KR100832614B1 - 경구섭취가능한 미슬토 렉틴 제제 및 방법 - Google Patents

Abstract

미슬토 렉틴Ⅰ(ML-Ⅰ), 미슬토 렉틴Ⅱ(ML-Ⅱ), 미슬토 렉틴Ⅲ(ML-Ⅲ)을 필수구성 성분으로 하는 경구섭취가능한 제제로서, 이는 특히 미슬토 추출물에 존재하는 구토 유발 화합물을 배제한다. 본 발명은 또한 상기 제제를 제조하는 방법과 약제학적 제제를 제조하기 위해 상기 제제를 사용하는 방법 및 암과 자가 면역질환으로 고통받는 환자의 치료에 상기 제제를 사용하는 방법을 제공한다.

미슬토 렉틴, 아르기닌, 항암작용

Description

경구섭취가능한 미슬토 렉틴 제제 및 방법{ORALLY INGESTIBLE PREPARATION OF MISTLETOE LECTINS AND METHOD}

본 발명은 미슬토(mistletoe)로부터 얻어지는 의학적으로 유용한 제제, 이러한 제제를 제조하는 방법 및 이러한 제제를 이용한 치료방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은, 입으로 섭취할 수 있는 것으로 암이나 다른 질병들의 치료에 유용한 미슬토 렉틴 제제에 관한 것이다.

렉틴과 면역제어(immunomodulation)

면역체계의 세포독성(cytotoxic) 세포들, 세포용해 T세포(CTL), 자연킬러(NK)세포 및 대식세포(macrophage)들은 스스로 또는 적합한 활성화에 의해 종양세포를 찾아내서 용해시켜버린다. 종양세포에 대한 자발적인 세포독성 활동은 주로 NK세포에 의한 것이다. 다양한 시토카인(cytokine)이 단독으로 또는 조합하여 항종양활성을 증대시키는 것으로 알려져 왔다: IL-2, IL-7, IL-12 및 IFN-γ는 NK세포와 T세포에서 세포독성 반응을 유발하는 반면, IFN-γ와 TNFα들은 대식세포와 단핵세포(monocyte)의 강력한 활성제(activator)이다. 이러한 효과를 증명한 연구의 대부분이 생체 외에서의 실험으로 제한되어 왔지만, 최근에 이러한 시토카인들의 항암효과가 동물 뿐 아니라 인간에 대한 생체실험을 통해 증명되었다. 많은 양 의 IL-2 존재하에 배양된 림프구(lymphocyte)들은 림포카인활성화 킬러(LAK)세포로 불린다. LAK세포들은 NK-저항성 종양세포를 주조직적합성 복합체(MHC) 제한 없이도 죽일 수 있는 능력으로 특징된다. 비록 LAK 활성에 NK세포와 T세포들이 관여하지만, NK세포가 이러한 활성의 대부분을 중개하는데 관여한다. 대식세포와 단핵세포들은 종양 주변에 축적되는 것으로 알려져 있다. 상기 세포들의 활성이 TNFα와 IFN-γ에 의해 자극되고 나서, 즉시 이 활성화된 세포들로부터 시토카인이 종양 내로 국부적으로 방출된다. 이것이 차례로 아폽토시스(apoptosis)를 유발시켜, 궁극적으로 종양세포를 죽게 만든다.

시토카인 이외에도 다양한 천연의 또는 합성된 단백질 혼합물들이 면역제어 특성을 보이는 것으로 보고되고 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 미슬토 추출물은 이러한 제제들의 카테고리에 속한다. 생화학적 분석을 통해서 면역제어 활성은 상기 추출물 내의 미슬토 렉틴(ML-I, ML-II 및 ML-III)의 존재에 기인한다는 것을 알게 되었다.

미슬토 추출물과 암치료에의 사용

미슬토 추출물은 특히 오스트리아, 스위스 및 독일의 진료소에서 80년이 넘도록 암치료에 사용되어 왔다. 이런 추출물의 사용은 미슬토의 유효 항암 성분의 실질적인 특성에 관한 지식부족 때문에 전통적인 “학교 의약(school medicine)”의 관련자들에 의해 맹렬히 비난받아왔다. 최근의 연구로 미슬토 추출물에 존재하는 정제된 렉틴((ML-I, ML-II 및 ML-III)이 면역제어특성과 세포독성 특성을 둘 다 가지고 있는 것이 명확하게 밝혀졌다. 그리하여 “학교 의약”을 옹호하는 사람들 에 의하여 제기되었던 논쟁은 상당부분 더 이상 의미가 없어졌다.

그러나, 상기 미슬토 추출물을 이용한 치료방법에는 몇가지 불편한 점이 있다. 먼저, 상업적으로 이용할 수 있는 추출물들은 그 조성에 있어서 매우 다양하기 때문에, 연구와 치료법들을 신뢰할 수 없게 된다. 더 나아가서 일반적으로 미슬토는 독성이 있다고 알려져 있다. 그래서 암환자를 치료하기 위한 잘 알려진 임상적인 치료 방법은 피하주입(subcutaneous injection)에 의한 것이었다. 그러나, 최근의 연구를 통해서 세륨글리코단백질(serum glycoprotein)이 암환자에게 주입된 미슬토 렉틴에 효과적으로 결합하여 그 효력을 최소화 시킨다는 것이 알려졌다. 이는 피하 경로가 별로 효과적이지 않다는 것을 알려준다. 따라서 대체적인 전달 방법이 요구되고 있다.

