电荷。随后可如上所述除去未封装的和表面吸附的核酸。
使用方法
本发明的脂质颗粒可用于在体外或体内将治疗剂递送至细胞。在具体的实施方案中，治疗剂是核酸，可使用本发明的核酸-脂质颗粒将其递送至细胞。虽然利用与核酸-脂质颗粒相关的描述举例说明了使用本发明的脂质颗粒和相关药物组合物的多种方法的下列描述，但应理解，这些方法和组合物可容易地进行改造而适合递送任何治疗剂，以治疗可从这样的治疗受益的任何疾病或障碍。
在某些实施方案中，本发明提供了用于将核酸引入细胞的方法。用于引入细胞的优选核酸是siRNA、免疫刺激性寡核苷酸、质粒、反义和核酶。此类方法可通过将本发明的颗粒或组合物与细胞接触进行足以使细胞内递送发生的一段时间来进行。
本发明的组合物可被吸附至几乎任何细胞类型，例如，肿瘤细胞系，包括但不限于HeLa、HCT116、A375、MCF7、B16F10、Hep3b、HUH7、HepG2、Skov3、U87和PC3细胞系。一旦吸附，核酸-脂质颗粒可被一部分细胞胞吞，与细胞膜交换脂质，或与细胞融合。复合物核酸部分的转移或整合可通过此类途径之任一来进行。不希望限定本发明的范围，据认为在颗粒通过胞吞被摄入细胞的情况下，颗粒随后与内体膜相互作用，从而可能由于非双层相的形成导致内体膜的去稳定化，从而导致封装的核酸至细胞质的引入。类似地，在颗粒与细胞质膜直接融合的情况下，当融合发生时，脂质体膜被整合进入细胞膜并且脂质体的内容物与细胞内液组合。细胞与脂质-核酸组合物之间的接触，当在体外进行时，将在生物相容性介质中进行。组合物的浓度可取决于具体的应用可广泛变化，但通常在约1μmol至约10mmol的范围内。在某些实施方案中，利用脂质-核酸组合物处理细胞通常在生理温度(约37℃)下，进行约1至24小时，优选约2至8小时的时期。对于体外应用，核酸可被递送至培养基中生长的任何细胞，无论是植物来源的还是动物来源的，无论是脊椎动物还是无脊椎动物，以及无论任何组合或类型。在优选实施方案中，细胞是动物细胞，更优选哺乳动物细胞，最优选人细胞。
在另一组实施方案中，向60-80％汇合的铺平板的细胞中加入脂质-核酸颗粒悬浮液，所述细胞具有约103至约105个细胞/mL，更优选约2×104个细胞/mL的细胞密度。加入至细胞的悬浮液的浓度优选为约0.01至20μg/mL，更优选约1μg/mL。
典型应用包括使用公知的方法提供siRNA的细胞内递送以敲低或沉默特定细胞靶。可选地，应用包括治疗上有用的多肽的编码DNA或mRNA序列的递送。这样，通过提供有缺陷的或不存在的基因产物(即，用于Duchenne型肌营养不良，参见Kunkel等人，Brit.Med.Bull.45(3)：630-643(1989)，和用于囊性纤维化，参见Goodfellow，Nature 341：102-103(1989))为遗传病提供治疗。本发明的组合物的其他用途包括在细胞中引入反义寡核苷酸(参见，Bennett等人，Mol.Pharm.41：1023-1033(1992))。
可选地，通过使用本领域技术人员已知的方法，本发明的组合物也可用于在体内将核酸递送至细胞。关于本发明的用于递送DNA或mRNA序列的应用，Zhu等人，Science 261：209-211(1993)(通过引用并入本文)描述了使用DOTMA-DOPE复合物进行的巨细胞病毒(CMV)-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)表达质粒的静脉内递送。Hyde等人，Nature 362：250-256(1993)(通过引用并入本文)描述了使用脂质体进行的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)基因至小鼠的气道上皮和肺的肺泡的递送。Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298：278-281(1989)(通过引用并入本文)描述了利用编码细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的功能性原核生物基因对小鼠肺的体内转染。因此，本发明的组合物可用于治疗感染性疾病。因此，在另一个方面，本发明的制剂可用于沉默或调节靶基因例如但不限于FVII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGF β基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因、p53肿瘤抑制基因、p53家族成员DN-p63、pRb肿瘤抑制基因、APC1肿瘤抑制基因、BRCA1肿瘤抑制基因、PTEN肿瘤抑制基因、mLL融合基因、BCR/ABL融合基因、TEL/AML1融合基因、EWS/FLI1融合基因、TLS/FUS1融合基因、PAX3/FKHR融合基因、AML1/ETO融合基因、αv-整联蛋白基因、Flt-1受体基因、微管蛋白基因、人类乳头瘤病毒基因、人类乳头瘤病毒复制所必需的基因、人类免疫缺陷病毒基因、人类免疫缺陷病毒复制所必需的基因、甲型肝炎病毒基因、甲型肝炎病毒复制所必需的基因、乙型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒复制所必需的基因、丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒复制所必需的基因、丁型肝炎病毒基因、丁型肝炎病毒复制所必需的基因、戊型肝炎病毒基因、戊型肝炎病毒复制所必需的基因、己型肝炎病毒基因、己型肝炎病毒复制所必需的基因、庚型肝炎病毒基因、庚型肝炎病毒复制所必需的基因、H型肝炎病毒基因、H型肝炎病毒复制所必需的基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒复制所必需的基因、单纯疱疹病毒基因、单纯疱疹病毒复制所必需的基因、疱疹巨细胞病毒基因、疱疹巨细胞病毒复制所必需的基因、疱疹EB病毒基因、疱疹EB病毒复制所必需的基因、卡波济肉瘤相关疱疹病毒基因、卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制所必需的基因、JC病毒基因、JC病毒复制所必需的人基因、粘液病毒基因、粘液病毒复制所必需的基因、鼻病毒基因、鼻病毒复制所必需的基因、冠状病毒基因、冠状病毒复制所必需的基因、西尼罗河病毒(West Nile Virus)基因、西尼罗河病毒复制所必需的基因、圣路易斯脑炎基因、圣路易斯脑炎复制所必需的基因、蜱传脑炎病毒基因、蜱传脑炎病毒复制所必需的基因、墨累河谷脑炎病毒基因、墨累河谷脑炎病毒复制所必需的基因、登革热病毒基因、登革热病毒复制所必需的基因、猴病毒40基因、猴病毒40复制所必需的基因、人类嗜T淋巴细胞病毒基因、人嗜T淋巴细胞病毒复制所必需的基因、莫洛尼氏鼠白血病病毒基因、莫洛尼氏鼠白血病病毒复制所必需的基因、脑心肌炎病毒基因、脑心肌炎病毒复制所必需的基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒复制所必需的基因、水痘带状疱疹病毒(Vericella zoster virus)基因、水痘带状疱疹病毒复制所必需的基因、腺病毒基因、腺病毒复制所必需的基因、黄热病病毒基因、黄热病病毒复制所必需的基因、脊髓灰质炎病毒基因、脊髓灰质炎病毒复制所必需的基因、痘病毒基因、痘病毒复制所必需的基因、疟原虫属基因，疟原虫复制所必需的基因、溃疡分枝杆菌基因、溃疡分枝杆菌复制所必需的基因、结核分枝杆菌基因、结核分枝杆菌复制所必需的基因、麻风分枝杆菌基因、麻风分枝杆菌复制所必需的基因、金黄色葡萄球菌基因、金黄色葡萄球菌复制所必需的基因、肺炎链球菌基因、肺炎链球菌复制所必需的基因、酿脓链球菌基因、酿脓链球菌复制所必需的基因、肺炎衣原体基因、肺炎衣原体复制所必需的基因，肺炎支原体基因、肺炎支原体复制所必需的基因、整联蛋白基因、选择蛋白基因、补体系统基因、趋化因子基因、趋化因子受体基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、血小板碱性蛋白原(Pro-Platelet Basic Protein)基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、离子通道的组分的基因、神经递质受体的基因、神经递质配体的基因、淀粉样蛋白-家族基因、早老素基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、LOH细胞中发现的等位基因或多态性基因的一个等位基因。
关于体内施用，优选胃肠外，即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用药物组合物。在具体的实施方案中，通过快速注射静脉内或腹膜内施用药物组合物。例如，参见Stadler等人，美国专利No.5,286,634，所述专利通过引用并入本文。细胞内核酸递送也已描述于Straubringer等人，METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，New York.101：512-527(1983)；Mannino，等人，Biotechniques 6：682-690(1988)；Nicolau等人，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.6：239-271(1989)以及Behr，Ace.Chem.Res.26：274-278(1993)中。施用基于脂质的治疗剂的其他方法描述于例如Rahman等人，美国专利No.3,993,754；Sears，美国专利No.4,145,410；Papahadjopoulos等人，美国专利No.4,235,871；Schneider，美国专利No.4,224,179；Lenk等人，美国专利No.4,522,803；和Fountain等人，美国专利No.4,588,578中。
在其他方法中，可通过直接施用制剂至组织使药物制剂与靶组织接触。可通过局部的、“开放”或“封闭”方法进行施用。关于“局部的”，其意指给暴露于环境的组织例如皮肤、口咽、外耳道等直接施用药物制剂。“开放”方法是包括切开患者的皮肤并且直接使对其施用药物制剂的下面的组织可见的方法。这通常通过手术操作例如开胸术(以到达肺)、腹式开腹(以到达腹腔内脏)或到达靶组织的其他直接手术操作来实现。“封闭”方法是侵入方法，其中未直接显现内部靶组织，但通过将手术器械插入通过皮肤的小伤口到达靶组织。例如，可通过针灌洗(needle lavage)给腹膜施用制剂。同样地，药物制剂在腰椎穿刺过程中可以通过注入被施用给脑膜或脊髓，该腰椎穿刺后面是如通常对于脊椎麻醉或脊髓的甲泛葡胺成像所操作的一样对患者进行适当复位。可选地，可通过内窥镜检查装置施用制剂。
还可将脂质-核酸组合物于气溶胶中吸入至肺中(参见，Brigham等人，Am.J.Sci.298(4)：278-281(1989))或通过在疾病部位直接注射(Culver，Human GeneTherapy，Mary Ann Liebert，Inc.，Publishers，New York，pp.70-71(1994))来进行施用。
可在多种宿主中实施本发明的方法。优选宿主包括哺乳动物种例如人、非人灵长类动物、狗、猫、牛、马、绵羊等。
本发明的脂质-治疗剂颗粒的剂量将取决于治疗剂对脂质的比率和主治医生基于患者的年龄、体重和状况的意见。
在一个实施方案中，本发明提供了调节靶多核苷酸或多肽的表达的方法。此类方法通常包括将细胞与本发明的脂质颗粒接触，所述脂质颗粒与能够调节靶多核苷酸或多肽的表达的核酸结合。如本文中所使用的，术语“调节”是指改变靶多核苷酸或多肽的表达。在不同的实施方案中，调节可意指增加或增强，或其可意指减少或降低。测量靶多核苷酸或多肽的表达水平的方法是已知的并且可在本领域内获得，包括例如利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术的方法。在具体的实施方案中，与适当的对照值相比较，靶多核苷酸或多肽的表达水平增加或减少至少10％、20％、30％、40％、50％或超过50％。
