CN115176157A - 用于检测抗干扰素γ抗体的免疫层析方法及试剂盒 - Google Patents

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CN115176157A CN202180017176.6A CN202180017176A CN115176157A CN 115176157 A CN115176157 A CN 115176157A CN 202180017176 A CN202180017176 A CN 202180017176A CN 115176157 A CN115176157 A CN 115176157A
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Abstract

本公开提供一种检测抗IFN‑γ抗体在从对象获得的体液样品中的存在的装置。该装置可包括:接收包含体液样品的溶剂相的沉积的采样区;浸渍有多个包含标记有生物素的第一重组IFN‑γ及附有信号部分的第一抗体的第一复合物的反应区,第一抗体通过结合至所标记的生物素上而偶联至第一重组IFN‑γ,以形成第一复合物;以及具有固定于其上的多个第二重组IFN‑γ的测试区。采样区、反应区以及测试区自层析固相的第一端向第二端连续设置。

Description

用于检测抗干扰素γ抗体的免疫层析方法及试剂盒
技术领域
本公开涉及一种基于免疫层析的测试装置,用于检测从对象获得的生物样品,优选体液样品中任何抗干扰素γ(IFN-γ)抗体的存在。此外,本公开还公开一种基于免疫层析法检测对象的生物样品中任何抗IFN-γ抗体的存在的方法。所公开的装置和方法可用于检测抗IFN-γ抗体的存在。
背景技术
干扰素γ(IFN-γ)为一种通过产生1型CD4+辅助性T细胞(Th1)淋巴细胞、CD8+细胞毒性淋巴细胞及自然杀伤(NK)细胞而激活先天性及特异性免疫所需的细胞因子。B细胞、自然杀伤T(NKT)细胞及专职性抗原提呈细胞(APC)等细胞可分泌IFN-γ。干扰素保护细胞免受外来微生物的侵袭,调节人体免疫系统的各种机制,并且抑制病毒、细菌及致癌作用的活性(米勒·CH,马厄·SG,杨·HA,干扰素γ的临床使用,纽约科学院年报,2009,1182:69~79;施罗德·K,赫尔佐格·PJ,拉瓦西·T,休谟·DA,干扰素γ:信号、机制及功能概述,白细胞生物学杂志,2004,75:163~89)。先前研究还表明,IFN-γ具有抗病毒活性。因此,作为抗病毒治疗开发的理想候选物,其已得到彻底的研究。此外,已发现,IFN-γ还具有抗癌作用。虽然机制尚不完全清楚,但IFN-γ在细胞分裂过程中对正常细胞和癌细胞均表现出抑制作用。考虑到癌细胞的分裂快于正常细胞,IFN-γ的抑制作用有望对癌细胞具有更大影响,并同时直接影响自然杀伤细胞对癌细胞的进一步侵袭。
此外,IFN-γ还被用于通过刺激动物而产生针对其自身的单克隆抗体,此类单克隆抗体随后用于酶联免疫吸附试验(ELISA)系统或干扰素γ释放试验(IGRA),以进行结核感染的诊断(阿尔法·MJ,登宾斯基·JJ,杰伊·FT,针对重组人干扰素γ的单克隆抗体的生产:无需纯化抗原的杂交瘤筛选,杂交瘤,1987,6:509~520;诺维克·D,艾希哈·Z,费歇尔·DG,弗里德兰德·J,鲁宾斯坦·M,针对人干扰素γ的单克隆抗体:生产、亲和纯化及放射免疫分析,欧洲分子生物学学会会刊,1983,2:1527~1530;乔里斯·SJ,库切·D,托罗·PL,奥斯汀·J,斯坦因·Z,萨德尔·W,一种用于结核病诊断的新型γ干扰素释放试验的敏感性分析及潜在用途,临床微生物学杂志,2006,44:2844~2850)。IFN-γ已同时用于基础研究及包括诊断试剂盒生产在内的药用用途开发中的研究。然而,以抗IFN-γ抗体的单克隆抗体制造的诊断试剂盒可能会因生产成本较高而较为昂贵。虽然重组干扰素γ(recombinant IFN-γ)能够在使用大肠杆菌(E.coli)细胞、哺乳动物细胞、酵母、原生动物或植物细胞当中至少一种的系统中进行生产,但是使用细菌的生产系统已知不但具有最高的产量,而且生产成本一般相对较低。
近年,已开发出用于辅助医学诊断和筛查的IFN-γ测试与检测方法。例如,申请号为CN103869084A的中国专利申请公开一种针对IFN-γ的抗体,该抗体可用于基于双抗体夹心ELISA的ELISA系统,其中,所使用的两种抗体结合至IFN-γ分子的不同位置,从而实现IFN-γ检测的发展。虽然上述中国专利申请中公开的抗体确实实现了对针对IFN-γ的抗体进行检测的目的,但是其中使用的平台远未达到被视为方便且对用户友好的程度。正如上述中国专利申请中公开的一样,由于患者体内抗IFN-γ抗体的筛选需要进行使用微量滴定板、流式细胞术、不同试剂等的常规ELISA,因此可能导致类似测试无法在实验室环境之外且/或在缺乏经过训练的实验室技术人员的情况下进行。因此,一种允许未经训练的人员在无任何获得实验室工具的可能性的情况下进行此类测试且能够在可接受的运行时间内得出高可靠性结果的替代平台将得到极大的青睐。
