JPH05500360A - 合成ペプチドによって検出、精製された天然ヒト抗ガンマインターフェロン抗体 - Google Patents
合成ペプチドによって検出、精製された天然ヒト抗ガンマインターフェロン抗体Info
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- JPH05500360A JPH05500360A JP2511587A JP51158790A JPH05500360A JP H05500360 A JPH05500360 A JP H05500360A JP 2511587 A JP2511587 A JP 2511587A JP 51158790 A JP51158790 A JP 51158790A JP H05500360 A JPH05500360 A JP H05500360A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
合成ペプチドによって検出、精製された天然ヒト抗ガンマインターフェロン抗体
本発明は、ヒト抗ガンフィンターフェロン抗体をヒトの治療に用いること及びヒ
トガンマインターフェロンの領域に対応する合成ペプチドによって該抗体を検出
、精製することに関する。
[背景の技術]
インターフェロン(I FN)は、ウィルス複製を阻止する性能により定義され
る蛋白質の不均質なファミリーを形成する。現在、ヒトIFNは、−次アミノ酸
配列のレベルでは30%似ているIFN−αとIFN−β、及びそれらのいずれ
とも似ていないIFN−γの3ケに大別されている。IFN−γは、IFN−α
及びIFN−βといくつかの点で性質、活性が同じであるが、種々の免疫機能を
仲介する。さらに、最近になって、第1表に示すように、IFN−7が、有力な
免疫モジュレータ−として機能することが分かってきた。抗原刺激に伴い、T−
細胞とNK−細胞が、IFN−γを放出する。そして、これが、T−細胞、B−
細胞及びマクロファージの応答に影響を与え、T−細胞の増殖と細胞障害性T−
細胞の機能的成熟を促進し、サプレッサーニー細胞の発生を抑制し、インビトロ
免疫応答中、後で加えた時、B−細胞の免疫グロブリンの分泌を促進し、1gG
2の製造を活性化する。適応免疫応答に関するこれらの調節効果に加えて、IF
N−γは、非適応防御のエフェクター細胞に作用し、プロ炎症活性を示す。IF
N−7に感作したマクロファージは、酸素依存及び非酸素依存機構によってバク
テリア、原生動物や腫よう細胞を殺すことが出来るようになる。さらに、内皮細
胞や、IL−1やTNFのような走化性因子を放出する拳法を誘発し、主要組織
適合遺伝子複合体(MMC) 、F Cレセプターや白血球接着蛋白質(インテ
グリン、インテグリンレセプターなど)のクラス11クラスIN抗原の合成や表
面発現を促進する。IFN−γによるMHC抗原の誘発は、他ではこれらの分子
を低い又は検知することのできないレベルで発現するような種々の細胞中で起こ
り得る。MI(CクラスINの発現によって、マクロファージ、内皮細胞、上皮
細胞やランゲルハンス細胞に対して抗原を悴えることができるが、同時にこれら
の細胞がクラスIIの限定されたT−リンパ球の細胞障害効果を受け易くする。
Pcレセプターの誘導によって、食細胞オプリニン抗原に対するマクロファージ
の性能が向上する。インテグリンレセプターの表面密度の促進によって、単球の
内皮細胞や局所炎症、免疫反応を助長するリンパ球への接着が促進される。
□1表
(IFN−γの多様な活性)
T−リンパ球二 T−リンパ球の増殖の促進。細胞障害性T−リンパ球の成熟の
誘発。サプレッサーニーリンパ球の成熟の抑制。
B−リンパ球: Ig合成及びIgG2aへの変換の促進。IgE合成の抑制。
マクロファージ:MHCクラスII、Pcレセプター、インテグリンレセプター
M a c −1、L F A −1、CR3の発現の誘発又は向上。IL−1
,TNF、走化性因子
の合成の誘発つ蛋白質分解酵素の放出
の向上。酸化的バースト、微生物や腫
よう細胞の死滅の活性化。
内皮細胞: MHCクラス■、I CAM−1の発現及び走化性因子の放出の誘
発。
と皮細胞: MHCクラス■、I CAM−1の誘発。
PMN: 蛋白質分解酵素及び酸化性ラジカルの放出の促進。
免疫、炎症応答の進行中のIFN−7の一般的刺激活性は、例えば、免疫モジコ
レ−ターとして有力な治療への適用を示すが、その活性を中和することのできる
薬剤は、同種移植の患者や、自己免疫疾患、慢性炎症、細菌性ショックや糖尿病
(第2表)に侵された患者に対して与えた時、IFN−γの製造の促進が有害で
あると考えられる如何なる臨床段階でも有効である。
χ−−2−1
(IFN−γアンタゴニストによる治療に有効であることが知られている疾患)
タイプI糖尿病: 免疫抑制剤により遅延。T FN−γにより憎悪。
多発性硬化症: IFN−γにより憎悪。
紅斑性狼癒: 抗IFN−γM A b sにより遅延。
IFN−γにより憎悪した腎炎の
発生。
アジュバント関節炎:IFN−γにより憎悪(疾患の初期段階)。抗IFN−7
MAbs
により遅延。
Shwartzman反応: 抗IFN−7MAbsにより抑制される内毒素、
血栓症、出血の致
死効果。
遅延型過敏症: 抗IFN−γM A b sにより抑制されるT−細胞の局所
回復。
同璽移植拒絶: 抗IFN−γMAbsにより遅延又は阻止される腫よう皮膚並
びに
心臓同種移植拒絶。
抗体は、最も特殊な天然免疫抑制剤である。Eilliauは、’1mmuno
1. Today”、 Vol、9.37 (198g)の中で、マウス抗IF