例如，如果需要增加多肽的表达，那么核酸可以是包括编码所需多肽的多核苷酸的表达载体。在另一个方面，如果需要减少多核苷酸或多肽的表达，那么核酸可以是例如包含与编码靶多肽的多核苷酸特异性杂交从而中断靶多核苷酸或多肽的表达的多核苷酸序列的反义寡核苷酸、siRNA或微RNA。可选地，核酸可以是表达这样的反义寡核苷酸、siRNA或微RNA的质粒。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了通过细胞调节多肽的表达的方法，包括给细胞提供脂质颗粒，所述脂质颗粒由或基本由式I的阳离子脂质、中性脂质、固醇、PEG或PEG修饰的脂质组成，例如：以摩尔比计，约20-65％的式I的阳离子脂质、3-25％的中性脂质、15-55％的固醇和0.5-15％的PEG或PEG修饰的脂质，其中脂质颗粒与能够调节多肽的表达的核酸结合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比为约60/7.5/31/1.5、57.5/7.5/31.5/3.5、57.2/7.1/34.3/1.4、52/13/30/5、50/10/38.5/1.5、50/10/35/5、40/10/40/10、40/15/40/5或35/15/40/10(式I的阳离子脂质/DSPC或DPPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)。在某些实施方案中，脂质颗粒也包含靶向部分例如本文中描述的靶向脂质(例如，脂质颗粒基本上由式I的阳离子脂质、中性脂质、固醇、PEG或PEG修饰的脂质和靶向部分组成)。在另一组实施方案中，此类组合物中的中性脂质被DPPC、POPC、DOPE或SM替代。在另一组实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质被PEG-DSG、PEG-DMG或PEG-DPG取代。
在具体的实施方案中，治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微RNA或反义RNA包含与编码所述多肽的多核苷酸结合的多核苷酸或其补体，以便减少所述多肽表达。
在其他实施方案中，核酸是编码多肽或功能变体或片段以便增加多肽或功能变体或片段的表达的质粒。
在相关实施方案中，本发明提供了用于转染培养细胞的试剂。例如，本文中描述的脂质制剂可用于递送核酸至培养的细胞(例如，贴壁细胞、悬浮细胞等)。
在相关实施方案中，本发明提供了治疗受治疗者中特征在于多肽的过表达的疾病或障碍，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中siRNA、微RNA或反义RNA包含与编码多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。
在一个实施方案中，药物组合物包含脂质颗粒，所述脂质颗粒由或基本上由式I的阳离子脂质、DSPC、Chol和PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-cDMA组成，例如：以摩尔比计，约20-65％的式I的阳离子脂质、3-25％的中性脂质、15-55％的固醇和0.5-15％的PEG或PEG-修饰的脂质PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-cDMA，其中脂质颗粒与治疗性核酸结合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比为约60/7.5/31/1.5、57.5/7.5/31.5/3.5、57.2/7.1/34.3/1.4、52/13/30/5、50/10/38.5/1.5、50/10/35/5、40/10/40/10、35/15/40/10或40/15/40/5(式I的阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)。在某些实施方案，脂质颗粒还包含本文中描述的靶向脂质(例如，基本上由式I的阳离子脂质、中性脂质、固醇、PEG或PEG修饰的脂质和靶向部分(例如，GalNAc3-PEG-DSG)组成)。在某些实施方案，当靶向脂质包含PEG部分并且被加至现有的脂质体制剂时，减少PEG修饰的脂质的量以便使PEG修饰的脂质(即，PEG修饰的脂质例如PEG-DMG，和含有PEG的靶向脂质)的总量保持恒定的摩尔百分比(例如，0.3％、1.5mol％或3.5mol％)。在另一组实施方案中，用DPPC、POPC、DOPE或SM替代此类组合物中的中性脂质。在另一组实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质被PEG-DSG或PEG-DPG替代。在另一个相关实施方案中，本发明包括治疗受治疗者中特征在于多肽的表达不足的疾病或障碍，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂是编码多肽或其功能变体或片段的质粒。
本发明还提供了诱导受治疗者的免疫应答的方法，包括给受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂是免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，免疫应答是由或基本上由式I的阳离子脂质、DSPC、Chol和PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-cDMA(例如以约20-65％的式I的阳离子脂质、3-25％的中性脂质、15-55％的固醇和0.5-15％的PEG或PEG修饰的脂质PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-cDMA的摩尔比)组成的体液或粘膜免疫应答，其中脂质颗粒与治疗性核酸结合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比为约60/7.5/31/1.5、57.5/7.5/31.5/3.5、57.2/7.1/34.3/1.4、52/13/30/5、50/10/38.5/1.5、50/10/35/5、40/10/40/10、35/15/40/10或40/15/40/5(式I的阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-cDMA的mol％)。在某些实施方案中，脂质颗粒还包含本文中描述的靶向脂质(例如，脂质颗粒基本上由式I的阳离子脂质、中性脂质、固醇、PEG或PEG修饰的脂质和靶向部分组成)。在某些实施方案，当靶向脂质包括PEG部分并且被添加至现有脂质体制剂中时，减少PEG修饰的脂质的量以便PEG修饰的脂质(即，PEG修饰的脂质，例如PEG-DMG和含PEG的靶向脂质)的总量保持以恒定的摩尔百分比(例如，0.3％、1.5mol％或3.5mol％)。在另一组实施方案中，此类组合物中的中性脂质被DPPC、POPC、DOPE或SM替代。在另一组实施方案中，PEG或PEG-修饰的脂质被PEG-DSG或PEG-DPG取代。在其他实施方案中，将药物组合物与疫苗或抗原组合提供给受治疗者。因此，本发明本身提供了包含本发明的脂质颗粒的疫苗，所述脂质颗粒包含免疫刺激性寡核苷酸，并且也与所需免疫应答的抗原结合。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤抗原或与传染剂例如病毒、细菌或寄生虫相关。
许多肿瘤抗原、感染剂抗原和与其他疾病相关的抗原在本领域内是公知的并且此类抗原的实例描述于本文中引用的参考文献中。适合用于本发明的抗原的实例包括但不限于多肽抗原和DNA抗原。抗原的具体实例为甲型肝炎、乙型肝炎、天花、脊髓灰质炎、炭疽、流感、斑疹伤寒、破伤风、麻疹、轮状病毒、白喉、百日咳、肺结核和风疹抗原。在一个实施方案中，抗原是乙型肝炎重组抗原。在其他方面，抗原是甲型肝炎重组抗原。在另一个方面，抗原是肿瘤抗原。此类肿瘤相关抗原的实例为MUC-1、EBV抗原和与伯基特淋巴瘤相关的抗原。在其他方面，抗原是酪氨酸激酶相关蛋白质肿瘤抗原重组抗原。本领域技术人员知道适合用于本发明的其他抗原。
适合用于本发明的肿瘤相关抗原包括可表示单个肿瘤类型、几个肿瘤类型中共享的和/或与正常细胞相比较在肿瘤中专有地表达或过表达的突变的和非突变的分子。除了蛋白质和糖蛋白外，已记录了碳水化合物、神经节苷脂类、糖脂类和粘蛋白类的表达的肿瘤特异性模式。用于所述癌症疫苗的示例性肿瘤相关抗原包括癌基因、肿瘤抑制基因和具有对于肿瘤细胞是独特的突变或重排的其他基因、再活化胚胎基因产物、癌胚抗原、组织特异性(但非肿瘤特异性)分化抗原、生长因子受体、细胞表面碳水化合物残基、外来病毒蛋白和许多其他自身蛋白质的蛋白质产物。
肿瘤相关抗原的具体实施方案包括例如：突变的抗原，例如Ras p21原癌基因、肿瘤抑制基因p53和BCR-abl癌基因的蛋白质产物以及CDK4、MUM1、Caspase 8和β连环蛋白；过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4、半乳糖凝集素9、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA、癌胚抗原例如α甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)；自体抗原，例如癌胚抗原(CEA)和黑色素细胞分化抗原例如Mart 1/Melan A、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2；前列腺相关抗原，例如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2；再活化胚胎基因产物，例如MAGE 1、MAGE 3、MAGE 4、GAGE 1、GAGE2、BAGE、RAGE和其他癌症睾丸抗原例如NY-ESO1、SSX2和SCP1；粘蛋白类，例如Muc-1和Muc-2；神经节苷脂类，例如GM2、GD2和GD3、中性糖脂和糖蛋白类例如Lewis(y)和globo-H；以及糖蛋白，例如Tn、汤普森-弗赖登莱希抗原(TF)和sTn。本文中还包括作为肿瘤相关抗原的是完整细胞和肿瘤细胞裂解物以及其免疫原性部分，以及用于抗B细胞淋巴瘤的B淋巴细胞的单克隆增殖上表达的免疫球蛋白个体基因型。
病原体包括但不限于感染哺乳动物(更具体地人)的传染原例如病毒。传染性病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒例如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；和其他分离株例如HIV-LP；细小RNA病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒(human Coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、埃柯病毒(echoviruses))；杯状病毒科(Calciviridae)(例如，引起胃肠炎的株系)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘液病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒(Hantaan viruses)、bunga病毒、静脉病毒和内罗病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、虫媒病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳突瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)和虹膜病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵样脑病的病原，丁型肝炎的因子(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷性卫星病毒)、非甲型肝炎、非乙型肝炎的因子(第1类＝内部传播的；第2类＝胃肠外传播的(即，丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒，和星状病毒)。