发明内容
本公开旨在提供一种用于检测抗IFN-γ抗体在得自对象的血液样品等体液样品中的存在的装置或测试试剂盒。优选地,所公开的装置或测试试剂盒利用免疫层析法提供所需要的结果。
本公开的另一目的在于提供一种用于筛选抗IFN-γ抗体的测试试剂盒,其能够在无需使用任何实验室工具的情况下且在实验室环境之外得出测试结果。如此,与常规ELISA平台相比,所公开的测试试剂盒对用户相对较为友好。
此外,本公开的另一目的在于提供一种能够以相对较低的成本制造的用于筛选抗IFN-γ抗体的测试试剂盒。具体而言,所公开的测试试剂盒的组装体内使用的IFN-γ为由相容细胞系表达且自其获取的重组肽。
本公开的另一目的涉及一种利用配备有重组IFN-γ的免疫层析平台筛选抗IFN-γ抗体在体液样品内的存在的方法。
本公开的一个方面涉及一种检测抗IFN-γ抗体在从对象获得的体液样品中的存在的装置。总体而言,该装置包括:接收包含体液样品的溶剂相的沉积的采样区;浸渍有多个包含标记有生物素的第一重组IFN-γ及附有信号部分的第一抗体的第一复合物的反应区,第一抗体通过结合至所标记的生物素而偶联至第一重组IFN-γ,以形成第一复合物;具有固定于其上的多个第二重组IFN-γ的测试区。优选地,采样区、反应区以及测试区自层析固相的第一端向第二端连续设置。
对于所公开装置的若干实施方式,溶剂相与体液样品内存在的抗IFN-γ抗体一起从固相的第一端向第二端迁移,以使得第一复合物在反应区附于抗IFN-γ抗体上而形成第二复合物,而且第一复合物和第二复合物进一步迁移进入测试区,在该处,第二复合物结合至所固定的第二重组IFN-γ上,以向其提供第一视觉信号。在测试区建立的第一视觉信号指示抗IFN-γ抗体在体液样品内的存在。
对于更多实施方式,所公开的装置进一步包括锚定于其上且构造为结合至第一抗体上的底物的对照区。该对照区在层析固相上紧邻测试区设于其后。
对于所公开装置的其他实施方式,在测试区未结合的第一复合物和第二复合物进一步迁移进入对照区,在该处,第一复合物和第二复合物通过第一抗体结合至底物上,以向其提供第二视觉信号。
在若干实施方式中,所公开的装置进一步包括连接至形成第二端至少一部分的对照区一端的吸收元件。优选地,该吸收物为纤维素纤维片、滤纸及纸浆中的任何一者或组合。
在所公开装置的一些实施方式中,第二重组IFN-γ和/或所述底物固定于合成膜上。
根据更多实施方式,所公开装置的信号部分为金纳米颗粒(AuNP)、荧光或量子点。
本公开的另一方面涉及一种检测抗IFN-γ抗体在从对象获得的体液样品中的存在的方法。该方法重要包括如下步骤:在采样区接收包含体液样品的溶剂相的沉积;引导溶剂相与体液样品内存在的抗IFN-γ抗体一起进入反应区,反应区浸渍有多个包含标记有生物素的第一重组IFN-γ以及附有信号部分的第一抗体的第一复合物,第一抗体通过结合至所标记的生物素而偶联至第一重组IFN-γ,以形成第一复合物,第一复合物构造为在反应区附于抗IFN-γ抗体上而形成第二复合物;以及引导溶剂相与所形成的第二复合物和第一复合物一起进一步移动进入具有固定于其上的多个第二重组IFN-γ的测试区,第二复合物构造为结合于所固定的第二重组IFN-γ上,以向其提供第一视觉信号。优选地,采样区、反应区以及测试区自层析固相的第一端向第二端连续设置。
根据所公开方法的若干实施方式,在测试区建立的第一视觉信号指示抗IFN-γ抗体在体液样品内的存在。
对于一些实施方式,所公开的方法可进一步包括引导溶剂相进一步进入包含锚定于其上且构造为结合至第一抗体上的底物的对照区的步骤,对照区在层析固相上紧邻测试区设于其后,在测试区未结合的第一复合物和第二复合物迁移进入对照区,在该处,第一复合物和第二复合物通过第一抗体结合至底物上,以向其提供第二视觉信号。
附图说明
图1为所公开的基于双抗原夹心ELISA检测从对象获得的生物样品中的抗IFN-γ抗体的装置和方法中使用的一般原理的示意图;
图2为本公开(a)所公开的装置的一种实施方式的一般设置方式以及该装置用于分别提供(b)阳性结果以及(c)阴性结果的相应构造的示意图;
图3为以采用抗His标签单抗的间接ELISA进行的重组IFN-γ分析结果图;
图4为以采用抗IFN-γ单抗的间接ELISA进行的重组IFN-γ分析结果图;
图5为以双抗体夹心ELISA进行的重组干扰素二聚体分析结果图;
图6为以采用活动性AOID(A)组和非活动性AOID(I)组的间接ELISA对20名患者的AOID患者血清进行的抗IFN-γ检测结果图;
图7为以采用活动性AOID(A)组和非活动性AOID(I)组的临界值为0.17的双抗原夹心ELISA对20名患者的AOID患者血清进行的抗IFN-γ检测结果图;
图8为通过采用活动性AOID(A)组和非活动性AOID(I)组的光密度归一化在间接ELISA和双抗原夹心ELISA之间对20名患者的AOID患者血清进行的抗IFN-γ检测比较图;
图9所示为通过进行直接斑点印迹试验由胶体金(CGC)标记的山羊抗生物素和生物素化IFN-γ复合物实现的信号建立;
(a)CGC标记的山羊抗生物素与1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL不同浓度生物素化IFN-γ反应后的阳性可视斑点;
(b)将重组IFN-γ滴加至1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL不同浓度生物素化IFN-γ后的阴性可视斑点;
(兔抗山羊IgG和PBS分别用作阳性对照和阴性对照);
图10所示为所公开装置的一种在测试区的测试线上涂覆浓度为1.0mg/mL和0.5mg/mL的重组IFN-γ的实施方式分别针对磷酸盐缓冲生理盐水(对照)、混合阳性血清(1~5号)及混合阴性血清(6~10号)进行的浸渍试验的结果。
具体实施方式
下文中,将根据优选实施方式,并参考相应说明内容和附图,对本公开进行描述。然而,需要理解的是,对本公开优选实施方式的说明内容及附图的参考仅旨在便于对所公开的各种实施方式进行论述,而且可以设想得到,本领域技术人员可在不脱离下附权利要求书范围的情况下,想出各种修改内容。
就本文中的使用而言,“在各实施方式中”这一短语是指,在一些实施方式中,但并不一定在所有实施方式中。
就本文中的使用而言,“大约”或“约”两词在组分浓度、条件、其他测量值等的语境中是指,所陈述值的±5%,或所陈述值的±4%,或所陈述值的±3%,或所陈述值的±2%,或所陈述值的±1%,或所陈述值的±0.5%,或所陈述值的±0%。
本文具体实施方式部分中使用的“可检测部分”,“信号部分”,“报告部分”和/或“报告物”是指能够通过释放可由装置或肉眼检测的信号而揭示所形成的抗原-抗体复合物的存在且进而确证目标化合物、分子、测试对象的患疾状态的化合物。所述信号的形式可以为低频波,或者因如ELISA或其所衍生的任何其他改进方法中的底物-酶活性而发生的颜色变化。
在说明书中,“重组干扰素γ”或“重组IFN-γ”两词可互换使用,是指从一种或多种经基因工程改造且被赋予分泌或生产IFN-γ能力的细胞系获取的人造IFN-γ。
参考图1和图2,本公开的一个方面涉及一种检测从对象获得的体液样品中抗IFN-γ抗体(30)的存在的装置。抗IFN-γ抗体(30)可以为IgG、IgM或IgA。该装置主要包括:供包含体液样品的溶剂相沉积的采样区(1);浸渍有多个第一复合物的反应区(2)或轭合区,第一复合物包含标记有生物素的第一重组IFN-γ(10)以及附有信号部分的第一抗体(20),第一抗体(20)通过结合至所标记的生物素上而与第一重组IFN-γ(10)结合,以形成第一复合物;以及具有固定于其上的多个第二重组IFN-γ(40)的测试区(3)。优选地,第一抗体(20)(抗生物素抗体)与信号部分的比例为0.1~0.5mg:0.5~5.0mL。
优选地,如图2所示,采样区(1)、反应区(2)及测试区(3)自层析固相的第一端向第二端连续设置。本公开中的层析固相可以为由不同材料以使得携带体液样品的溶剂相能够从采样区(1)经反应区(2)向采样区(1)移动且因而基于层析毛细作用渐进且固有地进行抗原ELISA的方式组装而成的复合材料。溶剂相和目标抗IFN-γ抗体(如有)构造为与预先沉积于固相上每一划定区域上的各种试剂接触并反应。固相优选包括:纤维素或塑料条带,其形成具有上述第一端和第二端的底层;覆盖底层表面的一部分的合成膜,用于构建测试区(3)以及与测试区(3)相邻的可选对照区(4);以及纳于第二端附近的吸收材料,用于吸收在通过所公开装置反应时间完成之前到达第二端的过量溶剂相。具体而言,重组IFN-γ以0.1~1.0μg的量沿测试区(3)内的测试线固定于合成膜上。对于一些实施方式,合成膜由玻璃纤维制成。在所公开的装置中,在位于测试区(3)上游的反应区(2)的表面上,第一复合物浸渍或设置于其上,以随时能够结合至以所公开装置测试的任何生物样品中所见的抗IFN-γ抗体(30)上。至于采样区(1),其形成所公开的装置的上述第一端或该第一端的一部分。溶剂相可以为对象的体液或该体液与一种或多种缓冲液的混合物,并用于通过沉积于其上而启动抗IFN-γ抗体的测试和/或检测。在一些实施方式中,体液可以为对象的血液样品或血清样品。体液可经过稀释处理或与其他试剂混合,以在溶剂相沉积于采样区(1)上后实现双抗体夹心ELISA。在所公开的装置的一些实施方式中,采样区(1)可配置过滤元件,以阻截体液中所见的较大细胞成分,使其无法向第二端移动。这些细胞成分可能会影响反应或测试结束后产生的结果。
如图2所示,溶剂相优选与体液样品中存在的抗IFN-γ抗体(30)一起从固相的第一端向第二端迁移,以使得在反应区(2),第一复合物附于抗IFN-γ抗体(30)上,从而形成第二复合物。因所制固相的材料、形状及尺寸,溶剂相在层析毛细作用的影响下,从第一端向第二端迁移。在通过反应区(2)后,未与任何抗IFN-γ抗体(30)结合的第一复合物以及所形成的第二复合物进一步迁移至测试区(3)内,在该处,第二复合物结合至固定的第二重组IFN-γ(40)上,以易于向其提供第一视觉信号。更具体而言,存在于体液样品内的抗IFN-γ抗体(如有)具有一对结合位点,每一结合位点可与第一重组IFN-γ(10)和第二重组IFN-γ免疫结合。为了使测试区(3)内的测试线发出视觉上可检测的信号,移入反应区(2)内的抗IFN-γ抗体(30)的其中一个结合位点反应结合至掺入预先沉积于反应区(2)的第一复合物内的第一重组IFN-γ(10)上,从而生成第二复合物。在反应区(2)下游,未反应或未结合的第一复合物及第二复合物与溶剂相一起在层析毛细作用下进一步迁移进入测试区(3)。在测试区(3),一个结合位点已附于所形成的第二复合物内的第一重组IFN-γ(10)上的抗IFN-γ抗体的另一结合位点免疫结合至锚定或固定于测试区(3)内的测试线上的第二重组IFN-γ(40)上。通过使第二复合物经与锚定的第二重组IFN-γ的结合而固定于测试线上,标记于第一抗体(20)上的信号部分在测试线处得到浓集,以累积发出强至足以优选被肉眼或相容信号读取装置看到或观察到的信号,从而保证对测试体液样品内抗IFN-γ抗体(30)的检测。优选地,固定的第二重组IFN-γ(40)与第一复合物的摩尔比为1:1至1:10。
根据一些实施方式,信号部分为金纳米颗粒(AuNP),而设置信号部分的第一抗体(20)为AuNP标记的抗生物素抗体(20)。测试区(3)产生第一视觉信号时,表明体液样品内存在抗IFN-γ抗体(30)。或者,体液样品内可不存在任何抗IFN-γ抗体(30),而即使在所公开的装置完成测试后,测试区(3)也不产生第一视觉信号。在所公开装置的若干实施方式中,信号部分可选自金属颗粒(即AuNP或胶体金、金/银、铂等)、荧光或量子点。
如上所述,所公开的装置可进一步包括固相上位于测试区(3)下游的对照区(4)。需要注意的重要一点是,与测试区(3)一样,对照区(4)也位于合成膜上。如图2所示,合成膜的平坦表面允许对第一抗体(20)或抗生物素抗体具有亲和力的底物(50)按照与将第二重组IFN-γ(40)永久设置于测试线上的方式类似的方式永久锚定于对照区(4)内的对照线上。更具体而言,所公开的装置进一步包括对照区(4),该对照区(4)包含锚定于其上且用于结合至第一抗体(20)上的底物(50),对照区(4)在层析固相上紧邻测试区(3)设于其下游。对于若干实施方式,底物(50)可以为以0.5~1.0μg的量固定于对照线(4)上的兔抗山羊IgG,而第一抗体(20)为山羊来源的抗体,以使得底物(50)对第一抗体具有所需的免疫亲和力。更具体而言,所公开装置的一些实施方式在将第一复合物浸渍于反应区或轭合区(2)上之前,使AuNP标记的山羊抗生物素抗体或第一抗体(20)以0.1~0.5mg的量与浓度为1~500μg/mL的生物素化IFN-γ(10)反应,以形成第一复合物。在测试区(3)下游,未在测试区(3)结合的第一复合物与第二复合物进一步迁移进入对照区(4),在该处,第一复合物和第二复合物通过第一抗体(20)结合在底物(50)上,以向其提供第二视觉信号。同样地,信号部分在对照线处得到浓集,而浓集后的信号部分累积提供强至足以可被肉眼或相容信号读取装置检测到的信号。即使测试体液内不存在抗IFN-γ抗体(30),来自反应区(2)的第一复合物也将必然在不与锚定的第二重组IFN-γ(40)结合且因此不产生第一视觉信号的同时与溶剂一起流过测试区(3)后到达对照区(4),并被其内锚定的底物(50)捕获。最为优选地,对照线设置为无论测试体液样品内是否存在抗IFN-γ,均将发出第二视觉信号,以确证第一视觉信号的缺失或针对抗IFN-γ检测所得的阴性结果并非所公开装置的缺陷所致。对照线用作所公开装置的阴性对照。
对于一些实施方式,底物(50)可以为在免疫学上对第一抗体(20)有效的第二抗体,以能够在含第一抗体(20)的第一复合物和/或第二复合物与对照线或对照区(4)接触时,将其有效捕获。更为优选地,固定的第二重组IFN-γ(40)与底物(50)的摩尔比为1:2至1:10。
对于若干实施方式,所公开的装置具有合成膜,该合成膜具有设于塑料条带或纸条带上的测试区(3)测试线及对照区(4)对照线,合成膜的一端与采样区(1)重叠,反应区(2)位于采样区(1)和测试区(3)之间。此外,平坦表面上供溶剂相通过的自由空间上进一步覆盖有一层涂覆物(60),该涂覆物为与溶剂相一起通过的试剂和/或细胞化合物创造化学惰性环境。该层涂覆物(60)优选由非特异性信号阻断蛋白制成。例如,该涂覆物可由在涂覆于合成膜表面前溶解于PBS内的牛血清白蛋白和/或脱脂牛奶磷蛋白制成。
如上所述,所公开装置的一些实施方式可进一步包括与形成第二端至少一部分的对照区(4)一端连接的吸收元件。吸收剂在第二端的存在除了吸收到达第二端的过量溶剂相之外,还可增强毛细作用,以驱使溶剂相和其他试剂向第二端流动。优选地,吸收剂为纤维素纤维片、滤纸及纸浆中的任意一种或组合。
本公开的另一方面为一种检测抗IFN-γ抗体(30)在从对象获得的体液样品中的存在的方法。优选地,该方法包括如下步骤:接收包含体液样品的溶剂相在采样区(1)的沉积;将溶剂相与存在于体液样品内的抗IFN-γ抗体一起引导至反应区(2)内,反应区(2)浸渍有多个第一复合物,第一复合物包含标记有生物素的第一重组IFN-γ(10)以及附有信号部分的第一抗体(20),第一抗体(20)通过结合至所标记的生物素上而与第一重组IFN-γ(10)结合,以形成第一复合物,第一复合物构造为在反应区(2)附于抗IFN-γ抗体上,以形成第二复合物;引导溶剂相与所形成的第二复合物及第一复合物一起进一步移动进入具有固定于其上的多个第二重组IFN-γ(40)的测试区(3),第二复合物构造为结合至固定的第二重组IFN-γ(40)上,以向其提供第一视觉信号。优选地,采样区(1)、反应区(2)及测试区(3)自层析固相的第一端向第二端连续设置。需要注意的重要一点是,各引导步骤在将溶剂相沉积于采样区(1)后层析固相的层析毛细作用下固有地进行。此外,测试区(3)产生第一视觉信号时,表明体液样品内存在抗IFN-γ抗体(30)。
如上所述,溶剂相和目标抗IFN-γ抗体(如有)构造为与预先沉积于固相上每一划定区域上的各种试剂接触并反应。固相优选包括:纤维素或塑料条带,其形成具有上述第一端和第二端的底层;覆盖底层表面的一部分的合成膜,用于构建测试区(3)以及与测试区(3)相邻的可选对照区(4);以及纳于第二端附近的吸收材料,用于吸收在通过所公开方法完成之前到达第二端的过量溶剂相。具体而言,重组IFN-γ以0.1~1.0μg的量沿测试区(3)内的测试线固定于合成膜上。在所公开的装置中,在位于测试区(3)上游的反应区(2)的表面上,第一复合物浸渍或设置于其上,以随时能够结合至以所测试的任何生物样品中所见的抗IFN-γ抗体(30)上。溶剂相可以为对象的体液或该体液与一种或多种缓冲液的混合物,并用于通过沉积于其上而启动抗IFN-γ抗体的测试和/或检测。在一些实施方式中,体液可以为对象的血液样品或血清样品。所公开的方法可进一步包括预处理步骤,用于将体液稀释或与其他试剂混合,以在溶剂相沉积于采样区(1)上后实现双抗体夹心ELISA。对于一些实施方式,所公开的方法进一步包括以过滤元件过滤体液样品的步骤,过滤元件可设置于采样区(1),用于阻截体液中所见的较大细胞成分。
根据若干优选实施方式,所公开的方法进一步包括引导溶剂相进一步移动进入对照区(4)的步骤,对照区(4)包含锚定于其上且用于结合至第一抗体上的底物(50)。对照区(4)在层析固相上紧邻测试区(3)设于其下游,而未在测试区(3)结合的第一复合物和第二复合物必然与溶剂相一起迁移进入对照区(4)。在针对底物的免疫亲和力的作用下,第一复合物和第二复合物通过第一抗体(20)结合至底物(50)上,以向其提供第二视觉信号。具体而言,未在测试区(3)结合的第一复合物和第二复合物进一步迁移进入对照区(4),在该处,第一复合物和第二复合物通过第一抗体(20)结合至底物(50)上,以向其提供第二视觉信号。信号部分在对照线处得到浓集,而浓集后的信号部分累积提供强至足以可被肉眼或相容信号读取装置检测到的信号。即使测试体液内不存在抗IFN-γ抗体(30),来自反应区(2)的第一复合物也将必然在不与锚定的第二重组IFN-γ(40)结合且因此不产生第一视觉信号的同时与溶剂一起流过测试区(3)后到达对照区(4),并被其内锚定的底物(50)捕获。最为优选地,对照线设置为无论测试体液样品内是否存在抗IFN-γ,均将发出第二视觉信号,以确证第一视觉信号的缺失或针对抗IFN-γ检测所得的阴性结果并非层析固相或试剂的缺陷或所公开方法的不当试用所致。对于更多实施方式,在所公开的方法中,第二重组IFN-γ(40)和/或底物(50)固定于合成膜上。
对于所公开方法的若干实施方式,信号部分为AuNP、荧光或量子点。
以下实施例旨在进一步说明本公开,而且无任何意图将本公开限制于其所描述的的具体实施方式。
实施例1
为了测试IFN-γ的生产,进行间接ELISA。微量滴定板上每孔包被50μL重组IFN-γ后,在湿度室中4℃下温育过夜。在室温下,进行如下步骤。包被后的板孔以溶于PBS内的0.05%吐温20洗涤3次,并以200μL封闭液(含2%脱脂牛奶的PBS)封闭1小时。洗涤5次后,加入50μL小鼠抗His标签单抗,并温育1小时。洗涤5次后,加入50μL的与HRP轭合的山羊抗小鼠免疫球蛋白,并温育1小时。与TMB底物反应后,以1N HCl停止反应。通过ELISA读数仪,测量450nm下的吸光度。
图3所示为以采用抗His标签单抗的间接ELISA进行的重组IFN-γ分析结果。重组IFN-γ制备后通过ELISA测定。重组IFN-γ包被的孔板在以小鼠抗His标签单抗探测时呈现阳性信号。该结果表明所形成的含再折叠形成的可溶性包涵体的IFN-γ蛋白与小鼠抗His标签抗体发生反应。然而,IFN-γ制剂在某些条件下呈现不同结合活性。
图4所示为以采用HRP-山羊抗小鼠Ig标记的抗IFN-γ单抗的间接ELISA进行的重组IFN-γ分析结果。该结果表明所形成的含再折叠形成的可溶性包涵体的IFN-γ蛋白与小鼠抗IFN-γ单抗抗体发生反应。
可以看出,当以可溶形式制备的重组IFN-γ以及溶有包涵体的IFN-γ蛋白以两种抗体标记时,几乎所有测试均检测到450nm下的光密度(OD)。然而,溶解在PBS缓冲液中的IFN-γ可溶化蛋白往往仅产生极低的可检测OD。
在IB得到溶解和纯化的蛋白制剂中,观察到抗His标签单抗及抗IFN-γ单抗的结合活性。该观察结果与可溶形式的IFN-γ蛋白制剂类似,但测试结果可随测试条件呈现轻微的差异。
实施例2
为了测试包括可溶性IFN-γ及再折叠形成的IFN-γ在内的IFN-γ的二聚体特性,进行双抗体夹心ELISA。微量滴定板上每孔包被50μL小鼠抗IFN-γ克隆B27(以0.5μg/mL溶于碳酸氢盐缓冲液,pH=9.6)后,在湿度室中4℃下温育过夜。在室温下,进行如下步骤。包被后的板孔以溶于PBS内的0.05%吐温20洗涤3次,并以200μL封闭液(含1%脱脂牛奶的PBS)封闭1小时。洗涤5次后,加入0.5μg/mL的生物素化小鼠抗IFN-γ克隆B27,并温育1小时。洗涤5次后,加入50μL的1:10000链霉亲和素-HRP稀释液,并温育1小时。与TMB底物反应后,以1N HCl停止反应。通过ELISA读数仪,测量450nm下的吸光度。
图5所示为通过双抗体夹心ELISA对以所生产的蛋白样品制备成可溶形式及包涵体(IB)溶液的重组干扰素γ进行的二聚体分析。除了光密度(OD)最低的溶于PBS缓冲液中的IFN-γ可溶化蛋白之外,均观察到较高的OD。
结果表明,所有的可溶性和IB重组干扰素γ均为二聚体蛋白,仅溶解于PBS缓冲液内的IFN-γ可溶化蛋白具有最少的二聚化特性。因此,不同样品中的干扰素γ蛋白具有不同的二聚化特性。
实施例3
对于以双抗原夹心ELISA对20名患者(已由标准间接ELISA确定为阳性结果)的成人免疫缺陷综合征(AOID)患者血清进行的抗干扰素γ检测,在获得双抗原夹心ELISA抗干扰素γ检测方法之后,以20名真实患者的血清进行测试,并将结果与标准间接ELISA进行比较。
将微孔板的板孔以浓度为10μg/mL的纯化干扰素γ包被,50μL每孔,然后在4℃的加湿箱内放置16~18h。在以溶于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)内的0.05%吐温20将板洗涤5次且拍干后,加入采用溶于PBS的2%牛血清白蛋白(BSA)的封闭液,200μL每孔,并将板在加湿箱内室温下放置1h。
所有20名AOID患者的血清均分别以溶于PBS内的2%BSA制备成1:100的稀释液,然后以溶于PBS的0.05%吐温20将板洗涤5次并拍干。在将以1:1000、1:500及1:100稀释的强阳性血清以50μL每孔的量加入后,将板在加湿箱内室温下放置1h,然后以溶于PBS的0.05%吐温20将板洗涤5次并拍干。
将浓度为1μg/mL的生物素化IFN-γ加入微孔板,50μL每孔,并将板在加湿箱内室温下放置1h。在将板以高严格性洗涤缓冲液洗涤5次且拍干后,在每孔内加入50μL的以1:5000稀释的HRP-抗生物素单抗,并将板在加湿箱内室温下放置1h。随后,以溶于PBS的0.05%吐温20将板洗涤5次。将板干燥后,每孔加入50μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物,以供进行HRP反应。在15分钟时,通过每孔加入50μL的6N HCL,停止辣根过氧化物酶(HRP)与TMB之间的反应。通过ELISA微孔板读数仪,测量450nm下的光密度(OD450)。
