MX2012005522A

MX2012005522A - Uso de una fuente de l3 y/o l5 como vacuna o como diagnostico para una enfermedad parasitaria.

Info

Publication number: MX2012005522A
Application number: MX2012005522A
Authority: MX
Inventors: Manuel Soto Alvarez; Carlos Alonso Bedate; Laura Ramirez Garcia
Original assignee: Leti Sl Lab
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-09-28
Also published as: TN2012000217A1; AP2012006275A0; EP3101028A1; ZA201203516B; CN107551264A; CY1118402T1; AR080621A1; IL219770A0; IL219770A; CN107551264B; HK1176074A1; CA2780740C; JP2013510823A; MX341066B; WO2011058137A1; EA201290319A1; ECSP12011951A; US20120263746A1; BR112012011395B1; CN102712684A

Abstract

Composición que comprende una fuente de L3 y/o L5 y opcionalmente un adyuvante para la preparación de una medicina para el tratamiento o prevención de una enfermedad parasitaria y su uso en el diagnóstico de dicha enfermedad parasitaria.

Description

USO DE UNA FUENTE DE L3 Y/O L5 COMO VACUNA O COMO DIAGNÓSTICO PARA UNA ENFERMEDAD PARASITARIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una fuente de L3 y/o L5 para la preparación de un medicamento o una medicina para usar como tratamiento, prevención, y/o diagnóstico de una enfermedad parasitaria.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Leishmaniasis comprende diferentes enfermedades causadas por parásitos protozoarios intracelulares que pertenecen al género Leishmania que principalmente infectan macrófagos de una variedad de mamíferos que incluye humanos y perros. Dependiendo en gran medida de las especies de los parásitos y del estado inmunocompetente del huésped humano, el espectro de enfermedad varía en un rango entre leishmaniasis cutánea autolimitante (CL) y leishmaniasis visceral fatal (VL) o kalaazar (18) . La leishmaniasis canina viscerocutánea (VCL) causada por Leishmania infantum y L. chagasi es una zoonosis emergente importante encontrada en países alrededor de la cuenca del Mediterráneo, en el Medio Este y en Latinoamérica (16) ; siendo los perros el mayor reservorio de estos parásitos jugando un papel central en la transmisión a humanos por mosquitos simúlidos flebotóminos (44) . El resultado de la infección es determinado por interacciones entre el sistema inmune del huésped y las diferentes especies de parásitos, no obstante la patogénesis de leishmaniasis permanece poco clara y el conocimiento de los mecanismos involucrados . en . la respuesta inmune a Leishmania en humanos y perros aún es limitado. Generalmente, la inmunidad protectora está asociada con una respuesta inmune clásica mediada por células que induce la activación de macrofagos por citoquinas derivadas de células T. Por otra parte, la enfermedad no limitante está asociada con la generación de respuestas humorales fuertes (15, 24).

La investigación para el desarro"! 1c ' de vacuna", dr. segunda generación, basadas en fracciones de parásitos en crudo o en antigenos de parásito definidos, se dirigió a la identificación de diferentes moléculas parasitarias de superficie o secretadas que han sido ensayadas como candidatos de vacunas en diferentes modelos experimentales usando diversos adyuvantes (1, 17, 20, 43, 45, 46, 49, 50) . El tamizaje de bibliotecas de expresión con suero ¿e animales o humanos infectados también ha permitido la selección de unos pocos antigenos como vacunas candidatas (revisión en (9)). Entre ellos, aquellos que producen como respuesta principalmente una respuesta inmune de tipo Thi en ratones o células de pacientes humanos infectados, sin tener en cuenta su localización celular, han sido implicados en la generación de respuestas protectoras en diferentes modelos animales (48, 51, 52) . Por otra parte, algunos de los antigenos aislados son proteínas conservadas intracelulares que predominantemente estimulan respuestas humorales, en humanos o perros que sufren de respuestas humorales mediadas por VL o Th2 en ratones infectados experimentalmente (3, 33, 35, 37, 39) . La respuesta humoral no adecuada inducida contra ellos en perros que sufren de leishmaniasis se piensa que resulta en inmunopatología, principalmente debido a los efectos adversos de complejos inmunes tal como uveítis (13), lesiones del sistema nervioso central (14) o nefritis (21, 22, 30, 31) . Recientemente también ha sido mostrado que la presencia de complejos inmunes IgG en humanos con VL se correlaciona con una incapacidad para resolver infecciones, demostrando que los complejos inmunes pueden ser pe judiciales para el huésped infectado (27) .

En lugar de no ser consideradas al principio como buenas candidatas- para vacuna, las proteínas que- inducen una' alta respuesta humoral durante el proceso infeccioso han sido asociadas con la inducción de una respuesta protectora. Por ejemplo, tubulinas parasitarias y la histona fueron reconocidas por clones de células T H2B derivadas de un donante inmune (36). Adicionalmente, rK39 causa proliferación y producción de IFN-? por células T de ratones inmunes (23.) También ha sido mostrado que la inmunización genética con genes H2B, H3 y H4 de parásito induce protección en modelos murinos de leishmaniasis visceral (62). Además, la inmunización con el receptor para quinasa C . activada (LACK) (29), algunas cistein proteinasas parasitarias (38, -41) o las histonas parasitarias formadoras del nucleosoma (11, 19) administrado con adyuvantes promotores de Thi generan respuestas inmunes que se correlacionan con protección contra leishmaniasis cutánea en modelos murinos.

Entre los antigenos evolutivamente conservados de LeishmanJLa,- diferentes lineas de evidencia sugieren- qi?^. proteínas ribosomales son moléculas inmunológicamente relevantes durante la infección con Leishmania. En algunos casos, constituyentes ribosomales pueden contribuir a la disfunción del sistema inmune del huésped por su capacidad para modular actividades celulares y liberación de citoquinas durante la infección. Por lo tanto, la inyección de la ¦proteína ¿ibosomar S3a de L. major en- -ratones BAL3 c indujo la expansión policlonal de clones de células B e inhibió la proliferación de células T (10). Además, la inmunización genética con una vacuna de ADN que codifica para la proteína ribosomal de 60S putativa L31 exacerbó la enfermedad en modelos de ratones por la inducción de citoquinas IL-10 y Th2 (41, 63). Adicionalmente, algunas proteínas ribosomales parasitarias como las proteínas P ácidas parasitarias han sido relacionadas con la generación de fuertes respuestas humorales en perros y humanos que sufren de leishmaniasis (revisión en (39) ) . Sin embargo, también' ha sido mostrado que diferentes proteínas ribosomales ensayadas no tuvieron la capacidad de inducir una respuesta inmunogénica protectora o, la respuesta inmunogénica protectora obtenida ' fue subóptima (55, 41) .