同样地，革兰阴性和革兰阳性细菌在脊椎动物中用作抗原。此类革兰阳性细菌包括但不限于巴斯德菌属(Pasteurella)种类、葡萄球菌属(Staphylococci)种类和链球菌属(Streptococcus)种类。革兰阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)种类和沙门菌属(Salmonella)种类。感染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺旋杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌(Mycobacteria sps)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登氏分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A组链球菌属)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌属(草绿色组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(Streptococcus)(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属某种(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌属某种(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus infuenzae)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属某种(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogene)、肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德杆菌(Pasturellamultocida)、拟杆菌属某种(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema palladium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)和以色列放线菌(Actinomyces israelii)。
病原体的其他实例包括但不限于感染哺乳动物(更具体地人)的感染性真菌。感染性真菌的实例包括但不限于：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。感染性寄生虫的实例包括疟原虫属(Plasmodium)例如恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫。其他感染性生物(即，原生生物)包括刚地弓形虫。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明提供了包含通过本文中描述的肝筛查模型鉴定的核酸试剂的药物组合物。所述组合物包含试剂例如dsRNA和药学上可接受的载体。药物组合物用于治疗与基因的表达或活性相关的疾病或障碍。基于递送模式配制此类药物组合物。一个实例是配制用于通过胃肠外递送全身性施用的组合物。以足以抑制靶基因例如因子VII基因表达的剂量施用包含鉴定的试剂的药物组合物。通常，适当的dsRNA的剂量在0.01至5.0毫克/千克患者的体重/天的范围内，通常1微克至1mg/千克体重/天的范围内。可以每天施用药物组合物1次，或在一天中以适当的间隔以2、3或更多个亚剂量的形式施用dsRNA，或甚至使用连续输注或通过缓释剂的递送来施用dsRNA。在该情况下，每一个亚剂量中包含的dsRNA必须相应地更小以获得总日剂量。还可以将剂量单位组合以用于数天的递送，例如使用提供dsRNA在数天时间内持续释放的常规持续释放制剂。持续释放制剂在本领域内是公知的并且对于试剂的阴道递送是特别有用的，例如其可与本发明的试剂一起使用。在该实施方案中，剂量单元包含相应的多个日剂量。
本领域技术人员应当理解，某些因素可影响有效地治疗受治疗者所必需的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或障碍的严重度、先前的治疗、受治疗者的一般健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，利用治疗有效量的组合物对受治疗者的治疗可包括单次治疗或系列治疗。可使用常规方法或基于使用适当的动物模型(如本文中其他地方描述的)的体内测试进行用于本发明包括的个别dsRNA的有效剂量和体内半衰期的评估。
在具体的实施方案中，按照标准技术制备包含本发明的脂质-核酸颗粒的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。通常地，生理盐水将用作药学上可接受的载体。其他适当的载体包括例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增强的稳定性的糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。在包含盐水或其他含盐载体的组合物中，优选在脂质颗粒形成后加入载体。因此，在形成脂质-核酸组合物后，可将组合物稀释到药学上可接受的载体例如生理盐水中。
可利用常规熟知的灭菌技术对所得的药物制剂进行灭菌。随后可包装水溶液以待使用或在无菌条件下过滤和冻干，在施用之前将冻干的制剂与无菌水溶液组合。组合物可按需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，脂质悬浮液可包含保护脂质在贮存中免受自由基和脂质-过氧化损害的脂质-保护剂。亲脂性自由基猝灭剂例如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂例如铁氧胺(ferrioxamine)是适合的。
药物制剂中脂质颗粒或脂质-核酸颗粒的浓度可广泛地变化，即按重量计算从低于约0.01％，通常约0.05-5％或至少约0.05-5％变化至高至10至30％，并且按照所选择的具体施用模式，主要根据流体体积或粘度等进行选择。例如，可增加浓度以降低与治疗相关的流体载荷。这在患有动脉粥样硬化相关充血性心力衰竭或严重高血压的患者中是特别需要的。可选地，可将由刺激性脂质组成的复合物稀释至低浓度以减轻施用位置的炎症。在一组实施方案中，核酸具有连接的标记并且可用于诊断(通过显示互补核酸的存在)。在该情况下，所施用的复合物的量将取决于所使用的特定标记、被诊断的疾病状态和临床医生的判断，但通常为约0.01至约50mg/千克体重(例如，核酸试剂的)，优选约0.1至约5mg/kg的体重。在某些实施方案中，施用的复合体包含约0.004至约50mg/千克体重的核酸试剂(例如约0.006mg/kg至约0.2mg/kg)。
如上文中所指出的，本发明的脂质-治疗剂(例如，核酸)颗粒可包含聚乙二醇(PEG)-修饰的磷脂类、PEG-神经酰胺或神经节苷脂Gm1-修饰的脂质或有效地阻止或限制聚集的其他脂质。此类成分的添加不仅仅阻止复合物聚集。相反，其还提供了用于增加循环周期和增加脂质-核酸组合物至靶组织的递送的方法。
本发明还以试剂盒形式提供脂质-治疗剂组合物。试剂盒通常由容器组合成，所述容器被分隔以用于容纳试剂盒的不同成分。试剂盒可以装有本发明的颗粒或药物组合物(优选以脱水或浓缩的形式存在)，具有用于它们再水化或稀释和施用的说明书。在某些实施方案中，颗粒包含活性剂，然而在其他实施方案中，它们不包含活性剂。
取决于需要局部还是需要全身性治疗和取决于待治疗的区域，可以以许多方法施用包含通过肝筛查模型鉴定的试剂的药物组合物。施用可以是局部的、肺部的，例如通过粉剂或气雾剂的吸入或吹入包括通过喷雾器、气管内的、鼻内的、表皮的和经皮肤的)、口服的或胃肠外的施用。还可设计施用以通过局部递送对特定组织的优先定位，例如通过直接关节内注射递送至关节中，通过直肠施用以直接递送至消化道和肠，通过阴道内施用以递送至宫颈和阴道，通过玻璃体内施用以递送至眼。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、关节内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂和粉剂。常规药物载体、，水性、粉状或油性基质，增稠剂等可以是必需或需要的。包被的避孕套、手套等也可以是有用的。优选局部制剂其中包括本发明的dsRNA与局部递送成分(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂或表面活性剂)混合的制剂。优选脂质和脂质体包括中性(例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴离子(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或DMPG)和阳离子(例如二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明的dsRNA可被封装在脂质体内或可形成复合体，特别是与与阳离子脂质体。可选地，可将dsRNA复合至脂质，特别地阳离子脂质。优选脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-癸酸单甘油酯、月桂氮酮(1-十二烷基氮杂环庚-2-酮)、酰基肉毒碱、酰基胆碱或C1-C10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂详细地描述于1999年5月20日提交的美国专利申请No.09/315,298(所述申请通过引用整体并入本文)中。
口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微粒、纳米颗粒、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片(minitablet)。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散辅助剂或粘合剂可以是需要的。优选的口服制剂是其中将本发明的dsRNA与一种或多种穿透促进剂表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。优选表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆酸和/或其盐。优选胆酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸、去氢胆酸、脱氧胆酸、谷氨胆酸(glucholic acid)、甘氨醇酸(glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺酸-24，25-二氢-夫西地酸钠和甘油二氢夫西地酸钠。优选脂肪酸包括花生四烯酸、十一酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸盐或酯、三癸酸盐或酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、月桂氮酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠)。也优选的是穿透促进剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。特别优选组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他穿透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的dsRNA可以以颗粒形式口服递送，包括喷雾干燥的颗粒或经复合以形成微粒或纳米颗粒。dsRNA络合剂包括聚氨基酸；聚亚胺类；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧杂环丁烷polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化明胶、白蛋白类、淀粉、丙烯酸盐类、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺类、短梗霉多糖、纤维素和淀粉。特别优选络合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、多组氨酸、多鸟氨酸、多精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨苯乙烯(例如对-氨基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(氰基丙烯酸异己酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D，L-乳酸)、多聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂和它们的制备详细地描述于美国申请No.08/886,829(1997年7月1日提交的)、No.09/108,673(1998年7月1日提交的)、No.09/256,515(1999年2月23日提交的)、No.09/082,624(1998年5月21日提交的)和No.09/315,298(1999年5月20日提交的)，每一个所述申请通过引用整体并入本文。
