KR20050027985A - 쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56백신을 이용한 진단 및 치료 - Google Patents

쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56백신을 이용한 진단 및 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20050027985A
KR20050027985A KR1020047018448A KR20047018448A KR20050027985A KR 20050027985 A KR20050027985 A KR 20050027985A KR 1020047018448 A KR1020047018448 A KR 1020047018448A KR 20047018448 A KR20047018448 A KR 20047018448A KR 20050027985 A KR20050027985 A KR 20050027985A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
seq
gly
ala
ile
Prior art date
Application number
KR1020047018448A
Other languages
English (en)
Inventor
웨이 메이 칭
게홍
치엔 청 차오
Original Assignee
더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 리프리젠티드 바이 더 세크리테리 오브 더 네이비
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 리프리젠티드 바이 더 세크리테리 오브 더 네이비 filed Critical 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 리프리젠티드 바이 더 세크리테리 오브 더 네이비
Publication of KR20050027985A publication Critical patent/KR20050027985A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0233—Rickettsiales, e.g. Anaplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1246—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Rickettsiales (O)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/29—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Richettsiales (o)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Abstract

본 발명은 절단형 r47 단백질(truncated r47 protein) 및 절단형 r56 단백질(truncated r56 protein)을 포함하는 쯔쯔가무시병 백신(scrub typhus vaccine)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 r56 단백질 변이체로 구성되는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 r47 및 r56 단백질들 그리고 이들의 항체들을 이용하여 HIV 바이러스 수를 감소하는 방법에 관한 것이다.

Description

쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아 쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56 백신을 이용한 진단 및 치료{Orientia tsutsugamushi truncated recombinant outer membrane protein r47 and r56 vaccines diagnostics and therapeutics for scrub typhus and HIV infection}
본 발명은 면역 항체 뿐만 아니라 진단 항체로서도 유용한 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 47 kDa 및 56 kDa의 표면 단백질 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HIV 환자의 체내 HIV 바이러스 수를 감소시키는 치료방법에 관한 것이다.
쯔쯔가무시병(Scrub typhus)의 감염은 진정 세포내(obligated intracellular), 그람 음성 세균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(O. tsutsugamushi)에 의해 일어난다. 그 증상(symptom)으로는 폐렴, 뇌막염, 발진 및 두통 등을 포함한다. 이와 같이 쯔쯔가무시병의 증후 및 증상(sign and symptom)은 다른 치명적인 열병(febrile illness), 예를 들어 렙토스피라증(leptospirosis), 발진열(murine typhus), 말라리아 등과 비슷하기 때문에 이들과 쯔쯔가무시병을 구별하는 것은 매우 어려울 수 있다. 쯔쯔가무시병 환자의 95~99%의 혈청은 총 리케치아 세포 단백질 함량(total rickettsial cellular protein content)의 10~15%를 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 56 kDa 단백질을 인식한다. 상기 56 kDa 단백질은, 이제까지 초기 진단 및 가능성 있는 백신 후보로서 개발되고 사용되어 온 다른 균주들과의 사이에 보존서열(conserved sequence) 및 특정서열(unique sequence)을 갖는다.
홀-오가니즘 백신(whole-organism vaccines)은 이미 개발되어 왔으나, 그 방어면역이 일시적이고 교차 방어 면역(cross strain protection)이 부족한 문제점이 있었다. 주요 표면 단백질 항원이자 항원성 변이(antigenic variation)의 원인인 변이성 56 kDa 단백질은 동형주(homologous strain)에 대해서는 숙주방어면역(protective immunity)을 유도하지만, 이형주(heterologous strain)에 대해서는 그렇지 않은 것으로 알려져 있다. 110, 47 및 22 kDa 과 같은 다른 항체들 또한 높은 혈청반응성(seroreactivity)을 갖는 것이 확인됨으로써, 이러한 몇몇 항체들을 결합하여 오리엔티아 쯔쯔가무시 감염의 다양한 균주에 대하여 좀 더 나은 방어면역성을 제공할 가능성을 예상할 수 있다. 최근, 쯔쯔가무시병 감염 환자에서 채취한 혈장(plasma)을 HIV 감염 환자에게 주입시킨 결과 최초 주입으로부터 2개월 후 HIV 바이러스 수가 감소되었으며, 이러한 결과는 쯔쯔가무시병 환자의 혈장이 약제학적으로 효과가 있음을 암시하는 것이다.
본 발명자들은 폭넓은 방어면역을 제공할 수 있는 백신 후보로서 r56 단백질과의 융합(combination)에 사용하기 위한 높은 순도의 재조합 47 kDa 단백질을 충분히 생산해 내기 위하여, NCBI 등록번호(accession number) L31934.1의 47 kDa 단백질 유전자를 클로닝하고 순수 r47(pure r47)을 얻고자 하였다. 또한 서열검색 결과, 상기 외막 단백질은 세린 프로테아제(serine protease)와 상동성을 보였으며, 이러한 사실은 r47 단백질 자체가 프로테아제로서 기능을 발휘할 수도 있음을 제시한다.
웨스턴 블랏(western blot) 결과를 통해 쯔쯔가무시병 환자의 혈장이 상기 r47 단백질에 대하여 강한 항원 반응을 나타냄을 볼 수 있었고, 이는 r47이 HIV 감염에 대하여 방어면역의 역할을 할 수 있는 가능성이 있음을 시사하였다. 이러한 저해효과는 r47 단백질에 대한 항체 반응이 원인일 수 있다. 또는, 세린 프로테아제와 r47 단백질 간의 상동성은 HIV 프로세싱(HIV processing)을 방해하는 r47과 관련된 프로테아제 활성 가능성을 암시한다.
짧고, 거의 정확한 매치(short, nearly exact matches)에 대한 NCBI 단백질 데이터베이스 검색 결과, 오리엔티아 쯔쯔가무시 카프종 47 kDa 항원(등록번호 gi/1220501) 47 kDa와 HIV 외피 단백질(envelope protein)(등록번호 gi/2250974) HIVgp120 사이에 10개 아미노산의 매치(10-amino-acid match)(8개 동일 및 2개 보존)가 있음을 밝혀내었다.
패턴: TLR+IVTN+K
따라서, 본 발명의 요지는 서열목록 서열번호 1의 r47 절단형 단백질(r47 truncated protein), 서열목록 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 군에서 선택되는 r56 절단형 단백질(r56 truncated protein) 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 서열목록 서열번호 1의 절단형 r47 단백질과 서열목록 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 군에서 선택되는 r56 절단형 단백질의 융합단백질에 대한 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 약제학적으로 유효한 함량으로 투여하는 것을 포함하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법에 관한 것이다. 또는, 상기 방법은 상기의 절단형 r47 단백질 또는 절단형 r56 단백질 중 어느 하나에 대한 항체의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 요지는 약제학적으로 유효한 양의 쯔쯔가무시병 백신(scrub typhus vaccine)을 투여하는 것을 포함하는 쯔쯔가무시병에 대한 면역성 부여방법에 대한 것이다.
