DE4229876A1

DE4229876A1 - Verfahren zur Gewinnung von Lektinen aus Mistelpflanzen

Info

Publication number: DE4229876A1
Application number: DE19924229876
Authority: DE
Inventors: Rudolf Dr Eifler; Uwe Dr Pfueller; Wolfgang Dr Goeckeritz; Karola Dr Pfueller; Michael Dr Gelbin; Aleks Dr Tonevitcij
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1992-09-04
Publication date: 1994-03-10

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der rei nen Mistellektine, die aufgrund ihrer biospezifischen Bin dungseigenschaften und ihrer biologischen Wirksamkeit als solche oder nach chemischer Veränderung bzw. Verbindung mit anderen Molekülen für biologische, biotechnologische, ana lytische, diagnostische und therapeutische Anwendungen von Interesse sind (H. Franz, Advances in Lectin Research, Vol. 4, Berlin 1991, Ullstein & Mosby). Von besonderer Bedeutung sind die Lektine oder davon abgeleitete Untereinheiten so wie Derivate und Konjugate für die Krebstherapie (A. G. Tonevitsky et al., Int. J. Immunopharmac., Vol. 12, No. 7, pp. 1037-1041, 1991).

Für die präparative Isolierung der Mistellektine I, II und III (ML I, ML II, ML III) ist bisher ein Verfahren bekannt, das in 40%iger Ausbeute Lektinpräparate von begrenzter Rein heit und Stabilität ergibt [H. Franz et al., Biochem. J., Vol. 195 (1981)] und nicht die exakte Trennung der Lektine I-III erlaubt.

Die Auftrennung des Lektins ML I in die isomeren Lektine ML I-1 und ML I-2 wurde bisher nicht beschrieben.

Das Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Gewin nung der Mistellektine zu entwickeln, welches auf rationelle Weise und in hohen Ausbeuten bei verbesserter Reinheit bio logisch aktive und haltbare Lektinpräparate ergibt.

Das Ziel der Erfindung wird durch Realisierung der Ansprüche 1, 8 und 9 erreicht, die Unteransprüche sind Vorzugsvarian ten.

Das erfindungsgemäße Verfahren läuft folgendermaßen ab. Homogenisierte frische oder getrocknete, zerkleinerte Mistelpflanzen werden kurze Zeit mit destilliertem Wasser gerührt, und der resultierende filtrierte Extrakt wird mit Essigsäure angesäuert. Nach Zentrifugation wird der Überstand mit einem geeigneten Kationenaustauscher, bevorzugt SP-Sephadex, gerührt. Der Austauscher adsor biert die lektinhaltige Proteinfraktion, die nach Waschen mit einer Pufferlösung mit einem basischen Puf fer höherer Ionenstärke eluiert wird. Aus der Rohlektin lösung werden die Lektine biospezifisch an einen geeig neten Affinitätsträger, vorzugsweise an Lactosyl-Sepha rose, gebunden. Die retardierten Lektine II und III werden mit isotonischer, phosphatgepufferter 0,8-1%iger Kochsalzlösung (pH 7,5) eluiert, und das ML I wird nach folgend biospezifisch mit galaktosehaltigen Lösungen eluiert. Die ML II/III-Fraktion wird an einem Kationen austauscher, vorzugsweise eine Mono-S-Säule, mit der FPLC-Technik in ML II und ML III getrennt. Durch Rechro matographie am gleichen Kationenaustauscher wird das ML I in die Lektine ML I-1 und ML I-2 aufgetrennt (vgl. Abb. 1 und 2).

Das ML I wird in Ausbeuten bis zu 90% erhalten; die Lek tine ML II, ML III sowie ML I-1 und ML I-2 werden in Ausbeuten zwischen 65 und 80% isoliert. Die absoluten isolierten Lektinmengen schwanken stark je nach Ernte zeitpunkt und Wirtsbaum der Mistelpflanze.

Wesentlich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Ver fahrens sind eine rasche Arbeitsweise, die vorgeschaltete Abtrennung störender Pflanzeninhaltsstoffe und die Anwen dung leistungsfähiger Trennsäulen nach den Methoden der FPLC und HPLC.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals die Isolierung aller bisher nachgewiesenen Lektine aus der Mistel in einem Verfahrensgang einschließlich der erst mals aufgefundenen und erfindungsgemäß isolierten Lektine ML I-1 und ML I-2.

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbei spiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1. Reagenzien und Ausgangsstoffe

Mistelpflanzen (Viscum album L. oder andere Spezies) von verschiedenen Wirtsbäumen; als Frischpflanze, getrock netes Pulver oder Misteltee.

Essigsäure, 2M
Acetatpuffer, 0,1 M, pH 4,0
Acetatpuffer, 0,015 M, pH 3,8
Citratpuffer, 0,015 M, pH 3,8, NaCL-Gradient von 0 bis 0,6 M Trispuffer, 0,1 M, 0,5 M NaCL, pH 8,0
Kochsalzlösung, 0,9% in dest. Wasser
Galactose-Lösung, 0,1 M, 0,9% NaCL
Ammoniumsulfatlösung, 3M
Ammoniumsulfat

SP-Sephadex C-50®, Pharmacia
Lactosyl-Sepharose 4B, Lactosyl-Sepharose 4CL; Lactosyl-Sephacryl 400
Mono-S-Säule®, Pharmacia

2. Isolierung und Trennung der Lektine ML I, ML II, ML III, ML I-1 und ML I-2

100 g pulverisierte, getrocknete Mistel werden mit 500 ml dest. Wasser (oder Frischpflanze: 250 g grob zerkleinert mit 500 ml dest. Wasser homogenisiertes Material) 1 Stunde gerührt. Die entstandene Suspension wird über ein grob maschiges Tuch filtriert. Die stark getrübte gefärbte Lösung wird mit 2 M Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wird durch 10minütiges Zentrifugieren bei 5000×g abgetrennt. Dem klaren Zentri fugat werden 4 g festes, gequollenes SP-Sephadex C-50® zugesetzt, und es wird 1 Stunde gerührt. Der Ionenaustau scher wird über eine Glasfilternutsche abgetrennt und mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,0 solange gewaschen, bis der Waschpuffer farblos die Nutsche verläßt. Die adsorbierten Proteine werden anschließend mit 0,1 M Trispuffer (0,5 M NaCL, pH 8,0) nach dem Säulenverfahren eluiert. Die re sultierende Rohlektinlösung wird über eine Lactosyl-Sepha rose-Säule mit 100 ml Bettvolumen gegeben. Nachgewaschen wird die Säule mit dem 3fachen Säulenvolumen 0,9%iger Kochsalzlösung. Die letzten 200 ml enthalten die Lektine II und III. Das ML I wird anschließend mit 1 Säulenvolumen 0,1 M Galaktoselösung eluiert.

Die ML II/III-Fraktion wird auf 1/10 eingeengt und darauf über einer Sephadex-G 25-Säule in 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 umgepuffert. Diese Lösung wird an einer Mono-S- Säule (10/10 Mono-S, Pharmacia) chromatographiert. Mit einem Kochsalzgradienten von 0-0,5 M in einem 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 und einem Gesamtvolumen von 160 ml werden die Lektine II und III nacheinander eluiert. Die beiden so erhaltenen Fraktionen werden unter diesen Bedin gungen rechromatographiert. Das ML II wird bei 0,15 M und das ML III bei 0,21 M NaCL eluiert.

Die Rechromatographie der aus der Frischpflanze isolierten ML I-Fraktion, umgepuffert in 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 an Mono-S (10/10) mit einem NaCL-Gradienten von 0,2-0,6 M in Citratpuffer (0,015 M, pH 3,8) ergibt die Lektine ML I-1 bei einer NaCL-Konzentration von 0,36 M und das ML I-2 bei 0,42 M.

Alle drei Lektine sind suspendiert in 3 M Ammoniumsulfat lösung mindestens 5 Jahre ohne Aktivitätsverlust und Beein trächtigung der Löslichkeit haltbar.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung der Mistellektine durch Ex traktion aus Pflanzenmaterial und nachfolgende Chroma tographie, dadurch gekennzeichnet, daß der durch Ex traktion mit Wasser, gegebenenfalls mit Zusätzen, erhaltene Extrakt der Mistellektine I-III durch batch- Adsorption am Kationenaustauscher, vorzugsweise SP- Sephadex, vorgereinigt wird, danach durch eine biospe zifische Adsorption an Lactosyl-Sepharose eine Trennung in 2 Fraktionen erfolgt, welche nachfolgend in die ein zelnen Lektinfraktionen zerlegt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Verfahrensschritte bei 0-25°C, bevorzugt bei 4°C, durchgeführt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion unter Zusatz von Inhibitoren wie Natriumdisulfit, Thioharnstoff, 5-Aminocapronsäure und/oder Phenylmethylsulfonyl-fluorid erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß für die chromatographischen Trennungen die FPLC- Technik eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeich net, daß die Elution der an die Lactosyl-Sepharose ge bundenen Mistellektine II und III mit 0,8-1%iger Koch salzlösung und nachfolgend die Elution des Mistellektins I mit 0,05-0,15 in Galaktoselösung erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 und 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die ML II/III-Fraktion mit einem Kochsalz gradienten von 0-0,5 M, vorzugsweise an einer Kationen austauscher-Mono-S-Säule, chromatographiert, das ML II bei 0,15 M und das ML III bei 0,21 M eluiert wird, wobei der Gradientenanstieg so gewählt wird, daß der Endpunkt beim 10-20fachen Säulenvolumen erreicht ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ML I-Fraktion mit einem Kochsalzgradienten von 0,2-0,6 M, vorzugsweise an einer Kationenaus tauscher-Mono-S-Säule, chromatographiert, das ML I-1 bei 0,36 M und das ML I-2 bei 0,42 M eluiert wird, wobei der Gradientenanstieg so gewählt wird, daß der Endpunkt beim 10-20fachen Säulenvolumen erreicht ist.

8. Mistellektin I-1, bestehend aus schwerer A-Kette und B-Kette, charakterisiert durch das Gewinnungsverfahren nach Anspruch 1 und 7 und durch das Elektropherogramm (Abb. 1 und 2).

9. Mistellektin I-2, bestehend aus leichter A-Kette und B-Kette, charakterisiert durch das Gewinnungsverfahren nach Anspruch 1 und 7 und durch das Elektropherogramm (Abb. 1 und 2).