TWI650330B - 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用 - Google Patents

辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TWI650330B
TWI650330B TW104119897A TW104119897A TWI650330B TW I650330 B TWI650330 B TW I650330B TW 104119897 A TW104119897 A TW 104119897A TW 104119897 A TW104119897 A TW 104119897A TW I650330 B TWI650330 B TW I650330B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ifnγ
interferon
autoantibodies
recombinant
patients
Prior art date
Application number
TW104119897A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201700495A (zh
Inventor
顧正崙
林嘉豪
齊治宇
施瀚博
丁靜雅
Original Assignee
長庚大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 長庚大學 filed Critical 長庚大學
Priority to TW104119897A priority Critical patent/TWI650330B/zh
Priority to US15/185,172 priority patent/US10273278B2/en
Publication of TW201700495A publication Critical patent/TW201700495A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI650330B publication Critical patent/TWI650330B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5434—IL-12
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明揭露了一種可應用於瀰漫性分支桿菌感染病人的胜肽片段。上述胜肽片段，包含如式(I)所示具有7個單元的胺基酸序列，其中X1為白胺酸(Leu)；X2為脯胺酸(Pro)；X3為谷胺酸(Glu)；X4為絲胺酸(Ser)；X5為絲胺酸(Ser)；X6為白胺酸(Leu)；以及X7為精胺酸(Arg)。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)

Description

辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其 應用
本發明有關於醫用、牙科用或梳妝用的配製品，特別是製備一種胜肽片段，其可應用於瀰漫性分支桿菌感染病人。
抗細胞激素自體抗體(ACADs)益發被認定在感染和自體免疫性疾病的發病機制之中扮演重要的角色1-6。近年來，抗丙型干擾素(IFNg)的自體抗體(AutoAbs)與嚴重瀰漫性分支桿菌感染以及多種細胞內細菌感染密切相關，尤其是上述感染的數據是來自東南亞的病人4,7-9。
臨床上致病性分枝桿菌可以導致結核病、麻風病、肺臟疾病、淋巴結炎以及皮膚病10。對於結核分枝桿菌的免疫一事，IFNγ扮演重要的角色，其主要由T細胞和NK細胞受微生物刺激時的結果。
丙型干擾素(IFNγ)/白介素-12(IL-12)路徑的遺傳缺陷可以造成具瀰漫性分支桿菌感染的年輕病人出現結核分枝桿菌疾病的孟德爾易感性(MSMDs)11。
在另一方面，抗IFNγ的自體抗體對於IFNγ的中和現象正可用以解釋：特別是來自東南亞的成年人，其雖不具明顯的免疫缺陷，卻罹 患瀰漫性分支桿菌感染。
臨床上對於MSMDs易感性的相似程度強烈暗示了抗IFNγ的自體抗體是導致瀰漫性分支桿菌感染的病灶，而非其產生結果12。
儘管關於自體免疫13的基因組技術不斷進步，目前尚未釐清致病性自體抗體形成的精確機制。此外，抗IFNγ的自體抗體的產生機制仍不清楚。發病僅侷限於東南亞裔便暗示了這可能與特定遺傳因素和機制有關。
根據發明人過去的研究，主要組織相容性複合體(HLA)之中的人類白血球組織抗原(HLA class II DRB1*16：02/DQB1*05：02)兩種特定等位基因與此疾病密切相關，而此基因組廣泛存在於東南亞族裔的現象可能解釋了特定族群對於抗IFNγ的自體抗體的易感性8。人類白血球組織抗原可針對CD4 +T細胞提供特定的胜肽以誘發適應性免疫反應，而且其係與自體免疫性疾病密切相關的遺傳因素。由上述特定HLA等位基因所提供的致病性胜肽片段可能參與了抗IFNγ的自體抗體生成。
各方已提出了致病性自體抗體14生成的假說。由Rowley等人15所提出的【分子模仿】理論強調外部抗原可以模仿自體抗原並誘導自體抗體生成。分子模仿理論亦載於多種自體免疫性疾病的文獻之中，此類疾病包括：多發性硬化(MS)、強直性脊柱炎、格雷夫斯病、糖尿病以及系統性紅斑狼瘡(SLE)16。在MS和SLE的病例之中，其疾病發病機理與某些病毒，比如艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)有關，因EBV與人類中樞神經系統的抗原結構或狼瘡自體抗原(Sm B)皆具備同源胺基酸序列16。近來，Kain等人 17 發現抗溶酶體膜蛋白2的自體抗體被已接種細菌FimH的小鼠所誘導，並可導 致腎小球腎炎。
上述結果顯示分子模仿在某些疾病的發病機制中可扮演重要角色。
發明人找到這群自體抗體辨識一個主要抗原決定區(P121-131)位於丙型干擾素的碳端，而這個區域對於丙型干擾素受體的活化非常關鍵。同時也發現辨識這個區域的自體抗體具有中和丙型干擾素的能力。這個抗原決定區的一級結構和麴黴屬(Aspergillus)Noc2蛋白具有百分之百的相似性，且抗丙型干擾素自體抗體皆可和兩者結合。體內實驗顯示：不僅大鼠免疫注射麴黴屬Noc2蛋白片段會產生抗人類丙型干擾素抗體，大鼠免疫注射丙型干擾素胜肽片段也會產生抗麴黴屬Noc2蛋白抗體。本案生產具修正抗原決定區之丙型干擾素(EE-IFNγ)，它可藉由修改抗丙型干擾素自體抗體辨識的抗原決定區，降低和抗丙型干擾素自體抗體的親和力，並可在抗丙型干擾素自體抗體病人之全血中活化丙型干擾素的下游訊息。本案發現病人的抗丙型干擾素自體抗體可辨識相同且關鍵的抗原決定區，並提出分子模擬機制的模型以闡述抗丙型干擾素自體抗體的產生是由麴黴屬Noc2蛋白所造成。本案所製造的具修正抗原決定區之丙型干擾素或可用於臨床上具抗丙型干擾素的自體抗體病人。
在本案，發明人藉由解析病人的抗IFNγ的自體抗體的特性而探討分支桿菌感染的發病過程。發明人發現來自不同病人的抗IFNγ的自體抗體皆可辨識一個特定區：IFNγ碳端SPAAKTGKRK，而且上述抗體可中和IFNγ。在麴黴屬Noc2蛋白之中發現與上述特定區的高度同源胜肽序列 (KTGKRKR)，其亦可被抗IFNγ的自體抗體所辨識。抗人類IFNγ的抗體可在測試大鼠(已利用麴黴屬Noc2蛋白進行免疫接種處理)體內生成。此外，發明人利用大鼠同源區域，以便替換在人類IFNγ之中，受抗IFNγ的自體抗體所辨識的決定區，並生成一個新的重組蛋白：具修正決定區之丙型干擾素的IFNγ(EE-IFNγ)。即使在體外存在抗IFNγ自體抗體的前提下，這種重組蛋白亦能夠誘發IFNγ活化。因此，抗IFNγ的自體抗體可能被分子模仿的手段所誘發，而且已進行結構修飾的IFNγ不受抗IFNγ的自體抗體的阻斷。
依據本發明的一實施例，發明人揭露一種胜肽，其包含如式(I)所示具有7個單元的胺基酸序列：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)，其中X1為白胺酸(Leu,L)；X2為脯胺酸(Pro,P)；X3為谷胺酸(Glu,E)；X4為絲胺酸(Ser,S)；X5為絲胺酸(Ser,S)；X6為白胺酸(Leu,L)；以及X7為精胺酸(Arg,R)。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種評估一重組丙型干擾素(IFNγ)調控一周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，其包含下列步驟：自一具抗丙型干擾素自體抗體的病人取樣該周邊血液單核球細胞；將包含一同源取代物的該重組丙型干擾素與該周邊血液單核球細胞混合；以及檢測該周邊血液單核球細胞所產生的一訊號傳遞及轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)的表現。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種評估一重組細胞激素調控一周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，包含下列步驟：自一具抗丙型干擾素自體抗體的病人取樣該周邊血液單核球細胞；將包含一取代物的該重組細胞激素與該周邊血液單核球細胞混合；以及檢測該周邊血 液單核球細胞所產生的一白介素-12(IL-12)的表現。
