JP2662460B2 - フルクトース‐１，６‐ビスホスフアート‐アルドラーゼ、その製造方法及びその使用方法 - Google Patents
フルクトース‐１，６‐ビスホスフアート‐アルドラーゼ、その製造方法及びその使用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の対象は、フルクトース−1,6−ビスホスフア
ート−アルドラーゼ（Ｆ−1,6−BP−アルドラーゼ）で
あり、かつこれはその製造方法及びその使用方法を包含
する。
ート−アルドラーゼ（Ｆ−1,6−BP−アルドラーゼ）で
あり、かつこれはその製造方法及びその使用方法を包含
する。
目的とされたアルドール反応への及び化学的に入手困
難な又は自然界に存在しないモノサッカライドの合成へ
の実際の関心は、これに関連するアルドラーゼにますま
す多くの注意を払うことにあった。医学にとっても有益
でありうるこの生物学的に重要な物質の有機合成に関し
て、生物触媒の使用が、有効な代替手段である。イエウ
サギ筋肉のＦ−1,6−BP−アルドラーゼは、従来その合
成で使用される唯一の酵素である（A.E.セリアニ（Seri
ani）等々Meth.Enzymol.89（1982）83-92）。イエウサ
ギ筋肉から単離されたこのアルドラーゼは、高価でかつ
比較的不安定である。他方、すでにクラス1 F−1,6−BP
−アルドラーゼが、スタフィロッコス アウレウス（St
aphylococcus aureus）から単離されている。これはイ
エウサギ筋肉から単離されたアルドラーゼと同様な酵素
学的性質を有するが、著しく熱安定性である（F.ゲエー
ツ（Gotz等々、Eur.J.Biochem.108（1980）293-301）。
しかしその病原性性質のゆえに、スタフィロコッカス
アウレウスが、酵素産出物として僅かにしか適さないの
が明らかである。
難な又は自然界に存在しないモノサッカライドの合成へ
の実際の関心は、これに関連するアルドラーゼにますま
す多くの注意を払うことにあった。医学にとっても有益
でありうるこの生物学的に重要な物質の有機合成に関し
て、生物触媒の使用が、有効な代替手段である。イエウ
サギ筋肉のＦ−1,6−BP−アルドラーゼは、従来その合
成で使用される唯一の酵素である（A.E.セリアニ（Seri
ani）等々Meth.Enzymol.89（1982）83-92）。イエウサ
ギ筋肉から単離されたこのアルドラーゼは、高価でかつ
比較的不安定である。他方、すでにクラス1 F−1,6−BP
−アルドラーゼが、スタフィロッコス アウレウス（St
aphylococcus aureus）から単離されている。これはイ
エウサギ筋肉から単離されたアルドラーゼと同様な酵素
学的性質を有するが、著しく熱安定性である（F.ゲエー
ツ（Gotz等々、Eur.J.Biochem.108（1980）293-301）。
しかしその病原性性質のゆえに、スタフィロコッカス
アウレウスが、酵素産出物として僅かにしか適さないの
が明らかである。
したがって本発明の目的は、酵素触媒法に良好な安定
性を有する、イエウサギ筋肉又はスタフィロコッカス
アウレウスから得られる従来公知のＦ−1,6−BPに比し
て改良された入手可能性を有するアルドラーゼにある。
性を有する、イエウサギ筋肉又はスタフィロコッカス
アウレウスから得られる従来公知のＦ−1,6−BPに比し
て改良された入手可能性を有するアルドラーゼにある。
この目的は、スタフィロコッカス カルノススから得
られる、本発明によるフルクトース−1,6−ビスホスフ
アート−アルドラーゼ（Ｆ−1,6−BP−アルドラーゼ）
によって達成される。
られる、本発明によるフルクトース−1,6−ビスホスフ
アート−アルドラーゼ（Ｆ−1,6−BP−アルドラーゼ）
によって達成される。
このアルドラーゼは、“イエウサギ筋肉−アルドラー
ゼ”に比して著しく改良された安定性の点で優れ、それ
はＴ＝25℃;pH6.5;酵素活性2.9U/ml又は25U/mgで、合成
条件下で不活性率１％/d（たとえば測定値:0.77％/
d）に相当する又はエッペンドルフ容器中0.06M トリス
−HCl−緩衝溶液中でpH7.5で精製された形（25U/mg）
で60℃−又は100℃−安定性は、30分後の残存活性率70
〜80％または20〜30％、特に76％または26％に相当す
る。したがってこのアルドラーゼは、スタフィロコッカ
ス アウレウスから得られるアルドラーゼに比してほん
の僅かの熱安定性しか有さず（後者は、100℃で90分後
著しい活性損失を示さない）、あらゆる条件下に適合し
て病原性起源のその著しい欠点で汚染されない。
ゼ”に比して著しく改良された安定性の点で優れ、それ
