JPH0361494A - ムテイン，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り果±象剋里公号 本発明は、線維芽細胞成長因子（以下、ＦＧＦと略称す
ることもある。）のムティン、およびそれを製造するた
めの技術に関する。

従来の技術 線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、ペプチド性細胞成長
因子で、等電点が塩基性のｂＦＧＦと酸性のａＦＧＦが
あり、共に全アミノ酸配列が明らかにされている［Ｆ、
Ｅｓｃｈら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ　Ａ　８５　：　６５０７（１９８
５）およびに、Ａ、　Ｔｈｏｍａｓら：　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２　：　
６４０９（１９８５）］。

ＦＧＦは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは３Ｔ３細胞や血管内皮
細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作用を、ｉ
ｎ　ｖｉｒｏでは血管新生作用を示すことが知られてい
る［Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら：　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｅ１？ｅｖｉｅｗｓ　３　：　９５（１９８７
）］。中でもＦＧＦの血管新生作用は細胞増殖作用と相
まって、損傷、火傷の治療薬、血栓症、動脈硬化症など
の予防治療薬として用いられるものである。

天然に存在するＦＧＦは極めて微量で、これを取得する
のは困難であったが、最近遺伝子組換え技術を用いた製
造法が開発された。遺伝子組換え技術を用いたｂＦＧＦ
およびａＦ　Ｇ　Ｆの製造については、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　　
１４旦：　４７０（１９８７）、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇＹ　５．：　９６０（１９８７）。

Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３＋　１６４７１（１９
８８）、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３　：　１８４５
２（１９８８）、　　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｒ　　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６３　
：　１６２９７（１９８８）などの報告がある。

ＦＧＦムティンに関しては、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、±５１　：　７０１（１９８
８）、　Ｔｈｅ　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒＹ　２６３　：　１８４５２（
１９８８）にＦＧＦに存在するＣｙｓ残基をＳｅｔに置
換したムティンについて記載されている。

発明が解決しようとする課題 本発明者らは、アミノ酸配列を修飾し、糖鎖付加部位を
導入することによって、ＦＧＦの安定性、細胞における
産生能、分子当りの細胞増殖活性の上昇、細胞外への分
泌能の付与、さらに未知の生物活性の賦活化がなされる
であろうと考えた。

天然に存在するＦＧＦにＮ鎖が結合していることを示す
データはなく、−船釣にＦＧＦは糖鎖を持たないペプチ
ドであると考えられている。それに起因するか否かは定
かでないが、ＦＧＦは非常に不安定なペプチドで容易に
その活性を失う。ＦＣＦ、特に組換え型ＦＧＦの安定性
を増すことは、これを医薬品などに応用するために不可
欠である。

さらに、ＦＧＦ遺伝子には明確なリーダー配列がなく細
胞内で合成されるＦＧＦは大部分細胞内に留まり、細胞
外に分泌されるＦＧＦはごくわずかかあるいは分泌され
ないことがわかっている。

これ這典型的な異種リーダー配列をＦＧＦ遺伝子の上流
に結合し、ＦＧＦを産生・分泌させようとする試みはい
ずれも成功していない。遺伝子組換え体を用いてＦＧＦ
を産生させる場合、Ｆ　Ｇ　Ｆを細胞外に分泌させるこ
とが出来ればその後の精製過程が非常に簡便化されるこ
とが考えられる。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換え型ＦＧＦのような糖鎖を持たない
生物活性のあるタンパク質を、その活性に悪影響を及ぼ
さないがタンパク質が安定化し、血中消失時間が延びる
ように、かつ産生時に組換え体外に分泌されるように改
変するためＦＧＦに糖鎖結合部位を導入することを考え
た。

★春Ｒ１１冬＋”　Ｉ斗　■工噛与ｎＭΔ拮は讐長トｒ
Ｃ銭室部位指向性変異（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　
　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、糖鎖結合部位を導
入するよう修飾されたｂＦＧＦのムティンを構築し、安
定性の向上、細胞内での産生能の上昇、細胞外への分泌
の向上、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭意研
究したところ、これらの目的に叶うムティンを見い出し
、これらの知見に基いてさらに研究した結果、本発明を
完成した。

本発明は、（１）、少なくとも１個の糖鎖結合部位を導
入した線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ムティン、（２）
、上記（１）のムティンをコードするＤＮＡ。

（３）、上記（２）のＤＮＡを含有するベクター（４）
、上記（３）のベクターで形質転換された形質転換体、
および （５）、上記（４）の形質転換体であって宿主が酵母ま
たは動物細胞であるものを培地に培養し、培養物中に上
記（１）のムティンを生成蓄積せしめることを特徴とす
る当該ムティンの製造法である。

本発明のムティンにおける変異させる前のＴ；’（”’
：Ｔ；’Ｊ−１ｙ＋＋斤ｈＭ＝Ｉ？Ａ（：’ｍ４．）／
Ｎ１圭Ｊ４−ＣＧＦでもよい。また、温血哺乳動物のＦ
ＧＦのいずれのものでもよい。

その代表例としてはたとえば、ヒト、ウシ、ラットのｂ
ＦＧＦが挙げられる。

さらに具体的には、 Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−１
１ｅ　−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｖ　ａｔ　−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ　　　［Ｉ］で示されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが好ましい。

さらに、一般式 ％式％ ［］ 〔式中、ＹはＴｈｒまたはＳｅｒを示し、ＹがＴｈｒの
とき２はＳｅｒを、ＹがＳｅｒのとき２はＰｒｏをそれ
ぞれ示す。〕で表わされるポリペプチドが好ましい。

さらに、アミノ酸配列： Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｉａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒ
ｏ−Ｐ　ｒ。

Ｇｌｙ−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ａｓｐ　−Ｐｒ
ｏ　−Ｌｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　
−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−［１ｅ−Ｈｉ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｒｇ
　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　１ｙ−Ｖ　ａｌ　−
Ａ　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ
　ｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｈｉｓ　−１１ｅ　−Ｌｙｓ　
−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ＩｎＡ　ｌａ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｖ　ａｌ　−５ｅｒ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｔ−Ｃｙｓ＋−Ａｌａ　−Ａｓｎ−Ａｒｇ−
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−３ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｃ
ｙｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｈｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ
　ｓｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｒｇ　−Ｓ　
ｅｔ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｔ　ｈ
ｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｖ　ａｌ
　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｙｓＡ　ｒｇ　−Ｔ
　ｈｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　
ｙｓ　−Ｌ　ｅｕＧ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｌａ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−
３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ　　　［ＩＩＩ］を含
有するヒトｂＦＧＦが好ましい。

またさらに、アミノ酸配列： Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ａ　ｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　
ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｈｉｓ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｒｇ　−
Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　
ｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−ＨｉｓＶ　ａｌ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒｌ　１ｅ　
−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｃｙｓ　−Ａ
　Ｉａ　−Ａ　ｓｎＡｒｇ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉ
ａ−Ｍｅｔ　−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕＡｓｐ−Ｇ　ｌｙ　−
Ａｒｇ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａ−１ａ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｌ　ｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｈｒ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　
ｈｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｇ　ｌｕＳ　ｅｔ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｓｎ　−
Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｙｓ　−Ｔ　ｙ
ｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓ　ｅｒＴ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｖ
　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　
ｒｇＴ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｙｒ　
−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−３ｅｒ　−Ｌ
　ｙｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｌａ　−ｒ　ｌ
ｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒ。

Ｍｅｔ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｓ　ｅｒ　　
　　　　　　［ＩＶコを含有するラットＦＧＦが好まし
い。

ａＦＧＦとしては、ヒト由来のもの、ウシ由来のものが
挙げられる。

ウシａＦＧＦのアミノ酸配列としては、Ｐ　ｈｅ　−Ａ
　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−
Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　
−Ｃｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
　ｌｙ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−
１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｔ　ｈｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｔ
　ｂｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｒｇ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｈｉｓ　−Ｉ　ｌｅ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｃｙｓ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−３ｅｒ　−Ｉ　
ｌｅ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙ
ｒ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　
−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｍｅｔ　−Ａ　
ｓｐ　−Ｔ　ｈｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｇ　ｌｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｎ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ
　ｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａｓｎ−Ｈ１ｓ−Ｔ
ｙｒ−Ａｓｒ＋−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ　−３ｅｒ　
−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｐ　ｈ
ｅ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｙｓ
　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｒｇ　
−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｅｕＧ　Ｉｙ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ａ　ｒｇ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｐ　ｈｅ
　−Ｇ　ｌｙＧ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ａ　Ｉａ　−ｒ　
ｌｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−ＬｅｕＰ　ｒｏ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ａ　ｓｐ［Ｖ］ さらに、ヒトａＦ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列としては、Ｐ
　ｈｅ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｙ−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ
　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ−Ｖａｔ　　Ａｓｐ　
　Ｇｌｙ　　Ｔｂｒ−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｒ
ｇ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｈｉｓ　
−Ｔ　Ｉｅ　−Ｇ　ｌｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｔ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｔ　ｙｒ［１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
ｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｉａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈ
ｒ　−Ａ　ｓｐ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｕ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌ
ｕＧ　Ｉｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ
　ｓｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｔ　ｙｒ　−１１ｅ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｈｉｓ　−Ａ　Ｉａ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｓｎ　−Ｔ　ｒｐ　−
Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ
　ｙｓ　−Ｌ　ｙｅｔ　−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｒｇ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　
ｙｒ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｙｓ　−Ａ　ｌａ　
−（ｌｅ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｓ　ｅｒ　−Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　［ＶＩ］が好ましい。