發明人揭露一種依據上述實施例而製造出的重組蛋白的用途，係於瀰漫性分枝桿菌感染時，該重組蛋白可活化一IFNγ受體，且不受該IFNγ的一自體抗體中和。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種重組丙型干擾素(IFNγ)，包含：在IFNγ碳端的一主要決定區(P121-131)的一取代物，其中於瀰漫性分枝桿菌感染時，該IFNγ可活化一IFNγ受體，且不受IFNγ的一自體抗體中和。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種重組丙型干擾素(IFNγ)，具一胺基酸序列，包含：表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係缺少該胺基酸序列之至少一單元；以及一同源取代物，具至少一胺基酸，且填補該主要決定區所缺少之該至少一單元。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種製造一重組丙型干擾素(IFNγ)的方法，其中該IFNγ具一胺基酸序列，包含：確認表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係該胺基酸序列之至少一單元；以及提供一同源取代物，其中該同源取代物具至少一胺基酸，用以取代該主要決定區之該至少一單元。
依據本發明的另一實施例，發明人揭露一種製造一重組丙型干擾素(IFNγ)的方法，其中該IFNγ具一胺基酸序列，包含：確認表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係該胺基酸序列之至少一單元；以及對該至少一單元實施一突變步驟，俾使該IFNγ可活化一IFNγ受體，且不受IFNγ的一自體抗體中和。
BCG‧‧‧卡介苗
EE-IFN‧‧‧具修正抗原決定區之丙型干擾素
HLA-DR‧‧‧人類白血球抗原DR位點
IFNγ‧‧‧丙型干擾素
IL-12‧‧‧p40白介素-12 p40亞單元
p-STAT-1‧‧‧訊號傳遞及轉錄活化蛋白1磷酸化
圖1a-圖1h係根據本發明的實施例，繪示IFNγ的自體抗體可辨識IFNγ的碳端區域；圖2a-圖2d係根據本發明的實施例，繪示具修正決定區之的IFNγ；圖2e係根據本發明的實施例，繪示健康對照組的PBMCs與濃度20%對照組血漿或抗IFNγ自體抗體病人的血漿進行預孵育，並予以不同刺激；圖3a-圖3g繪示分子模仿理論；圖4a-圖4h係根據本發明的實施例，繪示具修正決定區之干擾素；圖5顯示ELISA檢測自體抗體拮抗IFN的結果；圖6a-圖6b顯示ELISA檢測IL-12和IFN的結果；圖7繪示決定區定位的結果；圖8繪示重組IFNγ西方墨點法的結果；圖9繪示血漿對於重組蛋白測試的結果；圖10繪示蛋白質定位的結果；圖11繪示血漿與hIFNγ或mIFNγ作用的結果；圖12繪示重組Noc2蛋白西方墨點法的結果；圖13a-圖13b繪示p-STAT-1及HLA-DR的表現水平。
【本案材料與方法】【病患與定義】
所有參加者都是20歲以上的成年人，且在臺灣各醫療中心定期進行追蹤。如果病人體內出現不連續的兩處或更多病位而且血液或糞便 培養呈現陽性的話，則可診斷為瀰漫性分支桿菌感染。肺部非結核分枝桿菌(NTM)感染的診斷是基於美國胸科協會和美國傳染性疾病協會所提出的準則48。Chi等人8已公佈上述病人的詳細臨床數據。
本案係得到中國醫學大學附設醫院審查委員會(DMR98-IRB-261)、長庚醫院(103-2861C)，以及所有病人根據赫爾辛基宣言所簽署的研究知情同意書的支持。
【試劑】
發明人使用以下單株抗體：抗IFNγ(EPR1108克隆，abcam)、抗V5標記(SV5-Pk1克隆，abcam)、FITC老鼠抗人類CD14(M5E2克隆，BD Pharmingen)、PE老鼠抗人類白血球抗原DR位點(HLA-DR)(G46-6克隆，BD Pharmingen)以及PE老鼠抗Stat1(pY701)(4a克隆，BD Phosflow)。
【檢測與稀釋可中和自體抗體的IFNγ】
從病人和捐血者的血漿被連續稀釋至10-1至10-6的倍數，並於最終濃度200皮克/毫升(pg/mL)、37℃以及1小時條件之下與重組人類IFNγ進行孵育。並根據廠商的建議，利用BD Biosciences的人類IFNγ酶聯免疫法(ELISA)試劑盒測量IFNγ的水平。所有實驗均已重複進行。
【合成胜肽】
所有的胜肽均由Kelowna臺灣國際科學公司合成。胜肽被凍乾，它的純度和質量分別由高性能液相色譜法(HPLC)和質譜分析所評定。
【決定區定位】
乾淨的聚苯乙烯96孔平底板(Nunc)被塗覆胜肽溶液100微升(μL)、濃度為5微克/毫升，以及碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)，並處於4℃及 過一夜的條件。利用浸於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中的5%人類正常血清白蛋白(Aventis)阻斷剩餘結合部位後，平底板處於37℃，1小時的條件下而孵育。之後，利用浸於磷酸鹽緩衝生理鹽水中的0.5%聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(Tween 20)，沖洗平底板3次。
利用浸於磷酸鹽緩衝生理鹽水中含有5%人類正常血清白蛋白，血漿樣本以1：100的比例稀釋。室溫下孵育2小時並沖洗3次之後，加入與鹼性磷酸酶共軛的山羊抗人類IgG(Fcγ)片段(Jackson免疫研究實驗室)，而其稀釋度為1：5000。平底板在室溫下留置1個小時。最後，洗淨5次之後，加入100μL的p-硝基苯基磷酸酯(pNPP)。在37℃孵育30分鐘之後，利用VICTOR X3平板閱讀器(PerkinElmer)，讀測在405nm波長下的反應。
【競爭性酶聯免疫法】
為了得知反應的特異性，進行了競爭性酶聯免疫法實驗。以1：100的比例稀釋的每個血漿樣本使用不同濃度的競爭胜肽(5-30μg/mL)，在4℃留置一夜而與其進行預孵育。隨後，所有的血漿和不同濃度的競爭胜肽混合物樣本利用決定區定位規範來檢測決定區。6號胜肽被塗上碳酸氫鹽緩衝液，並在pH 9.6以及4℃的條件下留置一夜。在37℃阻斷1小時之後，所有預孵育的血漿和不同濃度的競爭胜肽混合物樣本被重複加入。經2小時室溫下的預孵育之後，加入可與鹼性磷酸酶形成共軛的山羊抗人類IgG(Fc片段)。最後，添加100μL的pNPP，在37°c預孵育30分鐘後，在405nm的波長下，以VICTOR X3平板閱讀器(PerkinElmer)讀測反應。
【預測B細胞的決定區】
使用Emini表面輔助工具18和Bepipred線性決定區Prediction19 來預測B細胞決定區。上述軟體需輸入FASTA格式的序列。BepiPred使用隱馬可夫模型(Hidden Markov Model)和傾向尺度方法(Propensity Scale Method)的結合模式以預測線性B細胞決定區的位置。在Emini表面輔助工具的預測法之中，其計算方式是基於某一物件表面可存取等級，而不是視窗內加法。
【產生人類重組IFNγ】
藉由聚合酶鏈反應(PCR)，發明人放大IFNγ之中開放閱讀框(ORF)的一段鹼基，並將其克隆入pMT/BiP/V5-His(Invitrogen)以利於果蠅Schneider 2(S2)的細胞表現。利用V5標記蛋白純化試劑盒(MBL)進一步純化重組IFNγ。突變的重組IFNγ係由定點快變突變試劑盒(Stratagene)所完成。藉由西方墨點法(Western Blot)，發明人得以確認所有構造的序列和克隆位置，以及重組IFNγ的大小和免疫活性。
【重組麴黴屬Noc2蛋白】
發明人放大Noc2蛋白之中開放閱讀框(ORF)中的一段鹼基，並將其克隆入pMT/BiP/V5-His(Invitrogen)以利於果蠅Schneider 2(S2)細胞表達。利用V5標記蛋白純化試劑盒(MBL)進一步純化重組Noc2蛋白。 藉由西方墨點法，發明人得以確認所有構造的序列和克隆位置以及重組Noc2蛋白的大小和免疫反應性。
【細胞內訊號傳遞及轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)染色】
總數106個周邊血液單核球細胞(PBMCs)浸於180μL含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的RPMI-1640之中，並與20μL正常人的血 漿或20μL病人的血漿在室溫孵育10分鐘。然後在37℃的孵育箱內使用500IU的IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ刺激細胞30分鐘。孵育之後，透過FITC-CD14(BD Pharmingen)表面染色技術而鑒定單核細胞。透過添加250微升的FASC裂解溶液(BD Pharmingen)，並避光室溫下孵育15分鐘，緊接著用PBS清洗2次。為了通透細胞，500微升冰冷的無水甲醇被添加到每個試管，並避光在冰上孵育15分鐘，緊接著用PBS清洗兩次。接下來，加入PE-phospho-STAT1(pY701)抗體(BD Pharmingen)，並避光在冰上孵育30分鐘。利用2mL的PBS沖洗細胞，之後利用500微升PBS取再懸浮液。利用FACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences)收集數據，並以FACSuite軟體(BD Biosciences)分析結果。