はＴ＝25℃;pH6.5;酵素活性2.9U/ml又は25U/mgで、合成
条件下で不活性率１％/d（たとえば測定値:0.77％/
d）に相当する又はエッペンドルフ容器中0.06M トリス
−HCl−緩衝溶液中でpH7.5で精製された形（25U/mg）
で60℃−又は100℃−安定性は、30分後の残存活性率70
〜80％または20〜30％、特に76％または26％に相当す
る。したがってこのアルドラーゼは、スタフィロコッカ
ス アウレウスから得られるアルドラーゼに比してほん
の僅かの熱安定性しか有さず（後者は、100℃で90分後
著しい活性損失を示さない）、あらゆる条件下に適合し
て病原性起源のその著しい欠点で汚染されない。
酵素産出物として使用されるスタフィロコッカス カ
ルノススは、天然起源から、特に乾燥生ソーセージから
直ちに入手でき（K.H.シュライフアー（Schleifer）等
々、Internat.J.System.Bacterial.32（1982）153-15
6）及びスターター培養物の形で市場で得られる。本発
明の範囲内で、特にDSM No.20501でドイツ微生物コレク
ション（ゲチンゲン）に寄託されたスタフィロコッカス
カルノスス−株を使用する。
ルノススは、天然起源から、特に乾燥生ソーセージから
直ちに入手でき（K.H.シュライフアー（Schleifer）等
々、Internat.J.System.Bacterial.32（1982）153-15
6）及びスターター培養物の形で市場で得られる。本発
明の範囲内で、特にDSM No.20501でドイツ微生物コレク
ション（ゲチンゲン）に寄託されたスタフィロコッカス
カルノスス−株を使用する。
菌株の培養は、振とう培養器で培地200mlを有する500
mlエルレンマイヤーフラスコ中で、110rpmで又は５及び
10lの処理容量を有する発酵器中で行われる。培養培地
（M1）は、たとえば次の組成を有する： 1,0％ トリプトン 0,5％ 酵母抽出物 0,5％ NaCl 0,1％ Na2HPO4 1,0％ グルコース pH 7,2 pH−値の修正のために、3M NaOH及び3M H3PO4を使用
する。他に明記しない限り、発酵の間次のパラメーター
を保つ： 回転数 100rpm 温度 37℃ 通気 ５％pO2 栄養液 M1 pH 7,2 培養時間 ８−13時間 細胞を、対数段階の最後に8000rpmで10分間遠心分離
して得る。細胞破壊は、ガラス小球を用いる湿潤粉砕に
よって行われる。
mlエルレンマイヤーフラスコ中で、110rpmで又は５及び
10lの処理容量を有する発酵器中で行われる。培養培地
（M1）は、たとえば次の組成を有する： 1,0％ トリプトン 0,5％ 酵母抽出物 0,5％ NaCl 0,1％ Na2HPO4 1,0％ グルコース pH 7,2 pH−値の修正のために、3M NaOH及び3M H3PO4を使用
する。他に明記しない限り、発酵の間次のパラメーター
を保つ： 回転数 100rpm 温度 37℃ 通気 ５％pO2 栄養液 M1 pH 7,2 培養時間 ８−13時間 細胞を、対数段階の最後に8000rpmで10分間遠心分離
して得る。細胞破壊は、ガラス小球を用いる湿潤粉砕に
よって行われる。
発酵容量9lから成るバイオマス（Biomass）の水含有
量は、121gである。次に記載する精製工程を、１〜６
℃、0.06M トリス−HCl−緩衝液中でpH7.5で実施す
る。
量は、121gである。次に記載する精製工程を、１〜６
℃、0.06M トリス−HCl−緩衝液中でpH7.5で実施す
る。
酵素の精製仕上げのために、硫酸アンモニウム分別沈
殿、pH−分別及びイオン交換クロマトグラフィーを実施
する： 硫酸アンモニウム分別沈殿 細胞不含粗抽出物195mlに、固形硫酸アンモニウムを4
0％の溶液が飽和するまで加える。pH−値を、3Mアンモ
ニアで7.5に調製し、沈殿を２時間氷浴中で行う。沈殿
した成分を、20000rpmで20分遠心分離して分離する。次
いで順次に(NH4)2SO4−濃度を60％又は80％飽和に増加
し、再び氷浴中で沈殿させ、遠心分離する。アルドラー
ゼの沈殿のために、上澄みを100％(NH4)2SO4−飽和に
し、pHを7M酢酸で5.0に下げる。沈殿を、破壊緩衝液50m
l（6mM2−メルカプトエタノールを有する0.06M トリス
−HCl pH7.5）中に再懸濁する。
殿、pH−分別及びイオン交換クロマトグラフィーを実施
する： 硫酸アンモニウム分別沈殿 細胞不含粗抽出物195mlに、固形硫酸アンモニウムを4
0％の溶液が飽和するまで加える。pH−値を、3Mアンモ
ニアで7.5に調製し、沈殿を２時間氷浴中で行う。沈殿
した成分を、20000rpmで20分遠心分離して分離する。次