用于胃肠外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液，其还可包含缓冲剂、稀释剂和其他适当的添加剂例如但不限于穿透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体制剂。此类组合物可从多种成分产生，所述成分包括但不限于形成的脂质、自乳化固体和自乳化半固体。
可方便地以单元剂型存在的药物制剂可按照制药工业中公知的常规方法来制备。此类技术包括将活性成分与药学上载体或赋形剂结合在一起的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细粉末状固体载体或两者均匀且紧密地组合在一起，随后，必需时，给产品塑形，从而制得组合物。
可将组合物配制成许多可能的剂型的任何剂型，所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。还可将本发明的组合物配制为水性、非水性或混合的介质中的悬浮液。水性悬浮液还可包含增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，可配制药物组合物，并且以泡沫形式使用。药物泡沫可包括制剂例如但不限于乳剂、微乳剂、乳膏剂、凝胶剂和脂质体。虽然在性质上基本上相似，但这些制剂在成分和终产品的稠度上可变化。此类组合物和制剂的制备对于制药和制剂领域的技术人员来说通常是已知的并且可用于配制本发明的组合物。
本发明在其申请中不限定于下列描述中显示的成分的结构和排列的内容。本发明能够以多种方法进行和实施其他实施方案。同样地，本文中使用的措词和术语是为了描述目的并且不应被当作限定。“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“拥有”和其在本文中的变型意指包括其后所列的项和其等同物以及另外的项。
实施例
提供下列实施例进行举例说明，但不限制所述发明。
如本文中提供的实施例中所使用的，除非另外指明，否则术语“ApoE”是指ApoE3。
实施例1：用于Luc和FVII靶向的siRNA双链体。
下面的表8提供了用于Luc和FVII的靶向的示例性序列。
表8.
注意：L8是小写字母是2’-O-甲基修饰的核苷酸，*是硫代磷酸酯主链键合，fN是2′-氟核苷酸，dN是2′-脱氧核苷酸。
实施例2：使用阳离子脂质衍生的脂质体进行的FVII体内评估
体内啮齿类动物因子VII和ApoB沉默实验。C57BL/6小鼠(Charles RiverLabs，MA)和Sprague-Dawley大鼠(Charles River Labs，MA)通过以0.01mL/g的体积的尾部静脉注射接受所需制剂中的盐水或siRNA。在施用后不同的时间点时，通过异氟烷吸入麻醉动物，通过眶后放血(retro orbital bleed)将血液收集至血清分离管中。按照制造商方案使用显色测定法(Coaset Factor VII，DiaPharma Group，OH或Biophen FVII，Aniara Corporation，OH)测定样品中因子VII蛋白的血清水平。使用从盐水处理的动物收集的血清产生标准曲线。在其中评价肝mRNA水平的实验中，在施用后不同时间点时，处死动物，收获肝脏，将其快速冷冻于液氮中。将冷冻的肝组织研磨成粉末。制备组织裂解物，使用分支DNA测定法(QuantiGene Assay，Panomics，CA)测定因子VII和apoB的肝mRNA水平。
实施例3.用于FVII靶向的脂质体制剂
因子VII(FVII)是凝血级联中的主导蛋白质，在肝(肝细胞)中合成并且被分泌至血浆中。血浆的FVII水平可利用简单的基于平板的比色测定法来测定。这样，FVII代表用于测定肝细胞来源的蛋白质的sima-介导抑制以及监控核酸脂质颗粒和siRNA的血浆浓度和组织分布的方便模型。
小鼠中因子VII的敲低
在C57BL/6小鼠中，在静脉内(推注)注射后第24小时评估FVII siRNA-处理的动物中的FVII活性。按照制造商的说明书，在酶规模上(at a microplatescale)，使用用于测定血清或组织的蛋白质水平的商购可得的试剂盒测量FVII。以未处理的小鼠为对照，测定FVII的减少，将结果表示为残留FVII的百分比。在每一个新型脂质体组合物的初步筛选中使用4个剂量水平(2、5、12.5、25mg/kg FVII siRNA)，基于初步筛选中获得的结果在随后研究中扩大该剂量。
耐受性的测定
通过监控体重改变、笼边观察、临床化学和在某些情况下的血液学来评估每一种新型脂质体siRNA制剂的耐受性。在处理之前和处理后第24小时记录动物体重。数据记录为体重变化的百分比。除了体重测量之外，注射后第24小时每一个剂量水平(2，5，12.5和25mg/kg siRNA)上的完全临床化学组(包括肝功能指标)被获得，通过使用用于FVII分析收集的血清的等分试样。将样本送至兽医中心实验室(Langley，BC)进行分析。在某些情况下，在处理组中包括额外小鼠以允许收集全血进行血液学分析。
治疗指数的测定
治疗指数(TI)是通过比较毒性和活性的测量产生的任意参数。为了进行这些研究，TI被测定为：
TI＝MTD(最大耐受剂量)/ED50(用于50％FVII敲低的剂量)
将这些研究的MTD设置为引起超过7％的体重减少和超过200倍的丙氨酸氨基转移酶(ALT)(在啮齿类动物中对肝损伤具有良好特异性的临床化学指标)增加的最低剂量。从FVII剂量-活性曲线测定ED50。实施例1中提供的AD1661 siRNA以制剂的形式施用，该制剂含有下列摩尔比的DLin-M-C3-DMA∶DSPC∶Chol∶PEG-DMG∶ 2∶60∶7.5∶31∶1.5、50∶10∶38.5∶1.5和40∶20∶38.5∶1.5，并采用实施例2中描述的方法制备和测试。这些体内实验的结果提供于图1中，其证明了所测试的制剂的沉默能力。
实施例4.1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰甘油酯(PEG-DMG)的制备
1，2-二-O-十四烷基-5H-甘油酯Ia(30g，61.80mmol)和N，N′-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，23.76g，1.5eq)置于二氯甲烷(DCM，500mL)中并且在冰水混合物上搅拌。向搅拌的溶液中加入三乙胺(TEA，25.30mL，3eq)，随后使反应混合物在环境温度下搅拌过夜。利用TLC监控反应的进展。用DCM(400mL)稀释反应混合物，用水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)洗涤有机层，然后进行标准处理。在高真空下在环境温度下干燥所获得的残留物过夜。在干燥后，将所获得的粗制碳酸酯IIa溶解在二氯甲烷(500mL)中并且在冰浴中搅拌。在氩气下向搅拌溶液中加入mPEG2000-NH2(III，103.00g，47.20mmol，购自NOF Corporation，Japan)和无水吡啶(Py，80mL，过量)。随后使反应混合物在环境温度下搅拌过夜。在真空下除去溶剂和挥发物，将残留物溶解在DCM(200mL)中，然后装载在于乙酸乙酯中填充的硅胶柱上。首先用乙酸乙酯洗脱柱子，随后用含有5-10％甲醇的二氯甲烷梯度洗脱以提供白色固体形式的所需PEG-脂质IVa(105.30g，83％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20-5.12(m，1H)，4.18-4.01(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.10-2.01(m，2H)，1.70-1.60(m，2H)，1.56-1.45(m，4H)，1.31-1.15(m，48H)，0.84(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2660-2836。
IVb的制备
将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯Ib(1.00g，1.848mmol)和DSC(0.710g，1.5当量)一起置于二氯甲烷(20mL)中，在冰水混合物中冷却至0℃。加入三乙胺(1.00mL，3当量)，将反应物搅拌过夜。然后利用TLC监控反应，用DCM稀释，用水(2次)、NaHCO3溶液洗涤，通过硫酸钠干燥。减压除去溶剂，将所获得的残留物IIb在高真空下维持过夜。将该化合物直接用于下一步反应而无需进一步纯化。在氩气下将MPEG2000-NH2III(1.50g，0.687mmol，购自NOFCorporation，Japan)和IIb(0.702g，1.5当量)溶解在二氯甲烷(20mL)中。将反应物冷却至0℃。加入吡啶(1mL，过量)，搅拌反应物过夜。利用TLC监控反应。真空除去溶剂和挥发物，利用层析法(首先乙酸乙酯，然后5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)纯化残留物以获得白色固体形式的所需化合物IVb(1.46g，76％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.17(t，J＝5.5Hz，1H)，4.13(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.05(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.05-1.90(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.61-1.45(m，6H)，1.35-1.17(m，56H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2716-2892。
IVc的制备
将1，2-二-O-十八基-sn-甘油酯Ic(4.00g，6.70mmol)和DSC(2.58g，1.5当量)一起置于二氯甲烷(60mL)中，在冰水混合物中冷却至0℃。加入三乙胺(2.75mL，3当量)，将反应物搅拌过夜。然后利用TLC监控反应，用DCM稀释，用水(2次)、NaHCO3溶液洗涤，通过硫酸钠干燥。减压除去溶剂，将残留物IIb在高真空下维持过夜。将该化合物直接用于下一步反应而无需进一步纯化。在氩气下将MPEG2000-NH2III(1.50g，0.687mmol，购自NOF Corporation，Japan)和IIc(0.760g，1.5当量)溶解在二氯甲烷(20mL)中。将反应物冷却至0℃。加入吡啶(1mL，过量)，搅拌反应物过夜。利用TLC监控反应。真空除去溶剂和挥发物，利用层析法(乙酸乙酯，然后5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)纯化残留物以获得白色固体形式的所需化合物IVc(0.92g，48％)。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.22-5.15(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.06(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.80-1.70(m，2H)，1.60-1.48(m，4H)，1.31-1.15(m，64H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2774-2948。
实施例5：DLin-M-C3-DMA(即，(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基胺基)丁酸酯)的制备
将(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N，N-二甲基胺基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N，N-二甲基胺基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)的二氯甲烷(5mL)溶液在室温下搅拌过夜。用稀盐酸洗涤溶液，然后用碳酸氢钠水溶液洗涤。在无水硫酸镁上干燥有机馏分，过滤，在旋转蒸发仪上除去溶剂。使用1-5％甲醇/二氯甲烷的洗脱梯度使残留物向下流过硅胶柱(20g)。合并包含纯化的产物的馏分，除去溶剂，产生无色油(0.54g)。
可利用下列论文(所述论文通过引用整体并入本文)中描述的方法合成本发明的化合物：
1.Schlueter，Urs；Lu，Jun；Fraser-Reid，Bert.Synthetic Approaches To HeavilyLipidated Phosphoglyceroinositides.Organic Letters(2003)，5(3)，255-257.