본 발명은 또한 피험자로부터 시료를 얻고, 상기 시료를 ELISA 플레이트(ELISA plates), 닷-블랏 매트리스(dot-blot matrices), 및 핸드 헬드 크로마토그래픽 분석 장치 및 플로우 스루 분석 장치(hand held chromatographic and flow through assay devices)로 구성된 군에서 선택되는 분석기기에서 r56 분석을 위한 보체로서 r47 단백질에 대해 노출시키는 과정을 포함하는 쯔쯔가무시병에 대한 항체를 탐색하는 분석방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 요지는 서열목록 서열번호 1의 절단형 r47 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 결과적으로 HIV 환자의 HIV 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열목록 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 군에서 선택되는 r56 단백질을 포함하는 HIV 환자의 치료에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 요지는 잠재적인 HIV 백신 및 절단형 r47 또는 r56 단백질 또는 이들의 융합단백질을 포함하는 HIV 백신에 관한 것이다.
본 발명의 상기한, 그리고 또 다른 특징 및 이점들은 아래의 바람직한 구체예의 상세한 설명뿐만 아니라 수반되는 실시예와 도면을 참고함으로써 더욱 분명해질 것이다. 실시예의 상세한 설명은 권리범위를 한정하는 것이 아니라 예시하는 것에 불과한 것으로, 본 발명의 권리범위는 첨부한 특허청구범위 및 그의 균등물에 의해 정해진다.
도 1은 47 kDa의 절단형 단백질을 코딩하는 DNA의 PCR 산물과 분해된 플라스미드를 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 IPTG를 이용한 r47 단백질의 유도 및 조추출물로부터 r47의 분획화(fractionation)을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 pH 8.0의 DEAE 음이온 교환컬럼(anion exchange column)에서 r47 단백질의 분획화(fractionation)를 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 pH 7.0의 DEAE 음이온 교환컬럼에서 r47 단백질의 분획화를 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.
도 5는 r47 단백질 서열의 블라스트(Blast) 검색 결과이며,
도 6은 r47 과 세린 프로테아제(serine protease) 간의 보존 도메인(conserved domains)을 비교한 차트이다.
쯔쯔가무시병(scrub typhus of tsutsugamushi disease)은 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamishi) 균의 감염에 의해 발생하는 치명적인 열병이다. 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamishi)는 그람 음성 세균이지만 지질다당류(lipopolysaccharide)나 펩티도글리칸층(peptidoglycan layer)을 갖지 않는다. 오리엔티아 분리체(Orientia isolates)는 그들의 항원 특성에 있어서 매우 변이적이다. 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamishi)의 주요 표면 단백질은 변이성 56 kDa 단백질(variable 56 kDa protein)이다. 오리엔티아에 대한 혈청형-특이적 모노클로날 항체(serotype-specific monoclonal antibodies)는 상기의 56 kDa 단백질과 반응한다. 쯔쯔가무시병을 앓고 있는 환자 대부분의 혈청은 상기의 단백질을 인식하지만 또 다른 47 kDa 단백질을 인식하기 때문에, 이러한 사실로부터 56 kDa과 47 kDa의 2개 단백질이 진단용 항원으로서 좋은 후보가 될 수 있으며, 이들 2개 단백질의 융합단백질은 면역 조성물(immunogenic composition)로서 잠재적인 유용성을 가짐을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 서열목록 서열번호 1의 r47 절단형 단백질, r56 절단형 단백질; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 쯔쯔가무시병 면역 조성물(immunogenic composition)을 일반적으로 제공할 수 있다.
상기의 47 kDa 항원은 막 단백질이다. 수용액에서 적절하게 접혀진 r47 단백질을 생산하기 위하여, 그것의 소수성 도메인(hydrophobic domain)을 함유하는 n-말단(n-terminus)을 절단한다. 서열목록 서열번호 7로 표시되는 174번째 내지 1481번째 뉴클레오티드로 구성된 유전자 단편을 증폭하기 위하여 서열목록 서열번호 5의 정방향 프라이머(forward primer) 및 서열목록 서열번호 6의 역방향 프라이머(reverse primer)를 설계하였다. 상기로부터 얻은 증폭된 유전자 단편을 pET24a 벡터에 클로닝하였다. 그 결과 발현된 단백질 서열은 서열목록 서열번호 1에 기재하였다.
본 발명의 구체예에 따르면, 쯔쯔가무시병(scrub typhus)에 대한 면역 조성물(immunogenic composition)은 서열목록 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 r56 절단형 단백질 중 어느 하나와 결합된 r47 절단형 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
복용량 및 투여(Dosing and Administration)
상기 면역 조성물의 최적 복용량은 인간의 경우, 0.5~20 mg, 영장류는 0.5~2.5 mg이다. 상기 면역 조성물은 피하주사를 통해 투여한다.
본 발명은 피험자로부터 시료를 얻고, 상기 시료를 분석기기 내에서 서열목록 서열번호 1로 표시되는 절단형 r47 단백질에 노출시키는 과정을 포함하는 쯔쯔가무시병에 대한 항체를 탐색하기 위한 분석방법을 제공한다. 그러한 분석기기는 ELISA 플레이트(ELISA plates), 닷-블랏 매트리스(dot-blot matrices), 및 핸드 헬드 크로마토그래픽 분석 장치 및 플로우 스루 분석 장치(hand held chromatographic and flow through assay devices)로 구성되는 군에서 선택할 수 있다. 항체를 탐색하거나 또는 실험용 항체에 의해 항원을 탐색하는 상기 분석방법에 적합한 시료는 혈액, 타액 및 뇨를 포함한다.
본 발명은 서열목록 서열번호 1의 절단형 r47 단백질과 서열목록 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 군에서 선택되는 절단형 r56 단백질의 융합단백질에 대한 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 약제학적으로 유효한 함량으로 투여하는 것을 포함하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 절단형 r56 단백질에 대한 항체들 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 상기 조성물을 투여함으로써 HIV 환자의 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기의 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4 또는 그들의 융합단백질로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 상기 조성물의 복용량 및 투여는 상기의 면역 조성물에서 언급한 것과 동일하다.
본 발명은 서열목록 서열번호 1로 표시되는 절단형 r47 단백질에 대한 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여, HIV 환자의 HIV 바이러스 수를 감소시킬 수 있음을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료용 조성물에 관한 것이다. 이 조성물의 복용량 및 투여 또한 상기에서 언급한 것과 동일하다.
또한, 본 발명은 r47 절단형 단백질 및 절단형 r56 단백질의 융합단백질에 대한 항체들 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 약제학적 조성물을 투여하여 HIV 환자의 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료용 조성물에 관한 것이다. 이 조성물의 복용량 및 투여 또한 상기에서 언급한 것과 동일하다.
본 발명은 절단형 r47 단백질 및 서열목록 서열번호 2 내지 4의 절단형 r56 단백질 및 그들의 융합단백질에 대한 항체들을 유효성분으로 포함하는 HIV 감염에 대한 면역 조성물에 관한 것이다. 그 복용량 및 투여 또한 상기에서 언급한 것과 동일하다.