いで順次に(NH4)2SO4−濃度を60％又は80％飽和に増加
し、再び氷浴中で沈殿させ、遠心分離する。アルドラー
ゼの沈殿のために、上澄みを100％(NH4)2SO4−飽和に
し、pHを7M酢酸で5.0に下げる。沈殿を、破壊緩衝液50m
l（6mM2−メルカプトエタノールを有する0.06M トリス
−HCl pH7.5）中に再懸濁する。
pH−分別 100％(NH4)2SO4−画分50mlのpH−値を、激しい攪拌下
に少しづつ7M酢酸で先ず4.0に、次いで6M HClで3.5に、
最後に3.0に下げる。形成された沈殿を、夫々20000rpm
で20分間遠心分離する。アルドラーゼは、上澄み中にあ
り、この上澄みを透析濾過によって限外濾過膜アミコン
YM10を用いて脱塩する。
に少しづつ7M酢酸で先ず4.0に、次いで6M HClで3.5に、
最後に3.0に下げる。形成された沈殿を、夫々20000rpm
で20分間遠心分離する。アルドラーゼは、上澄み中にあ
り、この上澄みを透析濾過によって限外濾過膜アミコン
YM10を用いて脱塩する。
イオン交換クロマトグラフィー 脱塩された酵素溶液30mlを、DEAE−セフアデックス
A25 カラム 160ml上に付与する。これは前もって0.1M
NaClを含有する0.06M トリス−HCl−緩衝液（pH7.5）
で洗浄されている。酵素を、0.06M トリス−HCl緩衝液
（pH7.5）中で0.1−0.5M NaClの直線状塩勾配によって
溶離する。流動速度は、30ml/hである。活性画分を一緒
にし、凍結乾燥する。
A25 カラム 160ml上に付与する。これは前もって0.1M
NaClを含有する0.06M トリス−HCl−緩衝液（pH7.5）
で洗浄されている。酵素を、0.06M トリス−HCl緩衝液
（pH7.5）中で0.1−0.5M NaClの直線状塩勾配によって
溶離する。流動速度は、30ml/hである。活性画分を一緒
にし、凍結乾燥する。
添付された図表（第１図）は、発酵器（５％pO2）中
での培養時間に基づく増殖及び酵素産出に関する曲線を
示す。
での培養時間に基づく増殖及び酵素産出に関する曲線を
示す。
次表１は、精製仕上げの結果に関する一覧表を示す。
これとは別に、アルドラーゼから、特に好ましくは細
胞分離及び−破壊の後、水性２−相間抽出によってバイ
オマス夾雑物を分離することができる。
胞分離及び−破壊の後、水性２−相間抽出によってバイ
オマス夾雑物を分離することができる。
これには、特にポリマー／塩混合物及び特別にポリエ
チレングリコール／リン酸カリウム混合物を使用する。
他の塩、たとえば硫酸塩を、同様にして使用することが
できる。低分子量、特に1500ダルトン以下のPEGの高含
量が特に有利である。
チレングリコール／リン酸カリウム混合物を使用する。
他の塩、たとえば硫酸塩を、同様にして使用することが
できる。低分子量、特に1500ダルトン以下のPEGの高含
量が特に有利である。
酵素は上相中に集まり、別の工程でこれから再抽出す
ることができる。しかし上相をアニオン交換体カラムを
介する後続の分離に直接使用するのが、技術的に簡単で
ある。この様な、直接の順次処理は、著しい欠点もなく
可能である。
ることができる。しかし上相をアニオン交換体カラムを
介する後続の分離に直接使用するのが、技術的に簡単で
ある。この様な、直接の順次処理は、著しい欠点もなく
可能である。
カラム材料として、アミノエチル−、ジエチルアミノ
エチル−（DEAE−）及び第四級アミノエチル基を有する
アニオン交換体が適当である。これらを常法でpH−値
５に及び特にpH7.5に平衡化する。特に商品名DEAEセフ
アデックス（Sephadex）、モノＱ及びＱ−セフアデック
スを使用する。
エチル−（DEAE−）及び第四級アミノエチル基を有する
アニオン交換体が適当である。これらを常法でpH−値
５に及び特にpH7.5に平衡化する。特に商品名DEAEセフ
アデックス（Sephadex）、モノＱ及びＱ−セフアデック
スを使用する。
特に分別されるたん白質通過液に対して調整された塩
含有率で、たとえば0.25M塩溶液を用いて通過速度３−5
ml/分で溶離する。
含有率で、たとえば0.25M塩溶液を用いて通過速度３−5
ml/分で溶離する。
酵素を含有する、集められた正の画分を、そのまま又
は凍結乾燥された形で使用することができる。
は凍結乾燥された形で使用することができる。
水性２−相間抽出で、この様な後処理を実施する例
を、次に示す。
を、次に示す。
S.カルノスス フルクトース−1,6−ビスホスフアート
−アルドラーゼに関する後処理 Ｉ）相系 50％ 粗抽出物（40％w/w） 27％ PEG 400 7％ KPi pH7.5 上相は、0.8U/mgたん白質で95％酵素活性を有する。