【免疫墨點法】
重組IFNγ(R&D Systems,XXX)及其各種截斷形式的蛋白一併進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，並使用8%凝膠、還原態、120伏特以及2小時的設定條件。上述蛋白被轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)的膜(Invitrogen Life Technologies)，其使用250毫安培和2小時的設定條件。該膜被含有0.1% Tween 20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)之5%人類正常血清白蛋白(Aventis)所阻斷(在4℃並過一夜的條件下)。該膜與1/100的病人血漿或對照組的血漿的稀釋液，一起在室溫下進行孵育3小時。經3次清洗之後，該膜與1/10000的辣根過氧化物酶共軛的小鼠抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的稀釋液，一起在室溫下進行孵育1小時。經3次清洗之後，該膜與ECL(Merck Millipore)作用。
【HLA-DR表現】
總數106個周邊血液單核球細胞(PBMCs)浸於180μL含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的RPMI-1640之中，並與20μL的正常人的血漿或20μL的病人的血漿一併在室溫孵育10分鐘。然後在37℃的孵育箱內分別使用500IU的IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ刺激細胞24小時。在孵育之後，透過FITC-CD14(BD Pharmingen)表面染色技術而鑒定單核細胞。接下來，加入PE-HLA-DR抗體(BD Pharmingen)，避光在冰上孵育30分鐘。再次，利用2毫升的PBS沖洗細胞，之後取其中500微升的再懸浮液。利用FACSVerse流式細胞儀(BD Biosciences)收集數據，並以FACSuite軟體(BD Biosciences)分析結果。
【接種Noc2蛋白或IFNγ胜肽】
發明人利用0.25毫克與卵清蛋白(OVA)共軛的Noc2蛋白或IFNγ胜肽(Noc2蛋白：CTPKTGKRKRSEQ；IFNγ：CAAKTGKRKRSQM)，對WKY/NcrlNarl大鼠進行免疫接種處理，而且在初始(第0天)注射之後，每兩個星期都給予一加強劑量。經70天之後，在每次注射後，藉由斑點印跡(dot blot)或ELISA檢測抗體生產水平。所有大鼠在第10次注射後的第10天被處死(第136天)，並收集全血。收集完畢後，令其在室溫不受干擾的情況下，靜置15分鐘，允許血液凝結。利用冷凍離心機離心(1500g/10分鐘)移除血塊。分裝血清和並將其存儲於-20℃以備後續使用。
以下針對本發明之實驗圖表作進一步說明。
圖1a-圖1h繪示IFNγ的自體抗體可辨識IFNγ的碳端區域。
圖1a繪示人類IFNγ的胺基酸序列之中30個單體單元(30-mer)重疊合成胜肽。
圖1b繪示決定區定位用於確認合成胜肽對於IFNγ的血清結合親和力，並以405奈米之平均光密度(OD)表示；血漿樣本分別來自具IFNγ自體抗體病人(n=15)、分枝桿菌感染病人(n=2)和健康對照組(n=6)。
圖1c繪示抑制ELISA，即從每個具IFNγ自體抗體病人的血漿樣本與不同濃度的對照組胜肽或6號胜肽，進行預孵育。然後所有的血漿稀釋液經由ELISA以檢測其對抗6號胜肽的活性。
圖1d繪示IFNγ的示意圖，以及線性B細胞決定區及表面可接受區域的預測得分。每個綠色長條圖(在上部)代表預測B細胞決定區，以及每個紅色長條形(在下部)代表預測的表面可接受區域。預測得分表示：所有在此區域內的胺基酸的預測值高於具有統計意義的門檻值的平均得分。長條圖顏色強度與預測得分成正比。
圖1e繪示IFNγ1-131的三維投影結構。IFNγ的胺基酸序列121-131的部分所形成的決定區係位於碳端並延伸到溶劑之中。
圖1f繪示不同長度的截斷重組IFNγ蛋白。
圖1g繪示蛋白定位用於確認重組蛋白對於IFNγ的血漿結合親和力，表示成在405奈米(nm)之平均光密度(OD)；血漿樣本分別取自具IFNγ自體抗體病人(n=16)、分枝桿菌感染病人(n=2)以及健康對照組(n=3)。
圖1h繪示西方墨點法顯示具IFNγ自體抗體病人血漿(n=4，P1-4)和健康對照組血漿(n=2，C1-2)對於IFNγ的不同截斷形式的結合能力。表1示出在不同物種間多個胺基酸序列與EE-IFNγ的比對，其中在其他物種中的保守單元已被框示表示。EE-IFNγ胜肽的序列，係以同源小鼠序 列：白胺酸(Leu,L)-脯胺酸(Pro,P)-谷胺酸(Glu,E)-絲胺酸(Ser,S)-絲胺酸(Ser,S)-白胺酸(Leu,L)-精胺酸(Arg,R)(即LPESSLR，已使用粗體顯示)取代人類P121-127：絲氨酸(Ser,S)-脯胺酸(Pro,P)-丙氨酸(Ala,A)-丙氨酸(Ala,A)-賴氨酸(Lys,K)-蘇氨酸(Thr,T)-甘氨酸(Gly,G)(即SPAAKTG)。
在其他的例子之中，亦有可能採用多種長度不等的同源取代物以取代決定區P121-127的序列。比如具至少一個胺基酸，且可填補該上述決定區所缺少之至少一單元。又比如對上述決定區之至少一單元實施突變處理。
圖2a-圖2d繪示具修正決定區之的IFNγ。
圖2a繪示藉由ELISA檢測，抗IFNγ自體抗體對於IFNγ_1-131與EE-IFNγ的親和力。抗IFNγ自體抗體取自5例自體免疫病人的血漿，並令其與IFNγ_1-131結合，抗IFNγ自體抗體具劑量依賴性，但與EE-IFNγ無關。 並以在405nm之下的平均光密度(OD)表示之。
圖2b繪示西方墨點法呈現具IFNγ自體抗體病人血漿(n= 4，P1-4)和健康對照組血漿(n=2，C1-2)分別對於IFNγ_1-131或EE-IFNγ的結合能力。3例健康捐贈者的血漿對IFNγ_1-131和EE-IFNγ皆無反應。
圖2c-圖2d繪示健康對照組的PBMCs與濃度20%對照組血漿(n=6)或抗IFNγ自體抗體病人的血漿(n=6)進行預孵育，並以野生型(WT)IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ加以處理。在使用CD14+門控之後，應用帶有p-STAT-1單株抗體的流式細胞儀測定p-STAT-1的水平。以長條圖(圖2c)和中位數螢光強度(MFI)(圖2d)表示。
圖2e繪示健康對照組的PBMCs與濃度20%對照組血漿(n=4)或抗IFNγ自體抗體病人的血漿(n=9)進行預孵育，並以卡介苗(BCG)、BCG加WT IFNγ、BCG加IFNγ_1-131或BCG加EE-IFNγ予以刺激。以ELISA檢測上清液中的IL-12 p40水平。
表2示出人類丙型干擾素胜肽P125-133對於麴菌屬Noc2蛋白的遺傳學同源性。胺基酸序列號(AA)對應于國家生物技術信息中心(NCBI)所公布的蛋白質，其中來源物種包括：Home sapiens、Aspergillus terreus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Cryptococcus neoformans、Mycobacterium intracellulare以及Clostridium sp.MSTE9。
表2
圖3a-圖3g繪示分子模仿理論。圖3a繪示抗原交叉反應定位用於確認合成胜肽對於麴黴屬Noc2蛋白的血清結合親和力，並以405奈米之平均光密度(OD)表示；血漿樣本分別來自具IFNγ自體抗體病人(n=9)、分枝桿菌感染病人(n=3)和健康對照組(n=3)。
圖3b繪示抑制ELISA，從具IFNγ自體抗體病人的每個血漿樣本(n=7)與不同濃度的對照組胜肽或麴黴屬Noc2蛋白，進行預孵育。然後所有的血漿稀釋液經由ELISA以檢測其對抗6號胜肽的活性。
圖3c繪示西方墨點法顯示具IFNγ自體抗體病人血漿(n=4，P1-4)和健康對照組血漿(n=2，C1-2)對於麴黴Aspergillus terreus(胺基酸序列號：1-165)和煙麴黴Aspergillus fumigatu(胺基酸序列號：1-162)的重組Noc2蛋白截斷形式的結合能力。
圖3d繪示與Noc2蛋白所誘導的抗IFNγ的抗體進行免疫接種。分別從免疫前大鼠(n=6)、經Noc2蛋白免疫的大鼠(n=4)和經6號胜肽免疫的大鼠(n=2)的血清被用來與對照組胜肽、6號胜肽和從麴黴和煙麴黴而來的Noc2蛋白作定位，以405奈米之平均光密度(OD)表示。
圖3e繪示從免疫前大鼠(n=6)、經Noc2蛋白免疫的大鼠(n=4)和經6號胜肽免疫的大鼠(n=2)的血清分別被連續稀釋，並與200 pg/mL的人類IFNγ進行孵育。取自免疫前大鼠的血清並無呈現hIFNγ的阻斷活動。經Noc2蛋白免疫的大鼠(n=4)和經6號胜肽免疫的大鼠(n=2)，其稀釋度達1/102的血清抑制hIFNγ的檢測。