식이렉틴과 종양의 성장

1994년 이후의 일련의 간행물(참고문헌 참조)들에 나타난 바와 같이, NMRI 쥐에 강낭콩(Phaseolus vulgaris), 식물성혈구응집제(PHA) 또는 미슬토 렉틴(ML-I)을 포함하는 식사를 먹임으로써, 복막내 또는 피하의 비-호지킨림프종(non-Hodgkin lymphoma) 종양의 성장을 줄일 수 있음을 알게 되었다. 다른 관찰에서 Balb/c 쥐에 PHA가 포함된 식사를 제공함으로써 피하형질세포종양(MPC-11)이 크게 감소하였다. 장 효소의 단백질 분해 효과에 대해 저항성이 있는 렉틴은 소화관(alimentary canal)에서 생물학적 활성을 갖는다. 실험동물의 식사에 렉틴이 첨가되면, 렉틴은 위장점막 표면에 부착되어 완전 가역적으로 작은창자의 투여량-의존적인 과다증식을 유발시킨다. 동시에 자극된 창자의 성장에 따라 PHA는 장내강(intestinal lumen)으로부터 아미노산과 다른 영양분들의 광범위한 흡수를 유발한다. 과다증식의 징후 전에, 창자 점막 내에서 세포외 폴리아민의 광범위한 축적이 일어난다. 폴리아민은 세포증직을 조절하는 일련의 중요한 메카니즘에 있어서 역할을 하는 분자들이고, 특히 종양의 성장에 관련된다.

종양세포가 주입된 때에 따른 PHA를 포함하는 식사를 쥐에게 먹이는 타이밍의 중요성을 연구하는 실험에 있어서, 특정한 날들에 식사를 바꾸었다. 종양세포들을 주입한 날과 동시에 락트알부민을 기초로한 식사를 PHA가 보충된 식사로 대체하자 종양세포의 숫자가 놀랄만큼 줄어들었다. 최근의 실험에서는, 확립된 NHL 종양을 가지고 있는 쥐의 식사에 PHA가 첨가되면, 종양의 성장이 크게 저지되었다. 예비적인 데이터에서는 PHA를 쥐에게 먹였더니 TNFα의 생성이 증가했다고 보고되어 있다. ML-1의 경구투여에 대한 반응으로, 이식된 NHL 종양에 있어서의 가속화된 세포의 변형으로 인해, 사행성의 비정상적인 죽은 세포의 증가된 영역과 함께 아폽토시스를 일으키는 세포의 수가 증가되고, 렉틴을 먹인 쥐에서 무생육성 세포들이 두배로 증가된 면적을 차지하고 있었다. 아폽토시스는 ML-I을 먹인 쥐의 종양에서 많이 나타나고, 이는 종양의 전이말단과 강력한 림프구 응집체내에서의 무생육성 종양세포들의 눈금말단표지(nick end-labelling) 주변 영역에 의해 인식된다. 종양부위에 대한 형태학적 연구에 의해, 종양의 혈관신생(vascularization) 발생률이 크게 감소하는 것이 확인되었고, 이는 ML-1이 항혈관생성(anti-angiogenic) 인자의 생성을 유도한다는 것을 나타낸다. 정제된 ML-III를 이용한 최근의 실험들을 통해 확립된 NHL 종양을 가지고 있는 쥐에게 렉틴을 먹이면, 더 이상의 종양의 성장을 줄이는데 매우 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

정제된 미슬토 렉틴이 경구용으로 처방되었을 때 내용력이 있다는 것은 동물 모델들에 있어서 잘 알려졌지만, 정제된 미슬토 렉틴은 매우 비싸고 제조하는데 시간이 많이 들기 때문에 치료방법으로는 이상적이지 못하다. 그래서 경구로 투여할 수 있고, 제조비용이 저렴한 미슬토 렉틴의 제조 및 관련된 치료 방법이 요구된다.

미슬토가 독성이 있다고 일반적으로 알려져 있지만, 1754년 발견의 결과에 관한 최근의 연구에서 미슬토의 우연한 섭취가 심한 독성과 관련이 없다는 것을 알게 되었다. 그러나 미슬토 추출물에는 구토를 유발하는 성분이 들어 있다. 알칼로이드(alkaloid)와 비스코톡신(viscotoxin)을 포함하는 이러한 구토 유발물질들은 지금껏 미슬토 추출물의 의학적 유효성에 있어 중요한 부분으로 간주되어 왔다(예컨대, 미국특허 제 5,637,563호 및 제 5,547,674호 참고). 그 결과, 이전에는 인간에게 만족스럽게 경구 투여될 수 있는 미슬토 제제를 제조하기 위한 어떠한 노력도 이루어지지 않았다.

정제된 미슬토 렉틴을 제조하기 위한 과정은 R. Eifler, K. Pfuller, W. Gockeritz 및 U. Pfuller의 “Lectins: Biology, Biochemistry and Clinical Biochemistry" vol.9(1993) pp.141-151에 기술되어 있으며, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.