2.King，J.F.；Allbutt，A.D.Can.J.Chem.1970，48，1754-1769
3.Mach，Mateusz；Schlueter，Urs；Mathew，Felix；Fraser-Reid，Bert；Hazen，Kevin C.Comparing n-pentenyl orthoesters and n-pentenyl glycosides asalternative glycosyl donors.Tetrahedron(2002)，58(36)，7345-7354.
实施例6：大鼠中具有不同脂质体组成的MC3脂质体的功效
为了检查含有MC3的脂质体制剂在大鼠中的剂量反应，基本上如实施例2中所述制备下列脂质体制剂。如下表中提供的，所包含的成分如下所示：MC3-DSPC-胆固醇-PEG-C14。下表9提供了测试的示例性制剂。
动物 Sprague-Dawley
总数 27
注射体积(μL)  5ul/g注射
如图2中所示，具有50mol％MC3的脂质体制剂在比具有40mol％MC3的脂质体制剂在略微更低的siRNA浓度上显示功效的剂量反应曲线。
实施例7：MC3脂质体的功效在小鼠中显示ApoE依赖性
为了进一步检查ApoE在各种脂质体制剂的功效中的作用，基本如实施例2中所述，以0.1、0.03和0.01mg/kg给野生型和ApoE敲除小鼠施用含有AD-1661 siRNA组合物的MC3脂质体。将一半脂质体制剂与重组ApoE蛋白预混合以确定在小鼠中外源添加ApoE是否可克服蛋白质的缺乏。
下文中的表10显示如所测试的示例性制剂。
表10
实验方案
动物     C57BL/6和ApoE敲除
总数     42
注射体积(μL)  基于体重是可变的
图3显示了当施用MC3配制的脂质体时，与剂量相关的野生型(右边条块)但非ApoE缺陷敲除小鼠(左边条块)的FVII蛋白水平的衰减，表明ApoE在细胞摄取和/或至肝的递送中的作用。以0.1、0.03和0.01mg/kg的浓度单独地或与ApoE脂质体预混合后施用如上所述用1661 siRNA配制的MC3脂质体。然而，在高得多的剂量(例如，约1.0mg/kg或以上)上，发现MC3-配制的制剂介导FVII mRNA和蛋白质的沉默(未显示)。如图3中显示，除非与重组ApoE预混合，否则所测试的MC3配制的脂质体制剂不能介导FVII在ApoE敲除小鼠中的沉默。因此，可通过将MC3(包含MC3的脂质体)与ApoE预混合在ApoE敲除小鼠中可以拯救活性。
实施例8：包含MC3的磷酸胆碱的摩尔百分比和尾长度变化的脂质体制剂的功效
为了检查磷酸胆碱的摩尔百分比和尾长度的变化对不同脂质体的制剂的功效的影响，以0.01或0.03mg/kg的浓度测试包含DSPC、DMPC和DLPC的不同制剂的FVII沉默的功效。
下文中的表11显示测试的示例性制剂：
实验方案
动物  C57BL/6
总数  45
注射体积(μL)  基于重量是可变的
图4显示MC3的摩尔百分比的变化(例如比较50和40摩尔百分比，而对于包含DMPC的制剂的情况，则比较50、40和30摩尔百分比)的效应。图4还显示中性脂质的变化的效应，对于包含DSPC、DMPC和DLPC的MC3脂质体制剂显示不同结果。
实施例9：GalNAc脂质至脂质体制剂的整合
为了探究潜在的替代递送机制，使用包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)缀合的脂质的脂质体制剂进行体内实验。选择GalNAc作为可能的靶向配体，因为已知GalNAc受体被认为在肝中高度表达。因此，基本上如实施例2中所述，在小鼠和大鼠中进行研究以测试含有MC3的脂质体制剂的功效，该脂质体制剂还进一步包含式III的GalNAc3-PEG-DSG脂质。在所有实验中，使PEG缀合的脂质的总量保持恒定(例如，加入0.5％mol的GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少0.5％mol)。实验中对于每基因型的9个组中的每一个组使用4只动物。
下文中的表12提供了包括具有5％PEG脂质浓度的含有MC3的脂质体的方法的实验细节，其中在C57BL6小鼠中测试制剂。脂质体包含下列相对摩尔量：50/10/35/5的MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG。加入0.5％GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至4.5％。
表12
实验方案
动物  C57BL6
总数  36
注射体积(μL)  基于重量是可变的
下文中的表13提供了包括具有10mol％的PEG-DSG脂质浓度的含有MC3的脂质体的方法的实验细节，其中在C57BL6小鼠中测试制剂。脂质体包含下列相对摩尔量：50/10/30/10的MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG。加入0.5％GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至9.5％。
表13
实验方案
动物  C57BL6
总数  36
注射体积(μL)  基于重量是可变的
图5显示在C57BL6小鼠中增加的PEG遮蔽减少了非-GalNAc介导的沉默的效应。利用C57BL6小鼠中5％和10％的PEG浓度，这得到了证明。以10mol％包含C18-PEG(即，PEG-DSG)有效地抑制沉默，这可通过用等摩尔量的GalNAc-脂质(即，式III的GalNAc3-PEG-DSG)替代0.5mol％的PEG脂质来克服。因此，增加的PEG遮蔽(例如，从5mol％至10mol％)显示减少非GalNAc介导的沉默，但也减少总体效能。
在大鼠中也进行相似的实验，其中以5mol％和10mol％将PEG脂质(也为PEG-DSG)包含在脂质体中。下文中的表14提供了关于包括具有5％PEG脂质浓度的含有MC3的脂质体的方法的实验细节，其中在大鼠中测试制剂。脂质体包含下列相对摩尔量：50/10/35/5的MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG。加入0.5％GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至4.5％。
表14
实验方案
动物  Sprague-Dawley大鼠
总数  36
注射体积(μL)  快速注射
下文中的表15提供了关于包括具有10％PEG脂质浓度的含有MC3的脂质体的方法的实验细节，其中在大鼠中测试制剂。脂质体包含下列相对摩尔量：50/10/30/10的MC3/DSPC/Chol/PEG-DSG。加入0.5％GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至9.5％。
表15
实验方案
动物  Sprague-Dawley
总数  36
注射体积(μL)  快速注射
图6显示以指定剂量给大鼠施用的包含5mol％和10mol％的C18 PEG的MC3制剂的结果。包含10mol％的PEG-DSG的制剂在测试的浓度(0.625-5mg/kg)上在大鼠中几乎未显示沉默。然而，包含0.5mol％的式III的GalNAc3-PEG-DSG(即，替代0.5mol％的C18-PEG)恢复了FVII的敲低。因此，当与小鼠比较时，在大鼠中，更高遮蔽的制剂通常更好地保持效能，如5mol％与10mol％的PEG浓度之间的差异所显示的。
实施例10：包含和不包含0.5mol％GalNAc3-PEG-DSG的含有MC3的脂质体制剂中成分的摩尔百分比的变化的评估
为了测定包含和不包含GalNAc3-PEG-DSG的具有不同摩尔百分比的成分的含有MC3的脂质体的功效，制备下列脂质体制剂，且在C57BL6小鼠中进行测试，基本上如上文实施例2中所述。按如下顺序提供表中描述的成分：MC3/DSPC/Chol./PEG-DSG。加入0.5％GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至4.5％，如下文表16中所显示的。
表16
动物  C57BL6
总数  33
注射体积(μL)  基于重量是可变的
如图7中所示，GlaNAc至脂质体制剂的添加促进了各制剂中FVII的沉默，即，其中MC3以50mol％、40mol％和30mol％的浓度存在。
实施例11：含有MC3和GalNAc的脂质体在WT和ASGPR KO小鼠中的功效
为了检查ASGPR在不同脂质体制剂的功效中的作用，如实施例1中所述，以3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg给野生型和ASGPR敲除小鼠施用包含AD-1661 siRNA的MC3脂质体。按如下顺序提供表中描述的成分：MC3/DSPC/Chol./PEG-DSG。加入0.5％的GalNAc3-PEG时，相应的PEG-DSG的量减少至9.5％，如下文表17中所示。
表17
实验方案
动物  C57BL6和ASGPr KO
总数  25+15
注射体积(μL)  基于重量是可变的
图8显示这些实验的结果，证明了当在缺少唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的小鼠品系中施用时，包含封装在GalNAc3-PEG-DSG脂质中的C18 PEG的制剂的FVII敲低的恢复被消除，所述唾液酸糖蛋白受体为GalNAc靶向部分的预期受体。
实施例12：寡核苷酸的合成
合成