圖3f-圖3g繪示急性單核白血病細胞THP1細胞株分別與免疫前大鼠(n=2)、經Noc2蛋白免疫的大鼠(n=4)和經6號胜肽免疫的大鼠(n=2)的50%血清濃度進行預孵育之後，再加入WT IFNγ。應用帶有p-STAT-1單株抗體的流式細胞儀，計算出p-STAT-1水平，並以中位數螢光強度(MFI)顯示。圖3f繪示應用帶有HLA-DR單株抗體的流式細胞儀，計算出HLA-DR表現水平，並以中位數螢光強度(MFI)顯示(請參見圖3g)。
圖4a-圖4h繪示具修正決定區之干擾素的臨床應用。
圖4a-圖4b繪示健康對照組的PBMCs或具IFNγ自體抗體病人的血漿(n=6)與濃度20%自體血漿進行預孵育，並加入WT IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ。在使用CD14+門控之後，應用帶有p-STAT-1單株抗體的流式細胞儀測定p-STAT-1的水平。以長條圖(圖4a/PE-A頻道)和中位數螢光強度(MFI)表示(請參見圖4b)。
圖4c繪示取自健康對照組或具IFNγ自體抗體病人(n=6)的PBMCs分別與濃度20%自體血漿進行預孵育，並以卡介苗(BCG)、BCG加WT IFNγ、BCG加IFNγ_1-131或BCG加EE-IFNγ予以刺激。並以ELISA檢測上清液中的IL-12 p40水平。
圖4d-圖4e繪示取自健康對照組(n=5)或具IFNγ自體抗體病人(n=6)的PBMCs分別與濃度20%自體血漿進行預孵育，並加入WT IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ。在使用CD14+門控之後，應用帶有HLA-DR 單株抗體的流式細胞儀測定HLA-DR的水平。以長條圖(圖4d)和中位數螢光強度(MFI)表示(請參見圖4e)。
圖4f-圖4g繪示取自健康對照組(n=4)或具IFNγ自體抗體病人(n=6)的全血，加入WT IFNγ、IFNγ_1-131或EE-IFNγ。在使用CD14+門控之後，應用帶有p-STAT-1單株抗體的流式細胞儀測定p-STAT-1的水平。 以長條圖(圖4f)和中位數螢光強度(MFI)表示(請參見圖4g)。
圖4h繪示取自健康對照組(n=4)或具IFNγ自體抗體病人(n=5)的全血分別利用卡介苗(BCG)、BCG加WT IFNγ、BCG加IFNγ_1-131或BCG加EE-IFNγ予以刺激。並以ELISA檢測上清液中的IL-12 p40水平。
圖5繪示針對IFNγ的ELISA可用於檢測自體抗體拮抗IFNγ。 表示成在405奈米(nm)之平均光密度(OD)；血漿樣本取自具抗丙型干擾素自體抗體病人(n=2)，與健康對照組的血漿樣本(n=65)。
圖6a繪示在三組人群(抗丙型干擾素自體抗體病人(n=3)、不具IFNγ自體抗體的健康對照組(n=7)，以及具未被中和的IFNγ自體抗體的健康對照組(n=4))的全血之中，分別針對未被活化、經卡介苗(BCG)活化、或經BCG與IFNγ的混合物活化之後，始利用ELISA檢測IL-12生成水平。
圖6b繪示在三組人群(抗丙型干擾素自體抗體病人(n=3)、不具IFN自體抗體的健康對照組(n=7)，以及具未中和的IFNγ自體抗體的健康對照組(n=4))的全血之中，分別針對未被活化、經卡介苗(BCG)活化、或經BCG與IL-12的混合物活化之後，始利用ELISA檢測IFNγ 生成水平。
圖7繪示決定區定位用於確認合成胜肽抗對IFNγ的血漿結合親和力，並以在405奈米的平均光密度(OD)表示之；血漿樣本分別取自具抗丙型干擾素自體抗體病人(n=3,P1-3)、不具自體抗體的健康對照組(n=2,C1-2)，以及具未中和的IFNγ自體抗體的健康對照組(n=5,N1-5)。
圖8繪示藉由V5標記抗體，西方墨點法可呈現不同形式的重組IFNγ。
圖9繪示取自抗丙型干擾素自體抗體病人(n=5,P1-5)和健康對照組(n=2,C1-2)的血漿分別被用於與IFNγ_1-50、IFNγ_1-70、IFNγ_68-121、IFNγ_1-121、IFNγ_1-131以及IFNγ_1-139重組蛋白等載體進行測試。
圖10繪示蛋白質定位被用於確認合成胜肽抗對IFNγ的血漿給合親和力，並以在405奈米的平均光密度(OD)表示之；血漿樣本分別取自不具自體抗體的健康對照組(n=3,C1-3)，以及具未中和的IFNγ自體抗體的健康對照組(n=5,N1-5)。
圖11繪示7名病人的血漿被連續稀釋並與濃度為200pg/mL的人類IFNγ(hIFNγ)或小鼠IFNγ(mIFNγ)進行孵育。從健康捐血者而來的血漿未呈現阻斷活動(即檢測出hIFNγ或mIFNγ)。但是，抗丙型干擾素自體抗體病人的血漿濃度稀釋至1/104仍抑制了hIFNγ的檢出，卻檢測出mIFNγ。
圖12繪示藉由V5標記抗體，西方墨點法呈現不同形式的重組Noc2蛋白。
圖13繪示急性單核白血病細胞THP1細胞株分別與未經免疫接種的大鼠(n=2)、接種Noc2蛋白大鼠(n=4)或接種6號胜肽大鼠(n=2)的50%血清濃度進行預孵育之後，再加入WT IFNγ。應用帶有p-STAT-1單株抗體的流式細胞儀，計算出p-STAT-1水平，並以長條圖顯示(請參見圖13a)。另以長條圖顯示利用流式細胞技術測定HLA-DR單株抗體的HLA-DR表現水平(請參見圖13b)。
【實施例】
【第1實施例】
在本實施例中，發明人嘗試藉由具7-8個重疊的胺基酸且覆蓋人類丙型干擾素的整個編碼序列的30個單體單元(30-mer)，確認可被分離自病人的抗IFNγ自體抗體所辨識的決定區。上述單體單元被合成，且其胺基酸序列如圖1a所示。
使用取自3個不同的病人群組的血漿以進行決定區定位。具IFNγ自體抗體的瀰漫性分支桿菌感染病人(第1組/n=15)。不具IFNγ自體抗體的瀰漫性分支桿菌感染病人(第2組/n=2)；以及健康對照組(第3組/n=6)。實驗結果顯示，只有6號胜肽可被第1組病人之中的12位病人所辨識(請參見圖1b)。相反地，在其他兩組(第2組和第3組)之中未出現對於6號胜肽的結合活性，此觀察便暗示了識別6號胜肽一事並非源自抗分支桿菌抗體的交叉反應。
接下來，發明人利用ELISA來確認抗丙型干擾素自體抗體對於6號胜肽的特異性。第1組病人的血漿與6號胜肽進行預孵育，這就導致以呈劑量依賴性地爭相與已塗佈6號胜肽作結合，而且當對照組胜肽(1-5號胜 肽)被當作的競爭者時，未出現競爭(圖1c)。上述數據表明來自第1組病人的抗IFNγ的自體抗體被6號胜肽之中一個主要決定區(P114-143)所辨識。
亦發現65例健康對照組之中的其中5個人具有未被中和的抗IFNγ的自體抗體(請參見圖5)。在以卡介苗加IFNγ或BCG加IL-12刺激之後，5個人皆產生了強烈反應。
上述現象與不具抗IFNγ的自體抗體的人相同(請參見圖6-圖7)。
相對於針對病人中和抗丙型干擾素自體抗體，對健康捐血者之中，未中和的自體抗體並未能辨識6號胜肽(請參見圖8)。
總之，取自病人的抗丙型干擾素自體抗體可辨識位於其碳端區域的主要決定區(6號胜肽)，此即中和特性。
【第2實施例】
為進一步確認可被抗IFNγ的自體抗體所辨識的精確位置，在本實施例中，發明人以電腦模擬的方式掃描可能的B細胞的線性抗原決定區以及表面可接受度18,19，發現在整個IFNγ之中，存在多個候選決定區(請參見圖1d)。本案同時考慮篩選特徵之中預測分數較高者，以及座落於6號胜肽，B細胞決定區預測演算法算出決定區SPAAKTGKRKR(P121-131)，表面可接受度預測演算法則算出決定區TGKRKR(P126-131)。上述結果與第1實施例之中胜肽抗原決定區定位數據相呼應。
關鍵的決定區SPAAKTGKRKR(P121-131)係位於碳端區域展開序列。它延伸到溶劑之中且未與分子其餘部分進行劇烈的交互作用20-22(請參見圖1e)。
【第3實施例】
為了調查取自第1組病人的抗IFNγ自體抗體可否辨識野生IFNγ蛋白的同一區域，在本實施例中，發明人利用Schneider 2(S2)細胞表現系統生成不同截斷形式的IFNγ(請參見圖1f和圖9)。結果顯示發現只有全長IFNγ(IFNγ_1-144)和刪除克隆IFNγ_1-131可被取自第1組病人的血漿所辨識(請參見圖1g)。
相反地，取自第2組和第3組病人(圖1g)的血漿並未能辨識所有進行測試的重組IFNγ。在西方墨點法和斑點印跡檢測，結果亦顯示類似的現象：只有全長IFNγ_1-144(數據未顯示)和刪除克隆IFNγ_1-139和IFNγ_1-131始為抗丙型干擾素自體抗體所辨識，而非IFNγ的其它截斷形式(請參見圖1h和圖10)。這些數據顯示，一個被抗IFNγ自體抗體所辨識的B細胞主要決定區：P121-131(SPAAKTGKRKR)，係位於IFNγ的碳端。
然而，相對於中和病人的抗丙型干擾素自體抗體，取自健康捐血者的非中和性的抗丙型干擾素自體抗體可辨識IFNγ_1-50、IFNγ_1-70、IFNγ_68-121以及IFNγ_1-121(請參見圖11)。
總之，有關於抗丙型干擾素自體抗體重組區域的結果和線性而野生IFNγ相呼應。取自病人的抗丙型干擾素自體抗體可辨識一個主要區域：P121-131(SPAAKTGKRKR)，係一重要中和屬性。亦即抗丙型干擾素自體抗體確實可辨識IFNγ蛋白的碳端區域。
【第4實施例】