실시예에서 투여량 및 투여방법은 상기 서술된 바와 같다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 예시를 나타낸 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
47 kDa(accession No. L31934.1)을 특정하는 정방향 및 역방향 DNA 프라이머(각각 서열번호 5-6)는 BamH1 및 NcoI(둘다 NEB 유래) 제한부위를 사용하여 설계되었고, 오리엔티아 쯔쯔가무시(O. tsutsugamushi)의 카프 종(karp strain) 유래의 정제된 DNA를 이용하여 절단형 47 kDa 단백질의 유전자 코딩을 증폭시키기 위한 PCR에 사용되었다.
PCR 산물(삽입)을 플라스미드 pET24d(Novagen)에 접합시키고 BamH1 및 NcoI로 절단(digested) 시켰다. 삽입물(insert)의 서열을 확인하고, 상기 접합시킨 플라스미드는 BL21(DE3) 세포(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 접합된 플라스미드를 포함하는 콜로니를 2YT 배지에서 배양하고 IPTG 1mM로 37℃에서 3시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 이 발현된 단백질을 정제하기 위해, Ching et al.(Clin. diag. Lab. Immuno. 5, 519-526, 1998)이 개발한 방법에 따라, BL21(DE3) 세포 600 mL를 배양하고, 유도하고, 원심분리하여 세포 펠렛을 5 mM EDTA 및 1 mM PMSF를 함유하는 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 용해시켰다. 초음파 분쇄 및 원심분리 후, 상기 발현된 단백질은 응집체(inclusion body)보다는 상등액(supernatant)에 존재한다. 이 분획은 30,000 MW 컷오프(cutoff) 막 여과 및 20 mM Tris pH 8.0 및 2 M NaCl염 농도구배를 이용한 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피(Agilent 1100 HPLC)에 의해 더욱 정제되었다. 또는, 상기 단백질은 20 mM Tris pH 7.0 및 2 M NaCl 염 농도구배를 이용한 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피로 분리되었다. 상기 염 농도구배로 용리된 단백질을 획득하여, SDS-PAGE로 분석하고, 각 분획의 순도를 알아보기 위해 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색하였다. 경우에 따라, SDS-PAGE 분석을 위해 서로 다른 분획을 함께 부었다.
47 kDa 단백질 서열과 다른 공지 단백질의 상동성은 표준 BLAST 방법으로 검색하였고, 47 kDa 단백질의 보존 도메인의 분석은 NCBI CDD 알고리즘을 이용하여 분석하였다(도 5-6). 또한, 47 kDa 단백질과 유사한 도메인을 가진 단백질은 집단(family) 내에 보존된 아미노산 서열을 분석하기 위해 함께 정렬하였다.
결과
47 kDa 단백질을 위한 DNA 코딩은, 오리엔티아 쯔쯔가무시 카프 종(O. tsutsugamushi karp strain) 유래의 정제된 DNA를 주형으로서 이용하고 이 유전자를 특정하도록 설계된 프라이머를 이용하여 성공적으로 PCR 증폭되었다(도 1). 이 PCR 산물의 Pet24d(+) 플라스미드로의 클로닝은 BamH1 및 NcoI로 절단 후 확인되었고(도 1), DNA 서열은 DNA 시퀀서(sequencer)로 검증되었다.
47 kDa 단백질의 발현은 37℃에서 1 mM IPTG로 3시간 발현 유도 후 관찰되었다(도 2). 이 발현된 단백질의 서열은 단백질 시퀀서로 확인되었다. 초음파 처리 및 원심분리 후, 상기 발현된 단백질은 Ching et al.의 보고에서 r56 단백질의 경우처럼 응집체(inclusion body)에 결합되어 있기 보다는 첫 번째 원심분리 후의 상등액(도 2)에 주로 존재한다. 상기 발현된 단백질은 막 분획(membrane fraction)에 결합되어 있을 수 있으며, 세정제(detergent)(1%의 NP40)의 첨가는 정제 과정 중에 수율을 향상시키는 것으로 나타났다(데이터 표시 없음). r47을 함유하는 상등액의 일부는 먼저 pH 8.0 트리스 버퍼를 이용한 DEAE 음이온 교환 HPLC로 정제하고 단백질을 NaCl 농도구배(0.8 mM 까지)로 용리하고, 각 분획을 획득하여 SDS-PAGE로 분석하였다(도 3). 상등액의 또다른 일부는 pH 7.0 Tris 완충액을 이용한 HPLC로 정제하고 단백질을 NaCl 농도구배(2 M 까지)로 용리시켰다. 얻어진 각 분획은 r47을 위해 분석하였다(도 4).
표준 BLAST로 r47의 유사성을 검색한 결과, 다양한 세린 프로테아제(serine proteases)와 상동성을 나타냈다(도 5). r47를 NCBI에 저장된 단백질 보존 도메인 데이터베이스에 대해 검색한 결과, 트립신 유사(77.7%의 보존 도메인 범위(217 잔기)가 정렬됨) 및 PDZ 도메인(73.3%의 보존 도메인 범위(86 잔기)가 정렬됨)이 확인되었다. 상기 2 도메인은 서로 다른 세린 프로테아제와 연관되어 있다(도 6).
실시예 2: 47 kDa 쯔쯔가무시병 항원(antigens)과 결합된 오리엔티아 쯔쯔가무시 유래의 재조합 56 kDa 단백질로 유도되는 상동성 보호 평가
r56 및 r47 단백질의 감염에 대한 보호 효과를 평가하기 위해, 마우스에 다양한 투여량으로 카프 종(Karp strain) 유래의 r56 및 r47 단백질 성분을 투여하였다. 본 발명자의 선행 실험(Annual Report J2_00_NMRC)에서 r56 25 ㎍ 또는 2 ㎍으로 면역시킨 쥐는 보호 효과를 나타냈으므로, 이번 실험에서 동일한 투여량을 사용하여 r56 을 실험하였다. r47 단백질에 대해서는 적정 투여량을 알 수 없으므로, 5 ㎍ 및 25 ㎍의 투여량으로 시작하기로 하였다. 알루미늄(Alum) 및 CpG를, 단백질: Al+3 : CpG = 1 : 25 : 10 의 비율로 하여 보조제로 사용한다. 알루미늄은 오랫 동안 인체 사용이 허용되어 왔다. 알루미늄 히드록사이드 겔(alhydrogel)에 흡착되는 항원에 의해 제조된 백신은 여러 가지 유리한 점이 있다. 항원의 함량은 표준화하기 쉬우며 백신의 안정성이 우수하다. 항원이 흡착된 알루미늄 히드록사이드 겔은 간편하고 사용하기에 더욱 편리하다. 또한, 면역화에 따른 국소적 반응의 정도는 감소된다. CpG는 IL12 및 IFN-γ의 지배를 받는 Th1-유사 사이토카인 생산 패턴을 유도하며 Th2 사이토카인은 거의 분비하지 않는다.