N−7抗体が、実験的にシュワルツマン(Shvartzsan)反応を抑制し
たと報告した。彼の実験は、シュワルツマン関連の炎症反応を処理に対する興味
ある臨床的適用を開発した。Jacobら”J、 Exp、 Med、”、Vo
l、166゜79g (1987)に報告された他のデータは、抗IFN−γ抗
体が自己免疫疾患の自然発生に対してNZBマウスをプロテクトすることを示し
ている。彼らの実験は、ポリクローナル、好ましくはモノクa−ナルな抗IFN
−1抗体が、全身エリテマトーデス(SLE)やリウマチ様関節炎などの結合組
織疾患、多発性硬化症、活性細胞仲介の免疫性を抑制することが必要な全ての疾
患への試みに熱望することができることを示していた。抗体免疫抑制治療は、R
h−関連の赤芽球症胎児を防ぐためのヒトの例に用いられている。しかしながら
、この処理は、原因となる抗原が分かっている場合や、特殊なヒト抗血清が手に
入る場合に限られる。
ヒト免疫系により自己認識された物質としては、自己免疫疾患を除き、又はそれ
らの構造や抗原性が改変される時には、IFNは、抗体を引き出すべきではない
。■FN−7に対する抗体は、Carusoらにより”J、 Biol。
Reg、 tlo@eogt、 Agents”、 Tol、3.8 (198
9)の中で、ヒト免疫不全ウィルス(HI V)に感染した患者において報告さ
れた。さらに最近では、Carusoらは、“J、 Immunol、−。
Vol、144.685 (1990)の中で、新生児から大人ニイたる健康な
人のIFN−7に対する天然の抗体の存在、及びより高いレベルでの種々のウィ
ルス感染症にかかった患者におけるそれを報告した。JPN−γに対して特異な
抗体は、組換えIFN−γ共役CN B r−活性セファロース4Bカラムを用
いることによって、健康な人、ウィルス感染した患者、又は他の異なった生物源
(後述の[発明を実施するための劃Iを参照)から得た血清からアフィニティー
精製した。これらの抗体は、主にIgGクラスものであることが分かり、組換え
IFN−7を結合する能力を維持した。抗体は、クラスIIMHC抗原や免疫グ
ロブリンのFcレセプター部位のIFN−γ誘発を抑制することができる半面、
IFN−γの抗ウィルス活性を中和したかった。さらに、天然ヒト抗IFN−γ
抗体は、混合リンパ球培養(MLC)中、内在的に製造されたIFN−γを抑制
することによって、リンパ球の増殖と細胞障害の発生をじゃますることが分かっ
た。
IFN−γの免疫モジュレータ−活性を中和することができるアフィニティー精
製されたヒト抗IFN−7抗体が得られることにより、活性細胞仲介の免疫を必
要とする全ての疾患に対して、興味ある臨床への適用が開発される。
中和性ヒト抗IFN−7抗体が容易に得られることにより、抗Ic抗体を誘発す
ることができる不均質な免疫グロブリン(ポリクローナル及び/又はモノクロー
ナル抗体)の投与によって起きる多くの問題を解決することができる。
本発明の主な目的は、ヒトIFN−γの領域に対応する合成ペプチドを用いて抗
IFN−γ抗体を検出、アフィニティー精製する技術を提供することである。
[発 明 の 開 示]
本発明は、ヒトIFN−7の領域に対応する合成ペプチドが、天然ヒト抗IF’
N−7抗体の検出、精製にあたり、天然または組換えIFN−7蛋白質を置換す
ることができるという発見に基づく。従って、本発明の第1の様態は、IFN−
γに対するヒト抗体を検出する種々の免疫法において合成ペプチドを使用するこ
とに関する。
上記方法は、直接または間接的に検出することが出来る抗IFN−7抗体を特異
的に結合することができる合成ペプチドの使用に基づく。第2の様態は、合成ペ
プチドを用いてヒト抗TFN−7抗体をアフィニティー精製する方法に関する。
この方法は、サポートまたは他の分子状キャリヤーに合成ペプチドを結合するこ
と、またはペプチドをニドσセルロース・シートに捕捉することに基づく。
本発明の第3の様態は、活性細胞仲介免疫により起こされる疾患をコントロール
する免疫治療処理に関する。
この処理は、疾患を臨床的見地から十分にコントロールする人に対するIFN−
7に対するヒト抗体を投与することよりなる。本発明の第4の様態は、上記患者
の処理のための単位調剤に関する。単位調剤は、製薬的に許容されたビヒクルを
組み合わせたIFN−γに対するヒト抗体よりなる。調剤中のヒト抗体の量は、
疾患の発現を実質的におさえるのに十分なものでなくてはならない。
疾患の発現は、疾患にともなう臨床的症状、または健康な人には見られないか、
低い力価でしか現れない疾患にともなう自己抗体の存在によって決定することが
できる。
本発明の第5の様態は、精製されたヒト抗IFN−7抗体を用いてIFN−γを
検出する免疫方法に関する。
この方法は、特異的にIFN−7分子を結合、検出する(直接または間接的方法
で)ヒト抗IPN−γ抗体の使用からなる。
本発明の最後の様態は、ヒト抗IFN−γ抗体によって認識されたIFN−7分
子をアフィニティー(親和)精製する方法に関する。この方法は、ヒト抗IFN
−7を、サポートまたは他の分子状キャリヤーに結合するか、それらをニトロセ
ルロース・シートに捕捉することからなる。
[図面の簡単な説明]
第1図は、組換えIFN−γにより刺激されたU937細胞について、Fc−レ
セプター部位とHLA−DR抗原の発現をヒト抗IFN−γ抗体によって抑制す
ることを示すグラフである。
第2図は、MLC増殖について、異なった時間でヒト抗IFN−γ抗体を加えた
時の効果を示すグラフである。
第3図は、MLCにおける細胞障害の発生についてヒ)IFN−7抗体の効果を
示したグラフである。