그러나, 본 발명의 출원인은 Eifler 등이 3가지 개별적인 미슬토 렉틴(ML-I, II 및 III)을 분리하고 정제하기 위하여 사용한 복잡한 과정이 치료용으로 경구섭취 가능한 렉틴제제의 제조에 적합하지 않다는 것을 인식하였다. 그 이유는:

(ⅰ) 본 발명의 출원인은 종양세포를 주입한 날과 같은 날에 쥐의 식사에 ML-I을 첨가할 때, 대조구에 비해 비-호지킨림프종 종양의 중량을 감소시킨다는 것을 밝혀내었다. 명확한 투여량-반응(dose-response)이 관찰되었다. ML-1의 최대 투여량을 투여했을 때 25%의 동물에서 종양이 완전히 제거되었다. 또한, 본 출원인은 최근에 Krebs II세포(비-호지킨림프종)의 피하주입이 있은지 5일 후에 쥐의 식사에 정제된 ML-III를 넣어 먹였을 때 확립된 종양의 성장이 멈추었다는 것을 확인하였다. 3종의 렉틴들은 서로 다른 생물학적 성질들(예컨대, 당에 결합성)을 가지고 있으므로, 이들을 별개로 공급하는 것 보다 함께 조합할 때 더 잘 작용할 것이다. 그래서 개별적인 렉틴을 정제하는 것은 의학적 관점에서 비생산적이다.

(ⅱ) 3종의 렉틴에 대한 완전한 정제 과정은 상당한 시간을 소비한다.

(ⅲ) 본 발명에 따른 렉틴의 제조는 놀랍게도, 당 업계의 통념과 다르게 경구섭취가 가능하다. 따라서, 다른 단백질들에 의한 약간의 오염은, 렉틴 이외의 단백질들은 소화효소에 의하여 분해될 것이므로 어떠한 큰 문제를 나타내지 않는다.

그래서 본 출원인은, 미량의 불순물을 포함할 수는 있지만, 구토를 유발하는 화합물은 배제한, 렉틴 ML-I, ML-II 및 ML-III를 포함하는 미슬토 렉틴 제제를 제조하기 위하여 Eeifler 등의 방법을 수정하고 개선하였다.

본 발명의 목적들과 유리한 점

경구투여에 의해 미슬토 렉틴을 제공하는 명확한 장점은 창자 점막에 결합하여 엔도시토시스된 많은 양의 렉틴이 집합임파소절(Peyers Patches)의 림프구로 안 내되어, 주된 시토카인 반응을 유도한다는 것이다. 관찰된 바에 의하면, PHA를 쥐에 먹인 후에 비장 중량의 상당한 감소가 나타난다. 이는 집합임파소절의 림프구로부터 시토카인이 방출되므로써 림프구의 혈액순환내로의 주된 방출 때문일 수 있다. 미슬토 추출물들이 피하로 주사되었을때, 림프조직에 도달할 수 있는 소량의 렉틴에 의해서는 상기의 반응을 일으킬 수 없을 것으로 생각된다. 또한 환자의 관점에서, 미슬토 렉틴 제제를 경구로 투여하는 것이 주사하는 것 보다 훨씬 더 참을만하고, 편하다.

동물 모델 시스템, 발표되지 않은 연구 및 간행된 데이터에 대한 관찰을 바탕으로, 본 발명에 따른 미슬토 렉틴제제의 경구투여에 따른 다음의 면역제어 효과들이 제안되었다:

1. ML이 창자의 점막에 강하게 결합.

2. ML이 작은 창자의 점막을 통하여 효과적으로 엔도시토시스.

3. 엔도시토시스된 ML이 집합임파소절의 림프구에 접합.

4. 시토카인의 방출과 NK 세포 등의 활성화를 위한 자극.

5. 항혈관생성 인자의 생산 및 방출.

6. 종양세포에 대한 세포독성 효과.

7. 종양세포의 혈관신생 감소.

8. 종양세포를 죽게 만드는 아폽토시스의 유도.

경구섭취에 의한 면역제어효과에 더하여, 미슬토 렉틴 제제는 또한 직접접촉을 통하여 종양에 대해 직접적인 세포독성효과를 나타낸다. 상기 제제중의 개별적 인 미슬토 렉틴은 2개의 체인 A와 B로 이루어진다. 체인 B는 종양세포 표면의 수용체에 결합하여 체인 A의 엔도시토시스를 일으킨다(체인 A를 종양세포 내부로 내재화). 체인 A는 N-글리코시다제 활성을 나타내고, 그 결과 리보솜 28S RNA를 특이적으로 분해시키고, 더 나아가 단백질 합성을 억제하여 종양세포를 죽게 만든다.

본 발명의 요약

미슬토 렉틴의 제조 및 방법

본 발명에 의하면, 구토 유발 물질은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 미슬토 추출물로부터 제거된다. 제조된 제제는 렉틴 ML-I, ML-II 및 ML-III로 구성된다. 상기 제제는, 구토를 유발하지 않으며 상기 제제의 생물학적/의학적 효과를 감소시키지 않는 미량의 다른 성분들을 포함할 수도 있다.

2차적인 의학적 징후와 사용방법

본 발명에 따르면, 미슬토 렉틴 제제는 천연 화학적 조성물로 투여될 수 있으며, 또는 영양보조제 및/또는 관절염, 류마티스, 천식 및 폐기종과 같은 자가면역질환 뿐 아니라 암의 치료 및 일반성 피로로 고통받는 환자들의 치료를 위하여 치료유효량을 투여될 수 있는 약제학적 제제를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 투여는 경구, 직장, 비강, 국소, 질 또는 에어로졸 투여, 또는 흡입이나 방광주입에 적합한 형태일 수 있다.