4-5주령의 13-15g 무게의 암컷 CD1 마우스는 찰스 리버 연구소(Charles River Laboratories, Wilmington, MA.)에서 구입하였다.
각 실험은 마우스 5~7 그룹을 포함시켰다. 80-85% 신뢰수준에서 20% 유의성으로 보호 효능을 선택하기 위해서는 최소 15~20마리 마우스가 필요하다. 20마리 마우스의 각 그룹은, 음성 대조군을 제외하고, 56 kDa 항원 단독 또는 r47 항원과 함께 근육주사에 의해 면역화시켰다. 마우스 15마리는 4주 후 면역 테스트에 제공되며, 5마리는 T-세포 면역 반응을 측정하기 위해 테스트 직전에 희생시켰다. 자세한 실험 설계는 다음과 같다.
실험 1 (5 그룹)
1. 음성 대조군 : PBS 단독
2. r56 25 ㎍ 단독
3. 47 kDa 25 ㎍ 단독
실험 2 (7 그룹)
1. 음성 대조군: 실험 1의 그룹 1과 동일
2. r56 25 ㎍ + 47 kDa 5 ㎍
3. r56 25 ㎍ + 47 kDa 25 ㎍
실험 3 (5 그룹)
1. 음성 대조군 : PBS 단독
2. r56 2 ㎍ 단독
3. 47 kDa 2 ㎍ 단독
실험 4 (7 그룹)
1. 음성 대조군 : 실험 1의 그룹 1과 동일
2. r56 2 ㎍ + 47 kDa 5 ㎍
3. r56 2 ㎍ + 47 kDa 2 ㎍
면역 반응의 모니터링
(a) 항체 검출 : 마우스 혈청을 면역 전 및 실험 전 즉시 뽑았다. 각 혈청 시료는 각 항원에 대한 항체 검출을 위해 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 2번 반복하여 분석하였다. 항 마우스 IgG 및 IgM 페록시다아제-표지된 컨쥬게이트 (Boehringer-Mannheim, indianapolis, IN)가 테스트되었다.
(b) 혈청에서 사이토카인 검출 : 사이토카인은 생리학적으로나 병리학적으로 감염시 면역 조절 기능에 촛점을 맞추어 연구되어 왔다. IFN 감마 및 IL-4는 각각 Th1 및 Th2 세포를 위한 사이토카인이다. 많은 세포내 감염에 있어서, IL-12는 Th1 반응, 즉, IFN-감마 생성을 유도한다. IFN 감마 및 IL-2 레벨은 56 kDa로 면역된 마우스의 비장 단핵 세포에서 증가하였다. IFN 증가는 만성적으로 오리엔티아에 감염된 마우스의 비장 세포 및 림프절 세포에서도 관찰되었다. 오리엔티아는 배양된 마우스 세포에서 INF 감마에 민감하다고 보고되었다. 쯔쯔가무시병 감염된 환자의 혈청에서 G-CSF, M-CSF, IFN 감마, TNF 알파의 레벨은 향상 조절되었다. 마우스 혈청을 면역 전, 면역 2, 4, 6, 8, 10 , 15, 30일 후에 헤파린 중에서 채혈하였다. 혈청 시료는 두번 반복하여 IFN 감마, TNF 알파, IL-4, IL-12, G-CSF, M-CSF의 사이토카인 레벨에 대해 분석하였다.
(C) 항원 특이적 T-세포에 의한 사이토카인 생성 : 재조합 항원에 의해 자극된 비장 단핵 세포(SMNC)를, 자극 1, 2, 3일 후에 IFN 감마 및 IL-2의 생성에 대해 모니터하였다. 세포는 Ficoll-Hypaque(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되었다. 세척 후, 세포를 따뜻한 RPMI-10 중에서 5 x 106 cells/mL 농도로 재현탁하고, 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다. 해당 재조합 항원으로 배양 후, 배양 상등액을 수득하여 사이토카인 분석에 이용하였다. 세 번의 SMNC 배양으로부터 얻은 상등액을 모으고, 모든 시료는 세번 반복하여 분석하였다. 상등액 중 항원에 의해 자극된 SMNC 유래의 IL-2 활성은, 항 IL-4 항체(11B11; 10 ㎍/mL)의 존재 하에서 IL-2 의존성 CTLL-2 세포의 생장을 돕는 IL-2의 능력을 테스트하였다. INF 감마 및 IL-4 레벨은, 제조사의 설명서에 따라 ELISA 키트(Genzyme, Boston, Mass.)에 의해 측정하였다. CD4 및 CD8 세포는 MACS direct MicroBeads (Miltenri Biotec, Auburn CA)를 이용하여 어떤 세포가 사이토카인을 생성하는지 결정하기 위해 선택되었다.
(d) 비장 세포의 증식 반응 : SMNC는 상기 서술한 바와 같이 얻었다. 서로 다른 양의 재조합 단백질 또는 오리엔티아 카프에 의한 자극 후, 배양물은 5% CO2 의 습한 환경에서 37℃, 72시간 동안 배양하였다. 총 1 uCi의 [3H] 티미딘(thymidine)을 각 웰에 첨가하고 18시간 더 배양하였다. 세포를 글래스 피버 필터 스트립(glass fiber filter strips)에 모으고, [3H] 티미딘과 결합된 것을 액체 섬광계수기(liquid scintillation counter)로 계수하였다.
실시예 3: 면역 조성물에 의해 면역된 피험자 유래의 면역글로불린으로 바이러스의 양을 감소시키는 HIV 환자의 치료에 대한 예측 실시예
HIV 감염에 대한 동물 모델은 현재 없다. 그러나 인간의 CD-4 유전자를 갖는 형질전환된 쥐는 HIV에 감염될 수 있다. 이러한 형태의 쥐가 다음 실험에 사용되었다.
마우스를 HIV로 감염시키고, 2달 후, 한 그룹의 마우스는, 상기 면역 조성물로 면역시킨 쥐와 동일한 타입의 과량의 면역 혈장(hyper immune plasma)으로 처리하였다(그룹 1). 다른 그룹의 마우스는, 대조군으로 기능하도록 정상 혈장으로 처리하였다(그룹 2). 각 그룹에서 1주 간격으로 4번 혈액을 채혈하였다. 혈중 HIV 양은 실시간 PCR로 정량하였다. 그룹 1의 결과를 그룹 2의 결과와 비교한 결과, 과량의 면역 혈장에 의해 바이러스 양이 감소한 것으로 나타났다.
결론
절단형(truncated) 47 kDa 단백질은 성공적으로 복제되고 BL21 세포에서 과발현되었다. 과발현된 단백질은 정제 과정을 복잡하게 하는 응집체(inclusion body)에 존재하지 않았다. 세정제(detergent)의 첨가는 r47의 양을 증가시켰는데 이는 단백질이 막 분획에 결합되어 있음을 의미한다. 조 추출물을 25,000 MW 컷오프로 투석함으로써 다소 정제되나, pH 8.0 또는 pH 7.0 완충액 및 염 농도구배를 이용한 음이온 교환 컬럼 상에서 더욱 정제되며, 단백질은 아직 완전히 정제되지는 않았다. r47의 pI는 8.2 인 것으로 예측되며, 양이온 교환이 정제에 더욱 적합한 것으로 시사된다. 원하는 순도를 달성하기 위해서는 r47 을 양이온 교환 및 겔 여과에 의해 정제하는 실험이 계속되게 된다.