ＦＧＦとしては、なかでもヒト塩基性ＦＧＦが好ましい
。

本発明におけるムティンは、少なくとも１個の糖鎖結合
部位を有するムティンであり、さらに冗のペプチドある
いは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであってもよ
い。該変異としては、たとえばアミノ酸の付加、構成ア
ミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。

上記糖鎖結合部位としては、糖鎖結合部位を構成するア
ミノ酸配列が、式Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ、（式中、Ｘはアミノ
酸残基を、ＹはＴ　ｈｒ、　Ｓ　ｅｒまたはＣｙｓをそ
れぞれ示す。）で表わされる配列が挙げられる。

糖鎖結合部位としては、具体的にはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ
、　Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｒ、　Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ、　（
ＸはＰｒｏ以外のいスレのアミノ酸でもよい〉のアミノ
酸配列が分子中に生ずればよい。糖タンパク質において
糖鎖がタンパク質に結合する部位についてはある種の規
則性の存在することが知られている。

即ち１Ｉｊｌはタンパク質中のＡｓｎ残基に結合する。

このＡｓｎを含むアミノ酸配列は　Ａｓｐａｒａｇ　１
ｎｅｓｅｑｕｏｎと呼ばれる配列をしており、上記の三
つのアミノ酸からなる配列で表わされる。これらは例え
ば下記の文献に記されている。

ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　ｌ　０８　：　３４１Ｃ
１９７９）。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　　２０３　：　７６１　（１
９８２）。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　　２０９　：　３３１　（１
９８３）。

ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　９６　：　１７９（１９
７８）。

上記式におけるＸとしては、Ｐｒｏ以外のアミノ酸が好
ましく、さらにはＧ　Ｉｙ、　Ｔ　ｙｒ、　　Ａ　ｒｇ
、　　Ｓ　ｅｒＬｙｓ、　　ＶａｌまたはＡｌａが好ま
しい。さらに、Ｘとしては、Ｇｌｙ、　　Ｌｙｓ、　　
Ｖａｌ、　　Ａｌａが好ましい。

上記式におけるＹとしては、ＴｈｒまたはＳｅｒが好ま
しい。

本出願に記載の方法により生産される糖鎖付加型ｂＦＧ
Ｆに付加する糖鎖の種類は、一般に知られている糖タン
パクに見い出される糖ならば何でもよく、特に種類を問
わない。例えば、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセ
チルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、フコ
ース、シアル酸などをあげることが出来る。

また、糖鎖の長さは、１種以上の糖が付加しておればよ
い。好ましくは、１０〜２０の糖鎖をもつｂＦＧＦをあ
げることが出来る。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

ＦＧＦと少なくとも１個のＦＧＦｉｉ戊アミノ酸が欠損
しているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の
数としては、ＦＧＦめ有する特徴を失わない限り何個で
もよい。

該欠損している構成アミ／酸の例としては、たとえばヒ
トｂＦＧＦのアミノ末端側１０残基：Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ。

ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのアミノ末端側１４残基：Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＡｓｐＧ　ｌ
ｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ
　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。

ヒ）　ｂＦ　Ｇ　Ｆのアミノ末端側４１ｉ基：１　　　
２　　　３　　　　　　　　４０Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ　−・・・−ＶａｌヒトｂＦＧＦのカルボキ
シル末端側６１残基：Ｌ　ｙｓ　−Ｃｙｓ　−０６，−
Ｅ”；ｓ　−ｂ’：ｒ８６　　８７ などが挙げられる。

さらに、ｂＦＧＦの少なくとも１個の構成アミノ酸が欠
損しているムティンとして、ｂＦ　Ｇ　Ｆのカルボキシ
ル末端側の７〜４６個のアミノ酸残基が欠損しているム
ティンが挙げられる。

該欠損の好ましい例としては、ヒトｂＦＧＦのアミノ酸
番号１０１以降のアミノ酸配列〃　　１０５　　　〃 〃　　ｌ１４　　　〃 〃　　１１８　　　　” 〃　　１２３　　　〃 〃　　１２９　　　〃 “　　１３７　　　　ノ／ が／に！Ｉ呂１？−ｆ、のｈく掌＋ｆ＾わ、Ａ−ＦＧＦ
の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸
で置換されているムティンにおける置換される前の少な
くとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数としては、ＦＧＦ
の特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、インロ
イシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、セリン。

スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前′のアミノ酸とは異なる性質をもつものを
選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギ
ン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアス
パラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン。

グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セゾン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がインロイシンである場合
には、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、グ
リシン、バリン、アラニン、ロイシン、チロシン、フェ
ニルアラニン、ヒスチジン。

トリプトファン、メチオニンが挙げられるが、特にセリ
ンが好ましい。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
、い。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

該アミノ酸の付加、構成アミノ酸の欠損、他のアミノ酸
への置換の好ましい例としては、たとえばバイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌａｎｄ　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎｓ）第１５１巻　第７０１−７０８頁（１９
８８年）、ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、２８１，８２
２号公報１日本特許出願特願平１−１５６６２号明細書
（ヨーロッパ特許出願第８９１０１１６２．９号、公開
第３２６．９０７号公報に対応）に記載のｂＦＧＦムテ
ィンが挙げられる。

本発明のムティンは、上記した糖鎖結合部位を有するム
ティンにさらに付加、欠損、置換の２つまたは３つが組
み合わさったものでもよい。

なかでも、上記した糖鎖結合部位を有するムティンに、
さらに少なくとも１個のヒト塩基性ｂＦＧＦ構成アミノ
酸が別のアミノ酸で置換されているムティンが好ましい
。特に、上記した糖鎖結合部位を有するムティンにさら
にヒトｂＦＧＦの６９位および８７位のＣｙｓがそれぞ
れＳｅｔに置換されたムティンが好ましい。

本発明のムティンを製造するためには、従来の組換えり
、ＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉ
ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
が採用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レ
イザー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及びジエイ・ピ
ー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　）、ジェネ
ティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社（１９８
３年）第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレ
オチドに指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ、　　Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌａｎ、　
　ｓ、　）、ジェネティック・エンジニアリング：原理
と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻　１−３
２頁に示されている。

本発明のムティンをコードする構造遺伝子を製造するた
めには、たとえば、 （ａ）ＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本ｌＤＮ
Ａを突然変異オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形成
させる、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び （Ｃ）この突然変異性ヘテロニ量体を複製する。

オリゴヌクレオチドブライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのブライマーの安定な雑種形成
に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌクレ
オチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオチ
ドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオ
チドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば全
体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大きさ〉
は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）によって記
述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、
突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最適化
するような長さであり、突然変異サイトから５′及び３
′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然
変異の編集をさけるのに十分な大きさとする。本発明に
従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは
、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ましくは約
１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは約１４個
ないし約１８個の塩基を含有する。これらは通常、変更
されるコドンの少なくとも約３個の塩基３′側を含有す
る。

たとえば、アミノ酸が付加されているムティンを得る目
的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作る方法としては
、付加するアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成ある
いは、制限酵素消化による断片とし、これをＦＧＦ遺伝
子の適当な箇所にＤＮＡリガーゼにより挿入あるいは付
加する。またＦＧＦ遺伝子に適当な制限酵素の認識部位
が存在しない場合には、前述の特定部位指向性変異法に
より制限酵素認識部位を新たに生成すればよい。

たとえば、ＦＧＦ構戊構成ノ酸が欠損しているムティン
を得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作る方法
としては、三つの場合が考えられる。ひとつはＦＧＦの
アミノ末端を欠損させる場合、二つめはＦＧＦの中央部
分を欠損させる場合、三つにはＦＧＦのカルボキシル末
端を欠損させる場合である。

アミノ末端を欠損させる場合には欠損させようとするア
ミノ酸配列のカルボキシル末端をコードする遺伝子のコ
ドンをＭｅｔをコードするＡ　’ｒ　Ｇに特定部位指向
性変異法を用いて変更し、さらにそのコドンの５′末端
側に適当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモー
ターとの連結（ｌ　ｉｇａｔ　１ｏｎ）を容易にさせる
。

アミノ酸配列をその中央部分で欠損させる場合には欠損
させたい配列をコードする遺伝子の５′および３′末端
側にユニークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変
異法を用いて生成し、この部位を酵素によって消化して
抜きとり、再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的
のアミノ酸を欠損したＦＧＦをコードする遺伝子ができ
上る。

−ａ）Ｊ−４７！、ＩＩ　ＰｔＪ　Ｈ轡ンＢノｌ／Ｉｊ
）Ｍ”１！　エ　日υ　ｈ　士九、−１＜　−ｐ　ｈ　
　什いようにすることは云うまでもない。

カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠損させる場合に
は、欠損させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコー
ドする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によってス
トップコドンに変更すればよい。

たとえば、構成アミノ酸がシスティンであってこれを置
換したムティンを得る目的の場合において、変異ＦＧＦ
遺伝子をつくる方法は、たとえば、Ｃｙｓを発現するコ
ドンを消失させるか、又はそれが別のアミノ酸を暗号化
するように変更させる合成ヌクレオチドブライマーを使
用して、ＣｙＳを発現させるコドンＴＧＣまたはＴＧＴ
に特定部位指向性変異誘発を行なわせるものである。た
とえば、ヒトｂＦＧＦのシスティン（２５位）をセリン
に変えるために、ブライマーをＦＧＦ遺伝子のセンス鎖
と雑種形成させる。たとえば、好ましいヌクレオチドブ
ライマーとしては ５’−ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧ（′　
Ｔ　　　　Ｑ’ が挙げられる（下線は変更されたコドンを示す）。

シスナイン（６９位）をセリンに変えるときの好ましい
プライマーとしては ５’−ＡＡＣＧＡＴＴＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣ−３′ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（８７位）をセリンに変えるときの好ましい
ブライマーとしては ５’−ＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴ−
３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

システィン（９２位）をセリンに変えるときの好ましい
ブライマーとしては ５’−ＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣ−
３’ が挙げられる。（下線は変更されたコドンを示す）。

Ｃｙｓ（２５位）で第一塩基のＴ→Ａの転位により、シ
スティンからセリンへの変化が起る。ざらにＣｙｓ（６
９位）では第１塩基のＴ４Ａ、第２塩基のＴ−４−Ｃ転
位、Ｃｙｓ（８７位、９２位）では第２塩基のＧ＋（に
位によりシスティンからセリンへの変化が起る。

特定部位指向性変異によりｂＦＧＦムティン蛋白質を産
生させる時に、Ｉ）ＮＡ配列に複数個の変異を行っても
よいこと、すなわち、アミノ酸に対応しているＤＮＡの
コドンは縮退していることを認識しておかなければなら
ない。

たとえば、構成アミノ酸がシスティン以外のアミノ酸で
あってこれを他のアミノ酸に置換したムティンを得る目
的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作る方法としては
、システィンの場合と同様にして、オリゴヌクレオチド
プライマーによるコドンの変更を行う。

ただしオリゴヌクレオチドブライマーのデザインはどの
アミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもない。

ブライマーは、ＦＧＦ遺伝子の１本鎖がクローン化され
たＭ　１３　［：Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ、　　
Ｃ，。

Ｖｉｅｉｒａ、　　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、　３３　１０３１１９（１９８５）、Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ　　Ｊ、メソッズ・イＥｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ
） ン・エンジ−モロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ、土互
ユ　２Ｏ−７８（１９８３））。

ｒｄ　（Ｒ，Ｈｅｒｒｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック（Ｍｏ１
．　　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）、１７７　２３１（１９８０））、又は
φ×１７４　ＣＭ、　５ＩＩｌｉｔｈ　　ａｎｄ　　Ｓ
、　　Ｇｉｌｌａｍ、ジェネティック・エンジニアリン
グ（Ｇｅｎａｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｍｏ１．３．ＰＰＩ　−３
２（１９８１））のような１本鎖ファージへ雑種形成さ
れる。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖の
いずれでも運搬できることは認められる。ファージがア
ンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を暗号づ
けたトリブレットを決定するこのコドンとの不一致以外
にもプライマーは突然変異させるコドンを含有するセン
ス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場合があ
ってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬する時に
は、欠損させるコドンと対合をつくるトリプレット中の
適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含有する
センス鎖の領域に対して相捕的でない場合があってもよ
い。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及びニス
・ギラム（前掲）によって記述されている。

温度は通常、約Ｏ℃ないし７０℃、もっと−船釣には約
ｌＯ℃ないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、プライ
マーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１１Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラーゼ
との反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ず
るｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリ
ガーゼでの処理によって閉鎖環ｄｓＤＮＡへ変換される
。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレ
アーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異成形ヘテロニ量体は、被感染能力をもつ
宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿主
によるヘテロニ量体の複製では、双方の鎖から子孫がで
きる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から突然変
異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベ
クターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用する
。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファ−ジＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のｐＢＲ３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）＋　２　＋９
５（１９７７）コ、ｐＢＲ３２５［ジーン、４．　ｌ　
２１（１９７８）］、ｐＵＣ１２［ジーン、１９，２５
９（１９８２）コ、ｐＵｃ１３［ジーン、１９．２５９
（１９８２）］、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ［バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂ　１
ｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｃｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎ）、土ユ２．６７８（１９８３）］など
が挙げられるが、その他のものであっても、宿主内で複
製保持されるものであれば、いずれをも用いることがで
きる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　　コール
ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　
　　Ｓ　ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）＋第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが
挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２゜ｐＵｃ１
３）、枯草菌由来プラスミド（例、ｐＵＢｌ　１０、ｐ
ＴＰ５．ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳ
　Ｈ１９，ｐＳ　Ｈ１５）、あるいはλファージなどの
バクテリオファージおよびレトロウィルス。

ワタシニアウイルスなどの動物ウィルスなどがあげられ
る。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。遺伝子
産物を培地中に分泌生産させるためには、該遺伝子の５
′末端に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ま
たは該シグナルペプチドをコードするＤＮＡおよびシグ
ナルベプチドープロペブチド（ブレ・プロ領域）をコー
ドするＤＮＡを連結するのが好ましい。該遺伝子を発現
させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明
で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用
いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかな
るものでもよい。

また、形質転換する際の宿主が酵母である場合は、α−
ファクタープロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧ
Ｋプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモー
ターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌
でプロモーターがｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモー
ターまたはＴ７プロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけ５Ｖ４Ｑ由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたムティンをコードする塩基配
列を有する組換えＤＮＡをを含むベクターを用いて、形
質転換体を製造する。

宿主としては、たとえば酵母、動物細胞などが挙げられ
る。

上記ｉ！母としては、たとλばす・ゾカロマイセスセレ
ビシアエ（Ｓ　ａｃａｈａｒｏ＊ｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ″″、ＮＡ３７−１１Ａρ−
、ＤＫＤ−５Ｄ、ＴＢ３９ρ−などが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖ　
ｅｒａ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，？ウスＬ
細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

好ましくは、糖付加に関与する一層の酵素系を有するこ
とが明らかにされている宿主・ベクター系、具体的には
酵母系、動物細胞系を用いるのが望ましい。

酵母を形質転換するには、たとえばＰ　ｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７５；
１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる
。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１９７３）に記載の
方法に従って行なわれる。

本発明のムティンをコードするプラスミドを保持させる
目的で、大腸菌を該プラスミドで形質転換し、形質転換
体を作成してもよい。該１１：、ｃｏｌｉとしては、た
とえばＥ、　ｃｎｌｉ　ＤＨｌ　ｒＰｒｎｃ　　Ｎｓｔ
ｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６０．　１６０（１９６
８）］。

Ｊ　Ｍ　ｌ　０３　［Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃＴｏ　９　、３０９（１９８１）］、　Ｊ
　Ａ　２２１　［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、土２０，５１７（１９７８）］
、ＨＢ　１０１［Ｊｏａｒｎａｌ　ｏｒ　ＭｏＩｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　　４１　＋　　４５９（１
９６９）］、　　Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９，
４４０（１９５４）］、ＭＭ２９４　［Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ、ヱ１．４１７４（１９７６）コなどが挙げられ
る。

大腸菌を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６９．２１
１０（１９７２）＋　Ｇｅｎｅ、　ｌヱ、　ｌ　Ｏ７（
１９８２）、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

ｐａｇｅ２４９．１９８２などに記載の方法に従って行
なわれる。

このようにして、ムティンをコードする塩基配列を有す
る組換えＤＮＡを含むベクターを形質転換された形質転
換体が得られる。

該形質転換体を培地に培養することに・より、ムティン
を産生させる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂ　ｕｒｋｈｏｌｄｅ
ｒ）最小培地［Ｂ　ｏｓｔｉａｎ、　　Ｋ　、　　Ｌ　
、　　ら。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＵＳＡ、７７゜４５０５（１９８０）］が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０°Ｃ〜３５℃で約２４〜７２時間行い、
必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地［サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）１２２．５０
１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［ヴイロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５９）］、ＲＰＭ＋
　１６４０培地［ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（ＴｈｅＪ　ｏｕｒｎａ
Ｊ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｍｅ
ｄｉｃａｌＡ　５ｓｏｃｉａｔｉｏｎ）　　上皇９．５
１９（１９６７）］。

１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテ
ィ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　５ｏｃｉｅｔｙ
　　ｆｏｒｔｈｅ　　Ｂｉｏｌｏｇｃａｌ　　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ）７３．１（１９５０）１などが挙げられる。

ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０
〜４０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応
じて通気や撹拌を加える。

上記培養物からムティンを分離精製するには、例えば下
記の方法により行うことができる。

ムティンを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して
は、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、こ
れを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に
懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレン
チプレス、超音波、リゾチームおよび（または）凍結融
解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離
によりムティンを得る方法などが適宜用い得る。とりわ
け、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ましい 上記上澄液からムティンを精製するには、自体公知の分
離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。

これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱
法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、
ゲルろ過法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イ
オン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する
方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的
親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ
ーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法
などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄？夜をＤＥＡＥセルロース
などを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかけ
ることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くこと
ができる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液をかけ、
素通り画分を集めることは有効である。また、さらにＣ
Ｍセルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラ
フィーにかけることにより、ムティンを担体に吸着させ
、塩溶岐を用いてこれを溶出させることができる。これ
らの溶出液は透析後、凍結乾燥することができる。

上記精製にあたっては、どのフラクションに目的とする
本発明のムティンが含まれているかについて、たとえば
抗ＦＧＦ抗体なかでも抗ＦＧＦモノクローナル抗体（例
、ヨーロッパ特許出願公開第２８８，６８７号公報記載
の方法で製造されるモノクローナル抗体）を用いる免疫
学的測定法により、検索することができる。

本発明のムティンは、ムティン産生時の産生能が向上さ
れ、また形質転換体の外に分泌されるので、工業的大量
製造に有利である。

また、本発明のムティンは、安定性が向上し、血中消失
時間が延長され。しかも活性が向上されているので、医
薬等として有利に用いることができる。

このようにして得られるムティンは線維非細胞の増殖を
促進させる作用を有し、毒性は低いので火傷、創傷、術
後組織などの治癒促進剤、あるいは血管新生作用による
血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いることがで
きる。また、細胞培養を促進させるための試薬として用
いることができる。

本発明のムティンを医薬として用いるには、そのまま粉
末として、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦
形剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、
カプセル剤、液剤、軟膏）として、哺乳温血動物（例、
ヒト、マウス、ラット、ハムスタ、ウサギ、犬、ネコ）
に対して非経口的または経口的に安全に投与することが
できる。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうる。

本発明のムティンを上記した医薬として用いる場合には
、たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状など
を考慮して、１日量約１ｎｇないし１００μｇ／ｋｇの
中から適当量を選んで投与される。

また、本発明のムティンを細胞培養を促進させるための
試薬として用いる場合、培地１１あたり約０．０１〜１
０μｇ１さらに好ましくは約０．１〜１０μｇとなるよ
うに培地に加えることが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　ＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　　
Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌＮ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる
場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　　：相補的デオキシリボ核酸Ａ　　　：ア
デニン Ｔ　　　：チミン Ｇ　　　ニゲアニン ：シトシン ：リボ核酸 ：デオキシアデノシン三リン酸 ＮＡ ＡＴＰ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ｄｒ ＤＴＡ ＤＳ １ｙ ｌａ ａｌ ｅｕ １ｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ ｙｓ ｒｇ ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキシグアノシン三リン酸 ：デオキシシチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ：グリシン ：アラニン ：バリン ：ロイシン ；イソロイシン ：セリン ：スレオニン ：システィン ：メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギニン Ｈｉｓ　　　　：ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　：フェニールアラニン Ｔｙｒ　　　　：チロシン Ｔｒｐ　　　　：）リブトファン Ｐｒｏ　　　　ニブロリン Ａｓｎ　　　　：アスパラギン Ｇｌｎ　　　　：グルタミン 本明細書および図面において、ヒトｂＦＧＦの構成アミ
ノ酸の番号は、上記式［Ｉ［１］のアミノ酸配列のＮ末
端のＰｒｏを第１番目とする。

以下の実施例で示される５ａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９ρ−は、種５ａｃｃ
ｈａｒｏ＊ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同様の菌学
的性質を有し、ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　：　ａ　、　　Ｌ
　Ｅ　Ｕ″″、ＨＩＳ−、ρ−を示し、ｇｅｎｏｔｙｐ
ｅ：　ａ、　ＭＡｔａ、　　Ｉｅｕ２＋　ｂｉｓ３．　
ｐｈｏ９゜ρ−を示し、遺伝子の発現量が高いという性
質を有する。

該Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　Ｔ　Ｂ　３９　Ｄ″″（αｐｈｏ９　、　ｈｉｓ３　
、１ｅｕ２）は、呼吸能欠損変異株であり、本国はＳａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｎ　
Ａ　７４−３Ａ（α、　ｐｈｏ９．　ｈｉｓ４．１ｅｕ
２）（日本特願昭６３−２８３７１６号参照、ヨーロッ
パ特許出願公開第３１７，２０９号公報に対応）とＳａ
ｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｄ
　Ｋ　−１３Ｄ（ａ、　１ｅｕ２．　ｔｒｐｌ　＋　ｈ
ｉｓ３　）［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋４　、　７７１　（１９８４
）］との交雑によって得られた株のうちの１株をエチジ
ウムブロマイドで処理することによって得られる。

上記交雑方法自体は公知であり、たとえば微生物学実験
法、微生物学研究法懇談会編、講談社。

１９７５年、第３２０頁に記載されている方法に従って
行なわれる。

エチジ、ラムブロマイド処理によって呼吸欠損株（ρ−
株〉を得る方法自体は公知であり、例えばＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｃａｕｓｅ　Ｍｏｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ。

１９８６に記載されている。

本Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９９−株は
、遺伝子の発現量が高いので、形質転換体を製造するた
めの宿主として有用である。

以下に示す参考例、実施例において製造された微生物は
、財団法人発酵研究所（ＴＰＯ）および通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託されてい
る。それらの受託番号および受託日を次の第１表に示す
。

（以下余白） 実施例 以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

参考例１　　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９ρ−の創製） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　　Ｎ　Ａ　７　４　−　３　　Ａ　（ａｔｐｈｏ９　
ｔ　　ｈｉｓ４　＋　　１ｅｕ２　）と　Ｓ、　　ｃｅ
ｒｅｖｉｇｉａｅ　Ｄ　Ｋ　−１３Ｄ（α、　１ｅｕ２
．　ｔｒｐｌ＋　ｈｉｓ３）［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎ
ｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　４　＋　　
７７１　（１９８４）コとを交雑し、そのうちの１株を
エチジウムブロマイドで処理することによって、呼吸能
欠損株Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９　ρ−（α＋　Ｍ
Ａｔａ、　１ｅｕ２゜ｈｉｓ３．ｐｈｏ９．　ρ−）（
ＩＦＯ１０４６７、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３９９）を得
た。

実施例１　（α−ｆａｃｔｏｒのプロモーターとｐｒｅ
ｐｒｏ領域を持った酵母用分泌発現ベクターの構築） α−ｆａｃｔｏｒのプロモーターとｐｒｅｐｒｏ領域を
持ったプラスミドＤ６９　Ａ　　ｒ　Ｊ、Ｋｕｒｊａｎ
　　ａｎｄｌ、１（ｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　Ｃｅ１ｌ、３
０．　９３３−９４３（１９８２）］を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化して１　、６　ｋｂｐより戊るα−ｆａｃｔ
ｏｒのプロモーターとｐｒｅｐｒｏ領域部分を切り出し
た。これを大腸菌ポリメラーゼフレノウフラグメントで
処理して、平滑末端として後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでＢ
ａｇ旧リンカ−ｐ（ＣＣＧ　Ｇ　Ａ　ＴＣＣＧＧ）を結
合して、制限酵素Ｂａ−旧と旧ｎｄＩ［［で切断して、
０　、９　ｋｂｐの断片とした。

このＤＮＡ断片をファージＭ１３ｓｐ１８のＢａｇ旧と
Ｈｉｎｄｌｌｌの部位に挿入して、−末鎖ファージＤＮ
Ａ（ｓｓＤＮＡ）を調製した。この５ｓＤＮＡと合成プ
ライマー ５’−ＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＣ−３
′ を用いて部位特異的突然変異を行った。この反応は５ｉ
ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋ
ｉｔ［アマジャム社。

ＵＫ］を用いて行った。この結果得られたミュータント
　ファージより二本鎖ＤＮＡ（ＲＦ−ＤＮＡ）を調製し
、Ｂａａ旧と旧ｎｄＩＩＩで消化してＢａｍＨＩ−旧ｎ
ｄ［［Ｉの断片（０，９ｋｂｐ）を調製した。このＤＮ
Ａ断片は初めに調製したＤＮＡ断片（０、９ｋｂｐ）よ
りも２５ｂｐ短くなっている。

一方、ＹｏｓｈｉＩｌｕｒａ　ら＊　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、　、土４５．７１２　（１９８７）に記
載の方法で得られたプラスミドｐＧＥＬ１２５を旧ｎｄ
ｌ［Ｉで消化してフレノウフラグメントで処理した後Ｔ
４ＤＮＡＩＪガーゼで切断部分を再結合してｐＧＥＬ１
２５Ｈを得た。さらにこれをＸｈｏ　Ｉで切断して、Ｘ
ｈｏ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［［アダプターｐＴＣＧＡＧＧ
ＣＣＡ ＣＣＧＧＴＴＣＧＡｐ をＴ４ＤＮＡリガーゼにより導入した後、ＨｉｎｄＩＩ
ＩとＢａｍ旧で消化して８　、３　ｋｂｐのＤＮＡ断片
を得た。

この断片（８，３ｋｂｐ）と先に調製した断片（０，９
ｋｂ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合してｐＡＬＦＡ３１
０を得た。

さらにｐＧＫターミネターを持つプラスミドｐＧＬＤＰ
３１−ＲｃＴ［ヨーロッパ特許出願公開−０２３５４３
０参照コよりこのターミネターに相当する部分を５ａｌ
ＩとＡｈｏ　ｍで切り出して２８７　ｂｐの断片を得た
。これにＴ４　ＤＮＡリガーゼでＸｈｏ　１リンカ−ｐ
（ＯＣＴ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　Ｇ　）と結合し、Ｓａｌ　Ｉ
とＸｈｏ　Ｉで消化した。このようにして得られた断片
をｐＡＬＦＡ３１０のＸｈｏ　Ｔ部位に挿入したｐＡＬ
ＦＡ３１０Ｔを構築した（第１図参照）。

なお、第１図のプラスミドｐＡＬＦＡ３１０Ｔの制限酵
素地図におけるＸｈｏ　ｒ−旧ｎｄｌｌ［の箇所につき
次に詳しく示す。

１ （上記アミノ酸の番号はα−ファクターのそれを示す。

） 実施例２（ヒトｂＦＧＦへの糖鎖結合部位の導入）（１
）アミノ末端への導入 ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａを組み込んだファージ
クローンＭｌ　３ＰＯ（ヨーロッパ特許出願公開第２８
１．８２２号公報）のｓｓＤ　Ｎ　Ａと合成ブライマー
５’−ＣＴＧＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＣＧＧＧＣＡＡＴ−
３’ を用いて部位特異的突然変異を作った。

この反応にはＳ、１ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｓ＋ｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ［アマジャム社、ＵＫ］を用
いた。この結果得られたミュータント　ファージＭ１３
Ｐ１４よりＲＦＤＮＡを調製し、Ａｖａ　（とＳａｌ　
Ｉで切断して、ｂＦＧＦのＮ末端５残基に相当するｃＤ
ＮＡ部分を欠いたｃＤＮＡ断片を調製し、合成アダプタ
ー（旧ｎｄＩ［Ｉ−Ａｖａ　Ｉ　） ５’　−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡ
ＴＴＧＣ−３’３’　−ＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＴ−５’を用いてｐＡＬＦＡ３１
０Ｔの旧ｎｄＩ［−Ｘｈｏ　■部位に挿入してｐＴＢｌ
ｏｌｌを得た（第２図参照）。

この結果ｂＦＧＦのＧｌｙがＡｓｎとなり、糖鎖績た（
第３図参照）。該ムティンをｈｂＦＧＦムティンＮｇと
弥する。

（２）カルボキシル末端への導入 ファージＭ１３ＰＯの５ｓＤＮＡと合成プライマ５’−
ＡＴＣＡＡＣＴＣＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＴＴＧ−３’ を用いて前項と同様にして部位特異的突然変異反応を行
った。この結果得られたミュータントファージＭ１３Ｐ
１５よりＲＦＤＮＡを調製し、Ａｖａ■と５ａｌＩで切
断して、ｂＦ　Ｇ　ＦのｃＤＮＡ断片を調製し、前記の
Ｈｉｎｄｌｌｌ−＾ｖａｌアダプターを用いてｐＡＬ、
ＦＡ３１０Ｔの旧ｎｄｌＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ部位に挿入
してｐＴＢ１０１２を得た（第４図参照）。

４４ この結果ｂＦＧＦのＡｌａがＡｓｎとなり糖鎖績１４４
　　１４５　　１４６ 合部位Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　ｏｒが形成された
（第５図参照）。該ムティンをｈｂＦＧＦムティンＣｇ
と称する。

実施例３（糖鎖結合部位を持ったｂＦＧＦの酵母による
産生） プラスミドｐＴＢ１０１１およびｐＴＢ１０１２のＤＮ
Ａをそれぞれ用い、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９　／：ｌ−を　Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡヱ５，１９２９（１９７８）に記載の方
法で形質転換して、形質転換体ＳａｃｃｈａｒｏＩＩｌ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＢ３９ρ−／ｐＴＢ
　１０１　１（Ｉ　ＦＯ１０４６８，ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２４００）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｇ　ａｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９ρ−／ｐＴ　Ｂ１０１
２（ＩＦＯ１０４６９，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２４０１）
をそれぞれ得た。

このようにして得られた形質転換株をそれぞれシヨ糖８
，９％、グルコース１．１％を含む改変バルクホルダー
培地［Ｔｏｈ−ｅら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋
　ＩＬ主、　　７２７　（１９７；１）］で３日間培養
して、培養後に遠心（３３ＧＯｒｐｍ、　１５　ｗｉｎ
）により培地と細胞に分けた。

培養容積１ｄから得られた細胞をｌＯＯμｅのザイモリ
エース溶液［２００μｇ／ｄザイモリエース、１２Ｍソ
ルビトール＋　　５０＋＊Ｍ　Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
（ｐＨ７，４）、０．１％メルカプトエタノール］に懸
濁して、室温で２時間放置した後、４００ｔｔＱのＴｒ
ｉｔｏｎＸ−１００溶液［０，１％、　Ｔｒｉｔｏｎ　
Ｘ　−１００，５０ｍＭ　　Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（
ＰＨ７，４）、　　　１　ｇ＋Ｍ　　ＰＭＳ　　Ｆ　コ
を加えて、さらに室温で２時装置いた。この後、水冷し
ながら２０秒間の超音波処理を２回行い、遠心（１６，
ＯＯＯｒｐｍ、　３０分）して上清を採り、これを粗抽
出液とした。

得られた培地と粗抽出液のｂＦ　Ｇ　Ｆ活性をＢＡＬＢ
／ｃ３Ｔ３細胞の［３Ｈ〕チミジンの取り込みで調べた
ところ、表に示す量のｂＦ　Ｇ　Ｆ活性が認められた。

培地中の　　　粗抽出液中 Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＢ３９ρＶｐＴＢ１０１１　　６１６　　　　　６５
６Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 実施例４（ヒトｂＦＧＦおよびｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティン
Ｃ８２への糖鎖結合部位の導入） ヒ）ｂＦＧＦｃＤＮＡを組み込んだファージクロンＭ　
１３　ＰＯ（ヨーロッパ特許出願公開第２８１．８２２
号公報）の５ｓＤＮＡおよび、そのムティンＣ８２のｃ
ＤＮＡをもつファージクローンＭ１３Ｐ２（ｉ−ロッパ
特許出願公開第２８１．８２２号公報）の５ｓＤＮＡと
合成プライマー５’−ＧＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＧＡＡ
ＧＣＣＡＧＴ−３’ を用いて部位特異的突然変異を行った。

この反応には５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇ
ｅｎｅａｉｓ　ｋｉｔ［フマシャム社、ＵＫ］を用いた
。この結果得られたそれぞれのミュータント　ファージ
Ｍ１３ＣＮ３゜Ｍ１３ＣＳ２ＣＮ３よりＲＦＤＮＡを調
製し、＾ｖａｌと５ａｉｌで切断して、ｂＦ　Ｇ　Ｆの
Ｎ末端５残基に相当するｃＤＮＡ部分を欠いたｃＤＮＡ
断片を調製し、合成アダプター（■１ｎｄ１１Ｆ　−Ａ
ｖａ　Ｉ　）５’　−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡ
ＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣ−３’３’　−ＡＣＣＴＡＴＴＴ
ＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＴ−５’を用いてｐ
ＡＬＦＡ３１０Ｔの旧ｎｄｎｌ　−Ｘｈｏ　ｒ部位に挿
入して１）ＴＢ１１３０およびｐＴＢ１１３１を得た（
第６図および第７図参照）。

７ この結果ｂＦ　Ｇ　ＦおよびムティンＣ３２のＣｙｓ８
１　　　８８　　　８９ がＡｓｎとなり糖鎖結合部位Ａ　ｓｎ　−Ｖ　ａｔ　−
Ｔ　ｈｒがｈｂＦＧＦおよびｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ
８２内に形成された（第８図および９図参照）。これら
ムティンを、ｈｂＦＧＦムティンＣＮ３．ｈｂＦＧＦム
ティンＣ３２ＣＮ３とそれぞれ称する。

実施例５（糖鎖結合部位を持ったｂＦＧＦの酵母による
産生） プラスミドｐＴＢ１１３０およびｐＴＢ１１３１のＤＮ
Ａをそれぞれ用い、酵母５ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９　ｐ−を形質転換し
て、形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　”ｒ’　Ｂ　３９ρ−／ｐＴＢ１１３０
（ＩＦＯ１０５００，ＦＥＲＭＢＰ−２８５２）および
５ａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ＋　ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉａ
ｅＴＢ３９／）−／ＰＴＢ１１３１（ＩＦＯ１０５０１
、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８５３）をそれぞれ得た。

このようにして得られた形質転換株をそれぞれシ＝Ｉ糖
８．９％、グルコース１．１％を含む改変バルクホルダ
ー培地［Ｔｏｈ−ｅら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、　ＩＬ主、　　７２７　（１９７３）］で４８時間培
養して、培養後に遠心（３３００ｒｐｍ、　１５　ｍ１
ｎ）により培地と細胞に分けた。

得られた培地中のｂＦＧＦ活性をＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細
胞の［３Ｈ］チミジンの取り込みで調べたところ、表に
示す量のｂＦＧＦ活性が認められた。

Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＢ３９ρ″″／ＰＴＢ１１３０　　　　　　　７２５
Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 実施例６（ヒ）ｂＦＧＦへの糖鎖結合部位の導入）ヒト
ｂＦ　Ｇ　Ｆ　ｃＤ　Ｎ　Ａを組み込んだファージクロ
ーンＭ１３ＣＮ３の５ｓＤＮＡと合成ブライマー５’−
ＧＴＡＡＣＧＧＧＴＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴ−３
’ を用いて部位特異的突然変異を行った。

この反応には５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　＊ｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ［アマジャム社、ＵＫ］を用いた
。

この結果得られたミュータント　ファージＭ１３ＣＮ２
３よりＲＦＤＮＡを調製し、Ａｖａ　Ｉと５ａｌｔで切
断して、ｂＦ　Ｇ　ＦのＮ末端５残基に相当するｃＤＮ
Ａ部分を欠いたｃＤＮＡ断片を調製し、合成アダプター
（ＨｉｎｄｎＩ−Ａｖａ　Ｉ　）５’　−ＡＧＣＴＴＧ
ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣ−３’３′−
＾ＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＧＧＧＣＴ
−５’を用いてｐＡＬＦＡ３１０ＴのＨｉｎｄｎｌ　−
Ｘｈｏ　Ｅ部位に挿入して、発現プラスミドｐＴＢ１１
７２が構築された（第１０図参照）。

６９　７１　８７ この結果ｂＦＧＦのＣｙｓ、　Ａ　ｓｎ、　Ｃｙｓがそ
れぞれ６９　７１　８７　　　　　　　　　　６９　　
　ＴＯＡ　ｓｎ、　Ｔ　ｈｒ、　Ａ　ｓｎとなり、糖鎖
結合部位Ａｓｎ−Ａｌａた。このムティンｈｂＦＧＦム
ティンＣＮ２３と称する。

このようにして得られる発現プラスミドのＤＮＡをそれ
ぞれ用い、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉ−ｓｉａｅＴＢ３９ρ−を形質転換して、形質転換
体が得られる。

このようにして得られる形質転換株をそれぞれシヨ糖８
．９％、グルコース１．１％を含む改変バルクホルダー
培地［Ｔｏｈ−ｅら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

Ｌ主１．７２７（１９７３）コで培養して、培養後に遠
心（３３０，Ｏｒｐｍ、　１５　ｗｉｎ）により培地と
細胞に分けて、得られる培地中のｂＦＧＦをＢＡＬＢ／
ｃ３Ｔ３細胞の［３Ｈ］チミジンの取り込みで調べるこ
とができる。

実施例７（ｈｂＦＧＦムティンｃＮ３の精製）４８ＢＲ
Ｊｉ２８℃で培養した組換え体サツカロマイセス・セレ
ビシアエＴＢ３９ρ−／ｐＴＢ１１３０の培養上清５０
０ｄを牛レーティングセファロースカラム（径１．４Ｘ
１０ｃ＋ｅ）を通過させた後、ヘパリン−鋼パイアフィ
ニティーカラム（Ｓｈ　１　ｎＬ　Ｙ（１９８８）Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　　２６３　＋　９０５９
−９０６２　；径２．５Ｘ７ｃ＋＋）にアプライした。

カラムニ９０ｙｄ（Ｄ　ＩＭ　ＮａＣ（２−２０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣ＆（ｐＨ７，４）、４０ｄの０　、２　
Ｍ　ＮａＣＱ　−２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・１ｉｃＩ２（
ｐＨ７、４）、　１００　ｄの１０＋＊Ｍ　１ｍ１ｄａ
ｚｏｌｅ　−０，２Ｍ　ＮａＣＱ　　２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ（２（ｐＨ７，４）を順次流し、初めの３０Ｒ
１が流れた時点から、溶出液を５ｍ毎に分画した。次に
１０ｍＭ　ｉａ＋ｉｄａｚｏｌｅ２Ｍ　ＮａＣ（！−２
０＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ７，４）をカラ
ムに流し、溶出液を２．５１２毎に分画した。得られた
分画１０μｇを、ヘパリンを一次リガントに用いた２サ
イトＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ（Ｓａｔｏ、Ｙら（１９８９）
Ｍｏ１．　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　　３　：　７４
４　７４８　）により、二次リガンドに抗ｂＦ　Ｇ　Ｆ
抗体を用いて調べると、免疫反応性は溶出液量が２５０
ｄを超えた付近から主に２８０−までに認められた。溶
出液量２６０ｄから２７２．５ｄまで（分画番号６５か
ら６９）を集め、５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べると分子量２
１〜２２ｋＤａの間に３本の染色バンドが認められた。

（第１２図Ａ）。抗ＦＧＦ抗体を用いたウェスタンブロ
ッティングにおいても２１〜２３　ｋＤａの位置に３本
のバンドが認められ、またこれらのバンドはＥ　ｎｄｏ
Ｈ処理によりｂＦＧＦの泳動位置（１６，５ｋＤａ）及
び１７．４ｋＤａの位置にシフトした（第１２図Ｂ）。

これらの結果より２０〜２３　ｋＤａの分子量を持つ３
種の蛋白質は、ｂＦＧＦ、及びα−ファクターのシグナ
ルペプチド由来のアミノ酸配列の付加したｂＦ　Ｇ　Ｆ
に糖鎖の結合したものであると考えられた。精製標品（
分画番号６５−６９）の生物活性をＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３
細胞に対するＤＮＡ合成誘起で調べると７．８μｇＦＧ
Ｆ当量／ｄであり、蛋白濃度が１Ｏ０８μｇ／ｘｌであ
ったことからその比活性はｂＦ　Ｇ　Ｆの７２％である
ことがわかった（第２表）。精製標品の総活性は９７．
５μｇＦＣＦ当量であり、回収率は２９．８％であった
（第２表）。

実施例８　（ｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ３２／ＣＮ３の
精製） ４８時間２８℃で培養した組換え体サツカロミセス・セ
レビシアエＴＢ３９ρ″″／ｐＴＢｌ１３１の培養上清
４００ｍをキレ−ティングセファロースカラム（径１．
４Ｘ１０ｃｍ）を通過させた後、ヘパリン−銅パイアフ
ィニティーカラム（Ｓｈｔｎｇ、　Ｙ（１９８８）Ｊ、
　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　２６３　：　９０５
９−９０６２　；径２．５Ｘ８ｃａ＋）にアプライした
。カラムに１４０ｄのｌ　Ｍ　ＮａＣＱ　−２０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１（ｐＨ７，４）、１１０Ｊ！１２の
０．２Ｍ　ＮａＣ（１−２０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩＣ（Ｒ
ｐＨ７、４）、　２００　ｄの１０ｍＭイミダゾール−
０、２Ｍ　ＮａＣｌ２−２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ
（（ｐＨ７，４）を順次流し、溶出液を５ｄ毎に分画し
た。

次に１０ａＭイミダゾールー２　Ｍ　ＮａＣｌ２−２０
　ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃＱ（ＰＨ７、４）をカラムに流
し溶出液を２ｄ毎に分画した。得られた分画１０μＱを
、ヘパリンを一次リガントに用いた２サイトＥＬＩＳＡ
（Ｓａｔｏ、：　Ｙら（１９８９）Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌ’、　　３　ニア　４４−７４８）により
、二次リガンドに抗ｂＦ　Ｇ　Ｆ抗体を用いて調べると
、免疫反応性は溶出液量が５００ｄを超えた付近から強
く認められた。溶出液量５０４、ｄから５１８ｍまで（
分画番号１１８→１２４）を集めてピーク分画とした。

ピーク分画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥで調べると糖鎖付加型
ｂＦＧＦに特徴的な分子量２ｌ−２２ｋＤａの染色バン
ドが認められ、またウェスタンブロッティングにおいて
も同じ位置にバンドを生じた（第１３図）。

ピーク分画分の総ＦＧＦ活性は８４．８μｇＦＧＦ当量
であり、回収率は４９％であった（第３表）。

実施例９（ヒ）　ｂＦ　Ｇ　Ｆムティン（糖鎖付加型）
をコードする遺伝子の動物細胞における発 現） （１）ヒトｂＦＧＦムティン（糖鎖付加型）発現用プラ
スミドｐＴＢｌ１４１の構築： 前記実施例４で得られたファージＭ１３ＣＮ３のＲＦ型
ＤＮＡを、制限酔素ＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍ１ｌ　Ｉで切
断し、ヒトｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＮ３のコード領域を
含む０．３８ｋｂＤＮＡ断片を得た。また、ヨーロッパ
特許出願公開第２２５，７０１号公報記載のプラスミド
ｐＴ　Ｂ　５０３をＣ１ａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩで切断し
、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）ＬＴＲ領域、ＳＶ
４０由来プロモーターおよびスプライス領域、およびヒ
トインターロイキン２（Ｉ　Ｌ−２）リーダー配列を含
む１　、７　ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片を得た。

また、ヨーロッパ特許出願公開第２８１．８２２号公報
記載のプラスミドｐ’ｒ　Ｂ　６７５をＣ１ａＩ−Ｂａ
ｍＨＩで切断し、ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆの末端のコード領域
と３′非翻訳領域およびプラスミドｐＢ　Ｒ３２２由来
アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌における複製開始
点を含む３．４ｋｂＤＮＡ断片を得た。

これら３種のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、プラスミドｐＴＢ１１４１を得た（第１４図）
。

（２）動物細胞における発現 サルＣＯ３７細胞を１０％牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培
地で直径６ｃ１１の組織培養用デイツシュに播種し、翌
日、同培地で培地交換した。４時間後にリン酸カルシウ
ム法（Ｇｒａｈａｍ　ら４ｉｒｏｌｏｚｙ　５２ｒ４５
６（１９７３））によりプラスミドｐＴＢ１１４ｌ　　
ＤＮＡＩＱμｇをトランスフェクトした。翌日０．５％
牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培地に加えて培養を続け、４
８時間後に培養液および細胞を集めた。細胞はＰＢＳで
２回洗ったのち、１ＭＮａＣ９２０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＮ（ＰＨ７，６）にけんだくし、短時間の超音波処
理ののち、１５０ＧＯｒｐｍで１５分遠心し上清液を得
た。これらプラスミド感染Ｃ０８７細胞の培養液と細胞
抽出液について、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　　８，５８８（１９８８）に
記載の方法によりＦＧＦ活性を測定した。結果を第４表
に示した。

ＦＧＦ活性（ｎｇ／ディソシ；Ｌ） ｐＴＢ１１４１　　　　　　５３０　　　　　　　　　
４９１＜　　　　０．０２　　　　　　　　１さらに培
養液０．５ｄについてウェスタンブロッティング法によ
り産物の解析をおこなった。その結果ｐＴＢ１１４１を
トランスフェクトしたＣＯ３７細胞の培養上清からｒｈ
ｂＦＧＦと同し１６ｋＤａのバンドと、約２０　ｋＤａ
のバンドが検出された。

２０　ｋＤａのバンドは、ツニカマイシン存在下でのｐ
ＴＢ１１４１感染ＣＯ５７細胞の培養上清では検出され
なくなったことから、糖鎖付加型ｂＦＧＦの産生が確認
された。

マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　　Ａ３１細胞にｐＴＢ１１
４１をトランスフェクトすると、ｆｏｃｕｓ形成が認め
られ、得られたトランスフオーム細胞は、軟寒天培地中
でのコロニー形成能およびヌードマウスに対する造腫瘍
性を示した。

（３）ヒ）ｂＦＧＦムティン（糖鎖付加型）発現用ブラ
スミ　ドｐＴＢ１　１６３．１１６４．１１６５．ｌ　
　１６６の構築（第１５図） ヨーロッパ特許出願公開第２８１．８２２号公報に記載
のプラスミドｐ’ｒ　Ｂ　６７５を制限酵素Ｎｅ。

ｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ）［ｌｅｎｏｗ断片反
応により付着末端を平滑化したのち、Ｃ１ａ　Ｉで切断
してヒ）ｂＦＧＦ構造遺伝子、３′側非翻訳領域、ＳＶ
４０由来ポリ（Ａ）付加領域およびｐＢ　Ｒ３２２由来
アンピシリン耐性遺伝子、複製開始点を含む３．８ｋｂ
ＤＮＡ断片を得た。また、前項（１）記載のプラスミド
ｐ’ｒ　Ｂ　５０３をＣ１ａｌ　−ＨｌｎｄＩ［Ｉで切
断し、ＭｕＬＶＬＴＲ領域を含む１．１ｋｂＤＮＡ断片
を得た。さらにプラスミドｐＴ　Ｂ　１０６　（Ｃｅｌ
ｌＳｔｒｕｃｔ、　Ｐｕｎｃｔ、　　１２．２０５　（
１９８７））をＨｇｉ＾Ｉで切断して１．ｏｋｂＤＮＡ
断片（ＳＶ４０プｏモーター領域およびヒトＩＬ−２Ｃ
ＤＮＡリーダー配列を含む）を分離精製した。Ｔ４ポリ
メラーゼ反応により末端を平滑化したのち旧ｎｄＩ［で
切断して、０．６４ｋｂＤＮＡ断片を得た。これら３種
のＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラ
スミドｐＴＢ１００１を得た。ｐＴＢｌｏｏｌは、Ｍｕ
ＬＶＬＴＲとＳＶ４０初期プロモーターの支配下にｒ　
ｔ、−２リ一ダー配列と読取枠を合わせて連結されたヒ
トｂＦＧＦの構造遺伝子（−９〜１４６アミノ酸）が発
現する構築を有する。

次に、ｐＴＢｌｏｏｌを旧ｎｄＩ［Ｉで切断して得られ
た、ヒトＩ　Ｌ−２リ一ダー配列に連結したヒトｂＦＧ
Ｆ遺伝子を含む１　、３　ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片をプラス
ミドｐＵｃ１１９（宝酒造株式会社）の旧ｎｄＩ［１部
位にクローニングした。

合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＡＡＣＡＴＴＣＴＴ
ＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴをブライマーとして、ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ、ミュータゲネシスシステムバージョン２　（Ａ
＋５ｅｒｓｈａ−社）キットを用い所定の方法に従って
５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
を行ないＣＮ３変換体（Ｉ　Ｌ−ＣＮ３−１５５　：　
Ｉ　Ｌ−２リ一ダー配列とｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＮ
３−９〜１４６の構造遺伝子を有する。）（プラスミド
ｐＴ８１１５８）を得た。

さらに、合成オリゴヌクレオチドをブライマーとして、
同様の方法にて、Ｃ３２／ＣＮ３変換体（ＩＬ−ＣＮ２
／ＣＮ３−１５５：　ＩＬ−２リ一ダー配列とｈｂＦＧ
ＦムティンＣＳ２ＣＮ３の−９〜１４６の構造遺伝子を
有する。）（プラスミドｐＴＢｌ１６０）を得た。

また、合成オリゴヌクレオチド３１＋＋＋ｅｒ５’−Ｃ
ＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡ
ＣＡＡＧＴ−３’ 除去しＩ　Ｌ−２リーダー配列と成熟型ヒトｂＦＧＦ（
アミノ酸Ｎｏ、　１　（Ｐｒｏ）〜ｌ　４６　）遺伝子
を連結したものを、上記ｋｉｔを使用して作製した（Ｉ
Ｌ−Ｆ１４６）（プラスミドｐＴＢ１１５５）。

これに、上記のＣＮ３変換用およびＣ８２変換用合戊オ
リゴヌクレオチドを使用して、変換体■Ｌ−ＣＮ３−１
４６（Ｉ　Ｌ−２リ一ダー配列とｈｂＦＧＦムティンＣ
Ｎ３の１〜１４６の構造遺伝子を有する。）（プラスミ
ドｐＴＢ１１５９）およびｌＩ、−Ｃ８２／ＣＮ３−１
４６（Ｉ　Ｌ−２リ一ダー配列とｈｂＦＧＦＣ３２／Ｃ
Ｎ３の１〜１４６の構造遺伝子を有する。）（プラスミ
ドｐＴＢ１１６１）を得た。

このようにして得られた変換遺伝子を含むｐＵＣ１１９
を各々Ｎｃｏ　Ｉ　−ＨｉｎｄＩ［Ｉで切断して、変換
遺伝子を含む１．１ｋｂＤＮＡ断片を分離し、それぞれ
のＤＮＡ断片と、前記の動物細胞用発現型プラスミドｐ
ＴＢ１００１から得た３、１ｋｂＣ１ａＩ　−Ｈｌｎｄ
ｌＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片および１．４ｋｂ　Ｃ１ａｌ　
−ＮｃｏＩＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により
連結して、以下の発現型プラスミドを構築した。

ｐＴＢ１１６２：　ｒＬ−Ｆ１４６ ｐＴＢ１１６３：　ＩＬ−ＣＮ３−１４６ｐＴＢ１１６
４：　ＴＬ−Ｃ８２／ＣＮ３−１４６ｐＴＢ　１１６５
　：　ＩＬ−ＣＮ３−１５５ｐＴＢ１１６６：　ＩＬ−
Ｃ３２／ＣＮ３−１５５プラスミドｐＴＢ　１１６３．
ｐＴＢ　１１６４．ｐＴＢ１１６５またはｐＴＢ１１６
６を用いてＥ、　ｃｏｌｉＤＨＩを、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｒｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　１ｌａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、第２４９頁、１９８２年に記載
の方法に従って、形質転換し、形質転換体Ｅ、　ｃｏｌ
ｉＤＨＩ／ｐＴＢ１１６３（ＩＦＯ１５０２０，ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ　　’２８５４）、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／
ｐＴＢ１１６４（ＩＦＯ１５０２１，ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−２８５５）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨｌ／ｐＴＢ　１１
６５（Ｉ　ＦＯ１５０２２、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８５
６）、Ｅ、ｃｏｌｉＤＨＩ／ｐＴＢ１１６６（ＩＦＯ１
５０２３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８５７）をそれぞれ得
た。

（４）動物細胞での発現 本実施例（２）に記載した方法によりｐＴＢ１１６３、
ｐＴＢ　ｌ　１６４．ｐＴＢ　１１６５およびｐＴＢ１
１６６ＤＮＡをサルＣＯ５７細胞にトランスフェクトす
ることによりその細胞培養液から糖鎖付加型ヒトｂＦＧ
Ｆを得ることが出来る。また、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ
３Ａ３１細胞にトランスフェクトすることによって、ト
ランスフオーム細胞を得ることが出来る。

（５）ヒ）ｂＦＧＦムティン（糖鎖付加型）を発現する
プラスミドｐＴＢ１１７８およびｐＴＢ１１７９の構築
ニ プラスミドｐＴＢ１１５９およびｐＴＢ１１５８を有す
るＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４からそれぞれ調整さ
れたＭ１３ファージ５ｓＤＮＡと、合成ブライマー５’
−ＧＴＡＡＣＧＧＧＴＡＧＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴ−
３’とから５ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（アマジャム社、英国）を用いて部
位特異的突然変異を行なう。得られたミュータントファ
ージからＲＦＤＮＡを調整し、Ｎｅｏ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ
■で切断して、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得る。この二
つの断片を用いて、上記（１）、　（３）項と同様の方
法でヒトｂＦＧＦムティンを発現する二つのプラスミ　
ドｐＴ８１１７８（ＩＬ−ＣＮ２３−１４６）およびｐ
ＴＢｌ　１７９（ＩＬ−ＣＮ２３−１５５）を構築する
。

（６）動物細胞における発現 サルｃｏｓ７細胞を１０％牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培
地で直径６ｃｍの組織培養用デイツシュに播種し、翌日
、同培地で培地交換する。４時間後にリン酸カルシウム
法（Ｇｒａｈａ−ら、Ｖｉｒｏｌｏｚｙ　５２ｒ４５６
（１９７３））によりプラスミドｐＴＢ１１７８ＤＮＡ
またはｐＴＢ１１７９ＤＮＡ１０μｇをトランスフェク
トする。翌日０．５％牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培地に
加えて培養を続け、４８時間後に培養液および細胞を集
める。細胞はＰＢＳで２回洗ったのち、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ
Ｑ　−２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ（２（ｐＨ７，６）
にけんだくし、短時間の超音波処理ののち、１５０００
ｒｐｍで１５分遠心し上清液を得る。これらプラスミド
感染ＣＯ３７細胞の培養液と細胞抽出液について、Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｂｆｏｌ、　　８　、５８８（１９
８８）に記載の方法によりＦＧＦ活性を測定する。

実施例１０（糖鎖付加型ｂＦＧＦムティンの安定性） （１）酵母で産生されたｈｂＦＧＦムティンＣＮ３の安
定性 培地８Ｓ５Ｎ中でのムティンの安定性について、３７°
Ｃで０〜２０時間の時間経過により調べた。

ｈｂＦＧＦムティンＣＮ３またはｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティ
ンｃｓ２３をそれぞれいづれも５００ｍｇ／ｄの比活性
に調整し、８３５Ｎ培地（ｐＨ５，６）中３７℃にイン
キュベーションした。

時間０におけるそれぞれの比活性を１００％とし、サン
プリングを行った時の活性を％で表示した（第１６図）
。

この結果ｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＮ３はｈｂＦＧＦム
ティンＣＳ２３よりも安定な傾向が示され、糖付加によ
る安定化が示唆された。

（２）動物細胞で産生されたｈｂＦＧＦムティンＣＮ３
の安定性 培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）中でのムティンの安定性につい
て３７℃で０〜２０時間の時間経過により調べた。

ｂｂＦＧＦ（ｐＴＢ　１０８５）、ｈｂＦＧＦムティン
Ｃ３２３（ｐＴＢ８３１０ＥＰ−２８１，８２２）、ｈ
ｂＦＧＦムティンＣＮ５（ｐＴＢ　ｌ　１４１）、いず
れもＩ　Ｌ−２のシグナルペプチドをＮ末端に連結させ
た発現系を用いてｃｏｓ７で産生させ、それぞれの培養
上清をＤＭＥＭ培地中（ｐＨ７，４）３７℃でインキュ
ベートした。それぞれ時間０の活性を１００％とし、各
時間における残存活性を％で表示した（第１７図）。

この結果、ｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＮ３は安定性に優
れていることが示唆された。

上記プラスミドｐＴＢ１０８５は、ｐＴ　Ｂ　６７５（
ＥＰ−２８１，８２２）を用い、これをＣ１ａ　ＩとＨ
ｉｎｄＩ［［のサイトにｐ’ｒ　Ｂ　５０４のＭｕＬＶ
ＬＴＲの塩基配列を挿入し、さらにｐＴＢ６７５をＰｓ
ｔ　１とＮｅｏ　Ｉを用いてｈｂＦ　Ｇ　ＦのｃＤＮＡ
の５′側の非翻訳領域を除去し、次いで該サイトを結合
することにより得られた。

窺匪（２）激（ 本発明の少なくとも１個の糖鎖結合部位を有する、ＦＧ
Ｆムティンは、安定性が向上し、血中消失時間が延長さ
れ、活性が向上され、しかも、ムティン産生時の産生能
が向上され、形質転換体の外に分泌される。そのため、
本発明のムティンは医薬などとして有利に用いることが
できる。また、本発明のムティンを大量に有利に製造す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた、プラスミドｐＡＬＦＡ
３１０Ｔの構築図を示す。 第２図は、実施例２（１）で得られた、プラスミドｐＴ
Ｂ１０１１の構築図を示す。 第３図は、実施例２（１）で得られた、プラスミドｐＴ
Ｂｌｏ１１が保持するｂＦＧＦムティンをコードするＤ
ＮＡ配列とそれがコードするムティンのアミノ酸配列を
示す。 箪４回は　蛍扁儲１’）（’））でｆＢ＾れた−　プラ
スミドｐＴ　Ｂ　１０１２の構築図を示す。 第５図は、実施例２（２）で得られた、プラスミドＩ）
ＴＢＩＯ１２が保持するｂＦ　Ｇ　Ｆムティンをコード
するＤＮＡ配列とそれがコードするムティンのアミノ酸
配列を示す。 第６図は、実施例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１１
３０の構築図を示す。 第７図は、実施例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１１
３１の構築図を示す。 第８図は、実施例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１１
３０が保持するｂＦＧＦムティンをコードするＤＮＡ配
列とそれがコードするｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＮ３の
アミノ酸配列を示す。 第９図は、実施例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１１
３１が保持するｂＦ　Ｇ　ＦムティンをコードするＤＮ
Ａ配列とそれがコードするｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ３
２／ＣＮ３のアミノ酸配列を示す。 第１０図は、実施例６で得られた、発現プラスミドｐＴ
Ｂ１１７２の構築図を示す。 ４写　１１１ｉ’刀ＩＪ　　　　ｄット社Ｉ々ｌ　ρ　
−引ヨ　鴇　ム　Ｊ−−／　　−−＋　　　＊りｐＴＢ
１１７２が保持するｈｂＦＧＦムティンＣＮ２３をコー
ドするＤＮＡ配列とそれがコードするｈｂＦ　Ｇ　Ｆム
ティンＣＮ２３のアミノ酸配列を示す。 第１２図は、実施例７で得られた、形質転換体Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＴＢ３９ρ−／ｐＴＢ　１１３０
の生産物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる解析パターンおよびウェスタンブロッティングの結
果を示す。 第１３図は、実施例８で得られた、形質転換体Ｓ、　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｔ　Ｂ　３９　ρ−／ｐＴＢ　１
１３１の生産物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動およびウェスタンブロッティングによる解析結果を
示す。 第１４図は、実施例９で得られた、プラスミドｐＴＢ１
１４１の構築図を示す。 第１５図は、実施例９で用いられた、プラスミドｐＴＢ
１００１の構造を示す。 第１６図は、実施例１０で得られた、ｈｂＦＧＦムティ
ンＣＮ３の安定性に関する結果を示す。 第１７図は、実施例ＩＯで得られた、ｈｂＦＧＦムティ
ンＣＮ３の安定性に関する結果を示す。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）、少なくとも１個の糖鎖結合部位を導入した、線
   維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ムテイン。
2. （２）、糖鎖の結合した請求項１記載のムテイン。
3. （３）、糖鎖がＮ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチ
   ルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、フコー
   スまたはシアル酸である請求項２記載のムテイン。
4. （４）、糖鎖結合部位を構成するアミノ酸配列が、式Ａ
   ｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘはアミノ酸残基を、ＹはＴｈｒ
   、ＳｅｒまたはＣｙｓをそれぞれ示す。）で表わされる
   配列である請求項１記載のムテイン。
5. （５）、ＸがＴｈｒ、ＳｅｒまたはＣｙｓである請求項
   ４記載のムテイン。
6. （６）、ＹがＴｈｒまたはＳｅｒである請求項４記載の
   ムテイン。
7. （７）、ＦＧＦがヒト塩基性ＦＧＦである請求項１記載
   のムテイン。
8. （８）、請求項１記載のムテインをコードするＤＮＡ。
9. （９）、請求項８記載のＤＮＡを含有するベクター。
10. （１０）、請求項９記載のベクターで形質転換された形
    質転換体。
11. （１１）、宿主が酵母または動物細胞である請求項１０
    記載の形質転換体。
12. （１２）、請求項１１記載の形質転換体を培地に培養し
    、培養物中に請求項１記載のムテインを生成蓄積せしめ
    ることを特徴とする当該ムテインの製造法。