在AKTAoligopilot合成仪上合成所有寡核苷酸。商购可得的可控孔度玻璃固体载体(dT-CPG，Prime Synthesis)和具有标准保护基团的RNA亚磷酰胺用于寡核苷酸合成，所述标准保护基团为5′-O-二甲氧基三苯甲基N6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基甲硅烷基-腺苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2′-叔丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧三苯甲基-N2-异丁基-2′-叔丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺和5′-O-二甲氧三苯甲基-2′-叔丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺(Pierce Nucleic Acids Technologies)。2′-F亚磷酰胺，5′-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2′-氟-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-氟-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺购自(Promega)。除了鸟苷以0.2M浓度(于THF/ANC(v/v)中)使用外，所有亚磷酰胺以0.2M浓度(于乙腈(CH3CN)中)使用。使用16分钟的偶联/再循环时间。激活剂是5-乙基硫代四唑(0.75M，American International Chemicals)；对于PO-氧化，使用碘/水/吡啶，对于PS-氧化，使用2，6-二甲基吡啶ACN(1∶1v/v)中的PADS(2％)。
使用含有对应配体的固体载体合成3′-配体缀合的链。例如，从羟脯氨醇-胆固醇亚磷酰胺将胆固醇单位引入序列中。通过6-氨基己酸酯键合将胆固醇系连至反式-4-羟脯氨醇以获得羟脯氨醇-胆固醇部分。从相应的Quasar-570(Cy-3)亚磷酰胺(购自Biosearch Technologies)合成5′-末端Cy-3和Cy-5.5(荧光基团)标记的siRNAs。配体至5′-末端和/或内部位置的缀合通过使用适当保护的配体-亚磷酰胺构建块来实现。在5-(乙基硫代)-1H-四唑激活剂存在的情况下使0.1M的无水CH3CN中的亚磷酰胺偶联至固体-载体结合的寡核苷酸，进行15分钟。通过使用标准碘-水(如(1)所报道的)或通过利用叔丁基过氧化氢/乙腈/水(10∶87∶3)处理氧化缀合的寡核苷酸10分钟来进行核苷酸间亚磷酸盐/酯至磷酸盐的氧化。通过使用硫转移试剂例如DDTT(购自AMChemicals)、PADS和/或Beaucage试剂将亚磷酸酯氧化成硫代磷酸酯来引入硫代磷酸酯。在室内合成胆固醇亚磷酰胺，以0.1M浓度(于二氯甲烷中)使用。用于胆固醇亚磷酰胺的偶联时间为16分钟。
脱保护I(核碱基脱保护)
在完成合成后，将载体转移至100mL玻璃瓶(VWR)。寡核苷酸在55℃下经过6.5小时与载体脱离，同时用80mL乙醇氨水的混合物[氨水∶乙醇(3∶1)]对碱基和磷酸基进行脱保护。将瓶子在冰上短暂冷却，随后将乙醇氨水混合物被过滤至新的250-mL瓶中。用2x 40mL部分的乙醇/水(1∶1 v/v)洗涤CPG 2次。随后通过旋转蒸发将混合物的体积减少至约30mL。随后在干冰上冷冻混合物，在真空离心浓缩仪(speed vac)上进行真空干燥。
脱保护II(2′-TBDMS基团的除去)
将干燥的残留物重悬浮于26mL的三乙胺、三乙胺三氢氟化物(TEA·3HF)或吡啶-HF和DMSO(3∶4∶6)中，在60℃下加热90分钟以除去2′位置上的叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团。随后用50mL 20mM乙酸钠猝灭反应，将pH调整至6.5。将寡核苷酸贮存在冰箱中直至纯化。
分析
在纯化之前利用高效液相色谱(HPLC)分析寡核苷酸，缓冲液和柱子的选择取决于序列的性质和/或缀合的配体。
HPLC纯化
利用反相制备型HPLC纯化配体缀合的寡核苷酸。利用在于室内填充的TSK凝胶柱上阴离子交换HPLC纯化未缀合的寡核苷酸。缓冲液为含有20mM磷酸钠(pH 8.5)的10％CH3CN(缓冲液A)和含有20mM磷酸钠(pH 8.5)的10％CH3CN、1M NaBr(缓冲液B)。包含全长寡核苷酸的级分进过混合，脱盐，然后冻干。将约0.15OD的脱盐寡核苷酸稀释在水中至150μL，随后用移液管转移进入专门的瓶中以进行CGE和LC/MS分析。随后利用LC-ESMS和CGE分析化合物。
siRNA制备
为了制备siRNA，将等摩尔的有义和反义链在1×PBS中于95℃下加热5分钟，缓慢冷却至室温。通过HPLC分析来确认双链体的完整性。
表18.用于Luc和FVII靶向的siRNA双链体
小写字母为2′OMe修饰，Nf为2′F修饰的核碱基，dT为脱氧胸苷，s为硫代磷酸酯。
实施例13：mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰甘油酯的合成
使用下列方法合成PEG-脂质例如mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰甘油酯：
mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰甘油酯
化合物4a(PEG-DMG)的制备：1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯1a(30g，61.80mmol)和N，N′-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，23.76g，1.5eq)置于二氯甲烷(DCM，500mL)中，在冰水混合物上搅拌。向搅拌的溶液中加入三乙胺(25.30mL，3eq)，随后使反应混合物在环境温度下搅拌过夜。利用TLC监控反应的进展。用DCM(400mL)稀释反应混合物，用水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)洗涤有机层，然后进行标准处理。在高真空下在环境温度下干燥所获得的残留物过夜。在干燥后，将所获得的粗制碳酸酯2a溶解在二氯甲烷(500mL)中并且在冰浴中进行搅拌。在氩气下向搅拌溶液中加入mPEG2000-NH2(3，103.00g，47.20mmol，购自NOF Corporation，Japan)和无水吡啶(80mL，过量)。在某些实施方案中，甲氧基-(PEG)x-胺具有x＝45-49，优选47-49以及更优选49。随后使反应混合物在环境温度下搅拌过夜。在真空下除去溶剂和挥发物，将残留物溶解在DCM(200mL)中，然后装载在于乙酸乙酯中填充的硅胶柱上。首先用乙酸乙酯洗脱柱子，随后用含有5-10％甲醇的二氯梯度洗脱以提供白色固体形式的所需PEG-脂质4a(105.30g，83％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20-5.12(m，1H)，4.18-4.01(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.10-2.01(m，2H)，1.70-1.60(m，2H)，1.56-1.45(m，4H)，1.31-1.15(m，48H)，0.84(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2660-2836。
4b的制备：将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯1b(1.00g，1.848mmol)和DSC(0.710g，1.5当量)一起置于二氯甲烷(20mL)中，在冰水混合物中冷却至0℃。加入三乙胺(1.00mL，3当量)，将反应物搅拌过夜。然后利用TLC监控反应，用DCM稀释，用水(2次)、NaHCO3溶液洗涤，于硫酸钠上干燥。减压除去溶剂，将所获得的残留物2b在高真空下过夜。将该化合物直接用于下一步反应而无需进一步纯化。在氩气下将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自NOF Corporation，Japan)和来自先前步骤2b的化合物(0.702g，1.5当量)溶解在二氯甲烷(20mL)中。将反应物冷却至0℃。向其中加入吡啶(1mL，过量)，搅拌反应物过夜。利用TLC监控反应。真空除去溶剂和挥发物，利用层析法(首先乙酸乙酯，然后5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)纯化残留物以获得白色固体形式的所需化合物4b(1.46g，76％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.17(t，J＝5.5Hz，1H)，4.13(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.05(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.05-1.90(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.61-1.45(m，6H)，1.35-1.17(m，56H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2716-2892。