본 발명의 주요 내용은 상기와 같으며, 이것이 여러 가지 방법으로 변형될 수 있음은 자명할 것이다. 그러한 변형은 본 발명의 범위 및 범주로부터 벗어난 것으로 간주되지 않으며, 그러한 모든 변형 및 수정은 하기 특허청구범위의 범위 내인 것으로 간주된다.
염기서열
서열목록 서열번호 1: r47 절단형 단백질의 염기서열
DNA 염기서열의 184-1458의 번역 서열을 나타내며, 굵은 글씨는 N-터미날 단백질 시퀀싱을 통해 확인된 것이다.
서열목록 서열번호 2: r56 단백질 Karp(Ching)
Ching에 의해 확인된 r56의 염기서열을 나타낸 것으로, 아미노산 서열 80-456이다. 올바른 아미노산 서열은 굵은 글씨체로 표시함.
서열목록 서열번호 3: r56 단백질 서열(Kato)
서열목록 서열번호 4: r56 단백질(Gilliam)
프라이머 셋트
a. 정방향 프라이머: 타겟 유전자의 염기서열로써 125-174
b. 역방향 프라이머: 타겟 유전자의 1443-1477의 서열.
서열목록 서열번호 7: PCR 증폭된 염기서열: 174-1481 뉴클레오티드. 발현된 DNA 서열: 184-1458 뉴클레오티드, 아미노산은 42-466, 코딩 부위는 굵은 글씨체부분임.
본 발명은 r47 절단형 단백질, r56 절단형 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 쯔쯔가무시병 백신을 제공한다. 또한, 본 발명은 r47 및 r56 단백질들 그리고 이들의 항체들을 이용하여 HIV 바이러스 수를 감소하는 방법을 제공한다.
<110> THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE SECRETARY OF THE NAVY <120> Orientia tsutsugamushi truncated recombinant outer membrane protein (r47) and (r56) vaccines diagnostics and therapeutics for scrub typhus and HIV infection <150> US60/380,301 <151> 2002-05-15 <150> PCT/US03/15072 <151> 2003-05-15 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 425 <212> PRT <213> Orientia tsutsugamuchi <400> 1 Met Val Asn Ser Leu Ser Asp Ile Val Glu Pro Leu Ile Ser Thr Val 1 5 10 15 Val Ser Ile Tyr Ala Val Asp Thr Asn Ile Gly Ile Ser Phe Asn Asn 20 25 30 Lys Val Ser Lys Tyr Gln Gln Glu Val Phe Leu Gly Ser Gly Val Ile 35 40 45 Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Ile Val Thr Asn Glu Asn Val Ile Ala Gly 50 55 60 Ala Glu Asn Ile Lys Val Lys Leu His Asp Gly Ser Glu Leu Ile Ala 65 70 75 80 Glu Leu Val Gly Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Ala Leu Leu Lys Ile 85 90 95 Asn Ser Pro Ala Ala Leu Ser Tyr Ala Thr Phe Gly Asp Ser Asn Gln 100 105 110 Ser Arg Val Gly Asp Gln Val Ile Ala Ile Gly Ser Pro Phe Gly Leu 115 120 125 Arg Gly Thr Val Thr Asn Gly Ile Ile Ser Ser Lys Gly Pro Asp Met 130 135 140 Gly Asn Gly Ile Val Thr Asp Phe Ile Gln Thr Asn Ala Ala Ile His 145 150 155 160 Met Gly Ser Phe Gly Gly Pro Met Phe Asn Leu Glu Gly Lys Ile Ile 165 170 175 Gly Ile Asn Ser Ile His Val Ser Tyr Ser Gly Ile Ser Phe Ala Ile 180 185 190 Pro Ser Asn Thr Val Leu Glu Ala Val Glu Cys Leu Lys Lys Gly Glu 195 200 205 Lys Ile Arg Arg Gly Met Leu Asn Val Met Leu Asn Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Glu Leu Asn Glu Asn Leu Gly Leu Lys Gln Asp Gln Asn Gly Val Leu 225 230 235 240 Ile Thr Glu Val Ile Lys Glu Gly Ser Ala Ala Gln Cys Gly Ile Ala 245 250 255 Pro Gly Asp Val Ile Thr Lys Phe His Asp Lys Glu Ile Lys Thr Gly 260 265 270 Arg Asp Leu Gln Val Ala Val Ser Ser Thr Met Leu Asn Ser Glu Arg 275 280 285 Glu Val Glu Leu Leu Arg Asn Gly Lys Ser Met Thr Leu Lys Cys Lys 290 295 300 Ile Ile Ala Asn Lys Gly Glu Asp Ser Glu Gln Gln Ser Asn Asp Gln 305 310 315 320 Ser Leu Val Val Asn Gly Val Lys Phe Val Asp Leu Thr Pro Asp Leu 325 330 335 Val Lys Lys Tyr Asn Ile Thr Ser Ala Asn Asn Asn Gly Leu Phe Val 340 345 350 Leu Glu Val Ser Pro Asn Ser Ser Trp Gly Arg Tyr Gly Leu Lys Met 355 360 365 Gly Leu Arg Pro Arg Asp Ile Ile Leu Ser Val Lys Arg Asp Asp Asn 370 375 380 Lys Lys Asp Ile Ser Val Lys Thr Leu Arg Glu Ile Val Thr Asn Ile 385 390 395 400 Lys His Asn Glu Ile Phe Phe Thr Val Gln Arg Gly Asp Arg Met Leu 405 410 415 Tyr Ile Ala Leu Pro Asn Ile Asn Lys 420 425 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Orientia tsutsugamuchi <400> 2 Met Thr Ile Ala Pro Gly Phe Arg Ala Glu Ile Gly Val Met Tyr Leu 1 5 10 15 Thr Asn Ile Thr Ala Gln Val Glu Glu Gly Lys Val Lys Ala Asp Ser 20 25 30 Val Gly Glu Thr Lys Ala Asp Ser Val Gly Gly Lys Asp Ala Pro Ile 35 40 45 Arg Lys Arg Phe Lys Leu Thr Pro Pro Gln Pro Thr Ile Met Pro Ile 50 55 60 Ser Ile Ala Val Arg Asp Phe Gly Ile Asp Ile Pro Asn Ile Pro Gln 65 70 75 80 Gln Gln Ala Gln Ala Ala Gln Pro Gln Leu Asn Asp Glu Gln Arg Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Ile Ala Trp Leu Lys Asn Cys Ala Gly Ile Asp Tyr Arg 100 105 110 Val Lys Asn Pro Asn Asp Pro Asn Gly Pro Met Val Ile Asn Pro Ile 115 120 125 Leu Leu Asn Ile Pro Gln Gly Asn Pro Asn Pro Val Gly Asn Pro Pro 130 135 140 Gln Arg Ala Asn Pro Pro Ala Gly Phe Ala Ile His Asn His Glu Gln 145 150 155 160 Trp Arg His Leu Val Val Gly Leu Ala Ala Leu Ser Asn Ala Asn Lys 165 170 175 Pro Ser Ala Ser Pro Val Lys Val Leu Ser Asp Lys Ile Thr Gln Ile 180 185 190 Tyr Ser Asp Ile Lys His Leu Ala Asp Ile Ala Gly Ile Asp Val Pro 195 200 205 Asp Thr Ser Leu Pro Asn Ser Ala Ser Val Glu Gln Ile Gln Asn Lys 210 215 220 Met Gln Glu Leu Asn Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Glu Ser Phe Asp 225 230 235 240 Gly Tyr Leu Gly Gly Asn Ala Phe Ala Asn Gln Ile Gln Leu Asn Phe 245 250 255 Val Met