아르기닌과 함께 사용

실시예에 기재된 것과 같이, 본 출원인은 경구 아르기닌 섭생과 함께 투여되 면 미슬토 렉틴 제제의 효과가 증대된다는 것을 밝혀내었다. L-아르기닌은 일반적으로 NO 도너(donor)로 설명될 수 있다. 아르기닌이 종양에서 내피 기능을 증가시켜, 종양 내의 혈관 벽이 단단해져서 글루코스와 단백질이 쉽게 통과할 수 없게 된다. 이는 차례로 종양의 영양상태를 악화시키는데, 이는 미슬토 렉틴 제제의 유사한 메카니즘과 효과를 보조한다. 아르기닌은 또한 면역 시스템을 자극하는 것으로 관찰되었는데, 이것 또한 미슬토 렉틴 제제의 유사한 효과를 보조한다.

도 1은 본 발명에 따라 미슬토 렉틴 제제를 제조하기 위한 방법의 도식적 설명도이다.

도 2는 미슬토 렉틴 제제에 대한 겔 전기용동을 나타낸 도면이다.

도 3은 환자들과 대조구로부터의 혈액샘플에 대한 겔 전기용동을 나타낸 도면이다.

제조 및 방법

도 1에 따라, 미슬토 렉틴 제제를 제조하기 위하여 다음 방법이 사용된다:

미슬토의 원료: Norsk Medisinaldepot(또는 일반적으로 붉은 겨우살이(Viscum album))으로부터의 Visci Alba Herba 4mm.

1. 푸드 프로세서(food processor)를 사용하여 미슬토를 분말화한다.

2. 0.2M 아세트산(중량(w/w)기준으로 5배량)을 혼합. 4℃에서 밤새도록 교반 한다.

3. 남은 식물의 거친부분을 거친 직물을 통한 여과로 제거한 후, 혼탁함을 제거하기 위해 240mm 종이 필터를 통해 여과한다.

4. 약 5g의 SP-Sephadex 양이온 교환기/1.0리터의 미슬토 조추출물을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 행한다.

5. 280nm에서의 흡광도가 0.05 미만이 될 때까지 컬럼을 0.15M 아세테이트 완충액으로 세정한다. 이 단계는 양이온 교환기에 결할할 수 있는 능력이 없는 성분을 제거한다.

6. pH 8.0의 0.1M Tris-HCl과 0.5M NaCl을 포함하는 완충액을 사용하여 ML-I, II 및 III 렉틴을 함께 용출시킨다.

7. 280nm에서의 흡광도가 1.0을 초과하는 분획들을 모아서, 10부피의 PBS(-NaCl)로 밤새도록(4℃) 투석한다. 투석막은 저분자량의 분자들을 제거하기 위하여 MW 10,000의 컷오프값(cutoff)을 갖는다.

8. 제제를 1ml씩 분액하여, 저장을 위해 -20℃에서 동결한다.

본 발명의 방법은 다음과 같은 여러가지 점에서 Eifler 등의 방법과 다르다:

a) 렉틴을 최대한 추출하기 위하여 아세트산과 함께 교반하는 기간이 늘어났다.

b) 혼탁도가 없는 추출물을 얻기 위하여는, 거친 직물로 처음 여과하고 나서 종이필터를 사용하여 여과하는 것이 중요한 것으로 밝혀졌다.

c) 종이로 여과된 아세트산 추출물은 양이온 교환기에 미리 혼합되기 전에 컬럼에 펌프로 공급되었다. 이는 특히 큰 부피를 다룰 때 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다.

d) 농축되고 의약적으로 효과적인 미슬토 렉틴 제제를 얻기 위하여, 280nm에서의 흡광도가 높은(>1.0) 분획들만을 선택적으로 회수하여 모아두었다.

e) 경구섭취하는 제제이기 때문에, 모아둔 분획들은 저분자량의 성분들을 제거하고, NaCl의 농도를 줄이기 위하여 염이 없는 완충액으로 투석하였다.

미슬토 렉틴 제제의 특성

1) 최종 투석된 결과물의 단백질 함량을 Bradford의 방법에 의하여 측정한 바, 250㎍/㎖였다.

2) 최종 투석된 결과물 1ml의 흡광도는 280㎚에서 3을 초과하였다.

3) 제제에 존재하는 단백질은 도 2에 도시된 바와 같이, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기용동을 통하여 측정된다. 중요한 밴드들은 미슬토 렉틴의 서브유니트로 추정되는 29~35kDa 범위의 단백질들과 일치하였다.

4) 생물학적인 활성은 세포독성분석을 통하여 확인되었는데, 이 세포독성분석에서는 새로이 심어진 CHO 세포들의 성작을 억제하는 ML의 능력이 테스트되었다.

5) 본 발명에 따른 제제의 안정성은 5주에 걸쳐서 체크되었다. 제제는 4℃, 실온, -20℃ 및 -80℃에서 안정한 것으로 판명되었다. 제제는 그의 생물학적인 활성에 영향을 미치지 않으면서 최소한 5번을 얼렸다가 급속하게 녹일 수 있었다. 그러나, 70℃ 또는 그 이상에서 최소한 5분동안 가열하면 생물학적 활성의 100%를 잃 는다. 이는 미슬토 차를 만들기 위하여 끓는 물을 사용하는 전통적인 방법은 미슬토 렉틴을 생물학적으로 효력없이 만들어버린다는 것을 의미한다.