第4図は、IFN−7関連のペプチド・スルフォ結合したアガロースカラムにつ
いてのヒト抗IFN−γ抗体のクロマトグラフィーである。
第5図は、IFN−7に対して特異な反応性を示すIFN−γ関連ペプチド系カ
ラムによってアフィニティー精製された抗IFN−7抗体のウェスタンプロット
分析を示す。
第6図は、MLC増殖のペプチド系アフィニティーカラムにより精製されたヒト
抗IFN−γ抗体の効果を示すグラフである。
第7図は、人血清中のヒト抗IFN−7抗体を検出、定量する際のrFN−7関
連のペプチド系EL I SAと組換えIFN−γ系RIAによって得られる相
関関係を示すグラフである。
[発明を実施する様1JsI
特に示すことのないかぎり、発明の実施に当たっては、当業界で従来から行われ
ている分子生物学、微生物学、組換えDNA、化学、生物学、バイオテクノロジ
ー、免疫学を採用する。これらの技術は、下記に示す文献に詳しく説明されてい
る。
Maniatis、 Fr1tschおよびSambrook 、分子クローニ
ング:ラボラトリ−マニュアル(1982); DNAクローニング、第1.■
巻(D、LGlover編、 191+5);オリゴヌクレオチド合成(M、J
、 Galt編、 1984);核酸および交雑(ハイブリダイゼーション)
(B、D、 gasesおよびS、J。
旧ggins;編、1984);動物細胞培養(R,[、Freshney。
1986):非可動化細胞および酵素(IRL Press、 1986):
B。
Perbal、分子クローニングへの実用的ガイド(1984)、シリーズ、酵
素学での方法(S、 C1ovick and Il、 Kaplan編。
Academic Press、 Inc、)および実験免疫学のハンドブック
:第■〜■巻(Djl、 WeirおよびC,C,Blackvell、編。
1986、バックウェル サイエンティフィック バブリケーシジン): M、
Boclanszky、ペプチド合成の原理(1984) ;L March
、上級有機化学(198g)、ペプチド分析、合成、生物学(1:、 Gros
sおよびJ、 Meienbofer、編、 19+10.アカデミツク プレ
ス社): P、 Tijgsen、酵素免疫検定の実際および治療(R,H,B
urdonおよびP、11. Van Knippenberg、編、 198
8. Elsevier); L、^、 Osterman、蛋白質および核酸
の研究方法、第1〜3巻、 (Springer−Yerlag);蛋白質工学
(D、L、 0xenderおよびC,F、 Fox、編、 198g。
Alan R,Li5s、社)。
本発明によれば、公知の検定法によって資料中のIFN−γに対する天然の抗体
を検出、定量することは、科学者や臨床医にとって非常に有用であり、関連が深
い。
例えば、ヒト抗IFN−γ抗体を検出する検定は下記の点で有用である。
イ)臨床においては、ウィルス疾患の早期診断のため、ウィルス感染とバクテリ
ア感染を区別すること。ウィルス感染、終局的には特定の抗ウイルス治療をモニ
ターすること。癌、ウィルス感染、及び/又は免疫不全の患者の抗IFN−7抗
体を研究すること。移植患者のウィルス感染の早期診断のために、器官移植をモ
ニターし、終局の同種移植拒絶を防止すること。抗ウイルス治療、免疫モジュレ
ータ−治療をモニターすること。
口)産業においては、クロマトグラフィーや他の予備的方法により得た免疫グロ
ブリン製剤の品質管理をすること。
ハ)血液銀行においては、表面上は健康な血液ドナーのウィルス感染を検出する
こと。
「免疫検定コ
IFN−7に対する抗体検出のための検定は、もとの分子の異なりたエピトープ
を表わす種々の長さの天然、組換えIFN−7またはIFN−γ関連ペプチドを
用いることによって展開することができる。これらの検定は、古典的なRIAや
EL I SA法に基づいている。
ミクロタイター・プレート、ストリップ、ウェルや他の固相サポートは、適当な
バッファー中、種々の温度で一晩インキユベーションするような公知の方法によ
り抗原をコートすることができる。コーティングに用いる抗原は、検出すべき抗
体によって蛋白質/ペプチド単独でもよいし、異なった抗原の混合物でもよい。
抗体は、血しょう、血清、脳を髄液、尿、唾液、組織培養液などの各種の資料中
で検出することができる。
抗原により資料をインキュベーションした後、結合抗体は、酵素共役抗血清また
はモノクローナル抗体を添加することによって検出することができる。この検定
では、伝統的な酵素トレーサー(ホース・ラディッシュ・ベロキシダーゼ、アル
カリ性フォスフェートなど)の全てを用いることができる。検定の感度は、アナ
ライト検出用のビオチン−アビジンやストレブタビジン系を用いることにより高
めることができる。最終的検出は、用いる酵素によって変わる基質溶液を添加す
ることによって行うことができる。
好ましい基質の例としては、O−フェニレンジアミン、テトラメチルベンチジン
、パラニトロフヱニレンフオスフェートなどがあげられる。結果は、目視や分光
光度計によって読み取ることができる。検定は、定性的、定量的のどちらも行う
ことができる。定量検定は、終点希釈標準曲線法や他の適当な方法により得るこ
とができる。
検定の原理は、抗体検出用のEL I SA検定の展開のために用いることがで
きる。特に、古典的または改造競合アッセイ、滴定アッセイ、直接または間接サ
ンドイッチ・アッセイ、!、捕獲アブセイなどの均質検定や不均質検定を採用す
ることができる。
EL I SAによる抗体の検出のために用いる同様な原理は、RIAや時分割
フルオロ免疫検定や異なったトレーサーを用いることによる検定により用いるこ