A pesar de todos los intentos hasta el momento, aún no hay vacunas valiosas contra una enfermedad parasitaria tal como, l.eishmaniasis.. Por lo- tanto, aún hay una - necesidad importante por dicha vacuna.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En este trabajo, los inventores sorprendentemente muestran que dos proteínas ribosomales L3 y L5 de L. major son antigénicas. Esto significa que cada una de estas dos proteínas fue reconocida por el suero de individuos afectados con leishmaniasis. Adicionalmente, - en el - modele murino de leishmaniasis cutánea, se encontraron anticuerpos anti-L3 y anti-L5 del isotipo IgGl. La inmunización de ambas proteínas en ratones BALB/c, en presencia de CpG-ODN, indujo una respuesta Thl contra ellos. Como resultado de la vacunación, los ratones fueron protegidos contra 'el desarrollo de CL luego del enfrentamiento con L. major. Los inventores además demostraron que las proteínas de L major también podían conferir protección contra la infección con L. braziliensis . Los inventores además demostraron que las proteínas ribosomales L3 y L5 están altamente conservadas al menos entre diferentes especies de Leishmania. Dichas composiciones son muy atractivas para ser usadas como una composición farmacéutica preferentemente como diagnóstico, una vacuna, o una aplicación terapéutica. La invención se describe adicionalmente más adelante.

USO . Pn .un primer aspecto de la inven ión,- r-.o provee el ur-o de una fuente de L3 y/o L5 y opcionalmente un adyuvante para la preparación de una medicina o un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad parasitaria en un su eto .

Las proteínas L3 y L5 son proteínas ribosomales. Las proteínas ribosomales son proteínas citosólicas bien ¦conservadas-;- Por lo tanto, "se puede preparar una- fuente de ~L3; y/o L5 a partir de cualquier organismo eucariota, sea vegetal o animal, sea de mamíferos, reptiles, peces, insectos, o cualquier otro organismo que posea cromosomas, tal como protozoarios . Preferentemente una fuente de L3 y/o L5 se obtiene de un organismo que es cercano a la enfermedad, preferentemente un organismo que causa enfermedad parasitaria en el árbol evolutivo. Por lo tanto, de particular interés como una fuente de L3 y/o L5 a ser usada en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad parasitaria están los protozoarios como Plasmodium y en particular miembros de la familia tripanosomátide, más en particular diferentes especies del protozoario tripanosomático Leishmania . Hay más de 20 especies conocidas de Leishmania , que incluye especies del subgénero Leishmania , que comprende el complejo L. major, que incluye L. major, el complejo L. donovani, que incluye L. chagasi, L. donovani y L. infantum, el complejo L. mexicana, que .incluye L. ama zonensis y L- mexicana¡ sí como las subespecies Viannia, que comprende el complejo L. braziliensis, que incluye L. braziliensis y L. peruviana y el complejo L. guyanensis, que incluye L. guyanensis y L. panamensis . Las especies de Plasmodium de interés particular son Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax. En una forma de realización preferida, se obtiene una fuente de L3 y/o L5 a partir-- de -especies de Leishmania,- preférente-mente -Leishmania major, Leishmania infantum, Leishmania donovani, Leishmania mexicana , Leishmania chagasi y/o Leishmania braziliensis . Más preferentemente se obtiene una fuente de L3 a partir de especies de Leishmania, preferentemente Leishmania major, Leishmania infantum y/o Leishmania Mexicana. Más preferentemente se obtiene una fuente de L5 a partir de especies de Leishmania , preferentemente Leishmania major, Leishmania infantum, Leishmania braziliensis y/o Leishmania mexicana. En el Ejemplo 2, los inventores demostraron la existencia de homólogos de L3 y L5 altamente conservados (identidad de al menos 90%, véase tabla 1) en al menos tres especies diferentes de Leishmania . En otra forma de realización preferida, se obtiene una fuente de L3 y/o L5 a partir de especies de Plasmodium. La persona con experiencia entenderá que una fuente de L3 y/o L5 también se puede preparar por mezcla de una fuente de L3 y/o L5 de varios organismos diferentes como se identif ca en · la prese te. El uso de una fuente de L3 y/o L5 en una vacuna ha sido demostrado en la presente para que tenga propiedades inmunogénicas atractivas ya que se ha mostrado que induce una respuesta inmune protectora en un sujeto tratado.

El término "una fuente de L3 y/o una de L5" puede ser reemplazado por "una fuente de L3 y/o de L5". Una fuente de -L-3 -y/o una de L5 preferentemente -comprende una proteina L3 y/o una L5, un péptido derivado de L3 y/o de L5 o fragmento de proteina y/o un ácido nucleico que codifica para una proteina o péptido derivado o fragmento de proteina de L3 y/o de L5. Una proteina L3 preferida está representada por SEQ ID NO:l. Esta proteina L3 preferida se origina de Leishmania major y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: 2. Otra proteina L3 preferida está representada por SEQ ID NO: 48. Esta proteina L3 preferida se origina de Leishmania infantum y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: 9. Otra 5. proteina L3 preferida está representada por SEQ ID NO: 50.

Esta proteina L3 preferida se origina de Leishmania mexicana y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: 51.

Una proteina L5 preferida está representada por SEQ ID NO: 3. Esta proteina L5 preferida se origina de Leishmania 0 major y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: . Otra proteina L5 preferida está representada por SEQ ID NO: 52. ..Esta proteina L5 preferida se origina de Leishmania infantum y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: 53. Otra proteina L5 preferida está representada por SEQ ID NO: 54. Esta proteina L5 preferida se origina de Leishmania mexicana y está preferentemente codificada por SEQ ID NO: 55. Otra proteina L5 preferida está representada por SEQ ID NO: 56. Esta proteina L5 preferida se origina de Leishmania -¦— brazi-M-en-si-s-- y está preferentemente codificada- -por SEQ H) NO:65.

A lo largo de esta solicitud, cada vez que se refiere a una secuencia de nucleótidos especifica SEQ ID NO (tomar SEQ ID NO:2 ó 4 ó 49 ó 51 ó 53 ó 55 ó 65 como ejemplo), se puede reemplazar por una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO:2 ó 4 ó 49 ó 51 ó 53 ó 55 ó 65.

A lo largo de esta solicitud, cada vez que se refiere a una secuencia de . aminoácidos especifica SEQ ID NO (tomar SEQ ID NO:l ó 3 ó 48 ó 50 ó 52 ó 54 ó 56 como ejemplo), se puede reemplazar por un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:l ó 3 ó 48 ó 50 ó 52 ó 54 ó 56.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de L3 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID N0:1 ó 48 ó 50 y/o que está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:2 ó 49 ó 51.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida una -fuente de L5 es un polipéptido que · comprende -'una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ó 52 ó 54 ó 56 y/o que está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 4 ó 53 ó 55 ó 65.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de L3 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:2 ó 49 ó 51 y/o que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:l ó 48 ó 50.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida una fuente de L5 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 ó 53 6 55 ó 65 y/o que-, codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 3 ó 52 ó 54 ó 56.