사용 방법

본 발명의 한 측면에 따라서, 암이나 또는 자가면역 질병과 같은 다른 질병으로 고통받는 사람들에게 면역제어 반응을 유도하기 위하여, 치료유효량의 미슬토 제제를 경구투여한다. 바람직한 구체예에서 제제는 매일의 아르기닌 경구섭생과 함께 투여된다.

본 발명의 다른 측면에 따라서, 미슬토 렉틴 제제는 직접적인 세포독성 반응을 유도하기 위하여, 본 발명의 제제와 종양세포들간의 직접 접촉을 제공하기 위한 방법으로 투여된다.

투여량의 결정:인간 자원자들에서의 제제에 대한 생물학적 반응:ML에 대한 항체들

정제된 ML-1이 쥐에 경구투여되면, 그 후에 혈액에서 항체가 검출된다(Lavelle 등, Immunology 2000, 99, 30-37; 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다)는 것이 알려져 있다.

본 발명에 따라, 인간이 강화된 미슬토 제제를 경구섭취하고 나서 미슬토 렉틴에 대한 생물학적 반응이 유발되는지 여부를 알아보기 위하여, 다음의 방법이 채용되었다. 항체의 잠재적 원료로 혈청을 사용하는 면역탁본법(immunoblotting)이 수행되었다. 도 3에서 보이는 바와 같이 객체 A의 혈청은 음성이지만, 객체 B의 혈청은 양성이다. 객체 B가 몇 달동안 본 발명의 제제를 경구섭취한 것에 반하여 객 체 A(B의 남편)는 섭취하지 않았다. 따라서, 이 방법은 제제의 적합한 투여량이 결정될 수 있도록, 즉 항체 반응을 촉진시키는데 충분한 렉틴을 경구 공급하면서 객체를 모니터하는데 사용된다.

원래는 일주일에 3번 1ml씩 월요일-수요일-금요일에 6주동안 투여하였다. 이 투여량은 소장 수용체의 탈포화반응(desaturation)을 허용하기 위하여 날을 바꿔가면서 투여되었다. 제제와 종양 자체간의 직접 접촉도 바람직한 대장의 종양에 있어서는, 먼저 소장에 있는 수용체를 포화시켜 렉틴이 종양 위치에 도달할 수 있도록 투여량을 늘릴 필요가 있을 수 있다는 것이 관찰되었다.

다음의 투여방식이 현재 가장 좋은 임상 효과를 제공하는 것으로 판명되었다.

1ml의 앰플로 제공되는 본 발명의 제제를 (소화의 편의를 위하여) 2dl의 물 또는 차가운 음료수에 혼합하고, 월요일 1ml; 수요일 2ml 및 금요일 1ml로 일주일에 3번 섭취한다. 아르기닌을 매일 아침과 저녁에 섭취한다. 아르기닌의 적합한 용량은 체중에 따른다. 바람직한 구체예에 있어서, 체중 kg당 0.001 내지 0.01g까지의 아르기닌이 사용된다. 소화를 쉽게하기 위하여 아르기닌은 2dl의 물 또는 다른 음료수에 혼합된다.

인간 자원자들로부터의 실시예들

지금까지 서로 다른 암을 앓고 있는 150명 이상의 환자들을 단일 환자 조사(single-patient survey)에 포함시켰다. 어떤 선택 기준들도 적용되지 않았다. 소화계, 신경계, 서로 다른 형태의 부인과 암 및 피부암 말기인 환자들이 포함되었 다.

환자들은 각각 암세포학 부서의 스탭에 의해 치료되어졌으며, 더 이상의 치료가 없거나 또는 병원 치료의 마지막 단계에 있었다. 모든 환자들은 좋지 않은 건강상태에 있었다. 이러한 유형의 환자 그룹에 경구 렉틴이 긍정적인 형태의 치료를 제공할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 요구되었다.

주기적으로 혈액샘플을 취하여 다른 유형의 실험(CT, X-선, 초음파)들을 행하였다. 필요한 정보를 제공하는 환자와의 치료 상담은 이 치료에서 중요하였다.

지금까지 이러한 유형의 치료를 통해 얻은 경험의 요약

A. 환자들 중 약 10%에 있어서 종양의 크기(1차 및 2차종양 모두)가 줄어드는 것이 관찰되었다. CT, X-선 및 초음파를 통해 확인하였다.

B. 환자들 중 약 25%에 있어서 복강(peritoneal cavity) 내에 물이 차고 종양 주변이 부어오르는 등의 이차 징후가 감소하면서 종양의 성장이 지체되었다.

C. 다른 30%의 환자들은 그들의 상태가 안정화 되면서 종양의 성장이 억제되었다.

D. 또 다른 30%의 환자들은 치료가 없는 경우에 예상되는 것 보다 훨씬 천천히 종양의 성장이 진행되었다.

E. 대략 5% 정도의 환자들이 아무런 반응을 보이지 않았다.

인간 자원자들에 대한 초기 시도에 있어서, 몇 명은 β-엔돌핀 생성의 명확한 증세를 경험하였다. 이는 환자들 중 100%가 기분좋은 "따뜻함(warmness)"과, 일반적으로는 보다 양호한 일반적인 상태(“편안한(ease)" 느낌)를 느꼈다고 보고되 었다. 이에 더하여 소화기능이 개선되고, 고통 수준이 크게 낮아진 것을 경험하였다고 보고되었다.