在已確認過的主要抗原決定區之中，IFNγ之中胺基酸序列號128-131(KRKR)對其功能至關重要，並在不同物種間保守存在23,24。然而， 在不同物種間，胺基酸序列號121-127並不存在保守性(人類SPAAKTG；小鼠LPESSLR，請參表1)。
從隨機選定具有抗IFNγ的自體抗體病人的血漿並未在重組小鼠抗IFNγ蛋白上呈現阻斷現象(請參圖12)，從而得知SPAAKTG是用於連結抗IFNγ的自體抗體的必要組成部分。稍早的研究23只提及：SPAAKTG序列對於IFNγ功能而言，不具關鍵影響力；而刪除人類IFNγ碳端的某些胺基酸將導致生物活性增加。
在本實施例中，發明人利用在IFNγ之中胺基酸序列號1-131之中，同源小鼠序列LPESSLR(請參表1)替換人類胺基酸序列號121-127(P121-127 SPAAKTG)，而產生具修正抗原決定區之丙型干擾素(EE-IFNγ)蛋白。
在其他的實施例之中，為了切合臨床需要，具修正抗原決定區之丙型干擾素可能會進一步地結合藥理學上可接受的賦形劑或載體，而一併用藥。術語『賦形劑(excipients)』或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何用於製備成劑型之習知適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本技術所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備成各劑型，投與動物或人類亦不致於造成不良反應、過敏或其它不適當反應。因而本技術所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。而術語『有效劑量(therapeutically effective amount)』係代表足以改善或防止醫學症狀惡化或生物體狀態之劑量。有效地劑量亦說明投與化合物 之劑量足供用於診斷之劑量。除非說明書另有敘述，否則『活性化合物』以及『醫藥活性化合物』於此均可替換使用，係指稱一具有製藥學、藥理學或治療效果之物質。
請參見圖2a，藉由ELISA，可觀察到相較於野生型(WT)IFNγ_1-131，EE-IFNγ對於抗IFNγ的自體抗體的親和力是明顯下降的。
請參見圖2b，借助西方墨點法，亦可觀察到抗IFNγ的自體抗體對於EE-IFNγ或WT IFNγ_1-131的親和力是不同的。
以上數據顯示，抗IFNγ的自體抗體的決定區座落於胺基酸序列號121-131，而SPAAKTG正是用於識別的必要組成部分。
【第5實施例】
下一步探討針對決定區P121-131的抗丙型干擾素自體抗體是否對於抗IFNγ自體抗體疾病之中所出現的中和作用扮演重要角色。
先前的研究23表明替換成同源性的小鼠序列單元121-127之間的單元將導致生物活性小幅下降。
請參見圖2c和圖2d，在本實施例中，發明人藉由流式細胞儀測量一訊號傳遞及轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)以及採用酶聯免疫法測定白介素-12產生，從而測試EE-IFNγ的生物活性。周邊血液單核球細胞(PBMCs)之中所觀察到p-STAT-1訊息上調係受重組IFNγ、WT IFNγ_1-131、EE-IFNγ或20%對照組血漿的啟動，結果顯示在p-STAT-1訊息傳遞方面，相較於NA或IFNγ，EE-IFNγ與WT IFNγ_1-131具有類似的生物活性。在20%血漿與取自病人的抗IFNγ自體抗體進行預孵育的部分，只有EE-IFNγ(不是重組IFNγ或IFNγ_1-131)可以誘導轉錄活化蛋白1(STAT1)磷酸化。這些數 據充分表明抗IFNγ自體抗體，特定於決定區P121-131，並具有中和效應。
類似於p-STAT-1訊息傳遞，當以20%病人血漿進行預孵育，並以BCG加重組IFNγ或IFNγ_1-131進行刺激之後，並未見白介素IL-12 p40表現提升。與此相反的是，BCG加上EE-IFNγ確實可恢復已與20%病人血漿進行預孵育的對照組PBMCs之中，IL-12p40的表現(請參見圖2e)。
這些實驗數據顯示：若以阻斷效果而言，在不同的病人之中，決定區P121-131是抗IFNγ自體抗體唯一或主要結合部位。
【第6實施例】
在具IFNγ自體抗體病人之中辨識識共同決定區和共用的人類白血球組織抗原(HLA)單體型一事暗示了與分子模仿的共同發病機制可能有關。
在本實施例中，發明人利用P125-135胺基酸序列(SPAAKTGKRKRSQML)作為索引，在人類和微生物資料庫中搜尋類似的胜肽。上述區域與人類其他蛋白質之間並無相似性。然而，發明人發現P125-133決定區與麴黴核糖體組成蛋白Noc2蛋白胺基酸序列號(AA)105-113呈現100%正相關(9個胺基酸之中8個相同)，而表2所示的資料庫之中可用的多數麴菌屬的相應區域係屬保守。可知IFNγ決定區P125-133同源於麴黴屬保守蛋白。
【第7實施例】
在本實施例中，發明人探討取自病人的抗丙型干擾素自體抗體能否與麴黴屬Noc2蛋白進行交叉反應。首先測量合成麴黴屬Noc2蛋白(KKDVTPKTGKRKRSEQQKDE)的抗原性，使用分離自具抗IFNγ自體抗 體病人的血漿而進行決定區定位評估。此實驗數據顯示麴黴屬Noc2蛋白被分離自具抗IFNγ自體抗體病人的血漿所辨識，但不與不具抗IFNγ的自體抗體的分支桿菌感染病人的血漿作用(請參見圖3a)。
由ELISA評估人類IFNγ之P125-133和麴黴屬Noc2蛋白保守區域P105-113之間的同源性。取自具抗IFNγ自體抗體病人的樣本與麴黴屬Noc2蛋白進行預孵育，之後與6號胜肽反應。數據表明，麴黴屬Noc2蛋白將與6號胜肽呈劑量呈依賴性地競逐與抗丙型干擾素自體抗體相結合，當對照組胜肽被用作為競爭對手時，則不存在競爭現象(請參見圖3b)。
以上實驗數據顯示，人類的抗丙型干擾素自體抗體可與麴黴屬Noc2蛋白進行交叉反應。
【第8實施例】
為了進一步研究抗丙型干擾素自體抗體是否能在蛋白質階層辨認麴黴屬Noc2蛋白，發明人從麴黴和煙麴黴產生截斷重組Noc2蛋白P1-165和P1-162。西方墨點法用於檢驗抗IFNγ自體抗體對於人類IFNγ或麴黴屬Noc2蛋白的交叉反應。利用取自具抗IFNγ自體抗體病人的血漿，並以其作為主要抗體時，結果顯示抗IFNγ自體抗體可辨識不同麴黴屬菌種中的截斷重組Noc2蛋白。相反地，取自健康對照組的血漿無法與截斷重組Noc2蛋白或WT IFNγ_1-131蛋白結合(請參見圖3c)。
以上實驗數據顯示，取自病人的抗丙型干擾素自體抗體可與麴黴屬Noc2蛋白進行交叉反應。
【第9實施例】
為了探討體內誘導決定區P121-131對抗IFNγ自體抗體的免疫 原性，在本實施例中，發明人利用與卵清蛋白(OVA)共軛的麴黴屬Noc2蛋白的胺基酸序列號103-114，接種4隻大鼠。這些大鼠產生了抗Noc2蛋白抗體，並可與人類IFNγ進行交叉反應。利用與卵清蛋白共軛的人類IFNγ的胺基酸序列號123-134，接種2隻大鼠。這兩隻大鼠產生了抗人類IFNγ的抗體，並可與麴黴屬Noc2蛋白進行交叉反應(請參見圖3d)。
此外，結果顯示所有經免疫接種Noc2蛋白和IFNγ胜肽的大鼠的血清皆可阻斷人類重組IFNγ(請參見圖3e)。實驗數據顯示，拮抗麴黴屬Noc2蛋白的抗體可以在體內和IFNγ進行交叉反應，反之亦然。
接下來，本實施例亦探討上述Noc2蛋白抗體對於IFNγ訊息路徑，是否具有中和能力。當與50%未接種的大鼠血清進行預孵育並以重組IFNγ刺激之後，應用流式細胞儀測定p-STAT-1可發現急性單核白血病細胞THP1之中p-STAT-1訊息是上調的。然而，當與已接種50% Noc2蛋白或IFNγ的大鼠血清進行預孵育並以重組IFNγ刺激之後，可發現急性單核白血病細胞THP1之中p-STAT-1訊息的上調程度減少的(請參見圖3f)。
IFNγ可以增加髓系細胞及其他細胞種類之中HLA-DR的合成及表現25。因此，本案測量經IFNγ刺激後的HLA-DR表現。HLA-DR表現測定亦可得到類似的結果(請參見圖3g)。
實驗數據顯示抗麴黴屬Noc2蛋白的抗體不僅與人類的IFNγ結合，並抑制了IFNγ下游訊息傳遞。因此，接種Noc2蛋白的大鼠在對於IFNγ具有一免疫耐受的空檔，抗IFNγ抗體即可透過分子模仿的過程而被誘發。 可知接種Noc2蛋白可誘發抗IFNγ抗體。
【第10實施例】
本案已經展示了EE-IFNγ可以恢復IFNγ所活化的p-STAT-1訊息，並在抗IFNγ自體抗體出現的前提下，促進對照組PBMCs細胞之IL-12表現(請參見圖2d-圖2f)。
在本實施例中，發明人研究了使用EE-IFNγ以在體外恢復具抗IFNγ自體抗體病人的IFNγ功能的可能性。病人的PBMCs分別與濃度10%自體血漿進行預孵育，並以卡介苗(BCG)或BCG加EE-IFNγ予以刺激以便檢測p-STAT-1訊息或IL-12的生成量。當具抗丙型干擾素自體抗體病人的PBMCs與濃度10%自體血漿進行預孵育，並以重組IFNγ和WT IFNγ_1-131加以刺激時，並未出現上調p-STAT-1訊息。相反地，EE-IFNγ可以恢復部分與濃度10%自體血漿進行預孵育的具抗丙型干擾素自體抗體病人的PBMCs的p-STAT-1訊息(6位病人中的4位，詳情請參圖4a-圖4b)。
此外，相較於BCG加重組IFNγ或加WT IFNγ_1-131，BCG加EE-IFNγ可以恢復部分與濃度10%自體血漿進行預孵育的具抗丙型干擾素自體抗體病人的PBMCs的IL-12 p40(6位病人中的3位，詳情請參圖4c)。
類似的現象亦見於HLA-DR表現檢測。實驗結果顯示：當具抗丙型干擾素自體抗體病人的PBMCs與濃度10%自體血漿進行預孵育，並以重組IFNγ和WT IFNγ_1-131加以刺激時，並未出現上調的HLA-DR水平。 相反地，EE-IFNγ可以恢復與濃度10%自體血漿進行預孵育的具抗丙型干擾素自體抗體的6個病人的PBMCs的其中4個的HLA-DR的表現水平(請參見圖4d-圖4e)。
接下來，發明人檢視EE-IFNγ可否恢復在體外、具抗丙型干擾素自體抗體病人的全血之中IFNγ受體的活性。經重組IFNγ、WT IFNγ_1 131或EE-IFNγ刺激後控制組全血中的p-STAT-1訊息是上調的。當具抗丙型干擾素自體抗體病人的全血以與重組IFNγ及WT IFNγ_1-131刺激後，並未出現上調的p-STAT-1訊息。相反地，EE-IFNγ可以恢復部分具抗丙型干擾素自體抗體病人的p-STAT-1訊息(6位病人中的4位，詳情請參見圖4f-圖4g)。
此外，相較於BCG加重組IFNγ或加WT IFNγ_1-131，BCG加EE-IFNγ可以恢復部分具抗丙型干擾素自體抗體病人的全血的IL-12 p40(6位病人中的4位，詳情請參見圖4h)。
總結可知，EE-IFNγ可以同時恢復體外具抗丙型干擾素自體抗體病人自體血漿及其全血的生物活性，即可恢復上述IFNγ受體的活性。
【結論】
總之，本案確認了可被抗IFNγ自體抗體所辨識的IFNγ的碳端的主要抗原決定區，而上述自體抗體可與麴黴屬Noc2蛋白進行交叉反應。
發明人假設在特定人類白血球組織抗原出現的情況下，可由Noc2蛋白透過分子模擬機制觸發：藉由辨識在IFNγ碳端有限的抗原決定區(P121-131)而中和抗IFNγ自體抗體一事。
此外，發明人製作具潛在治療功效的EE-IFNγ，即便在活體外的病人血液樣本的前提下，它亦可恢復IFNγ訊息路徑。
以上實驗數據提示了特定於P121-131的抗IFNγ自體抗體或許正是唯一能引發自體免疫的自體抗體類型。本案亦為抗IFNγ自體抗體所引發的瀰漫性分支桿菌感染提供了另一種新的分子模仿模型，並同時提供其治療方案。
更多的實施例
實施例1：一種胜肽，包含如式(I)所示具有7個單元的胺基酸序列：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)，其中X1為白胺酸(Leu,L)；X2為脯胺酸(Pro,P)；X3為谷胺酸(Glu,E)；X4為絲胺酸(Ser,S)；X5為絲胺酸(Ser,S)；X6為白胺酸(Leu,L)；以及X7為精胺酸(Arg,R)。
實施例2：一種評估一重組丙型干擾素(IFNγ)調控一周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，包含下列步驟：自一具抗丙型干擾素自體抗體的病人取樣該周邊血液單核球細胞；將包含一同源取代物的該重組丙型干擾素與該周邊血液單核球細胞混合；以及檢測該周邊血液單核球細胞所產生的一訊息傳遞子及一轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)的表現。
實施例3：一種評估一重組細胞激素調控一周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，包含下列步驟：自一具抗丙型干擾素自體抗體的病人取樣該周邊血液單核球細胞；將包含一取代物的該重組細胞激素與該周邊血液單核球細胞混合；以及檢測該周邊血液單核球細胞所產生的一白介素-12(IL-12)的表現。
實施例4：一種製造一重組蛋白的方法，包括下列步驟：提供一丙型干擾素(IFNγ)，該丙型干擾素具有一碳端；以及將在該碳端的序列號121-127所對應的單元(P121-127)用一成分取代，其中該成分係選自白胺酸-脯胺酸-谷胺酸-絲胺酸-絲胺酸-白胺酸-精胺酸所組成的胜肽。
實施例5：一種根據實施例4而製造出的重組蛋白的用途，係於瀰漫性分枝桿菌感染時，該重組蛋白可活化一IFNγ的一受體，且不受該IFNγ的一自體抗體中和。
實施例6：一種重組丙型干擾素(IFNγ)，包含：在IFNγ碳端的一主要決定區(P121-131)的一取代物，其中於瀰漫性分枝桿菌感染時，該IFNγ可活化一IFNγ受體，且不受IFNγ的一自體抗體中和。
實施例7：一種重組丙型干擾素(IFNγ)，具一胺基酸序列，包含：表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係缺少該胺基酸序列之至少一單元；以及一同源取代物，具至少一胺基酸，且填補該主要決定區所缺少之該至少一單元。
實施例8：如實施例6-7所述之重組IFNγ，更包含藥理學上可接受的賦形劑或載體。
實施例9：一種製造一重組丙型干擾素(IFNγ)的方法，其中該IFNγ具一胺基酸序列，包含：確認表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係該胺基酸序列之至少一單元；以及提供一同源取代物，其中該同源取代物具至少一胺基酸，用以取代該主要決定區之該至少一單元。
實施例10：一種製造一重組丙型干擾素(IFNγ)的方法，其中該IFNγ具一胺基酸序列，包含：確認表徵一瀰漫性分枝桿菌感染之一主要決定區，其中該主要決定區係該胺基酸序列之至少一單元；以及對該至少一單元實施一突變步驟，俾使該IFNγ可活化一IFNγ受體，且不受IFNγ的一自體抗體中和。
實施例11：如實施例3所述之方法，其中該重組細胞激素為一丙型干擾素(IFNγ)；以及該取代物同源於該丙型干擾素的一主要決定區。
實施例12：一種如式(I)所示的胺基酸序列： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (I)
其中，X1至X7分別選自以下胺基酸的其中之一：丙胺酸(Ala,A)、半胱胺酸(Cys,C)、天門冬胺酸(Asp,D)、谷胺酸(Glu,E)、苯丙胺酸(Phe,F)、甘胺酸(Gly,G)、組胺酸(His,H)、異白胺酸(Ile,I)、賴胺酸(Lys,K)、白胺酸(Leu,L)、蛋胺酸(Met,M)、天冬醯胺(Asn,N)、吡咯賴胺酸(Pyl,O)、脯胺酸(Pro,P)、谷氨醯胺(Gln,Q)、精胺酸(Arg,R)、絲胺酸(Ser,S)、蘇胺酸(Thr,T)、硒半胱胺酸(Sec,U)、纈胺酸(Val,V)、色胺酸(Trp,W)以及酪胺酸(Tyr,Y)。
參考文獻
1. Hoflich, C., et al. Naturally occurring anti-IFN-gamma autoantibody and severe infections with Mycobacterium cheloneae and Burkholderia cocovenenans. Blood 103, 673-675 (2004).
2. Puel, A., et al. Recurrent Staphylococcal cellulitis and subcutaneous abscesses in a child with autoantibodies against IL-6. J Immunol 180, 647-654 (2008).
3. Puel, A., et al. Autoantibodies against IL-17A, IL-17F, and IL-22 in patients with chronic mucocutaneous candidiasis and autoimmune polyendocrine syndrome type I. J Exp Med 207, 291-297 (2010).
4. Browne, S.K., et al. Adult-onset immunodeficiency in Thailand and Taiwan. N Engl J Med 367, 725-734 (2012).
5. Wang, Y., et al. Characterization of pathogenic human monoclonal autoantibodies against GM-CSF. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 7832-7837 (2013).
6. Browne, S.K. Anticytokine autoantibody-associated immunodeficiency. Annu Rev Immunol 32, 635-657 (2014).
7. Doffinger, R., et al. Autoantibodies to interferon-gamma in a patient with selective susceptibility to mycobacterial infection and organ-specific autoimmunity. Clin Infect Dis 38, e10-14 (2004).
8. Chi, C.Y., et al. Anti-IFN-gamma autoantibodies in adults with disseminated nontuberculous mycobacterial infections are associated with HLA-DRB1*16:02 and HLA-DQB1*05:02 and the reactivation of latent varicella-zoster virus infection. Blood 121, 1357-1366 (2013).
9. Kampmann, B., et al. Acquired predisposition to mycobacterial disease due to autoantibodies to IFN-gamma. J Clin Invest 115, 2480-2488 (2005).
10. Smith, I. Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence. Clin Microbiol Rev 16, 463-496 (2003).
11. Bustamante, J., Boisson-Dupuis, S., Abel, L. & Casanova, J.L. Mendelian susceptibility to mycobacterial disease: Genetic, immunological, and clinical features of inborn errors of IFN-gamma immunity. Semin Immunol 26, 454-470 (2014).
12. Puel, A. & Casanova, J.L. Autoantibodies against cytokines: back to human genetics. Blood 121, 1246-1247 (2013).
13. Zenewicz, L.A., Abraham, C., Flavell, R.A. & Cho, J.H. Unraveling the genetics of autoimmunity. Cell 140, 791-797 (2010).
14. Sfriso, P., et al. Infections and autoimmunity: the multifaceted relationship. J Leukoc Biol 87, 385-395 (2010).
15. Rowley, D. & Jenkin, C.R. Antigenic cross-reaction between host and parasite as a possible cause of pathogenicity. Nature 193, 151-154 (1962).
16. Cusick, M.F., Libbey, J.E. & Fujinami, R.S. Molecular mimicry as a mechanism of autoimmune disease. Clin Rev Allergy Immunol 42, 102-111 (2012).
17. Kain, R., et al. Molecular mimicry in pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis. Nat Med 14, 1088-1096 (2008).
18. Emini, E.A., Hughes, J.V., Perlow, D.S. & Boger, J. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol 55, 836-839 (1985).
19. Larsen, J.E., Lund, O. & Nielsen, M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2, 2 (2006).
20. Ealick, S.E., et al. Three-dimensional structure of recombinant human interferon-gamma. Science 252, 698-702 (1991).
21. Walter, M.R., et al. Crystal structure of a complex between interferon-gamma and its soluble high-affinity receptor. Nature 376, 230-235 (1995).
22. Thiel, D.J., et al. Observation of an unexpected third receptor molecule in the crystal structure of human interferon-gamma receptor complex. Structure 8, 927-936 (2000).
23. Lundell, D., et al. The Carboxyl-Terminal Region of Human Interferon-Gamma Is Important for Biological-Activity - Mutagenic and Nmr Analysis. Protein Engineering 4, 335-341 (1991).
24. Savan, R., Ravichandran, S., Collins, J.R., Sakai, M. & Young, H.A. Structural conservation of interferon gamma among vertebrates. Cytokine Growth Factor Rev 20, 115-124 (2009).
25. Basham, T.Y. & Merigan, T.C. Recombinant interferon-gamma increases HLA-DR synthesis and expression. J Immunol 130, 1492-1494 (1983).
26. Seelig, G.F., Wijdenes, J., Nagabhushan, T.L. & Trotta, P.P. Evidence for a polypeptide segment at the carboxyl terminus of recombinant human gamma interferon involved in expression of biological activity. Biochemistry 27, 1981-1987 (1988).
27. Zhao, Z.S., Granucci, F., Yeh, L., Schaffer, P.A. & Cantor, H. Molecular mimicry by herpes simplex virus-type 1: autoimmune disease after viral infection. Science 279, 1344-1347 (1998).
28. van den Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol 10, 469-482 (2014).
29. Barnes, P.D. & Marr, K.A. Aspergillosis: spectrum of disease, diagnosis, and treatment. Infect Dis Clin North Am 20, 545-561, vi (2006).
30. Araujo, R., Goncalves Rodrigues, A. & Pina-Vaz, C. Susceptibility pattern among pathogenic species of Aspergillus to physical and chemical treatments. Med Mycol 44, 439-443 (2006).
31. Chaudhary, N., Staab, J.F. & Marr, K.A. Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens. PLoS One 5, e9036 (2010).
32. Neal, C.O., et al. Global population structure of Aspergillus terreus inferred by ISSR typing reveals geographical subclustering. BMC Microbiol 11, 203 (2011).
33. Yuki, N. Molecular mimicry and disease model of Guillain-Barre syndrome. J Neuroimmunol 154, 14-14 (2004).
34. Gilchrist, F.C., et al. Class II HLA associations with autoantibodies in scleroderma: a highly significant role for HLA-DP. Genes Immun 2, 76-81 (2001).
35. Sabbah, E., et al. Disease-associated autoantibodies and HLA-DQB1 genotypes in children with newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). The Childhood Diabetes in Finland Study Group. Clin Exp Immunol 116, 78-83 (1999).
36. Gao, F., et al. Association of HLA-DRB1 alleles and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in Han and Uyghur patients with ulcerative colitis in China. J Dig Dis 15, 299-305 (2014).
37. Hasan, Z.N., et al. Association between human leukocyte antigen-DR and demylinating Guillain-Barre syndrome. Neurosciences (Riyadh) 19, 301-305 (2014).
38. Rosen, L.B., et al. Anti-GM-CSF Autoantibodies in Patients with Cryptococcal Meningitis. J Immunol 190, 3959-3966 (2013).
39. Rosen, L.B., et al. Nocardia-induced GM-CSF is neutralized by autoantibodies in disseminated/extrapulmonary nocardiosis. Clin Infect Dis (2014).
40. Sakiani, S., Olsen, N.J. & Kovacs, W.J. Gonadal steroids and humoral immunity. Nat Rev Endocrinol 9, 56-62 (2013).
41. Baerlecken, N., Jacobs, R., Stoll, M., Schmidt, R.E. & Witte, T. Recurrent, multifocal Mycobacterium avium-intercellulare infection in a patient with interferon-gamma autoantibody. Clin Infect Dis 49, e76-78 (2009).
42. Browne, S.K., et al. Anti-CD20 (rituximab) therapy for anti-IFN-gamma autoantibody-associated nontuberculous mycobacterial infection. Blood 119, 3933-3939 (2012).
43. Rao, V.K., et al. Use of rituximab for refractory cytopenias associated with autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS). Pediatr Blood Cancer 52, 847-852 (2009).
44. Keating, G.M. Rituximab: a review of its use in chronic lymphocytic leukaemia, low-grade or follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma. Drugs 70, 1445-1476 (2010).
45. Al-Muhsen, S. & Casanova, J.L. The genetic heterogeneity of mendelian susceptibility to mycobacterial diseases. J Allergy Clin Immunol 122, 1043-1051； quiz 1052-1043 (2008).
46. Doffinger, R., et al. Partial interferon-gamma receptor signaling chain deficiency in a patient with bacille Calmette-Guerin and Mycobacterium abscessus infection. J Infect Dis 181, 379-384 (2000).
47. Macdougall, I.C., et al. A peptide-based erythropoietin-receptor agonist for pure red-cell aplasia. N Engl J Med 361, 1848-1855 (2009).
48. Griffith, D.E., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. Am J Respir Crit Care Med 175, 367-416 (2007).
<110> 長庚大學
<120> 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用
<160> 19
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<223> 小鼠丙型干擾素之碳端片段
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 2
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 3
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 5
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 6
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之碳端重疊合成胜肽
<400> 7
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 11
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 12
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 13
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 14
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 16
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 17
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<223> 丙型干擾素之片段
<400> 19

Claims (2)

  1. 一種評估一重組丙型干擾素(EE-IFNγ)調控一周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，包含下列步驟：提供一取樣自具抗丙型干擾素自體抗體的病人之該周邊血液單核球細胞；將包含一同源取代物的該重組丙型干擾素與該周邊血液單核球細胞混合，其中該重組丙型干擾素(EE-IFNγ)是將具有一碳端的一人類丙型干擾素(IFNγ)，用該同源取代物取代該碳端的序列號121-127所對應的絲氨酸-脯胺酸-丙氨酸-丙氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-甘氨酸；檢測該周邊血液單核球細胞所產生的一白介素-12(IL-12)或一轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)的表現量；以及依據該白介素-12(IL-12)或該轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)的表現量來評估該重組丙型干擾素(EE-IFNγ)的調控效果，其中該白介素-12(IL-12)或該轉錄活化蛋白1磷酸化(p-STAT-1)的表現量與該重組丙型干擾素(EE-IFNγ)的調控效果成正比。
  2. 如請求項1所述之評估該重組丙型干擾素(EE-IFNγ)調控該周邊血液單核球細胞(PBMCs)的方法，其中該同源取代物係選自白胺酸-脯胺酸-谷胺酸-絲胺酸-絲胺酸-白胺酸-精胺酸所組成的胜肽。
TW104119897A 2015-06-18 2015-06-18 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用 TWI650330B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104119897A TWI650330B (zh) 2015-06-18 2015-06-18 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用
US15/185,172 US10273278B2 (en) 2015-06-18 2016-06-17 Epitope recognized by anti-interferon gamma autoantibodies in patients with disseminated mycobacterial infections and the application therefor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW104119897A TWI650330B (zh) 2015-06-18 2015-06-18 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201700495A TW201700495A (zh) 2017-01-01
TWI650330B true TWI650330B (zh) 2019-02-11

Family

ID=58401010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104119897A TWI650330B (zh) 2015-06-18 2015-06-18 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10273278B2 (zh)
TW (1) TWI650330B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7417231B2 (ja) * 2020-06-29 2024-01-18 マヒドン ユニバーシティ 抗インターフェロンγ抗体を検出するための免疫クロマトグラフィーによる方法及びキット
USD1007520S1 (en) * 2021-04-06 2023-12-12 China Medical University Display screen or portion thereof with graphical user interface
WO2023182947A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Chiang Mai University A modified protein of interferon gamma and its use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5770191A (en) * 1995-05-24 1998-06-23 University Of Florida Active C-terminal peptides of interferon--gamma and their use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lundell D et al., "The carboxyl-terminal region of human interferon gamma is important for biological activity: mutagenic and NMR analysis", Protein Engineering, 4(3):335-341, 1991/02
Lundell D et al., "The carboxyl-terminal region of human interferon gamma is important for biological activity: mutagenic and NMR analysis", Protein Engineering, 4(3):335-341, 1991/02 顧正崙，"非肺結核分枝桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之分子機制"，行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告，公開日:2014/11/5 *
Patel SY et al., "Anti-IFN-gamma autoantibodies in disseminated nontuberculous mycobacterial infections", The Journal of Immunology, 175(7):4769-4776, 2005/10/01 *
顧正崙，"非肺結核分枝桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之分子機制"，行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告，公開日:2014/11/5。

Also Published As

Publication number Publication date
US20170114112A1 (en) 2017-04-27
TW201700495A (zh) 2017-01-01
US10273278B2 (en) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7084247B2 (en) Identification of self and non-self antigens implicated in autoimmune diseases
US20030171280A1 (en) Compositions and methods for modulation of immune responses
AU2015302930B2 (en) Methods of treating cervical cancer
KR20150058152A (ko) 마이코박테리아 항원 백신
UA57702C2 (uk) Імуномодулятори
Favre et al. Epitope mapping of recombinant human gamma interferon using monoclonal antibodies
TWI650330B (zh) 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用
KR20030084992A (ko) 감소된 면역원성을 갖는 개질 인터페론 베타
US20210338806A1 (en) METHODS OF GENERATING VACCINES AGAINST NOVEL CORONAVIRUS, NAMED SARS-COV-2 COMPRISING VARIABLE EPITOPE LIBRARIES (VELs) AS IMMUNOGENS
JP2002525338A (ja) 糖尿病の処置および予防のためのケモカインレセプターペプチドワクチン
CA2276112A1 (en) Broad spectrum pyrogenic exotoxins antagonists and vaccines
WO2014165866A2 (en) Methods for immune-based diagnosis, prevention and personalized treatment of narcolepsy
JP4299777B2 (ja) 免疫応答を誘導するための方法および組成物
Rodríguez‐Álvarez et al. d‐Amino acid substitutions and dimerization increase the biological activity and stability of an IL‐15 antagonist peptide
KR20070050993A (ko) Ｃ형 간염 바이러스 유래 펩티드
WO2022140706A1 (en) Immune-regulatory li-key peptide vaccines for prophylaxis and long-term protection against sars-cov-2 infection and covid-19 disease
Shinnick et al. Isolation and restriction site maps of the genes encoding five Mycobacterium tuberculosis proteins
JP2003507011A (ja) Ｉｌ−１６拮抗剤
KR20050027985A (ko) 쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56백신을 이용한 진단 및 치료
WO1996006630A1 (en) Methods and compositions for modulating a t cell response
Schäfer et al. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization
JP5189593B2 (ja) 無差別ＨＥＲ−２／ＮｅｕＣＤ４Ｔ細胞エピトープ
US20170042988A1 (en) Antigens of pneumocystis murina and uses thereof
WO2007091881A2 (en) Methods and means for detection of mycobacterium leprae infections
WO2022251216A1 (en) T cell epitopes and related compositions useful in the prevention, diagnosis, and treatment of beta-coronaviruses