とができる。
現在、天然、組換えIFN−γを用いることにより得られる抗血清モノクローン
抗体は、組織培養液や生物学的資料中のrp’N−y検出用検定の展開に用いる
ことができる。アフィニティー・クロマトグラフィーや他の精製法により得たI
FN−γに対する精製抗体は、抗原検出検定の展開のために、抗血清モノクロー
ン抗体として、および/またはこれらの薬剤といっしょに用いることができる。
従来の方法の全てが、例えば、捕獲アッセイや競合免疫アッセイ(RI A、
EL I SA、 TR−F I Aなど)といった抗原検出検定の展開に適用
することができる。競合免疫アッセイを行うためには、天然組換えIFN−7や
IFN−7関連ペプチドを用いることができる。これらは、種々のトレーサー分
子と共役することができる。例えば、EL I SA法に適した酵素、RIA用
放射性材料、TRF I Aや他の免疫蛍光法用の蛍光分子、その他のトレーサ
ーと共役することができる。抗原の検出は、免疫蛍光法、フロー血球計算法や公
知の他の方法によっても得ることができる。
[ベプチ ド]
ペプチドを得るための一般的方法は、良く知られている。IFN−γのペプチド
は、種々の方法により得ることができる。
イ)天然または組換え蛋白質の酵素消化、化学分解(Arakawaら、 ”J
、Biol、Chew−’、Vol、261. 8534 (1986)。
Seelingら、”Biochem、−、Tol、 27.1981 (19
8g)参照)。
口)インビトロの酵素触媒合成(Mitin & Zapevalova。
−Int、 J、 Peptide Protein Res、−、Mo1.3
5.352 (199G)参照)。
ハ)類縁体の酵素改質。
二)組換え法による合成(Charbitら、”J、 1m5uno1.’。
Vol、 139.1658 (19g?)参照)。
ホ)コード化した配列の部位特異的突然変異誘発(runkel、 ”Proc
、 Na口、 Acad、 Sci、 [1,S、A、”、 Vol、 82゜
488 (1985)参照)。
へ)溶液ペプチド合成(Bodansky、 ’Pr1nciple or P
eptide 5ynthesis、 Springer−Verlag、 H
eidelberg−。
1984: Bodanky、 ”The Practice of Pept
ide 5yntbesis。
Springer−Verlag、 Heidelberg”’、 1984参
照)。
ト)固相ペプチド合成(5heppard、”5olid Phase Pe9
tide 5ynthesis−、IRL Press、 0xford (1
989)参照)。
チ)セグメント凝縮(Pettit、 ”5ynthetic Peptide
s”。
Vol、4. p、22 (1976)、Elsevier Amsterda
m参照) 。
す)一般に、上記方法の適当な組合わせの全て。
クローン化c D N Aのヌクレオチドに由来する成人ヒ)IFN−γの14
6−アミノ酸配列は、良く知られている( Gray等、−Nature−、T
ol、 295.503 (1982): Grey &Goedde1.”N
ature”、 Vol、 29J 859 (1982)参照)。
種々の長さのIFN−7関連ペプチドを合成することができる。例えば、我々は
、アミノ酸1(Cys)からアミノ酸146(G I n )にいたる自然rF
N−7−次配列をカバーする7ケのアミノ酸間隔での14の残基に及ぶ■FN−
γ関連ペプチドを得た(第3表参照)。このリストは、全てを意味するものでは
なく、ペプチドlから23(第3表参照)の配列下のより長いあるいはより短い
ペプチドを得ること、組み合わせること、ならびに天然ヒト抗TFN−γ抗体を
検出または精製するのに用いること(発明のペプチド配列)
但し、少なくとも5ケのアミノ酸が存在し、その一方、上限は明確ではないが、
実用的な理由によりその最大数は、約20に制限される。特に好ましいペプチド
は、第3表のNo、 1.2.3.9.1G、 11.13.14.15.21
.22である。IFN−γ関連ペプチドは、フリーの酸、アルコール、アミド、
エステル、ヒドラジドなどとしてC−末端機能や改造されたN−末端機能を持つ
ことができる。
N−末端機能を改造する方法としては、種々のものが知られており、その中で、
最も用いられるのは、アシル化、アルキル化などである。
IFN−γ関連ペプチドを形成するアミノ酸残基のいくつかのものは、保守的ま
たは非保守的方法によって、くり返されてもよいし、削除されてもよいし、また
置換されてもよい。例えば、IFN−7の生来の構造からのアミノ酸は、ミモト
ーブを形成するエピトープの三次構造をまねる他の非相関アミノ酸により置換さ
れてもよい。
また、アミノ酸残基は、擬イソテリツク・アミノ酸によって置き換えても良い。
さらに、メチオニンは、N−ロイシンやN−エチルノルロイシンによりて置き換
えることができる。関連する配列は、抗体に対するアフィニティーや安定性を向
上するために、ペプチド骨核に挿入することもできる。
また、ペプチドは、種々の糖類や改質糖分子によってグリコジル化をすることが
できる。ペプチドのグリコジル化については、多くの方法が知られている。また
、IFN−7のペプチドは、そのパブクボーン構造を変える方法によって改質す
ることができる。例えば、構造的束縛は、ペプチド鎖り−アミノ酸中にα−メチ
ルアミノ酸、プロリンや、他のアミノ酸を、例え改質されても挿入することによ
って得ることができる(例えば、1larshall &Ba5sbard、
−Circ、 Res、、 5upp1. ll−30″″、 Mo1.41.
143(1972)、 Mar+avalan & Momany、 ’Bio
polyver’、 Mo1.19゜1943 (1980)、 kladis
on & Kopple、 ”J、 Am、 Chew、 Soc、−。
Vol、 102.4855 (1980)参照)。
バックボーン改質の他の例としては、Huffsan & Ca1laphan
のC7擬態や、Freidingen、I[ahn & Keepのβ−擬態な
どがあげられる。例えば、Hufrman et al、(1988)。
ペプチド:化学および生物学、会報10、アメリカンペプチド シンポジウム(
llarsball、G、R,ed、) pp、 105−108、 ESCO
M、 Leiden; Freidingen、 (1981)ペプチド合成、
構造および機能、会報774アメリカンペプチドシンポジウム(Rich、 D
、H,& Gross、 E、、編)、l)L 673−783゜Pterce
Chemical Co、、RocMord、IL; Kahn (198g
) ペプチド、化学および生物学、会報10、アメリカンペプチド シンポジウ
ム (Marghall、 G、R,ed、) Pp、 109−111゜ES
COIl、 Leiden; Keep & Sun (19112)テトラヘ
ドロン レター; 23.3759゜
ペプチド結合を改質することができる。それにより、構造制限を誘発したり、例
えば、C′°7−二置換ペプチド、β−ジヒドロペプチド、チアペプチド、S−
アルキル化ペプチド、N−ヒドロキシル化ペプチド、ニトロソペプチドなどの、
N−C−Cバックボーン原子配列を変更することなく、−CO−NH−に対する
安定性を向上することができる。また、例えば、α−ヒドロキシまたはω−アミ
ノ酸含有化合物、[ψC11,0コ、[:ψC11(OH)Cut]、[ψC[
l、−N[+]、[ψCH=CHコを形成するような、トクーcバックボーン改
質によって変更を行うことができる。これらのペプチド代用物などを用いること
ができる。(Spatolg、 ”Chemistry and Bioche
*5try or As1no Ac1ds Peptides andPro
teins”、 Weinstein編、Mol、7.pp、 267−357
(1990)。
Dekker、N、Y、、McQuadaら、”5cience−、Mo1.
247. 454(199G)、 k!1llerら (1989)参照)。命
名法については、例えば、”IUPAC−IUB Com5ission in
Biochesical Womenclature (1984) Eur
opean J、 Bioct+s、、 IH19を参照することができる。一
方、IF’N−γ関連ペプチドは、均質な環状ペプチド、不均質な環状ペプチド
、例えば、N−Cl5C→C1C→C1、N →C、C−c’、NhN(7)二
環状系を形成する短、中、長範囲の閉環や、他の公知の方法によって構造的に制
限することができる(Toniolo。
″[nt、J、 Peptide Protein Res、−、Vol、 3
5.287 (1990)参照)。
ヌクレオチド、ヌクレオチド・デオシヌクレオチド・オリゴまたはポリヌクレオ
チド、リビド、グリコリピド、テルペンならびにそれらの類縁体は、IFN−7
関連ペプチド配列に導入することができる。
リビド、グリコリピド、テルペンおよびこれら化合物の適当な誘導体は、IFN
−γ関連ペプチドと結合することができる。また、IFN−1関連ペプチドは、
公知の種々な方法によって得られる改質又は非改質ペプチドの種々の組合わせに
よって形成することができる。
[キャリヤー]
ペプチドは、種々の目的(例えば、サポートとの結合の促進)のために、適当な
キャリヤーと結合して結合体を形成することができる。当業界で公知の種々の血
清アルブミン、破傷風トキソイド、キーホール・リンベット・ヘモシアニン(K
L)()等のキャリヤーを用いることができる。
ペプチド−蛋白質結合体は、基本的には、対称的は非対称的二官能性薬剤を使用
することによって得ることができる。これらは、最終の結合体に含ませてもよい
し、他のものとの結合のための一分子の反応性部位を活性化してもよい。
このような結合を得るための方法としては、多数のものが知られており、それら
は、グルタルデヒド、ビスイミドエステル、カルボジイミド、イミドエステル、
トルエンジイソシアネート、p−ニトロベンゾイルクロリド、ヒスタミンジヒド
ロクロリド、MBS (マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシサクシミド)な
どを含む。ペプチドにおけるキャリヤー分子の付着点は、ペプチド構造や立体要
件によって異なる。もし、ペプチドがスルホヒドリルを持たない時には、ミステ
ィン残基の添加によって提供することができる。これらの薬剤は、これらと、一
方の側でのペプチドミスティン残基との間でのジスルフィド結合、リジンのε−
アミノ基又は他のフリーのアミノ基を通してのアミノ結合を作ることができる。
種々のジスルフィド/アミド形成剤が知られている(−1霞■un。
Rev、”、 Vol、 62.185 (1982)参照)。他の二官能性結
合剤は、ジスルフィド結合よりもチオエーテルを形成する。
rFN−7関連ペプチドのキャリヤー分子への結合は、非共有結合によって行う
ことができる。例えば、疎水性ポケットの疎水性ドメインを通して、ペプチドを
キャリヤー蛋白質に結合することができる。
[精 製]
IFN−7に対するヒト天然抗体は、血しょう、血清、尿、唾液、すでに精製さ
れたヒト免疫グロブリン製剤を含む種々の資料から精製することができる。ヒト
免疫グロブリンは、種々のクラス(IgM、IgG、IgA。
IgD、IgE)を含む。これらは、生来の構造でもよいし、公知の実験条件に
より変性してもよい。また、免疫グロブリンのフラグメント(F(Abl)z、
Fab、Fλb’、FV)を結合する抗原を含んでもよい。免疫グロブリンのフ
ラグメントを結合する抗原は、化学的方法、酵素的方法や、ミニ抗体などの組換
えDNA手法によって得ることができる。
IFN−7に対するヒト天然抗体は、公知のアフィニティー手法により、サポー
トに結合した特定の結合分子としてIFN−7又はIFN−γ関連ペプチドを用
いることによって精製することができる。
多数の手法の内の一つは、アフィニティー・クロマトグラフィーである。
IFN−γ関連ペプチドは、アガロース、シリカケル、ポリアクリルアミド等の
公知のマトリックスと結合することができる。
マトリックスとのペプチドの結合は、スペーサーアームの介入によってマトリッ
クス上およびペプチド上の官能基を架橋することによって達成することができる
。最も一般的には、スペーサーアームは、マトリックスとペプチド間の架橋を形
成することのできる官能基を備えた直鎖の脂肪族C6−C8鎖である。親水性化
合物(即ち、アルコール)と疎水性化合物(即ち、ベンゼン環又は他のグループ
を含むスペーサーアーム)の両者を用いることができる。スペーサーアームの代
わりに、キャリヤー分子を使用することができる。
マトリックスへの付着にともなうペプチドの変性を防ぎ、この方法を助長するた
めに、マトリックスを予備的に活性化することが有効であり、これによって、マ
イルドな条件下、引き続くリガンドの結合を行うことができる。活性化は、マト
リックスと活性化合物間の化学反応であり、それによって、マトリックスの表面
に、リガンドの基(通常は請求核性の基で、例えばアミノ基)と容易に組合わさ
れる反応基(通常は、親電子性基)を生成する。反応基としては、イミドカルボ
ン酸塩、オキシラン(エポキシ活性)、トリクロロトリアジン、0−イミダゾリ
ルカルボニル等が知られている。ブロモ酢酸のN−ヒドロキシサクシミドエステ
ルとの反応により、末端アミノ基を持つスペーサーアームを活性化することがで
き、それにより高反応性アルキル化剤を得ることができる。
スペーサーアームを持つマトリックスを用いることにより、例えば、活性部位が
、フリーのスルホヒドリル基マトリックスとのペプチドの結合は、スペーサーア
ームの介入によってマトリックス上およびペプチド上の官能基を架橋することに
よって達成することができる。最も一般的には、スペーサーアームは、マトリッ
クスとペプチド間の架橋を形成することのできる官能基を備えた直鎖の脂肪族C
6−C8!llである。親水性化合物(即ち、アルコ・−ル)と疎水性化合物(
即ち、ベンゼン環又は他のグループを含むスペーサーアーム)の両者を用いるこ
とができる。スペーサーアームの代わりに、キャリヤー分子を使用することがで
きる。
マトリックスへの付着にともなうペプチドの変性を防ぎ、この方法を助長するた
めに、マトリックスを予備的に活性化することが有効であり、これによって、マ
イルドな条件下、引き続くリガンドの結合を行うことができる。活性化は、マト
リックスと活性化合物間の化学反応であり、それによって、マトリックスの表面
に、リガンドの基(通常は請求核性の基で、例えばアミノ基)と容易に組合わさ
れる反応基(通常は、親電子性基)を生成する。反応基としては、イミドカルボ
ン酸塩、オキシラン(エポキシ活性)、トリクロロトリアジン、 −イミダゾリ
ルカルボニル等が知られている。ブロモ酢酸のN−ヒドロキシサクシミドエステ
ルとの反応により、末端アミノ基を持つスペーサーアームを活性化することがで
き、それにより高反応性アルキル化剤を得ることができる。
スペーサーアームを持つマトリックスを用いることにより、例えば、活性部位が
、フリーのスルホヒドリル基と容易に反応するヨードアセチル基であるスルホ結
合カップリングゲルを使用することができる。
また、例えば、トリアジン染料樹脂を用いることにより、非共有結合によって、
IFN−7関連ペプチドをマトリックスに結合することもできる。
一方、■FN−γに対する精製されたヒト抗体をサポートに結合することにより
、IFN−1の認識された形をアフィニティー精製することができる。
抗体と、アフィニティーマトリックスに対するIFN−γとのアフィニティー結
合は、生物特異性相互作用にとって好ましくない条件を作り出すこと、又は競合
アフィニティー溶出の手段によって直接こわすことができる。
[治 療コ
マウス抗IFN−γ抗体は、同種腫よう細胞の拒絶を防止し、Shwartzm
an関連反応を抑制し、自己免疫疾患の自然展開に対してNZBマウスを保護す
ることが分かった。(例えば、Landolfoら、−3cience@、 V
ol、229.176(1985)、B111iau、 −1mmunol、
Today″″、 Yol、9.37(19gg)、Jacobら、−J、 E
xp、 led、”″、Vol、 166.798 (1987)を参照)。
IFN−γに対する精製されたヒト抗体は、臨床に用いることができ、これによ
り、特定のIFN−γアンタゴニストとして、IFN−γにより誘発される生理
的応答、より具体的には、免疫または自己免疫プロセスの調節に含まれる応答に
対して選択的に免疫抑制する。蛋白質の場合、抗体を非経口的、好ましくは静脈
内に投与する。これらは白血球細胞と反応し得るので、慣用のIV投与セットか
皮下貯蔵の何れかによってゆっくりと投与することが好ましい。人や異なった疾
患への投与量は、処理すべき疾患のしるしであるパラメータを消滅させるに際し
、抗IFN−γ抗体の効果を判定することによって決定される。Jacobらの
”J、 Exp、 Med、−1VoL 166゜768 (1988)の経験
ならびに抗体の天然クリアラントを考慮して、特定の疾患により、ヒト抗IPN
−γ抗体の投与量は、周期的にくり返さなくてはならない。予防として用いる場
合、ニケ月、半年、または−年に1回の割合で、ヒト抗IFN−γ抗体を短期間
投与することができる。既存の疾患を処理する際には、輸液装置を用いて、もっ
とひんばんに抗体を投与することが望まれる。IFN−γレベルの高める特異な
環境因子によって引き起こされるか悪化することが知られている自己免疫疾患の
場合、投与養性法が設定される。
非経口的投与の場合、ヒト抗IFN−7抗体は、非毒性の非治療的に許容される
非経口ビヒクルとともに注射調剤(溶液、懸濁液、乳液)に製剤する。非水溶性
ビヒクルも用いることができる。ビヒクルは、等張力性、化学的安定性を高める
物質を含むことができる。抗体は、約0.5−20■g/mlの範囲の濃度で、
実質的には凝集物や他の蛋白質を含まない純粋な形に製剤することが好ましい。
[実施例]
本発明を、下記実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲
を限定するものではない。本開示により、特許請求の範囲の中で種々の様態があ
ることは、当業者には明らかである。
■、アフィニティー精製されたヒト抗IFN−γ抗体による、天然、組換えIF
N−γ誘発Fcレセプター及びHLA−DR抗原の抑制
天然または組換えIFN−γを含む培地でインキュベートした時、U937細胞
は、表面でFcレセプターとHLA−DR抗原を増加する。IFN−7を200
U/mlノ濃度で用いた場合、最大効果は、通常24時間で達成される。
第1図に示したように、IFN−7により刺激されたU937細胞培養において
、アフィニティー精製したヒト抗IFN−7抗体が存在する時、これら抗体は、
FcレセプターやHLA−DR抗原における予想された増加を劇的に抑制した。
抑制は、投与量に依存することが分かり(第4表)、ヒト抗IFN−7抗体を4
.8μg/腸lの濃度で加えた場合、最大効果が得られた。同時に、コントロー
ルとして、非関連精製ヒト免疫グロブリンをIFN−γ処理U937細胞培養に
加えた時、抑制効果は得られなかった。
U937におけるFcレセプター部位(A、B、C)とHLA−DR抗原(A
’、B ’、C’) ノ発現は、フロー血球計算分析により評価した。
連続線:TFN−7の非存在下に設定した培養。
点線:IFN−γの存在下(A、A’)、IFN−7とヒ)・抗IFN−γ抗体
の存在下(B、B’) 、I FN−7とヒト非関連免疫グロブリンの存在下(
C、C’)に設定した培養。
肛表
(I F N−γ*により刺激されたU937細胞におけるFcレセプター及び
HLA−DR抗原の発現について、異なった濃度で加えた場合のrlFN−γに
対する天然ヒト抗体の効果)
Fcレセプター HLA−DR
発現U937 抑制 発現U937 抑制培養への添加 縛脚扮!、 (%)
細胞の% yIFN−γに対する
抗体くμg/膳l)
0 83 − 74.1 −
0.60 84.2 0 71.4 3.71.20 60 27.8 47.
4 36.12.40 30.4 63.4 13.6 81.74.80 8
,4 89.9 1,2 98.4非関連抗体
*: U937細胞培養を200UのrIFN−7で24時間刺激し、同時に、
異なった濃度のヒト抗IFN−γ抗体で処理又は非処理、または精製ヒト非関連
1gで処理。
7日目、混合リンパ球培養は、著しい増殖をもたらす。
培養開始時、ヒト抗IFN−γ抗体の添加は、〔3H〕チミジンの著しい取り込
み低下をもたらした。ヒト抗IFN−γ抗体の抑制力は、抗体の濃度の低下にと
もなって、しだいに失われた(第5表)。策2図は、IFN−γに対して特異的
なヒト抗体を0日目、1日目に加えた時、リンパ球増殖が抑制されたことを示す
。同じ抗体をその後加えた時(2日目、3日目、4日目)、増殖応答における抑
制は、観察されなかった。精製ヒト抗TFN−γ抗体を、混合リンパ球培養の開
始時、1日目、2日目、3日目、4日目に4.8μg/ウェルの濃度で加え、6
日目に18時間、〔3H〕チミジンパルスを加えた。
鼾1
(同種誘発されたリンパ球増殖”について、異なった濃度で加えた場合のヒト抗
IFN−γ抗体の効果)
〔3H〕チミジン
適用量 抑制
隻暑公の添加 (cps±SD) 工艶Σ例No、I
IFN−γに対する抗体
(μg/ウェル)
0 7202±422 −
4.80 216±64 97
2.40 4837±312 32.91.20 7485±453 0
0.607334±375 0
非関連抗体
(μg/ウェル)
4.80 7180±483 0.3
例No、2
IFN−γに対する抗体
(μg/ウェル)
0 6182±283 −
4.80 374±77 94
2.40 5196±188 16
1.20 6327±312 0
0.605986±507 3.2
非関連抗体
*: 照射された同種FBI、と混合したリンパ球をリスボンダー:ステイミュ
レータ−1:lの比で、培地単独、IFN−γに対するヒト抗体を異なった比で
含む培地、非関連ヒト抗体の培地でインキュベート。増殖応答は、7日目、〔3
H〕チミジン・パルスを18時間加えた後測定。
第3図は、PHA−刺激PBL又はに562細胞について評価した、混合リンパ
球培養の細胞障害応答についての代表的実験を示す。 ヒト抗IFN−γ抗体の
存在下に設定された培養から回収したエフェクター細胞の細胞障害は、PHA−
刺激PBLに対して強く低減した。一方、ヒト抗IFN−7抗体は、K562細
胞に対する細胞障害性リンパ球の発生について適度の影響しかもたらさなかった
。他の実験では、K562細胞に対する細胞障害活性は、コントロール培養に比
較して、1G−20%しか低減しなかった。
PBLは、インビトロで照射された同種PBL活性化した。混合リンパ球培養の
開始時、48μg/ウェルの濃度で、IFN−7(・)に対する精製ヒト抗体、
非関連精製ヒト免疫グロブリン(○)を加えた。PBL (−)は、中間を保っ
た。ターゲット細胞は、PHA刺激リンパ球(A)とK 562 (B )であ
る。
■、スペーサーアームを通してペプチドNo、22(第3表)に架橋したアガロ
ースマトリックスにおけ6hト抗IFN−7のクロマトグラフィー
N−末端にL−システィンを備えたペプチドNo、22(2I1g)をPIER
CE推しようの標準プロトコールに従って、スルホ結合カップリングゲル(PI
ERCE)2mQと結合した。アフィニティーカラムをEPLC装置(PHAR
MACIA)に接続し、リン酸塩バッファー生理食塩水(PBS)により平衡化
した。精製ヒト抗体(50mg)を、0.1+el/min、の流量でカラムに
加え、0.1Mグリノン(pH3,0)によって同流量で結合抗体を溶出した。
第4図は、アフィニティーマトリックスに結合した抗体の溶出の典型的なパター
ンを示す(ビーフ2)。
IFN−γと特異的に反応し、IFN−γ関連ペプチド系アフィニティーカラム
で精製された抗体が免疫グロブリンであり、組換えIFN−γと反応することが
、ウェスタンプロット分析により確認された。第5図は、トレーサーとして1!
5I−共役ヤギ抗ヒトIgを用いて、変性抗IFN−7抗体を、25.000と
50,000の分子量の2ケの反応帯で認識した。それぞれ、免疫グロブリンの
軽鎖であった(a)。同時に、これらの抗体は、分子量16.000と32.(
100の組換えIFN−y蛋白質(Hofff+ann−La Roche)と
反応することができた(b)。精製ヒト抗体の組換えIFN−γ抗体の特異性は
、市販の抗IFN−γモノクローン抗体(Boehringer)の反応性との
比較によって確認された(g)。ヒト抗IFN−γ抗体は、天然I F N −
a (Dr、 Karil:artellの寄11’)(b)、天然IFN−β
(Setono) (c)、組換えI F N −a (Bofffann−L
aRoche) (e)、組換えインターロイキン−2(Boehringer
)(r)とは反応しなかった。
■1人血清における抗IFN−7抗体検出用EL I SAポリスチレン・ミク
ロ滴定プレートのウェルを、IFN−γ関連ペプチドと組換えJPN−1でそれ
ぞれコートした。資料中の特定抗IFN−7抗体の量を定量するために、ネガテ
ィブコントロールと、一連のポジティブコントロールを各検定に含めた。ポジテ
ィブコントロールは、l、 25.30.50.60.100の任意の抗体単位
(AU)を与えた。これらのコントロールの吸着を意味する標準曲線を各テスト
毎にプロブトした。各テスト資料は、かかる標準曲線に基づいてAUの値を与え
た。88の血清資料のパネルを、IFN−γ関連ペプチド(ペプチドNo、3)
に基づ< EL I SAと、固相における抗原としての組換えIFN−γに基
づ<RIAとからの結果の相関関係を研究するために使用した。第6図に示すよ
うに、ELISAとRIAの相関関係は、非常に高く、直線回帰線によって示さ
れる理論値から±ISD内の結果の相関係数0.94.80.5%を示した。
[用 途]
本発明の種々の様態は、ヒト抗IFN−γ抗体の検出、定量、精製に有用であり
、自己免疫疾患、より一般的には、活性細胞仲介免疫の抑制を必要とする疾患を
もった人の治療に対して有効である。
FIG、1
FIG、2
FIG、3
o、o、 y。
吃妬一
FIG.5
RIA
補正書の写しく翻訳文)提出書
(特許法第184条の8)
平成4年2月10日
Claims (11)
- 1.ガンマインターフェロン(IFN−γ)の配列に対応する5乃至20のアミ ノ酸を持つペプチド。
- 2.下記のグループから選ばれる特許請求の範囲第1項のペプチド。 1【配列があります】(aa.1−14)。 2【配列があります】(aa.7−20)。 3【配列があります】(aa.13−28)。 4【配列があります】(aa.19−32)。 5【配列があります】(aa.25−38)。 6【配列があります】(aa.31−44)。 7【配列があります】(aa.37−50)。 8【配列があります】(aa.43−56)。 9【配列があります】(aa.49−62)。 10【配列があります】(aa.55−68)。 11【配列があります】(aa.61−74)。 12【配列があります】(aa.67−80)。 13【配列があります】(aa.73−86)。 14【配列があります】(aa.79−92)。 15【配列があります】(aa.85−98)。 16【配列があります】(aa.91−104)。 17【配列があります】(aa.97−110)。 18【配列があります】(aa.103−116)。 19【配列があります】(aa.109−122)。 20【配列があります】(aa.115−128)。 21【配列があります】(aa.121−134)。 22【配列があります】(aa.127−140)。 23【配列があります】(aa.133−146)。
- 3.血清中の抗IFN−γ抗体を決定するために特許請求の範囲第1項又は2項 に記載されたペプチドを用いる方法。
- 4.決定が、RIA,ELISA,蛍光免疫検定法によって行われる特許請求の 範囲第3項に記載された方法。
- 5.抗IFN−γ抗体のアフィニティー精製のために特許請求の範囲第1項又は 2項に記載されたペプチドを用いる方法。
- 6.IFN−γによって誘発される病源応答の選択的免疫抑制に有効な条件の処 理のための医薬の調製にヒトIFN−γ抗体を用いる方法。
- 7.条件が、タイプI糖尿病、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、アジュバント関節炎 、Schwartmann反応、遅延型過敏症、または同種移植拒絶である特許 請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.抗IFN−γ抗体を有効成分として含む製薬組成物。
- 9.単位調剤である特許請求の範囲第7項記載の製薬組成物。
- 10.天然又は組換えIFN−γの精製にヒト抗IFN−γ抗体を使用する方法 。
- 11.IFN−γの免疫検定に、ヒト抗IFN−γ抗体を使用する方法。
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1990
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