상기 제제를 복용한 환자들은 그렇지 않은 환자들에 비하여 화학요법 및/또는 방사선요법 동안에 높은 내성 수준을 갖는다는 명확한 징후가 있었다.

지금까지 어떠한 형태의 부작용도 보고된 바 없다.

상기 제제는 류마티스 장애와 같은 자가 면역 질병으로 고통받는 환자들 중에서 제한된 수의 환자들에 대한 치료에 사용되어왔다. 상기 치료는 관절이 부어오르는 것을 줄여 눈에 띄는 효과를 나타내고, 고통 수준을 낮추어 삶의 질을 전반적으로 향상시키는 것으로 보고되었다. 류마티스 장애를 갖는 환자들에 대한 일반적인 효과는 치료를 받았던 암환자들이 경험했던 것과 유사하다.

개별적인 케이스

다음은 특별한 관찰에 따른 몇가지 예들을 나타낸다:

A. 척추로 전이된 말기 전립선 암환자(몸져 누워있다)는 1998년 11월에 그의 의사에게서 생존가능기간이 몇주간이라는 의견을 들었다. 본 발명의 제제를 2달동안 경구섭취하면서 그의 건강은 그의 아들의 50번째 생일파티에 참석할 수 있을 정도로 빠르게 좋아졌다.

B. 극심한 복부통증을 가지고 있는 23살의 여성은 위암으로 진단받았다. 그녀는 그녀의 위를 제거하는 수술을 받을 예정이다. 미슬토 렉틴 제제를 이용한 치료를 시작하였다. 5일동안 그녀는 상당히 통증이 줄어들었다고 했다. 10일 후(수술 전 4일)에 그녀는 위경검사(gastroscopy)를 받았다. 위종양(플럼의 크기)은 그 크 기가 눈에 띄게 줄어들어 있어서 수술은 연기되었다. 두달 후 새로운 위경검사에서 종양이 발견되지 않았으므로, 그녀는 증상이 사라졌다고 발표하였다. 이것은 상기 제제의 종양세포에 대한 직접적인 세포독성 효과 때문인 것이 거의 확실하였다.

C. 55세의 남성으로, 1972년에 궤양 때문에 Bilroth II 위절제수술을 받았다. 2000년에 복막(peritoneum)으로 전이된 소화기관의 선암종(adenocarcinoma)으로 진단받았다. 수술은 불가능했다. 완화를 위한 화학요법 치료를 하였다. 치료에 대한 반응이 없어서 예측(prognosis)하기가 어려웠다. 본 발명에 따른 제제로 치료하고 나중에 아르기닌을 더하자 건강 상태가 안정화 되었다. 치료후 1년이 지나고 나서 복부 CT에서 복수(ascites), 전이 및 원래의 종양이 실질적으로 없어졌다.

D. 림프계와 복막으로 전이된 난소암에 걸린 49세의 여성. 임상학적으로 선암종이었다. 수술 불가능. 즉시 본 발명의 제제로 치료를 시작하였다. 3주 후에 생검법(biopsy)이 사용되는 침습적 처치술(staging procedure)에서 종양과 전이가 발견되지 않았다. 그 결과 어떠한 화학 또는 방사선 치료가 필요하지 않게 되었다. 정상적인 건강에 가깝도록 임상적으로 개선되었다. 이 환자는 상기 제제와 아르기닌만으로 치료를 받아왔다.

E. 1998년 유방암으로 진단받은 55세의 여성. 수술, 방사선 및 호르몬 치료를 하였지만, 여전히 폐와 뼈로의 전이가 진행중이다. 상기 제제와 아르기닌으로 치료한지 6주가 지나고 나서, X-선과 초음파 스캔을 통해 종양과 전이의 크기가 줄어든 것을 알게 되었다. 임상학적으로 더 활기를 되찾았고 고통은 없었다. 더 이상 진통제를 사용하지 않았다.

F. 34세의 여성. 6년 전에 자궁암이었고, 골반으로 전이되었다. 미슬토 제제로 치료를 시작하였다. 3주 후 침습적 처치술에서 종양은 그 크기가 눈에 띄게 줄어들어 있었다. 상기 제제를 이용한 치료와 동시에 방사능, 화학치료 및 체온저하법(hypothermia)을 시작하였다. 결과:종양이나 전이가 발견되지 않았다.

작용 메커니즘

관찰된 환자 데이터는 경구 제공된 미슬토 렉틴(ML)의 다음의 성질과 일치하며, 이러한 미슬토 렉틴(ML)은 종양 성장에 음성이다.

Ⅰ) 종양과 소장 사이에 영양인자에 대한 경쟁을 유도하는 소장증생 자극.

Ⅱ) 종양으로의 림프구(lymphocyte) 침투 자극.

Ⅲ) 대식세포(macrophage)와 림프구(예, tumor necrosis factor-α)로부터 종양으로 시토카인의 국소 방출. 이것들은 종양에 유해하고 성장을 감소시킨다.

Ⅳ) NKC(natural killer cells)가 활성화 되어 종양세포를 "공격"한다.

Ⅴ) Ⅱ), Ⅲ), Ⅳ)의 결과로서 종양에서 아폽토시스가 일어난다.

Ⅵ) 항혈관신생반응은 종양에 있는 모세혈관수를 현저히 감소시킨다. Ⅰ)과 함께 종양에 대한 영양분 공급이 감소된다.

Ⅶ) 만약 종양이 (예로서, 위나 대장)에 노출되면, 미슬토 렉틴이 세포독성 효과를 발휘할 수 있다. 즉, 종양세포에 의한 미슬토 렉틴의 섭취는 단백질 합성저해를 통해서 세포의 죽음을 야기시킨다.

약제학적 제제

본 발명에 따른 미슬토 렉틴 제제는 원료 그대로의 화학적 조성으로서 치료 에 사용이 가능하지만, 약제학적 제제의 형태로 미슬토 렉틴을 제공하는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 대상은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및 가능한 다른 치료 또는 질병예방 성분들과 함께, 미슬토 렉틴 제제 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염이나 그의 유도체를 포함하는 약제학적 제제이다. 상기한 담체는 제제중의 다른 성분들과 양립 가능하고, 환자에게 위험이 없어야한다는 점에서 허용가능한 것이어야 한다.

약제학적 제제는 흡입 및 방광주입 뿐만 아니라 경구, 직장, 비강, 질을 통한 투여에 적합한 것을 포함한다.

미슬토 렉틴 제제는 통상의 첨가제, 담체, 또는 희석제와 함께 정제, 충진 캡슐, 또는 용액과 같은 액체, 혼합물, 유화액, 엘릭시르, 또는 이것들로 채워진 캡슐등의 형태로 1회분의 투여량을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는데 사용될 수 있고, 이들 모두는 직장 투여를 위한 좌약의 형태뿐 아니라 경구 섭취를 위한 것이다.

이러한 약제학적 조성물과 이들의 개별 투여량은 통상의 성분 또는 실효성분을 함유하고, 이러한 투여 형태는 예정된 매일의 투여 범위에 따라서 어떠한 효과적인 농도의 유효성분을 포함할 수 있다. 1회분 투여량 단위당 약 0.25mg의 미슬토 렉틴 제제를 함유하는 제제가 적합한 농도의 전형적인 예이다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 넓은 범위의 투여 형태로 투여될 수 있다. 미슬토 렉틴 제제를 함유하는 약제학적 제제를 제조하는데 사용되는 담체는 고체 및 액체 물질 모두를 포함할 수 있다. 고체 투여 형태는 가루, 정제, 알약, 캡슐, 좌약, 또는 분산가능한 과립을 포함할 수 있다. 고체 담체는 희석제, 풍미료, 용매, 윤활제, 현탁제, 결합제, 보존제, 정제분해제, 캡슐화 물질로서 작용하는 하나 또는 그 이상의 물질들 일 수 있다.

분말형태에서, 담체는 유당, 하이드록시프로필메틸셀룰로즈, 및 PVP를 함유하는 미분말화된 고체이며, 적당한 양의 미분말화된 미슬토 렉틴 제제와 혼합된다.

분말 및 정제 형태를 위한 적당한 담체는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 유당, 펙틴, 덱스트린, 보강제, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로즈, 소듐카복시메틸셀룰로즈를 포함한다. "제제"라는 용어는 유효성분이 담체와 회합 또는 비회합의 상태로 캡슐화 물질내에 밀봉되어있는, 캡슐이나 당함유 정제를 포함하는 투여 형태들을 포함하는 의미이다.

좌약은 녹는점이 낮은 왁스를 녹이고, 녹은 왁스내에 미슬토 렉틴 제제를 분산시키므로써 제조된다. 그다음, 녹은 균질한 혼합물을 주형에 부어서 냉각시킨다.

질투여에 적합한 제제는 유효성분이외에 당해 기술분야에서 알려진 적당한 담체를 포함하는 압축제, 탐폰, 크림, 젤, 연고, 거품, 또는 스프레이로서 제공될수 있다.

액체형태로 된 제제는 적당한 색소, 풍미료, 안정화제, 또는 희석제등과 함께 예컨데, 수용액 또는 프로필렌글리콜용액과 같은 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 또한 소비 직전에 액체형태로 전환될 고체형태의 제제도 포함된다. 이러한 형태는 유효성분이외에 인공색소, 풍미료, 안정화제, 완충제, 천연 또는 인공 감미 료, 분산제, 증점제, 용해제등을 포함할 수 있다.

표피에 국소 투여를 위해, 미슬토 렉틴 제제는 연고, 크림, 젤, 피부 세정제, 경피 고약의 형태로 제공될 수 있다. 연고와 크림은 적당한 증점제 및/또는 젤의 첨가와 함께 수성 베이스 또는 유성 베이스로 제제화될 수 있다. 피부 세정제는 수성 베이스 또는 유성 베이스로 제제화될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 증점제, 방향제를 함유할 수 있다.

구강에 국소투여하기에 적합한 제제는 액체 담체내에 유효성분을 함유하는 구강 세정제뿐 아니라 슈크로즈, 아라비아 껌과 같은 불활성의 풍미 베이스내에 유효성분을 포함하는 당함유 정제를 포함한다.

용액 또는 혼합물은 드롭 또는 스프레이와 같은 통상의 방법을 사용하여 비강내에 직접 투여될 수 있다. 본 발명의 제제는 1회분 또는 수회분의 투여 형태로 제조될 수 있다. 수회분의 투여 형태는 미리 정한 제제의 양을 제공하는 점적기, 파이펫, 또는 분무기를 포함한다.

호흡기관에 투여하는 것은 압입 용기에 CFC, 트리클로로플루오르메탄, 다이클로로플루오르메탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체와 같은 적당한 분무제와 함께 유효성분이 들어있는 에어로졸 제제의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 이 투여는 적당한 밸브 시스템에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 약제학적 제제는 되도록이면 적당한 양의 유효성분을 함유하는 1회분의 투여 단위로 제공된다. 1회분의 투여는 팩키지 또는 가능한한 측정 장치를 포함하는 키트로서 제공될 수 있다.

아래의 모든 간행물 및 논문은 본 명세서에 참조문헌으로 특별히 포함되었다.

Claims (36)

1. 필수적으로 미슬토 렉틴Ⅰ(ML-1), 미슬토 렉틴Ⅱ(ML-Ⅱ) 및 미슬토 렉틴Ⅲ(ML-Ⅲ)으로 구성되며, 구토 유발 화합물이 없고, 포유류에 의해 경구 섭취될 수 있는 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 포유류가 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 구토 유발 화합물이 알카로이드 및 비스코톡신으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 조성물의 단백질 함량이 250㎍/ml 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 각각의 ML 서브유니트의 분자량이 29~35kDa인 것을 특징으 로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 조성물 1ml의 흡광도가 280nm에서 3.0 보다 큰 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 구토 유발 화합물이 전혀 없으며, 필수적으로 미슬토 렉틴Ⅰ(ML-Ⅰ), 미슬토 렉틴Ⅱ(ML-Ⅱ) 및 미슬토 렉틴Ⅲ(ML-Ⅲ)으로 구성되는 경구섭취가능한 조성물의 제조방법:

   ⅰ) 붉은 겨우살이(Viscum album) 조각으로 이루어진 출발 물질을 분말화하는 단계,

   ⅱ) 분말화된 물질의 용액을 만들기 위해, 상기 분말화된 물질과 중량기준으로 3~10배량의 0.2M 아세트산을 혼합하고, 상기 용액을 1~8℃사이의 온도에서 12 ~ 24시간 교반하는 단계,

   ⅲ) 상기 용액의 혼탁함을 제거하기 위해 직물로 용액을 여과한 후, 종이필터로 다시 여과하는 단계,

   ⅳ) 양이온 교환기에서 상기 ⅲ)의 조추출물을 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계,

   ⅴ) 상기 칼럼을 280nm에서 흡광도가 0.5 미만이 될 때까지 0.15M 아세테이트 완충액(pH4.0)으로 세정하는 단계,

   ⅵ) 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)과 0.5M NaCl을 포함하는 완충액을 사용하여 ML-Ⅰ, ML-Ⅱ 및 ML-Ⅲ를 함께 추출하는 단계,

   ⅶ) 280nm에서 흡광도가 1.0보다 큰 분획들을 모아서 10배부피의 PBS(-NaCl)로 4℃에서 밤새 투석시키는 단계,

   ⅷ) 최종 추출물을 적당량으로 분액하는 단계.
10. 제 9항에 있어서, 상기 ⅱ)단계에서 상기 용액이 중량기준으로 5배량의 0.2M 아세트산을 포함하고, 12시간동안 교반하며, ⅳ)단계에서 미슬토 조추출물 1리터당 5g의 SP-세파덱스 양이온 교환기를 사용하며, ⅶ)단계에서 모은 분획들을 컷오프 크기가 분자량 10,000인 막을 사용하여 투석시키는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, ⅷ)단계의 분액양이 1ml인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 약제학적으로 허용가능한 보조제, 희석제, 충진제, 부형제 및 보존제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암, 및 관절염, 류마티스, 천식 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가 면역질환 치료용 약제학적 제제.
13. 제 12항에 있어서, 경구 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
14. 제 12항에 있어서, 직장 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
15. 제 12항에 있어서, 비강 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
16. 제 12항에 있어서, 질 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
17. 제 12항에 있어서, 국소 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
18. 제 12항에 있어서, 흡입에 의한 투여에 적합한 투여 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 효과를 증진시키기 위해 적합한 투여량으로 투여되는 보충 물질의 존재 또는 부재하에서, 적합한 투여량으로, 암, 및 관절염, 류마티스, 천식 및 폐기종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가 면역질환을 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 21항에 있어서, 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 21항에 있어서, 직장으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 21항에 있어서, 비강으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 제 21항에 있어서, 질로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 제 21항에 있어서, 국소적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 제 21항에 있어서, 흡입에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 제 21항에 있어서, 상기 적합한 투여량이 비연속일로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 상기 적합한 투여량이 1주일에 3번 1ml씩 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 31항에 있어서, 상기 적합한 투여량이 1주일에 1ml씩 2일 및 1ml가 투여된 날들 사이의 하루는 2ml로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 제 21항에 있어서, 조성물의 효과를 증진시키기 위한 보충 물질이 아르기닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 34항에 있어서, 아르기닌 투여량이 매일 아침 및 저녁으로 체중 kg당 0.001~0.01g인 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 1항, 제 3항 또는 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 아르기닌 및 투여량 측정장치를 포함하는 밀폐 패키지를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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