Preferentemente, dicha secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud con una secuencia especifica de aminoácidos o nucleótidos están abarcadas en la presente invención y se •dice- qu-e son funcionóle-* cuando la proteína o "polipéptido, fragmento de proteina, o péptido codificado aún tiene la capacidad de provocar al menos la respuesta inmune que se puede obtener con SEQ ID NO:l ó 3 ó 48 ó 50 ó 52 ó 54 ó 56 en al menos alguna medida. En al menos alguna medida preferentemente significa al menos 50%, al menos 60%, 70%, 80%, al menos 90% o 100%. Provocar una respuesta inmune se define más adelante en la presente: un compuesto es funcional cuando tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune en un sujeto tratado que preferentemente significa que tiene la capacidad de promover o iniciar una respuesta inmune Thi contra un dado antigeno L3 y/o L5 y/o que tiene la capacidad de prevenir y/o retrasar el desarrollo de una lesión dérmica o mucosa y/o induce una reducción significativa de la carga parasitaria en una lesión dérmica y/o mucosa y/o en un oído y/o en un nodulo linfático de drenaje (DLN) que preferentemente drena cualquiera de estas regiones infectadas (región dérmica, mucosa, oído) .· así como e un órgano interno tal como hígado, bazo, médula ósea, riñon, cerebro, etc. una secuencia de aminoácidos abarcada por la presente invención puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones y/o inserciones y/o eliminaciones y/o aminoácidos N- o C-terminal adicionales o grupos químicos para aumentar la estabilidad, solubilidad e inmunogeneicidad .

- --Un fragmento de proteína L3 y/c L5 o un péptido derivado de L3 y/o L5 como se define en la presente preferentemente es un fragmento que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de una proteína L3 y/o L5 correspondiente y que tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune como se definió anteriormente en la presente. En una forma de realización preferida, por consiguiente, un fragmento de proteína L3 y/o L5 o un péptido derivado de L3 y/o L5 como se definió en la · presente preferentemente es un fragmento que comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:l ó 3 ó 48 ó 50 ó 52 ó 54 ó 56.

Como una forma de realización preferida, un fragmento preferido de proteína L3 o un péptido preferido derivado de ,L3, comprende o .consiste de los últimos 40, 39, 38, ..-.37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contiguos de la parte C-terminal de una proteína L3. Incluso más preferentemente, comprende o consiste de los últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:l ó 48 ó 50. Incluso más preferentemente, comprende o consiste de ios aminoácidos entre 394 y 419 de SEQ ID NO:l. Como otra forma de realización preferida, un fragmento preferido de proteína L5 o un péptido preferido derivado de L5, comprende o consiste de los primeros 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contiguos de la parte N-terminal de una proteina L5. Incluso más preferentemente, comprende o consiste de los primeros 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3 ó 52 ó 54 ó 56. Incluso más preferentemente, comprende o consiste de los aminoácidos entre 1 y 23 de SEQ ID NO: 3. Como otra forma de realización preferida, un fragmento preferido de proteina L5 o un péptido preferido derivado de L5, comprende o consiste de los últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 aminoácidos contiguos de la parte .. C-terminal de una proteina L5, Incluso- más preferentemente, comprende o consiste de los últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 3 ó 52 ó 54 ó 56. Incluso más preferentemente, comprende o consiste de los aminoácidos entre 322 y 328 de SEQ ID NO: 3. En otra forma de • realización preferida, una fuente de L3 y L5 .comprende -una' proteina que comprende al menos un fragmento proteico de una proteina L3 y al menos un fragmento proteico de una proteina L5. Más preferentemente, un fragmento de proteina L3 y un fragmento de proteina L5 han sido fusionados entre si para formar una proteina quimérica. Por consiguiente, la invención también abarca un ácido nucleico o un ácido nucleico que codifica para dicha fuente de L3 y L5.

En una forma de realización preferida, una fuente de L3 y/o de L5 comprende al menos una proteina L3 y/o L5 y/o al menos un fragmento proteico de L3 y/o L5. E una forma de realización más preferida, una fuente de L3 y/o L5 comprende al menos dos proteinas L3 y/o L5 y/o al menos dos fragmentos proteicos de L3 y/o L5. Esta forma de realización se relaciona con una fuente basada en proteina, preferentemente una vacuna basada en proteina.

Se debe mencionar que en una forma de realización preferida una fuente de L3 y/o de L5 como se identifica- en la presente podría no implicar que abarque un extracto de proteínas ribosomales (RPE) como se identifica en WO 2009/090175. Un RPE se puede obtener realizando los siguientes pasos usando una célula de parásito que provoque una enfermedad parasitaria cuando está presente en un sujeto: a. mezclar una célula de parásito con una solución amortiguadora- para lisis, - b. centrifugar la mezcla obtenida para obtener un extracto citosólico, c. preparar un RPE a partir del extracto citosólico obtenido .

Por lo tanto en una forma de realización preferida, una fuente de L3 y/o de L5 no es un RPE como se definió anteriormente .

En otra forma de realización preferida, una fuente de L3 y/o de L5 comprende al menos un ácido nucleico que codifica para L3 y/o L5 y/o al menos un ácido nucleico que codifica para un fragmento de proteina de L3 y/o L5. En una forma de realización más preferida, una fuente de L3 y/o L5 comprende al menos dos ácidos nucleicos que codifican para una proteina L3 y/o L5 y/o al menos dos ácidos nucleicos que codifican para fragmentos proteicos de L3 y/o L5. Esta forma de realización se relaciona con una fuente basada en ácido nucleico,., preferentemente una vacuna basada en ácido nucleico .

La fuente de L3 y/o L5 puede ser una proteina, una digestión de la proteina y/o un fragmento de la misma, que puede estar en una forma purificada o puede estar comprendida en una composición en crudo, preferentemente de origen biológico, tal como un lisado bacteriano, lisado de levaduras, lisado fúngico, sonicade o fi-jado. Como alternativa, una fuente de L3 y/o L5 puede ser sintetizada químicamente o producida enzimáticamente in vitro. La fuente de una proteína L3 y/o L5, o fragmento de la misma, puede ser también un ácido nucleico que codifica para la misma, o fragmento de la misma, a partir de un molde de ARN o ADN . Las moléculas de ARN o ADN puede ser ADN "desnudo", preferentemente comprendidas en vesículas o liposomas, o pueden estar comprendidas en un vector. El vector puede ser cualquier vector de ADN o ARN (recombinante) conocido en el arte, y preferentemente es un plásmido; en donde los genes que codifican antígenos de latencia se unen operativamente a secuencias regulatorias que confieren expresión y traducción de mensajeros codificados. El vector también puede ser cualquier virus de ADN o ARN, tal como, a modo de ejemplo ilustrativo, Adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , un retrovirus, un lentivirus, virus de vacuna modificado (MVA) o virus . Eowlpox, o cualquier otrc vector viral con -capacidad de conferir expresión de polipéptidos en un sujeto elegido. Los vectores de ADN pueden ser que no sean de integración, tal como vectores de replicación episomal, o pueden ser vectores que se integran en el genoma del huésped por integración al azar o por recombinación homologa.