4c的制备：将1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯1c(4.00g，6.70mmol)和DSC(2.58g，1.5当量)一起置于二氯甲烷(60mL)中，在冰水混合物中冷却至0℃。向其中加入三乙胺(2.75mL，3当量)，搅拌过夜。然后利用TLC监控反应，用DCM稀释，用水(2次)、NaHCO3溶液洗涤，通过硫酸钠干燥。减压除去溶剂，将残留物在高真空下维持过夜。将该化合物直接用于下一步反应而无需进一步纯化。在氩气下将MPEG2000-NH23(1.50g，0.687mmol，购自NOF Corporation，Japan)和来自先前的步骤2c的化合物(0.760g，1.5当量)溶解在二氯甲烷(20mL)中。将反应物冷却至0℃。向其中加入吡啶(1mL，过量)，搅拌过夜。利用TLC监控反应。真空除去溶剂和挥发物，利用层析(首先乙酸乙酯，然后5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)纯化残留物以获得白色固体形式的所需化合物4c(0.92g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.22-5.15(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.06(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.80-1.70(m，2H)，1.60-1.48(m，4H)，1.31-1.15(m，64H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。测得MS范围：2774-2948。
实施例14：挤出法的一般方案
将脂质(式I的阳离子脂质、DSPC、胆固醇、DMG-PEG)溶解，按照所需的摩尔比混合在乙醇中。利用将混合的脂质加入pH 5.2的乙酸钠缓冲液的乙醇注射法形成脂质体。这导致脂质体在35％乙醇中自发形成。将脂质体通过0.08μm聚碳酸酯膜挤出至少2次。在乙酸钠和35％乙醇中制备siRNA原液，将其加入脂质体以进行装载。将siRNA-脂质体溶液于37℃下温育30分钟，随后进行稀释。利用透析或切向流过滤除去乙醇和交换至PBS缓冲液。
实施例15：用于在线混合法的一般方案
制备单个的和分开的原液：一种包含脂质，另一种包含siRNA。通过溶解在90％乙醇中制备包含式I的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质的脂质原液。剩余的10％为低pH柠檬酸盐缓冲液。脂质原液的浓度为4mg/mL。取决于所使用的致融性脂质的类型，该柠檬酸盐缓冲液的pH可在pH 3-5的范围内变化。也将siRNA以4mg/mL的浓度溶解于柠檬酸盐缓冲液中。对于小规模而言，每一种原液制备5mL。
在与siRNA组合前，原液完全澄清，且脂质必须被完全溶解。因此可加热原液至完全溶解脂质。该过程中使用的siRNA可以是未修饰的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸，并且可与亲脂部分例如胆固醇缀合。
通过将每一种溶液泵送至T-接头来组合单个原液。将双头Watson-Marlow泵用于同时控制两个液流的起始和终止。将1.6mm聚丙烯管道进一步压缩成0.8mm管道以增加线流速度。将聚丙烯线(ID＝0.8mm)连接至T接头的任一侧。对于4.1mm3的所得体积，聚丙烯T具有1.6mm的线性边界。聚丙烯线的每一个大末端(1.6mm)被放置进包含溶解的脂质原液或溶解的siRNA的试管中。在T接头之后放置单个管道，其中组合液流将发射。随后将管道伸入具有2倍PBS体积的的容器中。快速搅拌PBS。将泵的流速设置在300rpm或110mL/分钟。利用透析除去乙醇和交换成PBS。随后使用离心或透析过滤将脂质制剂浓缩至适当的工作浓度。
实施例16：[6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯](式I的阳离子脂质或MC3)的合成
醇2的制备
将60L THF和5.73Kg(20.4mol)亚油酸载入干净、干燥的200L装配有氩气入口和热电偶套管的玻璃反应器。使用丙酮-干冰浴将反应器的内容物冷却至低于0℃。向该冷溶液中缓慢加入13.8L含有红铝(Vitride)(60％wt/vol)的甲苯，维持反应物的内部温度低于0℃。(注意：红铝的开始加入是放热的并且观察到起泡。在加入后15分钟起泡停止)。红铝的加入花费3小时45分钟。在完成加入后，将反应混合物在环境温度下搅拌2小时。取出等分，用饱和Na2SO4猝灭，针对起始酸的存在利用TLC分析所获得的粗产物。TLC显示反应完成，再次将反应混合物在约45分钟内冷却至0℃以下。在45分钟内缓慢地向反应混合物中加入饱和硫酸钠溶液(通过将1.1Kg硫酸钠溶解在1.5L水中而制备)。在完成加入后，在搅拌下，在30分钟的时间内加入25L乙酸乙酯。在45分钟的时间内将所获得的反应混合物通过硅藻土床过滤，用另外的17L乙酸乙酸洗涤硅藻土床以从残留物移去全部产物。减压浓缩组合的有机物。将残留物溶解在15L乙酸乙酯中，用水(2×7L)洗涤有机层，通过硫酸钠(1.1Kg)进行干燥。在过滤后，减压浓缩有机层，在高真空下干燥以获得油形式的产物亚麻醇。粗产量＝5.5Kg(理论产量＝5.43Kg)。在下一步骤中使用该产物而无需进一步纯化。
制备甲磺酸亚油醇酯3的方法
将45L DCM和5.5Kg来自步骤1的粗制产物载入干净、干燥的200L装配有氩气入口和热电偶套管的全玻璃反应器。向该溶液中加入11.5L三乙胺，然后加入0.252Kg(2.0mol)DMAP。利用干冰丙酮混合物将该混合物冷却至-10℃，然后在3小时的时间内逐滴向该冷反应物质中加入含有甲磺酰氯(3.2L，41.3mol)的DCM(10L)溶液同时使温度维持低于0℃。在完成加入后，将反应混合物在0℃下搅拌1小时，之后反应混合物的TLC(5％的DCM中的EtOAc；PMA染色)显示起始醇完全消失。向该反应混合物中加入17L冰冷的水，使层分离。再次用10L DCM洗涤上面含水层，然后使层分离。用2×10L的稀盐酸(通过将2L浓盐酸HCl与18L的反渗透水(RO water)混合而制备的)，用2×7.5L的水和10L的盐水(通过将11Kg NaCl溶解在10L反渗透水中制备的)洗涤组合有机层。分离有机层，在Na2SO4(2.75Kg)上干燥，然后过滤。减压蒸发有机层，并且真空干燥以获得淡黄色油形式的粗制甲磺酸。粗产量＝7.1Kg(理论产量＝7.1Kg)。在下一步骤中使用该物质而无需进一步纯化。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.42-5.21(m，4H)，4.20(t，2H)，3.06(s，3H)，2.79(t，2H)，2.19-2.00(m，4H)，1.90-1.70(m，2H)，1.06-1.18(m，18H)，0.88(t，3H).13C NMR(CDCl3)δ＝130.76，130.54，128.6，128.4，70.67，37.9，32.05，30.12，29.87，29.85，29.68，29.65，29.53，27.72，27.71，26.15，25.94，23.09，14.60。C19H36O3S的分子量，计算值344.53，测得值343.52(M-H)。
亚油烯基溴化物4的制备
将25L DMF和7.1Kg来自步骤2的粗制产物载入干净、干燥的200L装配有氩气入口和热电偶套管的全玻璃反应器。用干冰丙酮混合物将该混合物冷却至-10℃。在1.5小时的时间内向该搅拌的混合物中加入含有溴化锂(2.7Kg，31.0mol)的25LDMF溶液同时使温度维持低于0℃。在完成加入后，将反应混合物在45℃下搅拌18-20小时，直到等分试样的TLC(10％的己烷中的EtOAc；PMA染色)显示起始甲磺酸的完全消失。用70L水稀释反应混合物，用57L己烷提取。用2×10L己烷进一步提取水层，再次用2×10L水和1×10L盐水(通过将14Kg氯化钠溶解在10L水中而制备)洗涤合并的有机层(约120L)。通过硫酸钠(4Kg)干燥所获得的有机层(120L)，减压浓缩以获得粗产物(6.5Kg)。使用60-120目硅胶，利用己烷作为洗脱剂通过柱层析纯化粗产物。浓缩纯产物提供5.5Kg(81％，3个步骤)的无色液体形式的溴化物4。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.41-5.29(m，4H)，4.20(d，2H)，3.40(t，J＝7Hz，2H)，2.77(t，J＝6.6Hz，2H)，2.09-2.02(m，4H)，1.88-1.00(m，2H)，1.46-1.27(m，18H)，0.88(t，J＝3.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3)δ＝130.41，130.25，128.26，128.12，34.17，33.05，31.75，29.82，29.57，29.54，29.39，28.95，28.38，27.42，27.40，25.84，22.79，14.28。
二亚油烯基甲醇6的制备