Pro Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gly Gln Gly Gln Lys Ala Met 260 265 270 Glu Lys Leu Ala Ala Gln Gln Glu Glu Asp Ala Lys Asn Gln Gly Glu 275 280 285 Gly Asp Cys Lys Gln Gln Gln Gly Thr Ser Glu Lys Ser Lys Lys Gly 290 295 300 Lys Asp Lys Glu Ala Glu Phe Asp Leu Ser Met Ile Val Gly Gln Val 305 310 315 320 Lys Leu Tyr Ala Asp Val Met Ile Thr Glu Ser Val Ser Ile 325 330 <210> 3 <211> 529 <212> PRT <213> Orientia tsutsugamuchi <400> 3 Met Lys Lys Ile Met Leu Ile Ala Ser Ala Met Ser Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Phe Ser Ala Ser Ala Ile Glu Leu Gly Asp Glu Gly Gly Leu Glu 20 25 30 Cys Gly Pro Tyr Ala Lys Val Gly Val Val Gly Gly Met Ile Thr Gly 35 40 45 Val Glu Ser Thr Arg Leu Asp Pro Ala Asp Ala Gly Gly Lys Lys Gln 50 55 60 Leu Pro Leu Thr Thr Ser Met Pro Phe Gly Gly Thr Leu Ala Ala Gly 65 70 75 80 Met Thr Ile Ala Pro Gly Phe Arg Ala Glu Leu Gly Val Met Tyr Leu 85 90 95 Ala Asn Val Lys Ala Glu Val Glu Ser Gly Lys Thr Gly Ser Asp Ala 100 105 110 Asp Ile Arg Ser Gly Ala Asp Ser Pro Met Pro Gln Arg Tyr Lys Leu 115 120 125 Thr Pro Pro Gln Pro Thr Ile Met Pro Ile Ser Ile Ala Asp Arg Asp 130 135 140 Leu Gly Val Asp Ile Pro Asn Val Pro Gln Gly Gly Ala Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Asp Asn Leu Gly Ala Asn Asp Ile Arg Arg Ala Asp Asp Arg Ile 165 170 175 Thr Trp Leu Lys Asn Tyr Ala Gly Val Asp Tyr Met Val Pro Asp Pro 180 185 190 Asn Asn Pro Gln Ala Arg Ile Val Asn Pro Val Leu Leu Asn Ile Pro 195 200 205 Gln Gly Pro Pro Asn Ala Asn Pro Arg Gln Ala Met Gln Pro Cys Ser 210 215 220 Ile Leu Asn His Asp His Trp Arg His Leu Val Val Gly Ile Thr Ala 225 230 235 240 Met Ser Asn Ala Asn Lys Pro Ser Val Ser Pro Ile Lys Val Leu Ser 245 250 255 Glu Lys Ile Val Gln Ile Tyr Arg Asp Val Lys Pro Phe Ala Arg Val 260 265 270 Ala Gly Ile Glu Val Pro Ser Asp Pro Leu Pro Asn Ser Ala Ser Val 275 280 285 Glu Gln Ile Gln Asn Lys Met Gln Glu Leu Asn Asp Ile Leu Asp Glu 290 295 300 Ile Arg Asp Ser Phe Asp Gly Cys Ile Gly Gly Asn Ala Phe Ala Asn 305 310 315 320 Gln Ile Gln Leu Asn Phe Arg Ile Pro Gln Ala Gln Gln Gln Gly Gln 325 330 335 Gly Gln Gln Gln Gln Gln Ala Gln Ala Thr Ala Gln Glu Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Val Arg Val Leu Asn Asn Asn Asp Gln Ile Ile Lys Leu 355 360 365 Tyr Lys Asp Leu Val Lys Leu Lys Arg His Ala Gly Ile Lys Lys Ala 370 375 380 Met Glu Glu Leu Ala Ala Gln Asp Gly Gly Cys Asn Gly Gly Gly Asp 385 390 395 400 Asn Lys Lys Lys Arg Gly Ala Ser Glu Asp Ser Asp Ala Gly Gly Ala 405 410 415 Ser Lys Gly Gly Lys Gly Lys Glu Thr Lys Glu Thr Glu Phe Asp Leu 420 425 430 Ser Met Ile Val Gly Gln Val Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Thr 435 440 445 Glu Ser Phe Ser Ile Tyr Ala Gly Leu Gly Ala Gly Leu Ala Tyr Thr 450 455 460 Ser Gly Lys Ile Asp Gly Val Asp Ile Lys Ala Asn Thr Gly Met Val 465 470 475 480 Ala Ser Gly Ala Leu Gly Val Ala Ile Asn Ala Ala Glu Gly Val Tyr 485 490 495 Val Asp Ile Glu Gly Ser Tyr Met His Ser Phe Ser Lys Ile Glu Glu 500 505 510 Lys Tyr Ser Ile Asn Pro Leu Met Ala Ser Phe Gly Val Arg Tyr Asn 515 520 525 Phe <210> 4 <211> 524 <212> PRT <213> Orientia tsutsugamuchi <400> 4 Met Lys Lys Ile Met Leu Ile Ala Ser Ala Met Ser Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Phe Ser Ala Ser Ala Ile Glu Leu Gly Glu Glu Gly Gly Leu Glu 20 25 30 Cys Gly Pro Tyr Gly Lys Val Gly Ile Val Gly Gly Met Ile Thr Gly 35 40 45 Ala Glu Ser Thr Arg Leu Asp Ser Thr Asp Ser Glu Gly Lys Lys His 50 55 60 Leu Ser Leu Thr Thr Gly Leu Pro Phe Gly Gly Thr Leu Ala Ala Gly 65 70 75 80 Met Thr Ile Ala Pro Gly Phe Arg Ala Glu Leu Gly Val Met Tyr Leu 85 90 95 Arg Asn Ile Ser Ala Glu Val Glu Val Gly Lys Gly Lys Val Asp Ser 100 105 110 Lys Gly Glu Ile Lys Ala Asp Ser Gly Gly Gly Thr Asp Thr Pro Ile 115 120 125 Arg Lys Arg Phe Lys Leu Thr Pro Pro Gln Pro Thr Ile Met Pro Ile 130 135 140 Ser Ile Ala Asp Arg Asp Val Gly Val Asp Thr Asp Ile Leu Ala Gln 145 150 155 160 Ala Ala Ala Gly Gln Pro Gln Leu Thr Val Glu Gln Arg Ala Ala Asp 165 170 175 Arg Ile Ala Trp Leu Lys Asn Tyr Ala Gly Ile Asp Tyr Met Val Pro 180 185 190 Asp Pro Gln Asn Pro Asn Ala Arg Val Ile Asn Pro Val Leu Leu Asn 195 200 205 Ile Thr Gln Gly Pro Pro Asn Val Gln Pro Arg Pro Arg Gln Asn Leu 210 215 220 Asp Ile Leu Asp His Gly Gln Trp Arg His Leu Val Val Gly Val Thr 225 230 235 240 Ala Leu Ser His Ala Asn Lys Pro Ser Val Thr Pro Val Lys Val Leu 245 250 255 Ser Asp Lys Ile Thr Lys Ile Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Phe Ala Asp 260 265 270 Ile Ala Gly Ile Asp Val Pro Asp Thr Gly Leu Pro Asn Ser Ala Ser 275 280 285 Val Glu Gln Ile Gln Ser Lys Met Gln Glu Leu Asn Asp Val Leu Glu 290 295 300 Asp Leu Arg Asp Ser Phe Asp Gly Tyr Met Gly Asn Ala Phe Ala Asn 305 