Las moléculas de ADN que comprenden genes que codifican para una proteína L3 y/o L5, o fragmentos -de la- misma de acuerdo a la presente invención, opcionalmente insertadas en un vector tal como un virus o plásmido, pueden ser integradas en un genoma de un sujeto. En una forma de realización preferida de la invención, dicho huésped puede ser un microorganismo. Preferentemente dicho microorganismo recombinante es un Mycobacterium, por ejemplo de las especies M. tuberculosis M. smegmatís (Yue. Y. et al, (2007), J. Virol. Meth., 141: 41-48, Cayabiyab Y. et al, (2006), J. Virol., 80: 1645-1652) o M. bovis y más preferentemente M. bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) o M. smegmatís, con capacidad de transportar a un huésped los polipéptidos o fragmentos de los mismos de acuerdo a la invención. El BCG recombinante y los métodos para recombinación son conocidos en el arte; por ejemplo, en WO2004094469. Dicho microorganismo recombinante puede ser formulado como una vacuna recombinante viva y/o atenuada viva, como por ejemplo en .Jacobs et al. 1987, Nature, 327 ( 6122 ): 532-5 ). El vector también puede estar comprendido en un huésped de origen bacteriano, tal como, a modo de ejemplo ilustrativo, bacteria Shigella o Salmonella atenuada viva y/o recombinante.

Cualquier adyuvante conocido se puede usar en la presente invención. La persona con experiencia conoce varios adyuvantes adecuados. Los adyuvantes se seleccionan más preferentemente a partir de la siguiente lista de adyuvantes: péptidos catiónicos (antimicrobianos) , saponina y ligandos de receptores tipo Toll (TLR) tal como, a modo de ejemplo ilustrativo, poli(I:C), motivos CpG, LPS, lipido A, lipopéptido Pam3Cys y flagelinas bacterianas o partes de las mismas, y sus derivados que tienen modificaciones químicas.

Otros adyuvantes para uso en el método y en composiciones de acuerdo a la invención son: mezclas con BCG vivo o muerto, complejos de inmunoglobulinas con los mencionados antigenos de latencia o partes de los mismos, IC31 (de www.intercell.com; en WO03047602), QS21/MPL (US200309597 ) , DDA/MPL (WO2005004911) , DA/TDB (WO2005004911 ; Holten-Andersen et al, 2004 Infect Immun. 2004 Mar; 72 (3) : 1608-17. ) y soluble LAG3 (CD223) (de www.Immunotep.com; US2002192195) .

Adicionalmente, otros adyuvantes preferidos incluyen el uso de Corynebacterium paryum o Propionobacterium acnés (64, 65, 66) .

. .Los adyuvantes . particularmente preferidos son aquellos que son conocidos por actuar a través de receptores tipo Toll. Los adyuvantes que tienen la capacidad de activar el sistema inmune, pueden ser activados particularmente bien a través de receptores tipo Toll (TLR) , que incluye TLR 1 - 10 y/o a través de proteina RIG-1 (gen-1 inducible por ácido retinoico) y/o a través de receptor de endotelina. Los compuestos con ¦ capacidad- de - activar receptores- -TLR, y · modificaciones y derivados de los mismos, están bien documentados en el arte. TLR1 puede ser activado por lipoproteinas bacterianas y formas acetiladas de las mismas, TLR2 además puede ser activado por glicolipidos bacterianos de Gram positivos, LPS, LPA, LTA, fimbrias, proteínas de membrana externa, proteínas de choque térmico de bacterias o del huésped, y Mycobacterial lipoarabinomannans . TLR3 puede ser activado por ARNds, en particular de origen viral, o por el compuesto químico poli(I:C). TLR4 puede ser activado por LPS de · Gram negativos, LTA, proteínas de choque térmico del. huésped o de origen bacteriano, proteínas de recubrimiento o envoltura viral, taxol o derivados del mismo, oligosacáridos que contienen hialuronano y fibronectinas . TLR5 puede ser activado con flagelos o flagelina bacteriana. TLR6 puede ser activado por lipoproteínas micobacterianas y factor soluble lábil al calor de Estreptococos de grupo B (GBS-F) o modulinas de .Estafilococos. TLR7 puede ser ' activado .por imidazoquinolinas y derivados. TLR9 puede ser activado por ADN CpG no metilado o complejos de cromatina - IgG. En particular TLR3, TLR4 , TLR7 y TLR9 juegan un papel importante mediando una respuesta inmune innata contra las infecciones virales, y los compuestos con capacidad de activar estos receptores son particularmente preferidos para eso en la invención. Los adyuvantes particularmente preferidos comprenden, a modo de ejemplo ilustrativo, compuestos producidos sintéticamente que comprende ARNds, poli(I:C), ADN CpG no metilado que activa los receptores TLR3 y TLR9, IC31, un agonista de TLR9, IMSAVAC, un agonista de TLR . En otra forma de realización preferida, los adyuvantes son unidos físicamente a una fuente de L3 y/o L5 como se definió anteriormente en la presente. La unión física de adyuvantes y compuestos coestimuladores o grupos funcionales, a epitopes de HLA de clase I y HLA de clase II que comprende péptidos provee. . una · respuesta inmune mejorada por . estimulación simultánea de células presentadoras de antígenos, en particular células dendríticas, que internalizan, metabolizan y presentan antígenos. Otro compuesto modificador de respuesta inmune preferido es un inhibidor de adhesión de células T, más preferentemente un inhibidor de un receptor de endotelina tal como BQ-788 (67). BQ-788 es N-cis-2, 6-dimetilpip.eridinocarbonil-L-gamir.a-metilleuciJ.-D -1-metoxicarboniltriptofanil-D-norleucina . Sin embargo cualquier derivado de BQ-788 o compuesto BQ-788 modificado también se abarca en el alcance de esta invención.

Otros adyuvantes incluyen PL-SE (Glaxo Smithkline Biologicals, Bélgica) o EM005 (IDRI América) .