用氩气对干净的、干燥的20L装配有氩气入口、回流冷凝器和热电偶套管的全玻璃反应器进行脱气和清洗。将277g(11.3mol)活性镁，然后1.5L无水醚载入反应器中。再次使用氩气对反应器进行脱气和清洗三次。在氩气下将溴化物4(2.5Kg，7.6mol)溶解在5L无水醚中，将1L该溶液加入反应器中，然后加入25mL(0.35mol)二溴甲烷。使用水浴将反应器的内容物加热至40℃(观察到泡腾现象，然后回流，表明格里纳德试剂形成的开始)。在反应开始后，从反应器移去加热，在2小时30分钟的时间内缓慢加入剩余的4L溴化物，维持混合物的温和回流。在完成加入后，再次加热反应混合物至回流(水浴温度45℃)，进行1小时，之后用水猝灭反应混合物的等分试样，利用TLC(Hexanes，PMA染色)进行分析，TLC显示起始溴化物的完全消耗。使用冰浴将反应混合物冷却至10℃以下，在2小时30分钟的时间内加入甲酸乙酯的醚溶液(275mL于4L的醚中)，完成加入后，将反应混合物温热至室温，搅拌1小时。将反应混合物冷却回10℃，向混合物中缓慢添加丙酮(1.15L)，然后加入7L冰冷的水和10％的硫酸溶液(通过用34L冰冷的水稀释3.4L硫酸而制备)。用3×10L醚提取产物，用10L盐水洗涤组合的有机层，通过硫酸钠(2Kg)干燥。减压浓缩有机层提供了粗产物(2Kg)，为所需二亚麻醇和少量O-甲酰基化产物的混合物。将该粗产物重新溶解在THF(4L)中，将其装载至20L玻璃反应器中。向该溶液中加入NaOH(0.934Kg溶解于8L冰冷的水中)，将内容物在65℃下加热18小时，之后TLC(含有10％醚的己烷)显示O-甲酰基化产物完全转化成所需二亚油烯基甲醇。冷却反应混合物，利用醚(3×4L)提取，用5L盐水洗涤合并的有机层，在硫酸钠(4Kg)上进行干燥。过滤，然后浓缩有机层提供了粗产物。使用含有4％的醚己烷，利用60-120目硅胶，通过柱层析法纯化所获得的粗产物。浓缩纯产物馏分提供了无色液体形式的纯6(1.45Kg，80％)。NMR(400MHz，CDCl3)δ5.47-5.24(m，8H)，3.56(dd，J＝6.8，4.2，1H)，2.85-2.66(m，4H)，2.12-1.91(m，9H)，1.50-1.17(m，46H)，0.98-0.76(m，6H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ130.41，130.37，128.18，128.15，77.54，77.22，76.91，72.25，37.73，31.75，29.94，29.89，29.83，29.73，29.58，29.53，27.46，27.43，25.89，25.86，22.80，14.30。
[6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七烷基-6，9，28，31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯]MC3(8)的制备：
将二亚油烯基甲醇6(144g，272mmol)溶解在1L二氯甲烷中，向其中加入二甲基氨基丁酸7的盐酸盐(55g，328mmol)，然后加入二异丙基乙胺(70mL)和DMAP(4g)。在室温下搅拌5分钟后，加入EDCI(80g，417mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜，之后TLC(硅胶，5％MeOH于CH2Cl2中)分析显示起始醇完全消失。用CH2Cl2(500mL)稀释反应混合物，用饱和NaHCO3(400mL)、水(400mL)和盐水(500mL)洗涤。通过无水Na2SO4干燥合并的有机层，真空除去溶剂。利用快速柱层析法[2.5Kg硅胶，使用下列洗脱剂i)用6L 0.1％NEt3的DCM填充的柱子；在装载后ii)4L 0.1％NEt3的DCM；iii)16L 2％的MeOH-98％的含有0.1％NEt的DCM；iv)4L 2.5％MeOH-97.5％的含有0.1％NEt3的DCM3；v)12L的3％MeOH-97％的含有0.1％NEt3的DCM]纯化所获得的粗产物(180g)以分离无色油形式的纯产物8(MC3，159g，91％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ5.46-5.23(m，8H)，4.93-4.77(m，1H)，2.83-2.66(m，4H)，2.37-2.22(m，4H)，2.20(s，6H)，2.10-1.96(m，9H)，1.85-1.69(m，2H)，1.49(d，J＝5.4，4H)，1.39-1.15(m，39H)，0.95-0.75(m，6H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ173.56，130.38，130.33，128.17，128.14，77.54，77.22，76.90，74.44，59.17，45.64，34.36，32.69，31.73，29.87，29.76，29.74，29.70，29.56，29.50，27.44，27.41，25.84，25.55，23.38，22.78，14.27。EI-MS(+ve)：C43H79NO2(M+H)+的分子量计算值：642.6，测得值：642.6。
实施例17.使用预形成的小囊泡的siRNA制剂
使用预形成的小囊泡法制备含有阳离子脂质的颗粒。将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质分别以40/10/40/10的摩尔比溶解在乙醇中。将脂质混合物加入水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)，混合至终乙醇和脂质浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/mL，使其在室温下平衡2分钟，然后挤出。使用Lipex挤出机(Northern Lipids，Vancouver，BC)在22℃下将水化脂质通过两个叠加的80nm孔径大小的过滤器(Nuclepore)挤出，直至获得70-90nm直径的小囊泡，如通过Nicomp分析测定的。这通常需要1-3次通过。对于不形成小的小囊泡的某些阳离子脂质混合物，利用更低的pH缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 3)水化脂质混合物以质子化DSPC头基上的磷酸基帮助形成稳定的70-90nm小囊泡。
通过混合以约5mL/分钟的速率向预平衡至35℃的小囊泡中加入FVIIsiRNA(溶解在含有30％乙醇、50mM柠檬酸盐、pH为4的水溶液中)。在获得0.06(wt/wt)的终靶siRNA/脂质比率后，使混合物在35℃下进一步温育30分钟以使小囊泡再组织和封装FVII siRNA。随后利用透析或切向流透析过滤来实现除去乙醇和用PBS(155mM NaCl，3mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，pH 7.5)替换外部缓冲液。在使用大小排阻旋转柱或离子交换旋转柱除去未封装的siRNA后，测定最终封装的siRNA对脂质的比率。阐释残留FVII的百分比对剂量(mg/kg)的剂量反应曲线于图9进行了举例说明。
实施例18.式I的阳离子脂质的pKa测定
使用荧光探针2-(对-甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)(其在水中是无荧光的，但当与膜结合时变得略有荧光)，基本上如所描述的(Eastman等人1992Biochemistry 31：4262-4268)测定式I的阳离子脂质的pKa。于pH在2至11的范围内变化的缓冲液(130mM NaCl，10mM CH3COONH4，10mM MES，10mM HEPES)中将由阳离子脂质/DSPC/CH/PEG-c-DOMG(40∶10∶40∶10的摩尔比)组成的小囊泡稀释至0.1mM。将TNS水溶液(终浓度1μM)的等分试样加入稀释的小囊泡中，在30秒平衡期后，在分别为321nm和445nm的激发波长和发射波长下测量含TNS的溶液的荧光。通过将所测量的荧光对溶液的pH作图并使用商业绘图程序IgorPro将数据与Sigmodial曲线拟合来测定含有阳离子脂质的小囊泡的pKa。式I的阳离子脂质的pKa滴定曲线示于图10中。

Claims (18)

1.式I的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐。
2.包含如权利要求1所述的阳离子脂质的脂质制剂。
3.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含45-65％的式I的阳离子脂质、5-10％的中性脂质、25-40％的固醇和0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质。
4.如权利要求3所述的脂质制剂，其中，所述中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、POPC、DOPE和SM。
5.如权利要求3所述的脂质制剂，其中，所述固醇是胆固醇。
6.如权利要求3所述的脂质制剂，其中，所述PEG修饰的脂质为PEG-C14至PEG-C22、PEG-Cer14、PEG-Cer20或PEG-DSPE。
7.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含治疗剂，其中，所述治疗剂包含核酸。
8.如权利要求7所述的脂质制剂，其中，所述核酸选自siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、免疫刺激性核酸或U1接头。
9.如权利要求8所述的脂质制剂，其中所述核酸为siRNA，并且脂质：siRNA的比为3至15。
10.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含至少一种载脂蛋白。
11.如权利要求2所述的脂质制剂，其还包含靶向脂质。
12.如权利要求11所述的脂质制剂，其中，所述靶向脂质包含N-乙酰基半乳糖胺。
13.如权利要求11所述的脂质制剂，其中，所述靶向脂质以0.001％至5％的摩尔量存在于所述脂质制剂中。
14.如权利要求11所述的制剂，其中，所述靶向脂质是选自式II、和式III的化合物：
GalNAc3-DSG
GalNAc3-PEG-DSG。
15.如权利要求2所述的脂质制剂，其包含50％的式I的阳离子脂质、10％的中性脂质、38.5％的固醇和1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。
16.如权利要求7所述的脂质制剂在制备用于将治疗剂递送至细胞的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述治疗剂是dsRNA。
18.如权利要求17所述的用途，其中，所述治疗剂是反义寡核苷酸、siRNA或核酶。
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