−アルドラーゼに関する後処理 Ｉ）相系 50％ 粗抽出物（40％w/w） 27％ PEG 400 7％ KPi pH7.5 上相は、0.8U/mgたん白質で95％酵素活性を有する。
II）Ｏ−セフアロース−アニオン交換体 20mM トリス−HCl緩衝液pH7.5、0.15M NaCl及び0.1
％メルカプトエタノールで平衡化されたカラム50mlを使
用する。上相Ｉを、4:1に希釈し、交換体に加える。
％メルカプトエタノールで平衡化されたカラム50mlを使
用する。上相Ｉを、4:1に希釈し、交換体に加える。
20mM トリス−HCl pH7.5、0.25M NaCl、0.1％メルカ
プトエタノールで溶離する。80％収率;7.1U/mgたん白
質。
プトエタノールで溶離する。80％収率;7.1U/mgたん白
質。
III）Ｏ−セフアロース−アニオン交換体 II）と同様に平衡化する。流出Ｉからの正の画分を2:
1に希釈して、交換体に加える。たん白質を、0.15−0.2
5M NaClのNaCl−勾配によって溶離する。アルドラーゼ
は0.2M NaCl濃度で溶離する。
1に希釈して、交換体に加える。たん白質を、0.15−0.2
5M NaClのNaCl−勾配によって溶離する。アルドラーゼ
は0.2M NaCl濃度で溶離する。
70％収率、13.1U/mgたん白質。
酵素確認 酵素の確認のために、夫々精製仕上げされたアルドラ
ーゼ40μg/mlを、分子量測定のために120μg/mlを使用
する。
ーゼ40μg/mlを、分子量測定のために120μg/mlを使用
する。
クラスＩ アルドラーゼの分類 次の特性に基づいて、S.カルノススから得られるＦ−
1,6−BP−アルドラーゼは、アルドラーゼのクラスＩタ
イプに属する。
1,6−BP−アルドラーゼは、アルドラーゼのクラスＩタ
イプに属する。
−Ｆ−1,6−BPに対する活性は、種々の濃度EDTAの存在
で妨害されない。
で妨害されない。
−S.カルノススアルドラーゼは、DHAP及びNaBH4の存在
で完全に阻害される。
で完全に阻害される。
−１−及び２価のカチオンは、アルドラーゼ−活性に影
響を与えない。
響を与えない。
更にS.カルノススアルドラーゼは、天然基質に対して
極めて特異的に作用する。
極めて特異的に作用する。
アルドラーゼの分子量を、SDS−PAGEによって測定
し、〜33000ダルトン（構成単位）が決定される。
し、〜33000ダルトン（構成単位）が決定される。
ミハエリス−メンテンによるKm−値 基質Ｆ−1,6−BP及びＦ−１−Ｐに対するKm−値を、
酵素活性に関して種々の基質濃度で調べる。第２図は、
ミハエリス−メンテン−プロットを、Ｆ−1,6−BPのKm
−値の測定に関して示す。
酵素活性に関して種々の基質濃度で調べる。第２図は、
ミハエリス−メンテン−プロットを、Ｆ−1,6−BPのKm
−値の測定に関して示す。
これは0.022mMが測定され、Ｆ−１−Ｐのそれは18.8m
Mである。これから、アルドラーゼは、天然の基質に比
して極めて特異的に作用することが明らかである。Ｆ−
１−Ｐに関するKm−値は、Ｆ−1,6−BPに関する値より
もフアクター1000ほど大きい。
Mである。これから、アルドラーゼは、天然の基質に比
して極めて特異的に作用することが明らかである。Ｆ−
１−Ｐに関するKm−値は、Ｆ−1,6−BPに関する値より
もフアクター1000ほど大きい。
pH−最適条件 pH−最適条件の決定のために（第３図）、酵素活性を
37℃でpH3〜pH10で下記の緩衝液中で測定する： 0.06M クエン酸塩緩衝液 pH3.0−6.0 0.06M KP−緩衝液 pH6.0−7.5 0.06M トリス−HCl緩衝液 pH7.5−9.0 0.06M グリシン緩衝液 pH9.0−10.0 第３図から、二通り認められる： −アルドラーゼのpH−最適条件は、pH7.5で最高となるp
H−範囲6.5−9.0を含む。
37℃でpH3〜pH10で下記の緩衝液中で測定する： 0.06M クエン酸塩緩衝液 pH3.0−6.0 0.06M KP−緩衝液 pH6.0−7.5 0.06M トリス−HCl緩衝液 pH7.5−9.0 0.06M グリシン緩衝液 pH9.0−10.0 第３図から、二通り認められる： −アルドラーゼのpH−最適条件は、pH7.5で最高となるp
H−範囲6.5−9.0を含む。
−酵素は、種々の緩衝液の存在下に異なる活性を示す。
クエン酸ナトリウム−緩衝液は、酵素の最も強い阻害を
示す。
クエン酸ナトリウム−緩衝液は、酵素の最も強い阻害を
示す。
アルドラーゼの安定性 pH−安定性 酵素のpH−安定性を、室温（RT）でpH1〜pH12でアル
ドラーゼの10分間培養によって決定する（第４図）。0.