En una forma de realización preferida, un adyuvante es ün adyuvante que promueve Thi (por ejempio · un- adyuvante que comprende un motivo CpG ODN) . Un adyuvante que promueve Thl ha sido definido en la literatura (68) como un adyuvante que tiene la capacidad de promover o iniciar una respuesta inmune hi contra un dado antígeno cuando se usa junto con este antígeno (aquí una fuente de L3 y/o de L5) como se detecta en sobrenadantes de esplenocitos de un sujeto tratado cuando se cultiva con el antigeno. Como control, la promoción o inicio de una respuesta inmune Thl se evalúa en una población de esplenocitos del mismo sujeto que no ha sido tratado con el antigeno y el adyuvante, o con la misma población sólo tratada con el antigeno. El inicio o promoción de una respuesta inmune Thi preferentemente se define por la inducción de IFNy como se detecta en esplenocitos cultivados de un sujeto tratado con el antigeno y/o por inducción de la producción de inmunoglobulinas IgG2a especificas por antigeno. La evaluación de la inducción de esta citoquina preferentemente se realiza por ELISA en esplenocitos como se describe en el ejemplo. La evaluación de la inducción de IgG2a preferentemente se realiza por ELISA o transferencia Western como se describe en el ejemplo 1. La inducción de IFNy y/o IgG2a con la estimulación de esplenocitos con una fuente de L3 y/o L5 y un adyuvante preferentemente significa que el adyuvante es calificado como adyuvante promotor de Thl. · Como alternativa o en combinación con la primera definición de inicio o promoción de una respuesta inmune Thi dada anteriormente, el inicio o promoción de una respuesta inmune Thi puede ser definida además por la ausencia (o la ausencia de una inducción) de una respuesta inmune Th2. Una respuesta inmune Th2 está caracterizada por un aumento detectable en la inducción de IL-4, IL-10 y/o la producción de inmunoglobulinas IgGl detectables en comparación con esplenocitos no tratados. La evaluación de la inducción de IL-4 y/o . IL-10 preferentemente se realiza por- ELISA en esplenocitos como se describe en el ejemplo. La evaluación de la inducción de IgGl preferentemente se realiza por ELISA o transferencia Western como se describe en el ejemplo 1.

Como alternativa o en combinación con las dos primeras definiciones de inicio o promoción de una respuesta inmune Thi dadas anteriormente, inicio o promoción de una respuesta inmune Th-i- además se puede, definir por la generación de un aumento en la relación IFNy / IL-10 y/o relación IFNy / IL-4 y/o una disminución en la relación IgGl/IgG2a contra un antigeno definido, en ese caso una fuente de L3 y/o L5. En una forma de realización preferida, un cambio (aumento o disminución como se indica anteriormente) en cualquiera de estas relaciones de más de 2 indica que un adyuvante tiene propiedades Thl. La evaluación de la inducción de -cada una de las mencionadas citoquinas preferentemente se realiza por ELISA en esplenocitos como se describe en el ejemplo. La evaluación de la inducción de una inmunoglobulina IgGl o IgG2a preferentemente se realiza por ELISA o transferencia Western como se describe en el ejemplo 1.

En una forma de realización preferida, un adyuvante promotor de Th-1 es, o comprende, o consiste de, un oligodesoxinucleótido . Más preferentemente, un oligodesoxinucleótido (ODN) comprende, o consiste de, CpG en donde la C no está metilada (CpG ODN): 3' purina-CpG-5' pirimidina . Un oligodesoxinucleótido preferido es, o comprende, o consiste de, una secuencia ODN modificada con fosforotioato . El uso de oligodesoxinucleótidos que tienen dicha modificación es ventajoso ya que los oligodesoxinucleótidos entonces usados son más estables que los oligonucleótidos no modificados y por lo tanto no serán fácilmente degradados una vez que estén en el .torrente sanguíneo. Un adyuvante preferido promotor de Th-consiste de, o comprende, al menos un motivo CpG, al menos dos, o al menos tres. Las secuencias preferidas del ODN (5' a 3') inmunoestimulador fueron TCAACGTTGA (SEQ ID NO: 5) y GCTAGCGTTAGCGT (SEQ ID NO: 6). La persona con experiencia no está limitada a las secuencias descritas explícitamente en la presente. - Él/ella pueden- diseña... otras- -secuencias y posteriormente ensayar su propiedad promotora de Th-1 como se define anteriormente en la presente. Este adyuvante identificado CpG ODN preferido es muy atractivo ya que se demostró en el ejemplo que la coinoculación de LRPE con este I-adyuvante promotor de Thl induce protección contra un enfrentamiento con parásitos L. major en cepas de ratones BALB/c y C57BL/6. En ambos modelos, la protección se correlaciona con una producción específica de IFN-?. En BALB/c, también se detectó una restricción en la producción de IL-4 y IL-10.

La invención provee un uso de una fuente de L3 y/o L5 adecuada como una vacuna 1) preventiva (profiláctica), 2) post-exposición/infección o 3) terapéutica/curativa. Una ventaja de la presente invención es que permite la preparación de una preparación medicinal para el tratamiento de un espectro más amplio de enfermedades parasitarias es decir .una preparación medicinal con especificidad cruzada por especies. En muchas enfermedades parasitarias, una vacuna dirigida contra especies específicas, sólo funciona contra esas especies específicas. Un ejemplo de una enfermedad parasitaria en la cual este es el caso es leishmaniasis . Hasta la actualidad, la enfermedad es controlada con drogas, pero el tratamiento con drogas no previene la diseminación de la- enfermedad y en muchos casos no es · muy eficaz .- En una forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es leishmaniasis o malaria. Más preferentemente, una enfermedad parasitaria es causada por una especie de Leishmania o de Plasmodium. En otra forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es causada por una especie diferente de la especie de la cual la fuente de L3 y/o L5 deriva. En particular, la leishmaniasis causada por una especie del género Leishmania puede ser tratada usando una composición en base a una fuente de L3 y/o L5 a partir de otra especie de Leishmania ya que como se demostró en la sección experimental (véase ejemplo 2) homólogos de L3 y L5 de varias especies Leishmania están altamente conservados (al menos 90% de identidad, véase tabla 1) . Adicionalmente, los inventores ya han demostrado en la sección experimental (véase ejemplos 1 y 3) que proteínas L3 y L5 de Leishmania major tiene la capacidad de proteger contra una infección con Leishmania major o Leishmania braziliensis . En una forma de realización» leishmaniasis causada por L. major es tratada exitosamente con una composición que comprende una fuente de L3 y/o L5 de L. infantum, L. chagasi, L amazonensis o L. braziliensis . En otra forma de realización, leishmaniasis causada por L. chagasi o L. amazonensis es tratada exitosamente con una composición que comprende una fuente de L3 y/o L5 de L. infantum . -En otra forma de realización, leishmaniasis- causada por L. major o L. braziliensis es tratada exitosamente con una composición que comprende una fuente de L3 y/o L5 de L. major. Como alternativa, otras enfermedades parasitarias, tal como malaria, pueden ser tratadas exitosamente con una composición basada en una fuente de L3 y/o L5 de otra especie, por ejemplo basada en una fuente de ,L3 y/o L5 de L. infantum o L. major o L. mexicana o L. braziliensis .

En el contexto de la invención, un sujeto significa un humano o un animal. Un animal que está abarcado en el alcance de .. la invención incluye un mamífero, preferentemente un perro .