310 315 320 Gln Ile Gln Leu Asn Phe Val Met Pro Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln 325 330 335 Gly Gln Gly Gln Gln Gln Gln Ala Gln Ala Thr Ala Gln Glu Ala Val 340 345 350 Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Leu Asn Gly Asn Asp Gln Ile Ala Gln 355 360 365 Leu Tyr Lys Asp Leu Val Lys Leu Gln Arg His Ala Gly Val Lys Lys 370 375 380 Ala Met Glu Lys Leu Ala Ala Gln Gln Glu Glu Asp Ala Lys Asn Gln 385 390 395 400 Gly Glu Gly Asp Cys Lys Gln Gln Gln Gly Ala Ser Glu Lys Ser Lys 405 410 415 Glu Gly Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Asp Leu Ser Met Ile Val Gly 420 425 430 Gln Val Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Thr Glu Ser Phe Ser Ile 435 440 445 Tyr Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala His Thr Tyr Gly Lys Ile Asp 450 455 460 Asp Lys Asp Ile Lys Gly His Thr Gly Met Val Ala Ser Gly Ala Leu 465 470 475 480 Gly Val Ala Ile Asn Ala Ala Glu Gly Val Tyr Val Asp Leu Glu Gly 485 490 495 Ser Tyr Met His Ser Phe Ser Lys Ile Glu Glu Lys Tyr Ser Ile Asn 500 505 510 Pro Leu Met Ala Ser Val Gly Val Arg Tyr Asn Phe 515 520 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 125-174 as target gene sequence <400> 5 tatgcatacc atggtaaata gtttatctga t 31 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of 1443-1477 as target, 35bp <400> 6 cgcctggatc ctagatttac ttattaatat taggt 35 <210> 7 <211> 1308 <212> DNA <213> PCR amplified sequence: 174-1481 nt.expressed DNA sequence:184-1458 nt, aa 42-466 <400> 7 tatgcatatt atggtaaata gtttatctga tatagttgag ccattaatat ctacagtagt 60 aagtatttat gctgtagata ctaacattgg tattagtttt aataataagg tatctaagta 120 tcagcaagaa gtgttcttag gttctggggt tatcattgat agttctgggt atattgttac 180 taatgagaat gttatagcag gagctgaaaa tataaaagta aagttgcatg atggttcaga 240 actcatagca gaattagttg gtagtgacaa taaaattaat atagctttat taaaaattaa 300 ttctccagca gcattatctt atgcgacttt tggcgactca aatcagtcta gagtaggaga 360 tcaggttatt gcaataggaa gtccttttgg tttaagagga acagtaacaa atggcattat 420 ttcttctaaa ggaccagata tgggtaacgg catagtaact gattttattc aaactaatgc 480 tgctattcat atgggtagct ttggtggacc gatgtttaat cttgaaggaa aaattattgg 540 aattaattcc attcacgtat cttactcagg cataagtttt gctattccat ctaatactgt 600 acttgaagca gttgaatgct taaaaaaagg agaaaaaatt cgtcgtggta tgttaaatgt 660 tatgcttaat gaattaactc cagaattaaa tgagaattta ggacttaaac aagatcaaaa 720 tggagttcta ataactgaag ttataaaaga aggatctgca gcacaatgtg gaattgctcc 780 tggagatgta attactaaat ttcatgataa agagatcaaa acagggagag atttacaggt 840 agctgtatct tcaactatgc ttaattctga aagagaagtt gagcttttac gtaatggtaa 900 gtcgatgact ctaaaatgta aaattattgc caacaaaggt gaggatagtg agcaacaaag 960 taatgatcaa agccttgtgg ttaatggtgt aaaatttgtt gatcttacac ctgatttagt 1020 gaagaaatat aatattactt cagctaataa taatgggtta tttgtccttg aagtttcgcc 1080 taactcttct tgggggagat atggtttaaa aatggggcta agacctagag atataatttt 1140 atcagttaaa cgtgatgata ataaaaaaga tatttctgtt aaaactctaa gagaaatagt 1200 gacaaatata aagcataatg aaattttctt tacagtgcaa agaggagata gaatgcttta 1260 cattgcttta cctaatatta ataagtaaat ctagtttaaa ggcgattt 1308

Claims (25)

  1. r47 절단형 단백질, r56 절단형 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus)의 면역 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 r47 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 1에 기재되어 있음을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus)의 면역 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4에 기재된 아미노산 서열에서 선택됨을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus)의 면역 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4에 기재된 아미노산 서열에서 선택되는 2개의 단백질임을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus)의 면역 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4에 기재된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병(scrub typhus)의 면역 조성물.
  6. r47 절단형 단백질 및 r56 절단형 단백질의 융합단백질에 대한 항체를 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유효량은 피하주사로 투여됨을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 r47 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 1에 기재됨을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택됨을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택되는 2개의 단백질임을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질을 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병 환자의 치료방법.
  12. 다음의 단계를 포함하는 쯔쯔가무시병의 탐색방법:
    a) ELISA 플레이트(ELISA plates), 닷-블랏 매트리스(dot-blot matrices), 및 핸드 헬드 크로마토그래픽 분석 장치 및 플로우 스루 분석 장치(hand held chromatographic and flow through assay devices)로 구성된 군에서 선택되는 분석기기에서, r47 절단형 단백질과 r56 절단형 단백질의 융합단백질 또는 상기 융합단백질에 대한 실험용 항체들을 상기 시료에 첨가함; 및
    b) 상기 시료에서 상기 융합단백질에 대한 항체들을 탐색하거나 또는 상기 분석기기에서 상기 시료 내 상기 실험용 항체들에 대한 항원을 탐색하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 뇨 또는 타액을 포함함을 특징으로 하는 쯔쯔가무시병의 탐색방법.