06M トリス−HCl環状液中でのみ処理し、この際その都
度pH−値を2N NaOH又は2N HClを用いて調整する。培養
期間の経過後、サンプル溶液をpH7.5にし、酵素活性を
測定する。
ドラーゼの10分間培養によって決定する（第４図）。0.
06M トリス−HCl環状液中でのみ処理し、この際その都
度pH−値を2N NaOH又は2N HClを用いて調整する。培養
期間の経過後、サンプル溶液をpH7.5にし、酵素活性を
測定する。
第４図に示した様に、S.カルノススアルドラーゼは、
極めて良好なpH−安定性を有する。別のテストで、アル
ドラーゼ−活性は、pH2及び４℃で72時間貯蔵後もまだ
出発活性100％であることを確認することができる。
極めて良好なpH−安定性を有する。別のテストで、アル
ドラーゼ−活性は、pH2及び４℃で72時間貯蔵後もまだ
出発活性100％であることを確認することができる。
温度−安定性 アルドラーゼの温度−安定性を調べるために、次の測
定を実施する： １）酵素を、５分間0.06M トリスHCl緩衝液（pH7.5）
中で40℃〜100℃の温度で培養し、それによって酵素活
性の温度による依存を測定する（第５図）。
定を実施する： １）酵素を、５分間0.06M トリスHCl緩衝液（pH7.5）
中で40℃〜100℃の温度で培養し、それによって酵素活
性の温度による依存を測定する（第５図）。
２）別のテスト系で、精製仕上げされたアルドラーゼの
サンプルを60℃及び100℃で種々の長さの時間で培養
し、それによって２つの異なる温度での酵素活性の時間
による依存を測定する（第６図）。
サンプルを60℃及び100℃で種々の長さの時間で培養
し、それによって２つの異なる温度での酵素活性の時間
による依存を測定する（第６図）。
第５図及び第６図は、S.カルノススから得られるＦ−
1,6−BPアルドラーゼが、比較的に温度安定な酵素であ
ることを示す。これはS.アウレウスから得られるアルド
ラーゼに関して記載されている（100℃で90分後活性損
失）加熱安定性を示さないが、イエウサギ筋肉アルドラ
ーゼの温度安定性よりはるかにまさる。
1,6−BPアルドラーゼが、比較的に温度安定な酵素であ
ることを示す。これはS.アウレウスから得られるアルド
ラーゼに関して記載されている（100℃で90分後活性損
失）加熱安定性を示さないが、イエウサギ筋肉アルドラ
ーゼの温度安定性よりはるかにまさる。
アルドラーゼの貯蔵安定性 貯蔵安定性に関して言及するために、精製されたアル
ドラーゼのサンプルに種々の試薬を加え、５日間RT又は
−20℃で貯蔵する。表２は、その結果を示す： 表２は、５日間貯蔵後のアルドラーゼの活性を示す。
ドラーゼのサンプルに種々の試薬を加え、５日間RT又は
−20℃で貯蔵する。表２は、その結果を示す： 表２は、５日間貯蔵後のアルドラーゼの活性を示す。
イエウサギ筋肉−アルドラーゼを用いた安定性比較 本発明によるアルドラーゼの安定性を、イエウサギ筋
肉−アルドラーゼの安定性と比較する。これについて２
つの酵素を、表３中に記載した活性な実験下でテストす
る： ２つの試験に関して、比較できる開始活性の酵素濃度
を調整する。これは、イエウサギ筋肉−アルドラーゼ3.
4U/ml（9U/mg）及びS.カルノススアルドラーゼ2.9U/ml
（25U/mg）に関してである。第７図は、300時間にわた
る２つのアルドラーゼの安定性を示す。不活性化率の測
定のために、一次対数不活性化を採用し、その不活性化
率は、対数因子から明らかである（１＝100％／時間単
位）。
肉−アルドラーゼの安定性と比較する。これについて２
つの酵素を、表３中に記載した活性な実験下でテストす
る： ２つの試験に関して、比較できる開始活性の酵素濃度
を調整する。これは、イエウサギ筋肉−アルドラーゼ3.
4U/ml（9U/mg）及びS.カルノススアルドラーゼ2.9U/ml
（25U/mg）に関してである。第７図は、300時間にわた
る２つのアルドラーゼの安定性を示す。不活性化率の測
定のために、一次対数不活性化を採用し、その不活性化
率は、対数因子から明らかである（１＝100％／時間単
位）。
基質スペクトル 基質スペクトルの決定のために、例示的にアルデヒド
の数をテストする。その際次の混合物を選ぶ： 20mM DHAP 200mM アルデヒド １−4U/mlアルドラー
ゼ アルドラーゼの培養後、非連続的DC−コイトロールが
行われる。次に記載するアルデヒドを有する混合物中
に、５−８時間後もはやDHAPを認めることができない。
の数をテストする。その際次の混合物を選ぶ： 20mM DHAP 200mM アルデヒド １−4U/mlアルドラー
ゼ アルドラーゼの培養後、非連続的DC−コイトロールが
行われる。次に記載するアルデヒドを有する混合物中
に、５−８時間後もはやDHAPを認めることができない。
アルドラーゼ−基質 アルデヒド 生成物のRp グリセリンアルデヒド−３−ホスフアート 0.36 メチルグリオキサール 0.37 Ｄ（＋）−グリセリンアルデヒド 0.44 Ｌ（−）−グリセリンアルデヒド 0.44 D,L−グリセリンアルデヒド 0.44 グリコールアルデヒド 0.66 フタルジアルデヒド 0.69 ホルムアルデヒド 0.71 アセトアルデヒド 0.93 クロルアセトアルデヒド 1.08 プロピオンアルデヒド 1.20 ３−メチルメニカプトプロピオンアルデヒド 1.24 イソブチルアルデヒド 1.36 トリメチルアセトアルデヒド 1.41 ブチルアルデヒド 1.40 ３−ケトブチルアルデヒド 1.48 イソバレルアルデヒド 1.49 マロンジアルデヒド 1.49 ピリジン（２）カルボアルデヒド 1.50 ピリジン（４）カルボアルデヒド 1.50 フエニルアセトアルデヒド 1.53 ２−メチルアセトアルデヒド 1.54 バレルアルデヒド 1.60 Ｆ−1,6−BP−アルドラーゼ触媒反応に関する例とし
て、次に5,6−ジデオキシヘキスロースの合成を記載す
る： ジヒドロキシアセトンホスフアート（DHAP）を、実験
室的規模でプロピオンアルデヒドとＦ−1,6−BP−アル
ドラーゼの存在下に25℃で反応させる。
て、次に5,6−ジデオキシヘキスロースの合成を記載す
る： ジヒドロキシアセトンホスフアート（DHAP）を、実験
室的規模でプロピオンアルデヒドとＦ−1,6−BP−アル
ドラーゼの存在下に25℃で反応させる。
混合物:50mM（5mmol）DHAP 500mM（50mmol）プロピオンアルデヒド 40U アルドラーゼ プロピオンアルデヒドを、反応の前に新たに蒸留し、
アルゴン下に保存する。反応の経過を、波長595nmで施
光分析して及び残存−DHAP−含有量の測定を観察する。
6,5時間後、反応を終了し、生成物をシクロヘキシルア
ンモニウム塩として単離する。
アルゴン下に保存する。反応の経過を、波長595nmで施
光分析して及び残存−DHAP−含有量の測定を観察する。
6,5時間後、反応を終了し、生成物をシクロヘキシルア
ンモニウム塩として単離する。
構造の解明のために、物質250mgを酸性ホスフアター
ゼで脱リンする。遊離糖（Rp＝1.56）の過アセチル化
は、ピリジン中で無酢酸を用いて行われる。1H−又は13
C−NMRスペクトルによって、単離された化合物を、予期
された生成物として明確に同定することができる。
ゼで脱リンする。遊離糖（Rp＝1.56）の過アセチル化
は、ピリジン中で無酢酸を用いて行われる。1H−又は13
C−NMRスペクトルによって、単離された化合物を、予期
された生成物として明確に同定することができる。
本発明によるアルドラーゼは、炭水化物または炭水化
物誘導体の合成に非常に有用であり、特にこれは．芳香
物質フラネオール（ウオング（Wong）等、Z.Org.Chem.4
8（1983）3943-3497）の前駆体の６−デスオキス−フル
クトース−１−ホスフアートの製造に使用することがで
きる。更にアルドラーゼの使用下に6C−原子、特に
C8、C9等々を有する高級糖を得ることができる（ベドナ
ルスキ（Bednarski）等、Tetrahedron Lett.（1986）27
5807-5810参照）。混合アミノ糖、たとえば１−デスオ
キシマンノジリミシン、１−デスオキシノジリミシン及
び1,4−ジデスオキシ−1,4−イミノ−Ｄ−アラビニトー
ル−これは有効なβ−グルコシダーゼ阻害剤として重要
である（チーグラ−（Ziegler）等々、Angew.Chemie 10
0（1988）737-738）−は、本発明によるアルドラーゼを
用いてより一層良好に得やすくなり、これらは一部HIV
−ウイルスを抑制する作用を有する（フリート（Flee
t）等、FEBS Letters 273（1988）128-132）。
物誘導体の合成に非常に有用であり、特にこれは．芳香
物質フラネオール（ウオング（Wong）等、Z.Org.Chem.4
8（1983）3943-3497）の前駆体の６−デスオキス−フル
クトース−１−ホスフアートの製造に使用することがで
きる。更にアルドラーゼの使用下に6C−原子、特に
C8、C9等々を有する高級糖を得ることができる（ベドナ
ルスキ（Bednarski）等、Tetrahedron Lett.（1986）27
5807-5810参照）。混合アミノ糖、たとえば１−デスオ
キシマンノジリミシン、１−デスオキシノジリミシン及
び1,4−ジデスオキシ−1,4−イミノ−Ｄ−アラビニトー
ル−これは有効なβ−グルコシダーゼ阻害剤として重要
である（チーグラ−（Ziegler）等々、Angew.Chemie 10
0（1988）737-738）−は、本発明によるアルドラーゼを
用いてより一層良好に得やすくなり、これらは一部HIV
−ウイルスを抑制する作用を有する（フリート（Flee
t）等、FEBS Letters 273（1988）128-132）。
フエロモンの製造に関する他の使用は、M.シエルツ
（Schulz）等によってテトラヒドロンレタース第31巻
（1990）第867-8頁中に記載されている。
（Schulz）等によってテトラヒドロンレタース第31巻
（1990）第867-8頁中に記載されている。
第１図〜第７図は、本発明によるアルドラーゼの特性を
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フリードリッヒ・ゲッツ ドイツ連邦共和国、チユビンゲン、バイ ム・ヘルブ シユテンホーフ、31 (56)参考文献 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏａｒｕａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，108 （１）（1980） ｐ．295−301
Claims (7)
- 【請求項１】エッペンドルフ容器中で精製された形で
（25U/mg）pH7.5で0.06M トリス−HCl−緩衝溶液中
の60℃−及び100℃−安定性が、それぞれ対応して30分
後の残存活性率70〜80％及び20〜30％に相当し、そして
温度25℃;pH6.5;20mMジヒドロキシアセトンホスフェー
ト（DHAP）;75mM グリオキシル酸；酵素活性2.9U/ml又
は25U/mgでの合成条件下で不活性率１％d.を有し、分
子量が約33000ダルトン及び37℃で最適pH条件が6.5〜9.
0である、スタフィロコッカス カルノスス（Staphyloc
occus carnosus）から得られたフルクトース−1,6−ビ
スホスフアート−アルドラーゼ（Ｆ−1,6−BP−アルド
ラーゼ）。 - 【請求項２】スタフィロコッカス カルノスス DSM205
01から単離される、請求項１記載のアルドラーゼ。 - 【請求項３】次のパラメーター −クラスＩアルドラーゼに属する（プロトン化されたシ
ッフ塩基をジヒドロキシアセトンホスフアート（DHAP）
で形成;EDTAによってＦ−1,6−BPに対する活性は妨害さ
れない;DHAP及びNaBH4による完全な抑制）； −37℃で及びpH7.5でＦ−1,6−BPをDHAP及びグリセリン
アルデヒド−３−ホスフアートへの又はＦ−１−ＰをDH
AP及びグリセリンアルデヒドへの分解に関するKM−値0.
022mM又は18.8mM; −比活性（精製仕上げされた）25U/mgたん白質 （ブラドホードによるたん白質測定）； −分子量33.000ダルトン（構成単位で分解せず）； −pH6.5〜pH9の範囲にわたるpH−最適条件； −pH−安定性:pH1−12（25℃）で10分後及びpH2（４
℃）で72時間後の残存活性度100％； −温度（Ｔ）−安定性:100℃（pH7.5）で５分後及び60
℃（pH7.5）で90分後の残存活性度70％； −貯蔵安定性:a）室温（RT）:100％ ｂ）−20℃:100％で ５日後の精製仕上げされた凍結乾燥物の残存活性度； −基質スペクトル：短鎖脂肪族アルデヒドを、−Ｉ−効
果と共に官能基を有する分子に於て、変換速度の付加的
な増加につれて特に良好に変換する； によって特徴づけられる、請求項１又は２記載のアルド
ラーゼ。 - 【請求項４】発酵器中で培養された、スタフィロコッカ
スカルノススの細胞物質から培養液体を分離し、除去
し、酵素を細胞破壊後に収得する、請求項１ないし４の
いずれかに記載したＦ−1,6−BP−アルドラーゼの生成
方法。 - 【請求項５】酵素を細胞破壊の後に、分別された硫酸ア
ンモニウム沈殿、pH−分別及びイオン交換体クロマトグ
ラフィー分離によって単離する、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】酵素含有液体に、細胞破壊後に水性２−相
間抽出を行い、酵素を上相からアニオン交換体−クロマ
トグラフィーによって生成する請求項４記載の方法。 - 【請求項７】請求項１記載のＦ−1,6−BP−アルドラー
ゼを、アルデヒドとDHAPとの酵素反応による炭水化物又
はその誘導体の合成に使用する方法。
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|---|---|---|---|
| DE3940431.5 | 1989-12-07 | ||
| DE19893940431 DE3940431C1 (en) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | Fructose-1,6-di:phosphate aldolase used in prepn. of carbohydrate(s) - is obtd. from fermentation of Staphylococcus carnosus by fractional pptn. |
| DE19904026382 DE4026382A1 (de) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | Fructose-1,6-bisphosphat-aldolase, verfahren zur herstellung derselben und deren verwendung |
| DE4026382.7 | 1990-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03224485A JPH03224485A (ja) | 1991-10-03 |
| JP2662460B2 true JP2662460B2 (ja) | 1997-10-15 |
Family
ID=25887744
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2326136A Expired - Fee Related JP2662460B2 (ja) | 1989-12-07 | 1990-11-29 | フルクトース‐１，６‐ビスホスフアート‐アルドラーゼ、その製造方法及びその使用方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0431548B1 (ja) |
| JP (1) | JP2662460B2 (ja) |
| DE (1) | DE59008521D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2687659B1 (fr) * | 1992-02-24 | 1994-08-26 | Texel | Procede de traitement de la flore contaminant les circuits papetiers mettant en óoeuvre des bacteries. |
| DE4304097A1 (de) * | 1993-02-11 | 1994-08-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Dihydroxyacetonphosphat aus Glycerinphosphat und seine Verwendung in enzymatischen Aldoladditionen |
| US20060166236A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-07-27 | Chong-Sheng Yuan | Allosteric enzyme coupled immunoassay (AECIA) |
| CN103173421B (zh) * | 2013-03-20 | 2014-10-01 | 吴海春 | 用于测定果糖二磷酸钠含量的固体酶复合物的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2828235C2 (de) * | 1978-06-28 | 1980-04-17 | Kernforschungsanlage Juelich Gmbh, 5170 Juelich | Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Lösung |
| US4605622A (en) * | 1983-11-15 | 1986-08-12 | Kansai Paint Co., Ltd. | Process for producing granular fixed enzymes or microorganisms |
| JPH0672883B2 (ja) * | 1985-06-19 | 1994-09-14 | コニカ株式会社 | 分析素子 |
| US4958212A (en) * | 1988-12-30 | 1990-09-18 | Texas Instruments Incorporated | Trench memory cell |
-
1990
- 1990-11-29 JP JP2326136A patent/JP2662460B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-04 DK DK90123194.4T patent/DK0431548T3/da active
- 1990-12-04 DE DE59008521T patent/DE59008521D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-04 EP EP90123194A patent/EP0431548B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-07 US US07/624,234 patent/US5162221A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏａｒｕａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０８（１）（１９８０） ｐ．２９５−３０１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0431548T3 (da) | 1995-06-26 |
| DE59008521D1 (de) | 1995-03-30 |
| EP0431548A1 (de) | 1991-06-12 |
| EP0431548B1 (de) | 1995-02-22 |
| US5162221A (en) | 1992-11-10 |
| JPH03224485A (ja) | 1991-10-03 |
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