En una forma de realización preferida, una medicina (o preparación medicinal o composición farmacéutica o medicamento) como se define en la presente se usa para aumentar la capacidad del sistema inmune de un humano o animal para pelear contra una infección y/o una enfermedad, más preferentemente uña . infección con parásito y/o una enfermedad parasitaria. En particular, se puede usar para la administración a un sujeto humano o animal. Una medicina como se define en la presente preferentemente se administra parenteralmente, por ejemplo por inyección o infusión por ruta intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial o intralesión. Un modo de administración preferido es - subcutáneo . La- invención no- se limita- a- ün—modo específico de administración de una fuente de L3 y/o L5. Un modo preferido de administración es administración oral usando una cápsula o una tableta. Como alternativa, una fuente de L3 y/o de L5 se puede administrar localmente por medio de un catéter o una bomba, o un supositorio. Como alternativa, una fuente de L3 y/o L5 puede ser administrada tópicamente. La formulación de una fuente de L3 y/o L5 o de una composición que comprende una fuente de L3 y/o L5 depende del modo pretendido de administración y aplicación (terapéutica) . Un vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible, no tóxica para administrar una fuente de L3 y/o L5 a un sujeto. Por ejemplo se puede usar agua estéril, o sólidos o excipientes inertes como vehículo, usualmente complementado con adyuvantes, agentes amortiguadores, agentes de dispersión farmacéuticamente aceptables, y similares. Las composiciones estarán en forma tanto líquidas, por ejemplo una suspensión estabilizada de una fuente de L3 y/o L5, o una composición que comprende una fuente de L3 y/o de L5, o en sólido y/o seco: por ejemplo polvo. Para la administración oral y rectal, una fuente de L3 y/o de L5 se puede administrar en formas de dosificación sólida, tal como cápsulas, tabletas, supositorios, y polvos, o en formas de dosificación líquida, tal como elixires, jarabes, cremas-, ungüentos y suspensiones, ??-ra ·¦- forma puede ser una forma semisólida o semiliquida en donde está presente L3 y/o L5 como una forma líquida en o sobre un soporte sólido tal como un parche.

Se puede combinar una medicina con un medio o vehículo de administración farmacéuticamente aceptable por técnicas convencionales conocidas en el arte. Por ejemplo, se puede disolver una fuente de L3 y/o de L5 y opcionalmente un adyuvante en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Los métodos para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos en el arte y se describen con más detalle en diferentes fuentes, que incluye, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20ta edición, 2000, Williams & Wilkins, PA, EE.UU. Preferentemente se administra una medicina en una dosis terapéuticamente eficaz, es decir una que aumentará la capacidad del sistema inmune del humano o animal para pelear una infección ..y/o una enfermedad como se define en lá presente. Preferentemente, una dosis terapéuticamente eficaz de una preparación medicinal de la invención tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune como se define en la presente: una dosis es terapéuticamente eficaz cuando tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune en un sujeto tratado que preferentemente significa que tiene la capacidad - de- promover o iniciar una respuesta - inmüñé Tfti contra un dado antigeno L3 y/o L5 y/o que tiene la capacidad de prevenir y/o retrasar el desarrollo de una lesión dérmica o mucosa y/o induce una reducción significativa de la carga parasitaria en una lesión dérmica y/o mucosa y/o en un oído y/o en un nodulo linfático de drenaje (DLN) que preferentemente drena cualquiera de estas regiones infectadas (región dérmica, mucosa, oído) , asi como en un órgano interno tal como hígado, bazo, médula ósea, riñon, cerebro, etc. La evaluación de la presencia de una lesión dérmica se describe en el ejemplo 1 (véase figura 4: edema de almohadilla plantar) . La evaluación de la carga parasitaria se describe en el ejemplo (véase figura 4). Una dosis terapéuticamente eficaz de una medicina de la invención preferentemente prevendrá el desarrollo de una lesión dérmica y/o preferentemente inducirá una reducción de la carga parasitaria en un oído de aproximadamente 3 órdenes de magnitud y/o de aproximadamente una magnitud -similar en un DLN luego de un período de tiempo que comprende una primera vacunación usando una composición de la invención seguido por una infección secuencial con un parásito y un tiempo de espera de aproximadamente 6 semanas. En una forma de realización preferida, una medicina como se define en la presente es una vacuna. En una forma de realización más preferida, al menos 12 pg de una fuente de L3 - y/o de L5 -se está usando en una vacuna. La cantidad de una fuente de L3 y/o de L5 usada refiere a la cantidad total de L3 y L5 usada. Incluso en otra forma de realización preferida, se debe usar al menos entre 12 y 20 g de una fuente de L3 y/o de L5 para proveer una respuesta inmune opcionalmente en combinación con al menos 50µ? de un adyuvante, preferentemente un adyuvante promotor de Thi tal como por ejemplo, CpG ODN. Una vacuna como se define en la presente puede ser una vacuna profiláctica o una terapéutica. El volumen en el cual se puede disolver una fuente de L3 y/o de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferentemente un adyuvante promotor de Thl puede variar entre 100 y 500 microlitros.

Composición En otro aspecto, se provee una composición que comprende una fuente de L3 y/o de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferentemente un adyuvante promotor de Thi. Una fuente de L3 y/o de .L5 y un . adyuvante ya han sido definidos, n la presente. En una forma de realización preferida, una composición consiste de una fuente de L3 y/o de L5 y un adyuvante promotor de Thi . Un adyuvante promotor de Thi preferido es un CpG ODN. Una composición preferida comprende o consiste de una fuente de L3 y/o de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferentemente un adyuvante promotor de Thi dis-uelto- en- PBS. En otra forma de realización- preferida, también está abarcado por la presente invención que una fuente de L3 y/o de L5 y un adyuvante, preferentemente un adyuvante promotor de Thl se administran secuencialmente . Por lo tanto, ambos componentes no necesitan estar físicamente presentes en una única composición siempre que sean ambos administrados a un sujeto.

Dicha composición además puede comprender un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Dicha composición preferentemente es para uso como una medicina. La medicina preferentemente es una vacuna. La medicina, adyuvante y vacuna ya han sido extensamente definidos en la presente.

Una composición puede estar en forma líquida, sólida o semilíquida o semisólida tal como ya se definió en la presente .

En una forma de realización preferida, otros compuestos se usan secuencia! o simultáneamente con una fuente de L3 y/o de L5 con el objetivo de mejorar la especificidad del tratamiento terapéutico o profiláctico. Es ventajoso por ejemplo usar otros compuestos que potenciarán adicionalmente la respuesta inmune del sujeto tratado. Más preferentemente, dichos compuestos no están presentes en una única composición junto con una fuente de L3 y/o de L5. Por ejemplo dichos compuestos se . seleccionan de un grupe que consiste en una fuente de otras proteínas de un parásito que causa una enfermedad parasitaria (19) tal como Leishmaniasis . A una fuente de una dada proteína se le da en el mismo significado que una fuente de una L3 y/o una L5 como se definió anteriormente en la presente. Una proteína preferida en este contexto es una histona tal como H2A, H2B, H3, H4, otra proteína ribosomal tal como Li2A (LiP) , LiP2b (LiP' ) , LiPO, L2, L7, L8, L16, S6, L19 y S4.