  14. r47 절단형 단백질과 서열목록 서열번호 2 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 r56 절단형 단백질 및 이들의 융합단백질에 대한 항체들 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 이를 투여함으로써 HIV 환자의 HIV 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 r47 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 1에 기재됨을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  16. r47 절단형 단백질과 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택되는 r56 절단형 단백질 및 이들의 융합단백질, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 HIV 감염에 대한 면역 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 r47 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 1에 기재됨을 특징으로 하는 HIV 감염에 대한 면역 조성물.
  18. r56 절단형 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하고, 이들을 투여함으로써 HIV 환자의 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택됨을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택되는 2개의 단백질임을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 조성물은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 HIV 환자 치료용 약제학적 조성물.
  22. r47 절단형 단백질과 r56 절단형 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 약제학적 유효량으로 투여하여 상기 HIV 환자의 바이러스 수를 감소시킴을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택됨을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열에서 선택되는 2개의 단백질임을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료방법.
  25. 제 22항에 있어서, 상기 r56 절단형 단백질은 서열목록 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 HIV 환자의 치료방법.
KR1020047018448A 2002-05-15 2003-05-15 쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56백신을 이용한 진단 및 치료 KR20050027985A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38030102P 2002-05-15 2002-05-15
USUS60/380,301 2002-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050027985A true KR20050027985A (ko) 2005-03-21

Family

ID=29549950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047018448A KR20050027985A (ko) 2002-05-15 2003-05-15 쯔쯔가무시병 및 ＨＩＶ 감염에 대한 오리엔티아쯔쯔가무시 절단형 재조합 외막 단백질 ｒ47 및 ｒ56백신을 이용한 진단 및 치료

Country Status (5)

Country Link
US (2) US7306808B2 (ko)
JP (1) JP2005538948A (ko)
KR (1) KR20050027985A (ko)
AU (1) AU2003234538A1 (ko)
WO (1) WO2003096974A2 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003234538A1 (en) * 2002-05-15 2003-12-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Orientia tsutsugamuchi truncated recombinant outer membrane protein (r47) and (r56) vaccines diagnostics and therapeutics for scrub typhus and HIV infection.
CN102027020A (zh) * 2008-05-16 2011-04-20 海军部长代表的美国政府 用于诊断和预防丛林斑疹伤寒的重组嵌合抗原
AU2012302146A1 (en) 2011-09-02 2014-04-03 Burt's Farm, LLC Personal care compositions comprising squash or pumpkin extract
WO2015167029A1 (ko) * 2014-04-28 2015-11-05 서울대학교산학협력단 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 백신 조성물
KR101742236B1 (ko) * 2014-10-29 2017-05-31 인하대학교 산학협력단 쯔쯔가무시병에 대한 면역 조성물 및 이의 제조방법
CN113307852A (zh) * 2021-07-15 2021-08-27 李家斌 一种用于恙虫病东方体47kDa蛋白的诱导表达及纯化方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6482415B1 (en) * 1997-12-24 2002-11-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Expression and refolding of truncated recombinant major outer membrane protein antigen (r56) of Orientia tsutsugamushi and its use in antibody based detection assays and vaccines
US7335477B2 (en) * 1997-12-24 2008-02-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Truncated recombinant major outer membrane protein antigen (r56) of Orientia tsutsugamushi strains Karp, Kato and Gilliam and its use in antibody based detection assays and vaccines
AU2003234538A1 (en) * 2002-05-15 2003-12-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Orientia tsutsugamuchi truncated recombinant outer membrane protein (r47) and (r56) vaccines diagnostics and therapeutics for scrub typhus and HIV infection.

Also Published As

Publication number Publication date
US20080044806A1 (en) 2008-02-21
US7306808B2 (en) 2007-12-11
JP2005538948A (ja) 2005-12-22
US7820395B2 (en) 2010-10-26
WO2003096974A3 (en) 2004-09-16
AU2003234538A1 (en) 2003-12-02
WO2003096974A2 (en) 2003-11-27
US20060039920A1 (en) 2006-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4764445B2 (ja) 結核の免疫治療および診断のための化合物およびそれらの使用方法
Liu et al. Immunological characterizations of the nucleocapsid protein based SARS vaccine candidates
EP1347055B1 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis
KR101895768B1 (ko) 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질
Takahashi et al. Immunogenicity and protective effect against oral colonization by Streptococcus mutans of synthetic peptides of a streptococcal surface protein antigen.
Prabhakar et al. Identification of an immunogenic histone-like protein (HLPMt) ofMycobacterium tuberculosis
US20100166786A1 (en) A mycobacterium tuberculosis fusion protein and uses thereof
US7846675B2 (en) Truncated recombinant major outer membrane protein antigen (R56) of orientia tsutsugamushi strains karp, kato and gilliam and its use in antibody based detection assays and vaccines
Ortona et al. Molecular and immunological characterization of the C‐terminal region of a new Echinococcus granulosus Heat Shock Protein 70
US7820395B2 (en) Orientia tsutsugamushi truncated recombinant outer membrane protein (R47) and (R56) vaccines diagnostics and therapeutics for scrub typhus
US7189398B2 (en) Broad spectrum pyrogenic exotoxins antagonists and vaccines
EP1810033A2 (en) Immunogenic glycopeptides for diagnosing pathogenic microorganisms infections
KR20060053966A (ko) 슈퍼-항원 융합 단백질들 및 그 용도
MX2012005522A (es) Uso de una fuente de l3 y/o l5 como vacuna o como diagnostico para una enfermedad parasitaria.
TWI650330B (zh) 辨識瀰漫性分支桿菌感染病人中抗丙型干擾素自體抗體之抗原決定區及其應用
Bockenstedt et al. Identification of a Borrelia burgdorferi OspA T cell epitope that promotes anti-OspA IgG in mice.
GB2239246A (en) Protein antigen from Mycobacterium tuberculosis
GB2345061A (en) Protein and nucleic acid sequences of groES and groEL from B.pseudomallei and their use as a vaccine
US5976543A (en) 12-kDa protein derived from M. Tuberculosis useful for treatment of autoimmune diseases
US7638130B2 (en) Truncated recombinant major outer membrane protein antigen (R56) of Orientia tsutsugamushi strains Karp, Kato and Gilliam and its use in antibody based detection assays and vaccines
Ivanyi The use of monoclonal antibodies for the characterization and production of Mycobacterium leprae antigens
VELGE-ROUSSEL et al. DIFFERENCES IN IMMUNOLOGICAL RESPONSE TO A zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTS T. GONDII PROTEIN (SAGl) DERIVED PEPTIDE BETWEEN TWO STRAINS OF MICE: EFFECT ON PROTECTION IN T. CONLIZ/INFECTION
WO1996017864A1 (en) A 12-kda protein derived from m. tuberculosis useful for treatment of autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid