DE69008535T2

DE69008535T2 - Humane antigammainterferonantikörper, welche detektiert und geklärt sind mit verwendung von synthetischen peptiden.

Info

Publication number: DE69008535T2
Application number: DE69008535T
Authority: DE
Inventors: Adolfo Turano
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: WO1991002005A1; JPH05500360A; AU6176690A; DE69008535D1; IT8921517A0; IT1231727B; EP0485471A1; EP0485471B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von menschlichen Anti-Gamma-Interferonantikörpern für eine Humantherapie sowie auf den Nachweis und Reinigung der Antikörper durch synthetische Peptide, die Regionen von menschlichem Gamma-Interferon entsprechen.
Interferone (IFNs) bilden eine heterogene Proteinfamilie, die gemäß ihrer Fähigkeit zur Verhinderung von viralen Replikationen definiert ist. Zur Zeit sind drei Hauptklassen von menschlichem IFN bestimmt: Menschliches IFN-α und IFN-β - die bezüglich der primären Aminosäuresequenz zu 30 % ähnlich sind - und IFN-τ, welches keine Ähnlichkeit zu den anderen aufweist. IFN-τ hat verschiedene Eigenschaften und Aktivitäten mit IFN-α und IFN-β gemeinsam, aber es vermittelt verschiedene Immunfunktionen. Für IFN-τ ist kürzlich festgestellt worden, daß es als ein potenter Immunmodulator (Tabelle 1) wirkt. Auf eine antigene Stimulation setzen T-Zellen und NK-Zellen IFN-τ frei, das die Reaktion der T-Zellen, der B-Zellen und der Makrophagen beeinflußt, das die Proliferation der T-Zellen und die funktionelle Reifung der cytotoxischen T-Zellen fördert, das die Bildung der Suppressor T-Zellen hemmt, das die Immunglobulin-Sekretion der B-Zellen fördert, wenn es spät während einer in vitro Immunreaktion hinzugefügt wird, und das auf eine IgG2-Produkion umschaltet. Zusätzlich zu diesen regulatorischen Effekten auf die adaptative Immunreaktion wirkt IFN-τ auf die Effektorzellen der nicht-adaptiven Abwehr und übt eine Proentzündungsaktivität aus. Makrophagen, die mit IFN-τ sensibilisiert worden sind, werden zur Abtötung von Bakterien, Protozoen und Tumorzellen durch Sauerstoffabhängige und -unabhängige Mechanismen fähig. Zusätzlich induziert IFN-τ Endothelzellen und Monozyten bezüglich der Freisetzung von chemotaktischen Faktoren, wie IL-1 und TNF, und führt zur Verstärkung der Synthese und der Oberflächenexpression der Klasse I und Klasse II Antigene des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes (MHC), des Fc-Rezeptors und der Leukozyten-Adhäsionsproteine (z.B. Integrine und Integrinrezeptoren). Die Induktion von MHC-Antigenen durch IFN-τ kann in verschiedenen Zelltypen auftreten, die andererseits nur geringe oder nichtnachweisbare Mengen dieser Moleküle exprimieren. Die Förderung der MHC-Klasse II-Expression befähigt Makrophagen, Endothelzellen, Epithelzellen und Langerhans-Zellen, die Antigene zu zeigen, während diese Zellen aber andererseits empfindlich gegenüber möglichen zytotoxischen Effekten der auf Klasse II beschränkten T-Lymphozyten werden. Die Induktion der Fc- Rezeptoren fördert das Vermögen der Makrophagen, opsonisierte Antigene zu fressen. Die Zunahme der Oberflächendichte der Integrin-Rezeptoren fördert die Adhäsion der Monozyten an Endothelzellen und an Lymphozyten, wodurch lokale Entzündungs- und Immunreaktionen erleichtert werden.
Während die allgemeine stimulierende Aktivität von IFN-τ bei fortschreitenden, immunologischen und entzündlichen Reaktionen die potentielle therapeutische Anwendbarkeit anzeigt, z.B. als Immunmodulator, können Wirkstoffe, die diese Aktivität neutralisieren können, günstig sein, wenn sie allotransplantierten Patienten sowie Patienten, die an Autoimmunkrankheiten, chronischer Entzündung, septischen Schocks oder Diabetes (Tabelle 2) und an einem anderen klinischen Zustand leiden, gegeben werden, da in solchen Fällen eine Förderung der IFN-τ Produktion als nachteilig angesehen wird.
Antikörper sind die von Natur aus am meisten spezifischen, natürlichen, immunsuppressiven Wirkstoffe. Billiau (1988), Immunol. Today 9, 37, berichtete, daß Murin-Anti-IFN-τ Antikörper experimentell die Shwatzman-Reaktion hemmen. Diese Experimente eröffnen interessante, klinische Anwendungen für die Behandlung von Shwatzman-verwandten oder ähnlichen entzündlichen Reaktionen. Andere Daten, die von Jacob et al. (1987), J. Exp. Med. 166, 798, berichtet wurden, zeigten, daß Anti-IFN-τ Antikörper NZB-Mäuse gegen die spontane Entwicklung von Autoimmunkrankheiten schützen. Diese Experimente zeigen ferner an, daß polyklonale oder vorzugsweise monoklonale Anti-IFN-τ Antikörper Kandidaten für Versuche bei Bindegewebs-Krankheiten sein können, wie systemische Lupus erythematosus (SLE), rheumatische Arthritis und Multiple Sklerose. Möglicherweise müssen alle diese Krankheiten, wenn sie durch Zell-vermittelte Immunität aktiviert werden, unterdrückt werden. Eine immunsuppressive Antikörpertherapie wird in bestimmten Fällen bei Menschen verwendet, um Rh-verwandte Erythoblastosis fetalis zu verhindern. Diese Behandlung ist jedoch auf Krankheiten beschränkt, wo das zugrundeliegende Antigen bekannt und ein spezifisches, menschliches Antiserum verfügbar ist.
Als Substanzen, die von dem menschlichen Immunsystem selbst erkannt werden, sollten IFNs keine Antikörperbildung in dem Menschen fördern mit Ausnahme in Verbindung mit Autoimmun-Funktionsstörungen, oder wenn ihre Struktur und Antigenität modifiziert wurde. Antikörper gegen IFN-τ in Patienten, die mit HIV- Virus infiziert waren, wurde von Caruso et al. (1989), J. Biol. Reg. Homeost Agents 3, 8, berichtet. Kürzlich berichteten Caruso et al. (1990), J. Immunol. 144, 685, über die Gegenwart von natürlichen Antikörpern gegen IFN-τ in gesunden Individuen, die von neugeborenen Babys bis Erwachsenen reichen, wobei höhere Niveaus in Patienten auftreten, die an verschiedenen viralen Infektionen leiden. Die gegen IFN-τ spezifischen Antikörper wurden aus Seren von gesunden Individuen und mit Viren infizierten Patienten oder aus verschiedenen biologischen Quellen (siehe "Verfahrensweisen zur Durchführung der Erfindung") afffinitätsgereinigt, wobei eine rekombinante IFN-τ-gekoppelte, CNBr-aktivierte Sepharose 4B Säule verwendet wurde. Die gefundenen Antikörper gehörten hauptsächlich der IgG-Klasse an und behielten ihre Fähigkeit für die Bindung von rekombinantem IFN-τ. Sie neutralisierten die antivirale Aktivität von IFN-τ nicht, wobei sie in der Lage waren, die IFN-τ Induktion der Klasse II MHC Antigene und der Fc-Rezeptorstellen für Immunglobuline zu unterdrücken. Zusätzlich wurde herausgefunden, daß natürliche, menschliche Anti-IFN-τ Antikörper in einer gemischten Lymphozytenkultur (MLC) durch Hemmung von endogen produziertem IFN-τ mit der Proliferation und der cytotoxischen Erzeugung von Lymphozyten interferieren. Die Verfügbarkeit von affinitätsgereinigten, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern, die zur Neutralisierung der immunmodulierenden Aktivität von IFN-τ fähig sind, eröffnet interessante klinische Anwendungen und zwar möglicherweise für all solche Krankheiten, wo die aktivierte, Zell-vermittelte Immunität reguliert werden muß.
Die fertige Verfügbarkeit von neutralisierenden, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern kann viele der Probleme lösen, die mit der Verabreichung von heterologen Immunglobulinen, polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern, welche Anti-Ig Antikörper induzieren können, zusammenhängen.
Die Hauptaufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Techniken, welche unter Verwendung von synthetischen Peptiden, die Regionen von menschlichem IFN-τ entsprechen, Anti-IFN-τ Antikörper nachweisen und diese einer Affinitätsreinigung unterwerfen.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß synthetische Peptide, die Regionen von menschlichem IFN-τ entsprechen, die natürlichen oder rekombinanten IFN-τ Proteine für den Nachweis und die Reinigung von natürlichen, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern ersetzen können. Demgemäß besteht der erste Aspekt der Erfindung darin, synthetische Peptide in verschiedenen immunologischen Verfahren für den Nachweis von menschlichen Antikörpern gegen IFN-τ zu verwenden. Die oben erwähnten Verfahren basieren auf der Verwendung von synthetischen Peptiden, die spezifisch Anti-IFN-τ Antikörper binden können, was deren direkter oder indirekter Nachweis erlaubt. Der zweite Aspekt ist ein Verfahren für die Affinitätsreinigung von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern unter Verwendung von synthetischen Peptiden. Dieses Verfahren basiert auf der Bindung von synthetischen Peptiden auf einem Träger oder auf anderen molekularen Trägern oder auf dem Einschließen der Peptide in Nitrozellulose-Blätter.
Der dritte Aspekt der Erfindung ist eine immuntherapeutische Behandlung, um eine Krankheit zu steuern, die mit einer aktivierten, Zell-vermittelten Immunität zusammenhängt. Die Behandlung besteht in der Verabreichung von menschlichen Antikörpern, die gegen IFN-τ des Individuums gerichtet sind, um eine ausreichende Kontrolle der klinischen Aspekte der Krankheit zu erzielen. Der vierte Aspekt der Erfindung ist eine "Einheitsdosis" für die Behandlung der oben beschriebenen Patienten. Die Einheitsdosisform besteht aus menschlichen Antikörpern gegen IFN-τ in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Vehiculum. Die Menge der menschlichen Antikörper in der Dosisform muß ausreichend sein, um die Manifestation der Krankheit wesentlich herabzusetzen. Die Manifestation der Krankheit kann durch klinische Symptome, die mit der Krankheit assoziiert sind, und durch die Gegenwart von Auto-Antikörpern, die mit der Kranheit assoziiert sind, bestimmt werden, da diese in gesunden Individuen abwesend oder nur mit einem geringen Titer vorhanden sind.
Der fünfte Aspekt der Erfindung sind immunologische Verfahren, um IFN-τ durch die Verwendung von gereinigten, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern nachzuweisen. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern für die spezifische Bindung und den Nachweis (in einer direkten oder indirekten Weise) des (der) IFN-τ Moleküls(e).
Der letzte Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für die Affinitätsreinigung des (der) IFN-τ Moleküls(e), die von den menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern erkannt werden. Das Verfahren beinhaltet die Bindung von menschlichem Anti-IFN-τ an einen Träger oder an andere molekulare Träger oder das Einschließen in Nitrozellulose-Blätter.
Figur 1 stellt eine grafische Darstellung dar und zeigt die Expressionshemmung der Fc-Rezeptorstellen und der HLA-DR-Antigene auf U937-Zellen, die mit rekombinantem IFN-τ durch menschliche Anti-IFN-τ Antikörper stimuliert wurden.
Figur 2 ist ein Diagramm, welches den Effekt von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern, die zu verschiedenen Zeiten hinzugefügt wurden, auf die MLC- Proliferation zeigt.
Figur 3 zeigt in einem Diagramm den Effekt von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern auf die Entwicklung der Cytotoxizität in der MLC.
Figur 4 zeigt das Chromatographie-Profil von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern auf einer IFN-τ-verwandten, Peptid-Sulpho verbundenen Agarosesäule.
Figur 5 zeigt eine Western Blot-Analyse von Anti-IFN-τ Antikörpern, welche durch eine Säule auf Basis eines IFN-τ-verwandten Peptides affinitätsgereinigt wurden, wobei ihre spezifische Reaktivität mit IFN-τ illustriert ist.
Figur 6 ist ein Diagramm, welches den Effekt von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern, die durch eine Affinitätssäule auf Peptidbasis gereinigt wurden, auf die MLC-Proliferation zeigt.
Figur 7 zeigt im Diagramm die Beziehung, die durch ELISA auf Basis eines IFN-τ-verwandten Peptides und durch RIA auf Basis eines rekombinanten IFN-τ erzielt wurde, bei dem Nachweis und der Quantifizierung von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern im Humanserum.