图6所示为通过标准/现有间接ELISA方法检测抗IFN-γ自身抗体时的AOID患者测试结果。在20名AOID患者的血清中,无论该疾病为活动性(n=6),还是非活动性(n=14),均呈阳性。
在通过双抗原夹心ELISA法对相同的20名AOID患者进行抗IFN-γ自身抗体的检测时,血清的稀释度选择为1:100。在15分钟时停止反应后,测量450nm下的OD值。无论是活动性组(A)(n=6),还是非活动性组(I)(n=14),每位患者均在上述方法的抗干扰素γ抗体检测中产生不同的阳性结果,而且此类结果可与严重程度并无关联性。此外,用于判断阳性结果的阈值根据从平均值为各份血清的背景值获得的临界值确定,从而获得如图7所示的20名患者的所有阳性结果。
与上述间接ELISA和双抗原夹心ELISA这两种方法相比,图8所示为归一化后的光密度数据。可以看出,对于每一患者而言,两种方法的结果较为类似。差异在于患者I002,双抗原夹心ELISA技术的结果值高于间接ELISA的结果值,其原因可能在于IgG之外的其他类型抗干扰素γ抗体(可能为IgM或IgA)的存在。
实施例4
所公开的可基于双抗体夹心ELISA操作的装置或测试试剂盒的一种实施方式组装可包括如下过程:
A.在测试区(3)固定重组IFN-γ,并在对照区(4)固定针对金纳米颗粒标记的抗生物素(20)的特异性底物,其中,重组IFN-γ和底物均锚定于合成膜上,且合成膜的开口区域隐于涂覆物(60)之下。
B.在反应区(2)浸渍多个第一复合物,该第一复合物包含与生物素化IFN-γ(10)偶联的金纳米颗粒标记的抗生物素(或第一抗体)(20),其中,生物素化IFN-γ(10)将固有地结合至血清样品内存在的任何抗IFN-γ抗体上,以产生阳性结果。
C.通过将过程A所得的包括测试区(3)和对照区(4)的合成膜置于塑料条带或层析固相的中间,组装测试试剂盒。与反应区相邻的合成膜一端与结合区(2)连接,连接方式为使各个区域的端部彼此物理接触。上述条带可进一步包括纳有吸收材料的接触区(5),该吸收材料以重叠方式与对照区(4)的一端连接。
实施例5
为了对胶体金轭合(CGC)状况加以验证,并且优化所公开实施方式中使用的标记有生物素的第一重组干扰素或生物素化IFN-γ的浓度,通过将胶体金标记的山羊抗生物素施加至100μg/mL、10μg/mL及1μg/mL三种不同浓度的生物素化IFN-γ而进行直接斑点印迹试验,其中,以10μg/mL的兔抗山羊IgG作为阳性对照,并且将PBS作为阴性对照。如图9a所示,红紫色或深紫色斑点仅出现于包被/固定有生物素化IFN-γ的范围或区域。由此可见,在所公开的实施方式中,CGC标记的抗生物素专门用于报告或发出信号。与此相对,如图9b所示,当将重组IFN-γ施加至生物素化IFN-γ时,未出现红紫色或深紫色斑点。
图10为展示所公开实施方式在检测样品中存在或不存在抗干扰素γ抗体时的准确性的照片,其中,所有的5份阳性血清(1~5号)均可看到测试区及对照区的两个视觉信号,而阴性血清(6~10号)仅可看到对照区的视觉信号。
本公开在不脱离其如本文所宽泛描述且如下文所要求的结构、方法或其他本质特征的情况下,还可以其他具体形式实施。上述实施方式应该在所有方面均视为说明性的,而非限制性的。因此,本公开的范围由下附权利要求书给出,而非由以上描述给出。所有处于权利要求书等效含义和范围内的变化均应包含于其范围之内。
参考符号说明
1 采样区/样品垫
2 反应区/轭合垫
3 测试区/测试线
4 对照区/对照线
5 吸收元件/吸收垫
10 生物素化IFN-γ/标记有生物素的第一重组干扰素γ
20 报告物标记的抗生物素/AuNP标记的抗生物素/CGC标记的抗生物素
30 AOID患者的抗IFN-γ抗体/抗IFN-γ自身抗体
40 第二重组干扰素γ
50 底物/抗体/第一抗体的特异性抗体/兔抗山羊IgG
60 涂覆剂

Claims (15)

1.一种检测抗干扰素γ抗体在从对象获得的体液样品中的存在的装置,所述装置包括:
接收包含所述体液样品的溶剂相的沉积的采样区;
浸渍有多个包含标记有生物素的第一重组干扰素γ及附有信号部分的第一抗体的第一复合物的反应区,所述第一抗体通过结合至所述被标记的生物素上而偶联至所述第一重组干扰素γ,以形成所述第一复合物;以及
具有固定于其上的多个第二重组干扰素γ的测试区,
其中,所述采样区、所述反应区以及所述测试区自层析固相的第一端向第二端连续设置,
其中,所述溶剂相与所述体液样品内存在的所述抗干扰素γ抗体一起从所述固相的所述第一端向所述第二端迁移,以使得所述第一复合物在所述反应区附于所述抗干扰素γ抗体上而形成第二复合物,而且所述第一复合物和所述第二复合物进一步迁移进入所述测试区,在该处,所述第二复合物结合至所述被固定的第二重组干扰素γ上,以向其提供第一视觉信号,
其中,在所述测试区建立的所述第一视觉信号指示所述抗干扰素γ抗体在所述体液样品内的所述存在。
2.权利要求1的所述装置,进一步包括包含锚定于其上且构造为结合至所述第一抗体上的底物的对照区,所述对照区在所述层析固相上紧邻所述测试区设于其后。
3.权利要求2的所述装置,其中,在所述测试区未结合的所述第一复合物和所述第二复合物进一步迁移进入所述对照区,在该处,所述第一复合物和所述第二复合物通过所述第一抗体结合至所述底物上,以向其提供第二视觉信号。
4.权利要求2的所述装置,进一步包括连接至形成所述第二端至少一部分的所述对照区一端的吸收元件。
5.权利要求4的所述装置,其中,所述吸收元件为纤维素纤维片、滤纸及纸浆中的任何一者或组合。
6.权利要求2的所述装置,其中,所述第二重组IFN-γ和/或所述底物固定于合成膜上。
7.权利要求1的所述装置,其中,所述第一抗体为抗生物素抗体。
8.权利要求1的所述装置,其中,所述信号部分为AuNP、荧光或量子点。
9.权利要求1的所述装置,其中,所述抗干扰素γ为IgG、IgM或IgA。
10.权利要求1的所述装置,其中,所述被固定的第二重组干扰素γ与所述第一复合物的摩尔比为1:1至1:10。
11.权利要求2的所述装置,其中,所述被固定的第二重组干扰素γ与所述底物的摩尔比为1:2至1:10。
12.一种检测抗干扰素γ抗体在从对象获得的体液样品中的存在的方法,所述方法包括:
在采样区接收包含所述体液样品的溶剂相的沉积;
引导所述溶剂相与所述体液样品内存在的抗干扰素γ抗体一起进入反应区,所述反应区浸渍有多个包含标记有生物素的第一重组干扰素γ以及附有信号部分的第一抗体的第一复合物,所述第一抗体通过结合至所述被标记的生物素上而偶联至所述第一重组干扰素γ,以形成所述第一复合物,所述第一复合物构造为在所述反应区附于所述抗干扰素γ抗体上而形成第二复合物;以及
引导所述溶剂相与所述被形成的第二复合物和所述第一复合物一起进一步移动进入具有固定于其上的多个第二重组干扰素γ的测试区,所述第二复合物构造为结合于所述被固定的第二重组干扰素γ上,以向其提供第一视觉信号,
其中,所述采样区、所述反应区以及所述测试区自层析固相的第一端向第二端连续设置,
其中,在所述测试区建立的所述第一视觉信号指示所述抗干扰素γ抗体在所述体液样品内的存在。
13.权利要求12的所述方法,进一步包括引导所述溶剂相进一步进入包含锚定于其上且构造为结合至所述第一抗体上的底物的对照区的所述步骤,所述对照区在所述层析固相上紧邻所述测试区设于其后,在所述测试区未结合的所述第一复合物和所述第二复合物迁移进入所述对照区,在该处,所述第一复合物和所述第二复合物通过所述第一抗体结合至所述底物上,以向其提供第二视觉信号。
14.权利要求12的所述方法,其中,所述第二重组干扰素γ和/或所述底物固定于合成膜上。
15.权利要求12的所述方法,其中,所述信号部分为AuNP、荧光或量子点。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1231727B (it) * 1989-08-11 1991-12-21 Enrico Savoldi Peptidi utili per la determinazione e la purificazione di anticorpi anti gamma interferone.
AU660837B2 (en) * 1992-09-04 1995-07-06 Becton Dickinson & Company Indirect chromatographic antigen sandwich test for detection of specific antibody and device therefor
US20080138842A1 (en) * 2006-12-11 2008-06-12 Hans Boehringer Indirect lateral flow sandwich assay
WO2010009457A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Boston Medical Center Corporation Diagnostics for membranous nephropathy
WO2011005357A2 (en) * 2009-07-08 2011-01-13 Anp Technologies, Inc. Immunogenicity assay
TWI650330B (zh) 2015-06-18 2019-02-11 長庚大學 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用

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