Una proteína H2A preferida está representada por SEQ ID NO: 7. Un ácido nucleico preferido que codifica para una H2A está representado por SEQ ID NO: 8. Una proteína H2B preferida está representada por SEQ ID NO: 9. Un ácido nucleico preferido que codifica para una H2B está representado por SEQ ID NO: 10. Una proteína H3 preferida está representada por SEQ ID NO: 11. Un ácido nucleico preferido que codifica para una H3 está representado por SEQ ID NO: 12. Una proteína H4 preferida está representada por SEQ ID NO: 13. Un ácido nucleico preferido que codifica para una H4 está representado por SEQ ID NO: 14. Una Li2A también nombrada como proteína LiP2a está representada por SEQ ID NO: 15 ó 16. Un ácido nucleico preferido que codifica para una Li2A está representado por SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 17 es una secuencia genómica. La persona con experiencia podría derivar secuencias1 codificantes preferidas a partir dé-és-t'a secuencia genómica. Dichas secuencias codificantes preferidas corresponden a un ácido nucleico que codifica para un ARNm que codifica para una proteína Li2A representada por SEQ ID NO: 15 ó 16: una del nucleótido entre 791 y 1111 y una entre 1662 y 1982 de SEQ ID NO:17.

Una proteína LiP2b preferida está representada por SEQ ID NO: 18. Un ácido nucleico preferido que codifica para una LiP2b está representado por SEQ ID NO: 19. Una proteína LiPO preferida está representada por SEQ ID NO: 20. Un ácido nucleico preferido que codifica para una LiPO está representado por SEQ ID NO: 21.

Las SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 19 y 21 son secuencias qenómicas. La persona con experiencia podría derivar otras secuencias codificantes preferidas a partir de estas secuencias genómicas. Dichas otras secuencias codificantes preferidas corresponden a un ácido nucleico que codifica para un ARNm que codifica para la proteína respectiva: · Estas secuencias de ácido nucleico están representadas por SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72 y 73 respectivamente.

Una proteína L2 preferida está representada por SEQ ID NO: 22. Un ácido nucleico preferido que codifica para L2 está representado por SEQ ID NO: 23. Una proteína L7 preferida está representada por SEQ ID NO: 24. Un ácido nucleico preferido ¦que- codifica -para a L7 está representada por SEQ ID NO: 25. Una proteína L8 preferida está representada por SEQ ID NO: 26. Un ácido nucleico preferido que codifica para una L8 está representado por SEQ ID NO: 27. Una proteína L16 preferida está representada por SEQ ID NO: 28. Un ácido nucleico preferido que codifica para una L16 está representado por SEQ ID NO: 29. Una proteína L19 preferida está representada por SEQ ID NO: 30. Un ácido nucleico preferido que codifica para una L19 está representado por SEQ ID NO: 31. Una proteína S4 preferida está representada por SEQ ID NO: 32. Un ácido nucleico preferido que codifica para una S4 está representado por SEQ ID NO: 33. Una proteína S6 preferida está representada por SEQ ID NO: 34 . Un ácido nucleico preferido que codifica para una S6 está representado por SEQ ID NO: 35.

Otro ejemplo es el uso de poli-proteínas que contienen diferentes antígenos parasitarios (63, 65) . Un ejemplo de una poliproteína es proteína Q como se identifica en EP 1 141 305. Una molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína Q está representada por SEQ ID NO: 36. Una correspondiente proteína Q codificada está representada por SEQ ID NO: 37. La proteína Q o una parte o fragmento de la misma o una fuente de proteína Q o una fuente de un fragmento de proteína Q pueden ser usados en combinación con una fuente de L3 y/o L5. Otro ejemplo de una poliproteína es Leish-llOf • (69). Leish-llOf o una parte o un fragmento de -?-a· misma¦ o una fuente de Leish-llOf o una fuente de un fragmento de Leish- llOf se puede usar en combinación con una fuente de L3 y/o L5.

En el párrafo siguiente, una fuente de una proteína histona se toma como un ejemplo de una proteína que se puede usar en combinación con una fuente de una proteina L3 y/o L5. Lo mismo se aplica para otras proteínas definidas anteriormente, preferentemente otras proteínas ribosomales diferentes de L3 y/o L5. Los compuestos preferidos incluyen una proteína .histona o un fragmento de la misma, o . una molécula de ácido nucleico que codifica dicha histona o dicho fragmento de histona. Más preferentemente, una proteína histona es H2A, H2B, H3 y/o H4 como se identifica en EP 1 687 023. Las histonas H2A, H2B, H3 y H4 son proteínas nucleares bien conservadas y sus secuencias son bien conocidas en el arte, véase referencia 39. Preferentemente las histonas se obtienen a partir de un organismo que es cercano- en- ' el-- árbol evolutivo al organismo que causa la enfermedad. Por lo tanto, los protozoarios son de interés particular como una fuente de histonas para ser usadas en el tratamiento de enfermedades parasitarias tal como leishmaniasis y en miembros particulares de la familia tripanosomátide, aún más particular especies diferentes del protozoario t ipartosomático- Leishmania.

Otros compuestos preferidos incluyen otras proteínas ribosomales o fragmentos de las mismas o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína o fragmento de la misma. Los ejemplos de otras proteínas ribosomales incluyen Otros compuestos preferidos incluyen un extracto de proteínas ribosomales como se identifica en WO 2009/090175.

Cada uno de los compuestos o fuentes de cada uno de estos compuestos se puede usar en combinación con una fuente de una L3 ..y/o una fuente de L5. El uso combinado puede ser secuencial o simultáneo.

En una forma de realización preferida, se usa una fuente de L3 y/o de L5 en combinación con una fuente de S4 y/o de S6. Más preferentemente se usa en combinación una fuente de L3, de L5, de S4 y de S6. En otra forma de realización más preferida, se usa en combinación una fuente de L3, de L5 y de S4. ..En ' otra forma de realización más preferida, se usa en combinación una fuente de L3, de L5 y de S6. Los inventores demostraron (véase ejemplo 5) que el uso combinado de L3, L5 y S4 proveía protección sinérgica en comparación con el uso de L3 o L5 o S4 sola. En este contexto, una proteína S4 preferida está representada por SEQ ID NO: 32. Un ácido nucleico preferido que codifica para una S4 está representado por SEQ ID NO: 33. Una prcteína S6 preferida está -representada¦ por SEQ ID NO: 34. Un ácido nucleico preferido que codifica para una S6 está representado por SEQ ID NO: 35. El término "fuente" cuando se usa en "una fuente de S4 y/o de S6" tiene el mismo significado que el término "fuente" cuando se usa en "una fuente de L3 y/o de L5".

Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de S4 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que- tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:32 y/o el cual está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:33.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida una fuente de S6 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 y/o el cual está codificado por una secuencia de. nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 35.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de S4 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 33 y/o el cual codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 32.

Dependiendo del tipo de fuente usada (basada en proteina o basada en ácido nucleico) , la persona con experiencia sabrá qué tipo de formulación es adecuada. Una fuente puede ser administrada como tal (proteina o ácido nucleico desnudos) . Como alternativa, se puede administrar una fuente de ácido nucleico usando una construcción de ácido nucleico como se define en la presente.