Verfahrensweisen zur Durchführung der Erfindung

Soweit nichts anderes angezeigt ist, werden bei der Durchführung der Erfindung konventionelle Techniken der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der rekombinanten DNA, der Chemie, der Biochemie, der Biotechnologie und der Immunologie verwendet, die innerhalb des Standes der Technik liegen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erläutert (siehe Literatur, Anlage 1).
Gemäß der Erfindung ist es sehr nützlich und von Relevanz für Wissenschaftler und Mediziner, natürliche Antikörper gegen IFN-τ in Proben durch eine der bekannten Analysen nachzuweisen und zu quantifizieren.
Analysen zum Nachweis von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern können beispielsweise nützlich sein:
a) in der Klinik für eine schnelle Diagnose von Viruskrankheiten und für eine schnelle Unterscheidung zwischen einer viralen und einer bakteriellen Infektion; um eine virale Infektion und ggf. eine spezifische Antivirustherapie zu bestimmen; um Anti-IFN-τ Antikörper in Patienten mit Krebs, viralen Infektionen und/oder immunologischen Funktionsstörungen zu studieren; um Organtransplantationen für eine schnelle Diagnose auf virale Infektionen in den transplantierten Patienten zu überwachen, um ggf. eine Allotransplantatabstoßung zu verhindern; um antivirale sowie immunmodulierende Therapien zu überwachen;
b) in der Industrie für die Qualitätskontrolle von Immunglobulin-Präparaten, die durch Chromatographie oder andere präparative Verfahren erzielt werden;
c) in Blutbanken, um virale Infektionen in anscheinend gesunden Blutspendern zu entdecken.

Immunologische Analysen

Analysen für den Nachweis von Antikörpern gegen IFN-τ können unter Verwendung von natürlichen und rekombinanten IFN-τ oder IFN-τ-verwandten Peptiden von verschiedener Länge entwickelt werden, wobei die Peptide repräsentativ für verschiedene Epitope des Ursprungsmoleküls sind. Diese Analysen können auf einer der klassischen RIA und ELISA-Techniken basieren.
Mikrotiterplatten, Streifen, Vertiefungen oder andere Festphasenträger können mit dem Antigen mit einer geeigneten, in dem Stand der Technik bekannten Technik beschichtet werden, z.B. mit einer Übernacht-Inkubation in geeigneten Puffern bei verschiedenen Temperaturen. Das für die Beschichtung benutzte Antigen kann ein einzelnes Protein/Peptid oder eine Mischung von verschiedenen Antigenen sein, was von den Antikörpern abhängt, die nachzuweisen sind. Antikörper können in verschiedenen Proben, wie Plasma, Serum, cerebraler Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebekultur-Flüssigkeiten etc., nachgewiesen werden.
Nach Inkubation der Proben mit dem Antigen kann der gebundene Antikörper durch Zugabe eines Enzym-konjugierten Antiserums oder eines monoklonalen Antikörpers nachgewiesen werden. Alle bekannten Enzymindikatoren können bei dieser Analyse verwendet werden (Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, etc.) Die Sensibilität der Analyse kann durch Verwendung eines bekannten Biotin-Avidin oder Streptavidin-Systems zum Nachweis des Analyten verbessert werden. Der endgültige Nachweis kann durch Zusatz einer Substratlösung, die in Abhängigkeit von dem verwendeten Enzym variabel ist, erzielt werden.
Beispiele des Idonsubstrates sind o-Phenylendiamin, Tetramethylbenzidin, Paranitrophenylphosphat und andere. Die Ergebnisse können mit dem Auge oder durch ein Spectrophotometer abgelesen werden, und die Analyse kann sowohl qualitativ als auch quantitativ sein. Die Quantifizierung kann durch eine Endpunktverdünnung, ein Standardkurvensystem oder durch eine andere geeignete Quantifizierungstechnik erzielt werden.
Jedes Prinzip der Analyse kann für die Entwicklung einer ELISA-Prüfung zum Nachweis der Antikörper verwendet werden, wobei dies insbesondere homogene Prüfungen oder heterogene Prüfungen sein können, wie klassische oder modifizierte kompetitive Prüfungen, Titrationsprüfungen, direkte und indirekte Sandwich- Prüfungen, Ig-Einfangprüfungen und ähnliches.
Die gleichen Prinzipien, die für den Nachweis der Antikörper durch ELISA verwendet werden, können auch bei RIA oder einer zeitlich aufgelösten Fluorimmunanalyse oder bei anderen Analysen, die auf der Verwendung von verschiedenen Indikatoren basieren, verwendet werden.
Im Stand der Technik können Antiseren und monoklonale Antikörper, die unter Verwendung von natürlichem oder rekombinantem IFN-τ erzielt werden, verwendet werden, um Analysen zum Nachweis von IFN-τ in Gewebekultur-Flüssigkeiten und in biologischen Proben zu entwickeln. Gereinigte Antikörper gegen IFN-τ, die durch Affinitätschromatografie oder durch andere Reinigungsverfahren erzielt werden, können wie auch Antiseren und monoklonale Antikörper verwendet werden und/oder zusammen mit diesen Reagentien, um Antigen-Nachweisanalysen zu entwickeln. Alle bekannten Techniken können für die Entwicklung der Antigen-Nachweisanalysen verwendet werden, die beispielsweise Einfang- oder kompetitive Immunanalysen (RIA, ELISA, TR-FIA etc.) sein können. Um kompetitive Immunanalysen durchzuführen, können natürliche, rekombinante IFN-τ oder IFN-τ-verwandte Peptide benutzt werden. Diese können mit verschiedenen Indikatormolekülen konjugiert werden. Beispielsweise können sie mit Enzymen verbunden werden, die für ELISA-Techniken geeignet sind, mit radioaktiven Materialien für RIAs, mit fluoreszierenden Molekülen für TRFIA und anderen immunfluoreszierenden Techniken sowie mit anderen Indikatoren. Der Nachweis des Antigens kann auch durch Immunfluoreszenz, Strömungs-Cytometrie oder mit anderen, bekannten Techniken erzielt werden.

Peptide

Die allgemeinen Verfahrensweisen zur Erzielung von Peptiden sind gut bekannt. Peptide von IFN-τ können mit verschiedenen Verfahren erreicht werden:
a) Enzymverdau und chemische Spaltung der natürlichen oder rekombinanten Proteine. Siehe beispielsweise Arakawa et al. (1986), J. Biol. Chem. 261, 8534 sowie Seeling et al. (1988), Biochem. 27, 1981.
b) Enzym-katalysierte in vitro Synthese. Siehe beispielsweise Mitin und Zapevalova (1990), Int. J. Peptide Protein Res. 35, 352.
c) Enzymmodifikation von Analoga.
d) Synthese durch rekombinante Techniken. Siehe beispielsweise Charbit et al. (1987), J. Immunol. 139, 1658.
e) Lage-spezifische und regional gerichtete Mutagenese von Protein-codierenden Sequenzen. Siehe beispielsweise Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488.
f) Lösungs-Peptidsynthese. Siehe beispielsweise Bodansky (1984) in Principles of Peptide synthesis, Springer- Verlag, Heidelberg; Bodansky (1984), The practice of peptide synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
g) Festphasen-Peptidsynthese. Siehe beispielsweise Sheppard (1989), Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press Oxford.
h) Segmentkondensation. Siehe beispielsweise Pettit (1976) in Synthetic Peptides, Vol. 4, Seite 22, Elsevier, Amsterdam.
i) Und allgemein alle geeigneten Kombinationen der oben erwähnten Verfahren.
Die 146-Aminosäuresequenz von reifem, menschlichen IFN-τ, die von der Nucleotid-Sequenz einer klonierten cDNA abgeleitet wurde, ist gut bekannt. Siehe beispielsweise Gray et al. (1982) Nature, 295, 503; Grey und Goeddel (1982) Nature 298, 859.
IFN-τ-verwandte Peptide von verschiedener Länge können synthetisiert werden. Wir haben beispielsweise IFN-τ-verwandte Peptide erzielt, die mit sieben Aminosäure-Intervallen 14 Reste überspannen und welche die native IFN-τ Primärsequenz von der Aminosäure 121 (Ala) bis zu der Aminosäure 140 (Gln) (Tabelle 3) abdecken. Diese Liste ist nicht erschöpfend gemeint, sondern es können auch kürzere oder längere Peptide erzielt und kombiniert werden und für den Nachweis und die Reinigung von natürlichen, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern verwendet werden.
Es sind wenigstens fünf Aminosäuren vorhanden, wobei die obere Grenze nicht kritisch ist, aber aus praktischen Gründen auf eine Gesamtzahl von etwa 20 Aminosäuren beschränkt wird. IFN-τ-verwandte Peptide können als C-terminale Funktion eine freie Säure, einen Alkohol, ein Amid, ein Ester, Hydrazid, etc. sowie eine modifizierte N-terminale Funktion aufweisen. Eine Zahl von Techniken für die Modifikation der N-terminalen Funktion sind bekannt, wobei die gebräuchlichsten Techniken Acylierung, Alkylierung, etc. sind.
Einige Aminosäure-Reste, welche die IFN-τ-verwandten Peptide bilden, können wiederholt, deletiert oder substituiert in einer konservativen oder nicht-konservativen Weise sein. Beispielsweise können Aminosäuren aus der nativen Struktur des IFN-τ durch andere, nicht-zugehörige Aminosäuren ersetzt sein, welche die tertiäre Struktur des Epitops nachahmen und ein Mimotop bilden. Die Aminosäure-Reste können ferner durch pseudoisosterische Aminosäuren ersetzt sein. Ferner kann Methionin durch N-Leucin oder durch N-Ethyl-Norleucin ersetzt sein. Relevante Sequenzen können auch in ein Peptidgerüst eingefügt werden, um dessen Affinität zu Antikörpern und dessen Stabilität zu erhöhen.
Die Peptide können ferner konventionell durch verschiedene Zucker oder modifizierte Zuckermoleküle glycosilisiert sein. Eine Reihe von Techniken zur Erzielung der Glycosilierung von Peptiden sind im Stand der Technik bekannt. Die Peptide von IFN-τ können ferner so modifiziert werden, daß ihre Rückgrat- Konformation verändert ist. Einschränkungen der Struktur können beispielsweise durch die Einfügung von D-Aminosäuren, Alpha- Methylaminosäuren, Prolin und anderen Aminosäuren, auch modifizierten, in die Peptidkette erreicht werden. Siehe beispielsweise Marshall und Bassbard (1972), Circ. Res., Suppl., Suppl. 11 bis 30, 41, 143; Manavalan und Momany (1980), Biopolymers 19, 1943; Madison und Kopple (1980), J. Am. Chem. Soc. 102, 4855.
Andere Möglichkeiten der Rückgrat-Modifizierung sind die C7 Drehnachahmung von Huffman und Callahan, die β-Drehnachahmung von Freidingen, Kahn, Kemp und anderen. Siehe beispielsweise Huffman et al. (1988), Peptides: Chemistry and Biology, Proc. 10th. American Peptide Symp. (Marshall, G.R. ed.) Seite 105-108, ESCOM, Leiden; Freidingen (1981), Peptides: Synthesis, Structure and Function, Proc. 774 American Peptide Symposium (Rich, D.H. und Gross, E., eds.) Seite 673-783, Pierce Chemical Co., Rockford, Il.; Kahn (1988), Peptides, Chemistry and Biology, Proc. 10th American Peptide Symp. (Marshall, G.R., ed.), Seite 109-111, ESCOM, Leiden; Kemp und Sun (1982) Tetrahedron Lett. 23, 3759.
Die Peptidbindungen können modifiziert werden, um Konformationsbeschränkungen einzuführen oder um die Stabilität gegenüber einem enzymatischen Angriff zu erhöhen.
Die Peptidbindungs-Modifikation kann entweder eine -CαH< oder eine -CO-NH- ohne Änderung der N-C-C atomaren Rückgratsequenz sein, z.B. Cα,α-disubstituierte Peptide, -β-Dehydropeptide, Thiamin-Peptide, N-alkylierte Peptide, N-hydroxylierte Peptide, Nitrono-Peptide etc. Weitere Veränderungen können durch N-C-C Rückgrat-Modifizierung erzielt werden, um beispielsweise Verbindungen zu bilden, die α-Hydroxy- oder ω-Aminosäuren, [ψCH&sub2;O], [ψCH(OH)CH&sub2;], [ψCH2-NH], [ψCH=CH] enthalten. Diese Peptid-Surrogate und andere können verwendet werden. Siehe beispielsweise Spatola (1983), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Weinstein, B., ed.), Vol 7, Seite 267-357, Dekker, N.Y., McQuade et al. (1990), Science, 247, 454, Miller et al. (1989). Für die Nomenklatur siehe beispielsweise IUPAC-IUB Commission in Biochemcal Nomenclature (1984), European J. Biochem., 138, 9. Andererseits können IFN-τ-verwandte Peptide in ihrer Struktur beschränkt werden und zwar entweder durch eine kurze, mittlere und lange Cyklisierung, um homodete, cyklische Peptide, heterodete, cyklische Peptide, bicyklische Systeme zu bilden, beispielsweise durch NE> C, CE> C, CE> C, NE> C, CE> C, NE> N, oder durch Spiro-Systembildung oder durch jede andere bekannte Technik. Siehe beispielweise Toniolo, 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 287.
Nucleotide, Nucleoside, Deossinucleotide, Oligo- und Polynucleotide, Lipide, Glycolipide, Terpene und ihre Analoga können in die IFN-τ-verwandten Peptidsequenzen eingeführt werden.
Lipide, Glycolipide, Terpene und geeignete Derivate von diesen Verbindungen können mit den IFN-τ-verwandten Peptiden verbunden werden. Die IFN-τ-verwandten Peptide können ferner auch durch verschiedene Kombinationen von modifizierten oder nicht-modifizierten Peptiden, die über verschiedene, bekannte Techniken erzielbar sind, gebildet werden.

Träger

Die Peptide können für verschiedene Zwecke (z.B. um ihre Bindung an eine Trägersubstanz zu erleichtern) an einen geeigneten Träger gebunden werden, um ein Konjugat zu bilden. Jeder im Stand der Technik bekannte Träger kann verwendet werden, wie die verschiedenen Serumalbumine, Tetanustoxoide oder Schlüsselloch- Napfschnecke-Hemocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH).
Die Peptid-Proteinkonjugate können grundsätzlich unter Verwendung von symmetrischen oder asymmetrischen, bifunktionellen Reagentien erzielt werden. Sie können in das Endkonjugat eingefügt werden oder sie können bestimmte reaktive Stellen auf einem Molekül für die nachfolgende Verbindung mit einem anderen Molekül aktivieren.
Eine Reihe von Techniken zur Erzielung solch einer Verbindung sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich Glutaraldehyd, Bis-Imidoester, Carbodiimid, Imidoester, Toluoldiisocyanat, p-Nitrobenzoylchlorid, Hystamin-Dihydrochlorid, MBS (Maleimidbenzoyl-N-Hydroxysuccimid) und viele andere. Der Berührungspunkt der Trägermoleküle auf einem Peptid kann in Abhängigkeit von der Peptidstruktur und den sterischen Erfordernissen unterschiedlich sein. Wenn dem Peptid ein Sulfhydryl fehlt, kann dieses durch den Einbau eines Cysterin-Restes bereitgestellt werden. Diese Reagenzien schaffen eine Disulfid-Verbindung zwischen ihnen und den Peptidcystein-Resten andererseits sowie eine Amidverbindung durch das E-Amino auf einem Lysin oder einer anderen freien Aminogruppe auf dem anderen. Eine Reihe von solchen Disulfid/Amid-bildenden Agenzien sind bekannt. Siehe beispielsweise Immun. Rev. (1982), 62, 185. Andere bifunktionelle Kupplungsmittel bilden eher eine Thioether- als eine Disulphydverbindung.
Die Bindung der INF-τ-verwandten Peptide an das Trägermolekül kann durch nicht-kovalente Bindungen erzielt werden. Beispielsweise kann ein Peptid an ein Trägerprotein durch eine hydrophobe Domäne in einer hydrophoben Tasche gebunden werden.

Reinigung

Menschliche, natürliche Antikörper gegen IFN-τ können aus verschiedenen Proben, wie Plasma, Serum, Urin, Speichel, oder aus schon gereinigten, menschlichen Immunglobulinpräparaten gereinigt werden. Menschliche Immunglobuline können verschiedene Klassen umfassen (IgM, IgG, IgA, IgD oder IgE). Diese können in der nativen Struktur vorliegen oder gemäß einer Reihe von experimentellen Bedingungen, die im Stand der Technik bekannt sind, denaturiert werden oder sie können Antigen-Bindungsfragmente (F(Ab')&sub2;, Fab, Fab', FV) der Immungluboline aufweisen. Die Antigen-Bindungsfragmente der Immungluboline können chemisch, enzymatisch oder durch rekombinante DNA-τechniken, z.B. Miniantikörper, erzielt werden.
Menschliche, natürliche Antikörper gegen IFN-τ können durch jede der bekannten Affinitätstechniken unter Verwendung von IFN-τ oder von IFN-τ-verwandten Peptiden als spezifische Bindungsmoleküle, die an einen Träger gebunden sind, gereinigt werden.
Eine der vielen, bekannten Techniken ist die Affinitätschromatografie.
Die IFN-τ-verwandten Peptide können an viele, bekannte Matrices gebunden werden, wie Agarose, Kieselgel, Polyacrylamid und ähnliches.
Die Bindung der Peptide an die Matrix kann durch Quervernetzung der funktionellen Gruppen an die Matrix und an das Peptid durch Anordnung eines Trennarmes erzielt werden. Die Trennarme sind oft lineare, aliphatische C6-C8-Ketten mit funktionellen Gruppen, die eine Brücke zwischen der Matrix und dem Peptid bilden können. Es können hydrophile Verbindungen (d.h. Alkohole) und hydrophobe Verbindungen (d.h. Trennelemente, die einen Benzolring oder andere Gruppen aufweisen) verwendet werden. Trägermoleküle können anstelle der Trennelemente verwendet werden.
Um eine Denaturierung der Peptide infolge ihrer Anbindung an eine Matrix zu vermeiden und um dieses Verfahren zu erleichtern, kann es nützlich sein, eine Präaktivierung der Matrix durchzuführen, so daß die nachfolgende Bindung des Liganden unter milden Bedingungen erzielt werden kann. Die Aktivierung ist eine chemische Reaktion zwischen der Matrix und der aktivierenden Verbindung und führt an der Oberfläche der Matrix selbst zu der Bildung von reaktiven Gruppen (im allgemeinen elektrophil), die mit den Gruppen des Liganden (im allgemeinen nucleophil, beispielsweise Aminogruppen) kombinieren. Reaktive Gruppen, wie Imidocarbonat, Oxiran (Epoxy-Aktivierung), Trichlortriazin, O-Imidazolylcarbonyl und viele andere, sind im Stand der Technik bekannt. Durch Reaktion mit einem N-Hydroxysuccinamidester der Bromessigsäure kann ein Trennarm mit einer terminalen Aminogruppe aktiviert werden, um ein sehr reaktives, alkylierendes Mittel zu erhalten.
Fertig zu verwendende Matrices mit aktivierten Trennarmen können verwendet werden, wie beispielsweise SulphoLink Kopplungsgel, in dem die aktive Stelle eine Iodacetylgruppe ist, die fertig mit einer freien Sulhydrilgruppe reagieren kann.
Die IFN-τ-verwandten Peptide können auch durch nicht-kovalente Bindungen unter beispielsweiser Verwendung eines Triacin- Farbstoffharzes an eine Matrix gebunden werden. Ferner können die Peptide von IFN-τ auch durch reversible, kovalente Bindungen an die Matrix gebunden werden.
Andererseits können die gereinigten, menschlichen Antikörper gegen IFN-τ an eine Trägersubstanz gebunden werden, um die erkannte(n) Form(en) von IFN-τ einer Affinitätsreinigung zu unterziehen.
Die Affinitätsverbindung zwischen den Antikörpern und IFN-τ an der Affinitätsmatrix kann entweder direkt durch Schaffung von Bedingungen, die für die biospezifischen Interaktionen nicht günstig sind, oder mittels einer kompetitiven Affinitätselution gebrochen werden.

Therapie

Für Murin-Anti-IFN-τ Antikörper wurde gezeigt, daß sie eine Abstoßung von allogenen Tumorzellen verhindern, daß sie die Shwartzman-verwandte oder eine ähnliche Reaktion hemmen und daß sie NZB Mäuse gegen eine spontane Entwicklung von Autoimmunkrankheiten schützen. Siehe beispielsweise Landolfo et al. (1985) Science 229, 176, Billiau (1988), Immunol. Today 9, 37, Jacob et al. (1987), J. Exp. Med. 166, 798.
Gereinigte, menschliche Antikörper gegen IFN-τ können in der Klinik als spezifische Antagonisten von IFN-τ verwendet werden, um selektiv die physiologische(n) Reaktion(en), die durch IFN-τ induziert wird, zu unterdrücken und insbesondere solche Reaktionen, die an der Aufregulation des Immun- oder Autoimmunprozesses beteiligt sind. Da es sich um Proteine handelt, werden die Antikörper parental, insbesondere intravenös appliziert. Da sie mit weißen Blutzellen reagieren können, werden sie vorzugsweise langsam verabreicht und zwar entweder aus einem bekannten IV- Verabreichungsset oder aus einem subcutanen Depot. Die Dosis für einzelne Individuen und für die verschiedenen Krankheiten wird durch Messung des Effektes des Anti-IFN-τ Antikörpers auf die Herabsetzung von solchen Parametern bestimmt, welche für die zu behandelnde Krankheit maßgebend sind. Basierend auf dem Experiment von Jacob et al. (1988), J. Exp. Med. 166, 798, und unter Berücksichtigung der natürlichen Toleranz der Antikörper, kann die Dosis der menschlichen Anti-IFN-τ Antikörper periodisch in Abhängigkeit von der besonderen Krankheit wiederholt werden. Wenn sie zur Prophylaxe verwendet werden, ist es möglich, die menschlichen Anti-IFN-τ Antikörper in kürzeren Abfolgen, zweimonatlich, halbjährlich oder jährlich, zu verabreichen. Bei der Behandlung einer bestehenden Krankheit wird erwartet, daß eine sehr häufige Antikörperverabreichung unter Verwendung von Infusionsvorrichtungen erfolgt. Für Autoimmunkrankheiten, von denen bekannt ist, daß sie durch besondere Umweltfaktoren, welche die Menge an IFN-τ erhöhen, gefördert oder gehemmt werden, ist eine entsprechende Dosistherapie vorgesehen.
Bei einer parentalen Verabreichung werden die menschlichen Anti-IFN-τ Antikörper in einer injizierbaren Einheitsdosisform in Verbindung mit einem nicht-toxischen und einem nicht-therapeutischen, akzeptablen, parentalen Vehiculum formuliert. Nichtwäßrige Vehicel können verwendet werden. Das Vehiculum kann Substanzen enthalten, welche die Isotonie und die chemische Stabilität fördern. Der Antikörper wird vorzugsweise in gereinigter Form mit verschiedenen Konzentrationen in dem Bereich von etwa 0,5 mg/ml bis 20 mg/ml formuliert, und zwar im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen.

Beispiele

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht. Gemäß der Offenbarung sind für Fachleute zahlreiche Ausführungsformen innerhalb des Schutzumfanges der Ansprüche möglich.

I. Hemmung des natürlichen und rekombinanten IFN-τ-induzierten Fc-Rezeotors und der HLA-DR-Antigene durch affinitätsgereinigte, menschliche Anti-IFN-τ Antikörper.

Bei U937 Zellen, die in einem Medium mit natürlichem oder rekombinanten IFN-τ inkubiert werden, nehmen sowohl der Fc-Rezeptor als auch die HLA-DR-Antigene an ihren Oberflächen zu. Der maximale Effekt wird normalerweise bei Verwendung von IFN-τ mit einer Konzentration von 200 U/ml nach 24 Stunden erzielt.
Wenn affinitätsgereinigte, menschliche Anti-IFN-τ Antikörper in den U937 Zellkulturen, die mit IFN-τ stimuliert sind, vorhanden sind, hemmen sie gemäß der Darstellung in Figur 1 in dramatischer Weise die erwartete Zunahme des Fc-Rezeptors und der HLA-DR Antigene. Es wurde gefunden, daß die Hemmung dosisabhängig (Tabelle 4) ist, wobei der maximale Effekt mit menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern bei einer Konzentration von 4,8 ug/ml auftritt. Zur selben Zeit wurde kein hemmender Effekt beobachtet, wenn nicht-verwandte, gereinigte, menschliche Immungluboline als Kontrolle zu den IFN-τ behandelten U937 Zellkulturen hinzugefügt wurden.
Die Expression der Fc Rezeptorstellen (A, B, C) und der HLA-DR Antigene (A', B', D') auf U937 wurde durch Analyse mittels Strömungscytometrie bestimmt.
Durchgezogene Linie: In Abwesenheit von IFN-τ herangezogene Kulturen.
Gepunktete Linie: In Gegenwart von IFN-τ (A, A'), in Gegenwart von IFN-τ und menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern (B, B') und in Gegenwart von IFN-τ und nichtverwandten, menschlichen Immunglubolinen (C, C') herangezogene Kulturen.

I.A.1. Effekt von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern auf die Lymphozyten-Proliferation, die durch bestrahlte, alogene, periphere Blutleukozyten (PBL) induziert wurde.

Gemischte Lymphozyten-Kulturen führten am Tag 7 zu einer markierten Lymphozyten-Proliferation. Die Zugabe von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern zu Beginn der Kultur führte zu einer deutlich reduzierten Aufnahme von [³H] Thymidin. Die hemmende Wirkung von menschlichen Anti- IFN-τ Antikörpern nahm mit abnehmenden Konzentrationen der Antikörper (Tabelle 5) graduell ab. Figur 2 zeigt, daß die Lymphozyten-Proliferation gehemmt wurde, wenn gegen IFN-τ spezifische, menschliche Antikörper an den Tagen 0 und 1 hinzugefügt wurden. Wenn die gleichen Antikörper später zugesetzt wurden (die Tage 2, 3 und 4), wurde keine Hemmung in der Proliferationsreaktion beobachtet.
Gereinigte, menschliche Anti-IFN-τ Antikörper wurden mit einer Konzentration von 4,8 ug/Vertiefung zu Beginn der gemischten Lymphozytenkultur oder an den Tagen 1, 2, 3, 4 hinzugefügt. [³H]-Thymidin-Puls für 18 Stunden am Tag 6.

I.A.2. Effekt von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern auf die allogene, induzierte Lymphozyten-Cytotoxizität.

Figur 3 zeigt ein repräsentatives Experiment der cytotoxischen Reaktion von gemischten Lymphozyten-Kulturen, die mit PHA-stimulierten PBL oder mit K562 Zellen bestimmt wurde. Die Cytotoxizität der Effektorzellen, die von Kulturen wiedergewonnen wurden, die in Gegenwart von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern aufgezogen wurden, wurde stark reduziert gegenüber PHA-stimulierten PBL. Andererseits hatten die menschlichen Anti-IFN-τ Antikörper nur einen moderaten Einfluß auf die Entwicklung der cytotoxischen Lymphozyten gegenüber K562- Zellen. Bei anderen Experimenten wurde die cytotoxische Aktivität gegenüber K562-Zellen nur zu 10-20 % im Vergleich zu Kontrollkulturen reduziert.
PBL wurde in vitro mit bestrahlten, allogenen PBK aktiviert. Gereinigte, menschliche Antikörper gegen IFN-τ ( ) oder gereinigte, nicht-verwandte, menschliche Immungluboline (ο) wurden mit einer Konzentration von 4,8 ug/Vertiefung zu Beginn der gemischten Lymphozyten- Kultur hinzugefügt. ( ) PBL-Zellen nur mit Medium. Zielzellen waren PHA-stimulierte Lymphozyten (A) und K562 (B).

II. Chromatographie von menschlichem Anti-IFN-τ auf einer Agarosematrix, die mittels eines Spacerarms an das Peptid Nr. 22 (siehe Tabelle 3) kreuzvernetzt war.

2 mg des Peptides Nr. 22, das ein zusätzliches L-Cystein an seinem N-terminalen Ende aufwies, wurde mit 2 ml von Sulfolink Kupplungsgel (PIERCE) gemäß einem von PIERCE empfohlenen Standardprotokoll verbunden. Die Affinitätssäule wurde mit einem FPLC Apparat (PHARMACIA) verbunden und mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) equilibriert. Gereinigte, menschliche Antikörper (50 mg) wurden auf die Säule mit einer Strömungsrate von 0,1 ml/min gegeben, und die gebundenen Antikörper wurden mit der gleichen Strömungsrate mit 0,1 M Glycin, pH 3,0, eluiert.
Figur 4 zeigt ein typisches Elutionsmuster der Antikörper, die an der Affinitätsmatrix (siehe Peak 2) gebunden waren.

III. Western Blot-Analyse der affinitätsgereinigten, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörper.

Spezifisch gegen IFN-τ reagierende Antikörper, die auf einer Affinitätssäule auf Basis eines IFN-τ-verwandten Peptides gereinigt wurden, wurden durch Western Blot- Analyse als Immunglobuline bestätigt, die mit rekombinantem IFN-τ reagierten. Figur 5 zeigt, daß unter Verwendung von ¹²&sup5;I-konjugierten Ziege-Anti-Mensch Ig als Tracer die Anti-IFN-τ Antikörper in einer denaturierten Form als zwei reaktive Banden von 25.000 und 50.000 Molekulargewicht bestimmt wurden, welche die leichte und die schwere Kette der entsprechenden Immungluboline (a) darstellen. Zur gleichen Zeit waren diese Antikörper in der Lage, mit rekombinanten IFN-τ Proteinen mit einem Molekulargewicht von 16.000 und 32.000 (Hoffmann-La Roche) (b) zu reagieren. Die Spezifität der rekombinanten IFN-τ Reaktivität der gereinigten, menschlichen Antikörper wurde durch Vergleich mit der Reaktivität eines kommerziell verfügbaren Anti- IFN-τ, monoclonalen Antikörpers (Boehringer) (g) bestätigt.
Menschliche Anti-IFN-τ Antikörper reagierten mit natürlichem IFN-α (Geschenk von Dr. Kari Kantell) (b), natürlichem IFN-β (Serono) (c), rekombinantem IFN-α (Hoffmann-La Roche) (e) und mit rekombinantem Interleukin-2 (Boehringer) (f) nicht.

IV. ELISA zum Nachweis der Anti-IFN-τ Antikörper in Humanserum.

Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotitrationsplatten wurden mit IFN-τ-verwandten Peptiden oder mit rekombinantem IFN-τ beschichtet. Um die Menge der spezifischen Anti-IFN-τ Antikorper in den Proben zu quantifizieren, enthielt jede Analyse eine negative Kontrolle und eine Reihe von positiven Kontrollen. Den positiven Kontrollen wurde ein Wert von 1, 25, 30, 50, 60 und 100 willkürlichen Antikörpereinheiten (AU) gegeben. Eine Standardkurve wurde für jeden Testlauf bezüglich der Adsorption dieser Kontrollen aufgestellt, und jeder Testprobe wurde ein Wert in AU auf Basis dieser Standardkurve gegeben.
Eine Platte von 88 Serum-Proben wurde verwendet, um die Korrelation der Ergebnisse, die durch ELISA auf Basis eines IFN-τ-verwandten Peptides (Peptid Nr. 21 in diesem Beispiel; siehe Tabelle 3) und durch RIA auf Basis eines rekombinanten IFN-τ als Antigen auf der Festphase erzielt wurde, zu studieren. Gemäß der Figur 6 ist die Korrelation zwischen ELISA und RIA mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,94 sehr hoch, wobei 80,5 % der Ergebnisse innerhalb von ±1 SD von den theoretischen Werten liegen, die durch die lineare Regressionslinie angezeigt sind.

Verwendbarkeit

Die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind für den Nachweis, die Quantifizierung, die Reinigung von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern sowie für die Behandlung von Individuen, die für Autoimmunkrankheiten empfindlich sind, oder allgemein für Individuen nützlich, die an solchen Krankheiten leiden, wo eine aktivierte, Zell-vermittelte Immunität unterdrückt werden muß.

ANLAGE 1

Literatur

Maniatis, Fritsch und Sambrook, MOLECULAR CLONNING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, Bände I und II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed. 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames und S.J. Higgins; eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.K. Freshney, ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONNING (1984); Die Reihen METHODS IN ENZYMOLOGY (S. Clowick und N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.) und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Bände I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); M. Bodanszky, PRINCIPLES OF PEPTIDE SYNTHESIS (1984); K. March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (1988); THE PEPTIDES, ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY (E. Gross und J. Meienhofer, eds., 1980, Academic Press, Inc.); P. Tijssen, PRACTICE AND THERAPY OF ENZYME IMMUNOASSAYS (R.H. Burdon und P.H. Van Knippenberg, eds., 1988, Elsevier); L.A. Osterman, METHODS OF PROTEIN AND NUCLEIC ACID RESEARCH, Volumes 1-3 (Springer-Verlag); PROTEIN ENGINEERING (D.L. Oxender und C.F. Fox, eds., 1988, Alan R. Liss, Inc.) Tabelle 1: Die IFN-τ multiplen Aktivitäten Lymphozyten Makrophagen Endothelzellen Epithelzellen PMN fördern die T-Lymphozyten-Proliferation, induzieren die Reifung von cytotoxischen T- Lymphozyten; hemmen die Reifung von Supressor-T-Lymphozyten. fördern die Ig-Synthese und schalten auf IgG2a; hemmen die IgE-Synthese. induzieren oder fördern die Expression von MHC Klasse II, Fc Rezeptor, Integrinrezeptoren, Mac-1, LFA-1, CR3; induzieren die Synthese von IL-1, TNF, chemotaktischem Faktor; fördern die Freisetzung von proteolytischen Enzymen; aktivieren das oxydative Platzen und Abtöten der Mikroorganismen und von Tumorzellen. induzieren die Expression der MHC Klasse II und ICAM-1 und die Freisetzung der chemotaktischen Faktoren. induzieren die Expression der MHC Klasse II und der ICAM-1. fördern die Freisetzung von proteolytischen Enzymen und oxydativen Radikalen. Tabelle 2: Bekannte Krankheiten, bei denen eine Therapie mit IFN-τ Antagonisten nützlich ist Diabetis Tp I Multiple Sklerose Lupus erythematosus Adjuvans-Arthritis Shwartzman-Reaktion Verzögerte Hypersensitivität Allotransplantat-Abstoßung verzögert durch immunsuppressive Stoffe; Exazerbation durch IFN-τ. Exazerbation durch IFN-τ. verzögert durch Anti-IFN-τ, MAbs; Entwicklung von Nephritis; Exazerbation durch IFN-τ. Exazerbation durch IFN-τ (frühe Phase der Krankheit) und Verzögerung durch Anti- IFN-τ MAbs. Letale Effekte von Endotoxin, Thrombose und Hemorrhagie, die durch Anti-IFN-τ MAbs verhindert werden. Lokale Rekrutierung von T-Zellen, die durch Anti-IFN-τ MAbs gehemmt wird. Abstoßungen von Tumorhaut und Herztransplantaten, die durch Anti-IFN-τ MAbs verzögert oder blockiert werden. Tabelle 3: Sequenzen von Peptiden nach der Erfindung Tabelle 4: Effekt von in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügten, natürlichen, menschlichen Antikörpern gegen IFN-τ auf die Expression des Fc Rezeptors und der HLA-DR Antigene bei U937 Zellen, die mit rIFN-τ (a) stimuliert wurden. Zugabe zur Kultur % von U937 Zellen, die Fc Rezeptoren exprimieren Hemmung (%) % von U937 Zellen, die HLA-DR exprimieren Antikörper gegen IFN-τ (ug/ml) Nicht-verwandte Antikörper (ug/ml)
a. U937 Zellkulturen wurden für 24 h mit 200 U von rIFN-τ stimuliert und zur gleichen Zeit wurden sie mit verschiedenen Konzentrationen von menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern oder mit gereinigtem, menschlichem, nicht-verwandtem Ig behandelt oder nicht. Tabelle 5: Effekt von in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügten, menschlichen Anti-IFN-τ Antikörpern auf die allogene, induzierte Lymphozyten-Proliferation (a). Zugabe zur Kultur [³H] Thymidin-Einbau (cpm ± SD) Hemmung (%) Antikörper gegen IFN-τ (ug/Vertiefung) Nicht-verwandte Antikörper (ug/Vertiefung)
a. Lymphozyten, die in einem Reaktions/Stimulator-Verhältnis von 1:1 mit bestrahltem, allogenen PBL gemischt wurden, wurden allein mit Medium oder mit Medium inkubiert, das verschiedene Verhältnisse von menschlichen Antikörpern zu IFN-τ oder von nicht-verwandten, menschlichen Antikörpern enthielt. Die Proliferationsreaktion wurde am Tag 7 nach einem 18 Stundenpuls mit [³H]-Thymidin gemessen.

Claims

1. Peptide ausgewählt aus der Gruppe

Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg. (aa. 121-134).

Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Gln. (aa. 127-140).

2. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1, für die Bestimmung von Anti-IFN-γ-Antikörpern im Serum.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Bestimmung durch RIA, ELISA, Fluorimmunoassay-Verfahren durchgeführt wird.

4.. Verwendung der Peptide nach Anspruch 1, für die Affinitätsreinigung von Anti-IFN-γ-Anitkörpern.

5. Verwendung von menschlichen Anti-IFN-γ-Antikörpern zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Bedingungen, welche von einer selektive Immununterdrückung von pathologischen Reaktionen, induziert durch IFN-γ, Nutzen ziehen können.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Bedingungen Diabetis vom Typ I, Multiple Sclerose, Lupus erythematosus, Adjuvant Arthritis, Schwartzmann-Reaktion, verzögerte Hypersensivität, Allotransplantatabstoßung sind.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche als aktiven Bestandteil menschliche Anti-IFN-γ-Antikörper enthält.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 in Einheitsdosisform.

9. Verwendung von menschlichen Anti-IFN-γ-Antikörpern zur Reinigung von natürlichem oder rekombinantem IFN-γ.

10. Verwendung von menschlichen Anti-IFN-γ-Antikörpern für die Immunanalyse von IFN-γ.