DE2828235C2 - Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Lösung - Google Patents

Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Lösung

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung und Reindarstcllung von Enzymen aus einer aus tierischen Organen oder Geweben gebildeten Roh-ilnzym-l.ösiing, bei dem ein die Bindung eines vorbestimmten Fn/.yms bewirkendes Adsorptionsmittel in die Roh-En/ym-l.ösung eingegeben und in dieser so lange belassen wird, bis die Bindung erfolgt ist. wonach das Adsorptionsmittel der Höh -Enzym-Lösung entnommen und das Enzym durch Elutiun mittels einer hierfür vorgesehenen Lösung von den Adsorptionsmittel abgetrennt wird.
Die Erfindung bezieht sich feiner auf ein Adsorptionsmittel zur Durchführung des Verfahrens.
Enzyme werden in vielen Anwendungsgebieten, beispielsweise in tier klinischen Chemie, der l.ebcnsmittclchcmie, der Botanik, der Mikrobiologie, der Pharmakologie, ebenso wie in der Agrikiilturchemie, eingesetzt. Dabei werden vielfach spezifische Enzyme, und /war in hochreiner Eorm. benötigt.
Zwar sind Verfahren der eingangs bezeichneten An bekannt, bei denen ein Adsorptionsmittel, wie beispielsweise Kieselgur, Aluminiumoxid, Kaolin oder auch Molekularsiebe, eingesetzt wird. Auch ist nach diesen bekannten Verfahren eine Reindarstellung vorbestimmter Enzyme bis zu einem gewissen Reinheitsgrad möglich, ledoch gelingt es bei Verwendung der vorgenannten Adsorptionsmittel nicht, durch einmalige Adsorption und Elution ein spezifisches Enzym in hochreiner Form zu erhalten. Denn eine bevorzugte Bindung eines vorbestimmten Enzyms an Kieselgel ist praktisch nicht möglich.
Man hat daher auch weitere Verfahren zur Trennung von komplizierten Enzymgemischen entwickelt, die sich der Hochspannungselektrophorese, der Elektrodialyse oder auch der Chromatographie bedienen. Derartige Verfahren sind jedoch relativ aufwendig.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und ein zur Durchführung des Verfahrens ersetzbares Adsorptionsmittel der eingangs bezeichneten Art zu schaffen, nach dem und mittels dessen es möglich ist, ein vorbestimmtes Enz.ym aus einer Roh-Enzym-Lösung zu isolieren und in hochreiner Form darzustellen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäll der Erfindung dadurch gelöst, daß als Adsorptionsmittel Membranen von in an sich bekannter Weise durch Osmose hümolysicrter, menschlicher oder tierischer Erythrozyten in die Roh·Enzym-Lösung eingegeben werden, wobei zuvor von den Membranen Enzyme abgelöst werden, die gleiche oder nahezu gleiche Affinität hinsichtlich ihrer Bindung an die Membranen, wie die der zu bindenden Enzyme aufweisen.
Das Verfahren gemäll der Erfindung ist einfach in der Durchführung und zudem billig, weil Tierblut oder ausdatiertes menschliches Blut verwendet werden kann und die Membranen mehrmals als Adsorptionsmittel einsei/bar sind. Es hat sich außerdem gezeigt, dall schon bei einmaliger Adsorption und Elution Enzyme isoliert und in hochreiner form dargestellt werden können.
Eine zweckmäßige Aiisführungsvarianie des Verfahrens gemäß der Erfindung besieht darin, dall von den Membranen vor deren Eingabe in die Roh-Enzym-Lösung die Enzyme gleu her oder nahe/u gleicher Affinität mittels der zur Elution vorgesehenen Lösung abgelöst werden. Bei mehrmaliger Verwendung der Membranen als Adsorptionsmittel ist somit kein besonderer Vorbereitungsschriti vor der Eingabe des 'Ulsorptionsmitlels in die Roh-En/ym-Lösung erfiirJcrlich.
Das Adsorptionsmittel gemäll der Erfindung besieht au:. Membranen, die in an sich bekannter Weise aus durch Osnuv.t hämolysierlen, menschlichen oder tierischen Erythrozyten gebildet worden sind, wobei die an den Membranen gebundene Menge an Enzymen mit einer dem zu bindenden Enzym gleicher oder nahezu gleicher Affinität hinsichtlich der Bindung an die Membranen geringer ist als es den zur Bildung der Membranen herangezogenen Erythrozyten entspricht.
Die bei der lliimolyse gebildeten Membranen sind über viele Tilge lager, und einsci/har Dennoch kann es zweckmäßig sein, die Membranen durch Vernetzungsmittel, wie Glulindialdchvd. /υ stabilisieren, um somit
ohne eine Verringerung der Affinität des /ii isolierenden I.n/s ms in Kauf nehmen /u müssen — eine Verlängerung der l.ager/eit um rlwa den Faktor 2 fiir die Membranen zu erzielen, liier/u können die Membranen mit einer I niM/l Glutardiuldchyd enthaltenden Lösung behandelt werden.
Ausführungsbeispiele:
lläniolysevon Erythrozyten zur Bildung von
Mcinbriincn:
Als Ausgangsmaierial dienic frisches menschliches Blut, ausdaliertes menschliches Bim von Blutbanken oder Blut von Ratte, Rind oder Schwein. Die Erythrozyten wurden zweimal mit isotoner NaCI-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Erythrozyten wurden im Volumenverhältnis von I : 40 in eine 5 niM/l Phosphat enthaltende Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 bei 4"C eingegeben. Nach der Hämolysc wurde die Suspension bei 15 000-facher Erdbeschleunigung 30 Minuten lang bei 4"C zentrifugiert. Die gebildeten Membranen wurden sodann zweimal mit der vorgenannten Pufferlösung im gleichen Mischungsverhältnis gewaschen, um das Hämoglobin zu entfernen.
Herstellung des Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellungde·? Enzyms Aldolase sowie des Enzyms GlyzerinaldehydO-phosphal-dehydrogcnase
(GAPDH):
Die durch Hämolyse der Erythrozyten hergestellten Membranen wurden im Volumenverhältnis von 1 :20 bei 4"C in 2%iger NaC'1-l.ösiing. die 5 niM/l Phosphat enthielt, suspendiert und die Suspension eine Stunde lang gerührt. Die Membranen wurden sodann zentrifugiert und zweimal mit der vorgenannten Lösung gewaschen und anschließend einmal mit einer 5 niM/l Phosphat enthaltenden Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen.
Herstellung der Roh-r.nzym-'.ösungen:
Ks wurden Roh-Enzyml.ösunyen ieweils getrennt aus Muskeln. Leber. Niere und Geh.:ii von Mäusen sowie von Rallen hergestellt. Hier/u wurden 2 g der jeweiligen Probe mit einem Ullra-Turravl lomogenisalor JO Sekunden lang zerkleinert und anschließend 2 Minuten lang in einem-Poiier-Elvehjem-Glas-Ilomogenisalor. der mit einem Teflon-Pistill ausgestaltet war. in einer SmMiI Phosphat einhaltenden Pufferlösung, die lOniM/l /f-Mercnptoäthanol enthielt, homogenisiert. Das Volumen des Homogenaies wurde auf 40 ml gebracht, das 1 lomogenat bei 4 C I Stunde lang gerührt und anschließend bei etwa 15 OOOfacher Erdbeschleunigung 45 Minuten lang zentrifugiert. Zur Gewinnung der Roh-Enzym-Lösung wurde der Überstand durch ein Membranfilier mit dem Porendurchmesser von 0.4 (im filtriert.
Ausführungsbeispiel I
Aus menschlichen Erythrozyten hergestelltes Adsorptionsmittel wurde im Volumenverhälinis I : 3 in aus Muskeln von Mausen gebildeter Roh-Enzym-I.osung inkubierl und etwa I Stunde lang in dieser Lösung belassen. Danach wurden die Membranen zweimal mit einer 5mM/l Phosphat enthaltenden Pufferlösung bei 4"C gewaschen. Anschließend wurden die Membranen zur Isolierung von Aldolasc im Volumenverhälinis von I : 20 bei 4"C in eine 5 niM/l Phosphat, 15 niM/l NaCI und 2 inM/l Fructose-l.b-diphosphat enthaltende Pufferlösung eines pH-Wertes von H.O inkiibiert. Die so gebildete Suspension wurde 30 Minuten lang im Eisbad geschüllell. Die Membranen wurden sodann abzentrifiigiert.
Die Bestimmung der Aldolasc - Aktivität wurde nach der Meihode von Siblcy und l.chninger durchgeführt fSiblev. I. A und l.chninger. A. I... |. Hiol. Chem. 177.
859-872(1949)).
Während die spezifische Aktivität der Aldolase in der Roh-Enzym-Lösung 0,01 Einheiten pro mg Proiein betrug, betrug sie nach der Eluierung 0,1 Einheiten pro mg Protein.
Ausführungsbeispiel 2:
Wie in Aur,führungsbeispicl I wurde aus menschlichen Erythrozyten hergestelltes Adsorptionsmitte.' im Volumenverhältnis von 1 :3 in aus Muskeln von Mäusen gebildete Roh-Enzym-Lösung inkubiert und etwa 1 Stunde lang in dieser Lösung belassen. Danach wurden die Membranen mit einer 5 niM/l Phosphat, 15mM/l NaCI und 2 mM/l Fructose- 1,6-diphosphat enthaltenden PuPerlösung eines pH-Wertes von 8,0 gewaschen, wobei die so gebildete Suspension etwa 30 Minuten lang im Eisbad geschüttelt wurde. Zur Eluierung des Enzyms GAPDH wurden die Membranen in eine 5 mM/l Phosphat und 2 niM/l reduziertes Nikotinamid-Adenindinukleotid enthaltende Lösung gegeben und 90 Minuten lang darin belassen. Die Membranen wurden sodann ab/.entrifugiert.
Die Bestimmung des GAPDH wurde nach der Meihode von Tanner und Gray durchgeführt (Tanner, M. |.A. und Gray. W. R., Biochcm. 1.125, 1109-1117 (1971)).
Während die spezifisc/ie Aktivität des GAPDH in der Roh-Enzym-Lösung 7,4 Einheiten pro mg Protein betrug, betrug die spezifische GAPDH nach der Eluierung 15J Einheilen pro mg Protein.
Zur Konirolle wurde eine weitere Reinhcilsprüfung des Enzyms GAPDH mil einer Probe der mit dem Enzym belegten Membranen durchgeführt. Dabei wurde die Auflösung der Membranen, die Polyacrylamidgel-Elckirophorese in Gegenwart von SDS und das Anfärben nach der Meihode von Fairbanks et al durchgeführt (vergleiche hierzu Fairbanks. G.. Steck. T. L. and Wallach. F. [λ II.. Biochemistry 10.2606-2617 (1971). Bei der Gel-Elektrophorese !rat das Enzym GAPDH als einzelne Bande auf. die einem Molekulargewicht von 37 000 zugeordnet werden konnte, was in guter Übereinstimmung anderen Wericn aus der Literatur entspricht.
Ausiühriingsbeispicl 3:
Wie in Ausführungsbeispiel I beschrieben, wurde das Enzym Aldolase isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausführungsbeispicl I wurde eine aus der Leber von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Enzyms betrug 0.01 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 0,1 Einheiten pro mg Prolein.
Ausführungsbeispiel 4:
Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das l'nzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Aiisführungsbeispicl 2 wurde eine aus der Leber von Mausen hergestellte Roh -Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzyml.ösung enthaltenen Enzyme CiAPDH betrug 1.1 Einheiten pro mi» Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 90 Einheilen pro mg Protein.
Ausführungsbeispiel 5:
Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das Enzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausführungsbeispiel 2 wurde eine aus der Niere von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-En/ym-Lösung enthaltenen Enzyms GAPDH betrug 1,0 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 146 Einheiten pro mg Protein.
Ausfuhrungsbeispiel 6:
Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, wurde das Enzym GAPDH isoliert und rein dargestellt. Im Unterschied zu Ausfiihrungsbeispiel 2 wurde eine aus dem Gehirn von Mäusen hergestellte Roh-Enzym-Lösung verwendet. Die spezifische Aktivität des in der Roh-Enzym-Lösung enthaltenen Erzyms GAPDH betrug 3,3 Einheiten pro mg Protein, die spezifische Aktivität des Enzyms nach der Eluierung betrug 144 Einheiten pro mg Protein.
Ausführungsbeispiel 7:
Wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, jedoch aus einer aus den Muskeln von Ratten hergestellten Roh-Enzym-Lösung wurde das Enzym GAPDII mil dem gleichen Ergebnis, wie in Ausführungsbeispiel 2 angegeben, rein dargestellt.
Ausführungsbeispiel 8:
Es wurde wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben verfahren. Die für die Isolierung vorbereiteten Membranen wurden jedoch vor ihrer Inkubierung in die Roh-Enz.ym-Lösung zu ihrer Vernetzung in einer 5 mM/l Phosphat und 1 niM/l Glutardialdehyd enthaltenden Pufferlösung für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Membranen /entrifugieri und zweimal mit einer 5 mM/l Phosphat enthaltenden Pufferlösung eines pH-Wertes von 8,0 ge.·.-..■!sehen. Es wurden die in Ausführungsbeispiel 4 angegebenen Ergebnisse erhalten.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer aus tierischen Organen oder Geweben gebildeten Roh-Enz.ym-Lösung, bei dem ein die Bindung eines vorbestimmten Enzyms bewirkendes Adsorptionsmittel in die Roh-Enzym-Lösung eingegeben und in dieser so lange belassen wird, bis die Bindung erfolgt ist. wonach das Adsorptionsmittel der Roh-Enzym-Lösung entnommen und das Enzym durch Elution mittel? einer hierfür vorgesehenen Lösung von dem Adsorptionsmittel abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorptionsmittel Membranen von in an sich bekannter Weise durch Osmose hämolysierier, menschlicher oder tierischer Erythrozyten in die Roh-Enzyrn-Lösung eingegeben werden, wobei zuvor den den Membranen Enzyme abgelöst werden, die gleiche oder nahezu gleiche Affinität hinsichtlieh ihrer Bindung an die Membran wie die der zu bindenden Enzyme aufweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß von (Jen Membranen vor deren Eingabe in die Roh-Enzym-Lösung die Enzyme gleicher oder nahezu gleicher Affinität mittels der zur Elution vorgesehenen Lösung abgelöst werden.
3. Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarslellung von Enzymen aus einer Roh- Enzym-Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es aus in an sich bekannter Weise durch Osmose hiimolysierten, menschlichen oder tierischen Erythrozyten gebildeien Membranen bcslehi. wobei die an den Membranen gebundene Menge an Enzymen mit einer dem zu bindenden Enz> m gleicher oder nahe/u gleicher Affinität hinsichtlich der Bindung an die Membranen geringer ist als die den zur Bildung der Membranen herangezogenen Erythrozyten entspricht.
4. Adsorptionsmittel nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, dall die Membranen durch Vernetzungsmittel, wie Glutardialdehvd. stabilisier! worden sind.
DE2828235A 1978-06-28 1978-06-28 Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Lösung Expired DE2828235C2 (de)

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