Fuente de S6 En otro aspecto se provee una fuente de S6 o una composición que comprende o consiste de una fuente de S6 pero que no comprende una fuente de L3 y/o de L5 y/o de S4. Los inventores demostraron (véase ejemplo 4) que el uso de S6 sola proveía protección contra infección con Leishmania .

El término "fuente" cuando se usa en "una fuente de S6" tiene el mismo significado que el término "fuente" cuando se usa en ."una fuente de L3 y/o de L5", Cada uno de los usos o métodos o tipos de composiciones definidos en la presente que comprende una fuente de L3 y/o de L5 también se aplica para una fuente de S6.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida una fuente de S6 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o¦ similitud de secuencia con la secuencia de- aminoácidos SEQ ID NO: 34 y/o el cual está codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:35.

Por consiguiente, en una forma de realización preferida una fuente de S6 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 35 y/o el cual codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:34.

Método En otro aspecto, la invención provee un método para prevenir y/o tratar una enfermedad parasitaria y/o retrasar su progresión y/o tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune como se define en la presente: un método es terapéuticamente eficaz cuando tiene la capacidad de provocar una respuesta inmune en un sujeto tratado que - preferentemente significa que tiene la capacidad de promover o iniciar una respuesta inmune Thi contra un dado antigeno L3 y/o L5 y/o contra una dada fuente de L3 y/o L5 y/o que tiene la capacidad de prevenir y/o retrasar el desarrollo de una lesión dérmica o mucosa y/o induce una reducción significativa de la carga parasitaria en una lesión dérmica y/o mucosa y/o en ur: oído y/o en un nódulo -linfático de drenaje (DLN) que preferentemente drena cualquiera de estas regiones infectadas (región dérmica, mucosa, oído), asi como en un órgano interno tal como hígado, bazo, médula ósea, riñon, cerebro, etc. en la presente. En este método, una vacuna de la invención funciona como una vacuna terapéutica.

Generalmente, hay un período de tiempo entre la infección y enfermedad. En este caso, una vacuna podría actuar como un producto inmune farmacológico que podría prevenir y/o tratar la enfermedad y/o retrasar su progresión por provocar una respuesta inmune en el huésped que contrarreste el efecto patológico de la infección. Una vacuna terapéutica difiere de una vacuna profiláctica en que una vacuna terapéutica inducirá protección en un paciente que ya tiene la infección o enfermedad. La invención abarca tanto una vacuna terapéutica como una profiláctica. En este método, se puede usar opcionalmente una fuente de S4 y/o de S6 en combinación con una. fuente de L3 y/o de L5. ... . . . .

Uso En otro aspecto, se provee otro uso de una fuente de L3 y/o de L5 para el diagnóstico de una enfermedad parasitaria en un sujeto. Una enfermedad parasitaria, una fuente de L3 y/o de L5 y un sujeto han sido definidos anteriormente en la presente. En este uso, se pueden usar opcionalmente una fuente de S y/o de 36 en combinación con una fuénte- dé- L3 y/o de L5.

Una ventaja de la presente invención es que permite alcanzar un diagnóstico específico y temprano de un espectro más amplio de enfermedades parasitarias. Un ejemplo de una enfermedad parasitaria en donde este es el caso, es leishmaniasis . En una forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es leishmaniasis o malaria. Más preferentemente, una enfermedad parasitaria es causada por una especie de Leishmania o de Plasmodium. En otra forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es causada por especies diferentes de las especies de las cuales deriva L3 y/o L5. En particular, leishmaniasis causada por una especie del género Leishmania puede ser diagnosticada usando una composición basada en una fuente de L3 y/o de L5 de otra especie de Leishmania. En una forma de realización, leishmaniasis causada por L. major se diagnosticó exitosamente con una composición, que comprende, una -fuente de, L3 y/o de L5 de L. major, L. infantum, L. brazilíenzis o L. mexicana. Como alternativa, otras enfermedades parasitarias, tal como malaria, puede ser diagnosticada exitosamente con una composición basada en una fuente de L3 y/o de L5 de otra especie, por ejemplo basada en una fuente de L3 y/o de L5 de L. infantum, L. major, L. brazilíenzis o L. mexicana .

En principio, cualquier sujete puede ser · diagnosticado usando la invención. El método de diagnóstico puede ser aplicado cada vez que sea necesario en un sujeto. Preferentemente, un sujeto diagnosticado es un sujeto que se sospecha que tiene riesgo de haber estado infectado con dicho parásito que causa dicha enfermedad parasitaria. Un sujeto que se sospecha que tiene riesgo de haber estado infectado con dicho parásito puede vivir en un área endémica o ha estado visitando un área endémica. Un área endémica incluye África del Norte desde Argelia a Arabia Saudita, Kenia, Sudán,- .Etiopia. . Además incluye Europa del Sur: países mediterráneos España, Francia, Grecia, etc. También incluye América Central (todos los países) y del Sur: Brasil, Venezuela, Perú, Bolivia, Colombia, Norte de Argentina, Paraguay, Uruguay, Asia Central al Sudoeste: India, Irán, Iraq, ongolia, Afganistán, Nepal, Bangladesh.

En el contexto de la invención, un uso como se define, en la presente preferentemente es un uso in.-vitro o ex vivo use. Preferentemente significa que dicho uso se lleva a cabo en una muestra de dicho sujeto. Las muestras preferidas incluyen sangre, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal u orina. Más preferentemente, la muestra es una muestra de sangre o suero obtenida de un sujeto.

En una forma de realización preferida, se logra un diagnóstico antes de la aparición de un síntoma -de dicha enfermedad parasitaria, llamado diagnóstico presintomático o diagnóstico de un sujeto asintomático . En este contexto, "presintomático" preferentemente significa al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos seis días, al menos siete días, al menos ocho días, al menos nueve días, al menos diez días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días o más antes de la aparición del primer síntoma. Un primer síntoma o un primer signo clínico asociado con una enfermedad parasitaria tal como leishmaniasis se puede seleccionar de la siguiente lista: fiebre, esplenomegalia, hepatomegalia, linfadenopatía, conjuntivitis, dermatitis, onicogrifosis, queratoconjuntivitis, apatía y caquexia. La mayoría de ellos pueden ser detectados simplemente por el examen físico externo. Cada uno de conjuntivitis, dermatitis, onicogrifosis, queratoconjuntivitis es una forma de alteración cutánea.

Un primer síntoma ligado a leishmaniasis es linfadenopatía . Puede ser detectado por examen físico externo tal como palpación.

En otra forma de realización preferida, se obtiene un diagnóstico antes de la aparición de algunos síntomas de dicha enfermedad parasitaria, llamado diagnóstico de un sujeto oligosintomático- En este contexto, " ligosintomáticó" preferentemente significa un sujeto que tiene un máximo de tres de los síntomas como se definen anteriormente.

En otra forma de realización preferida, se obtiene un diagnóstico antes de la aparición de todos los síntomas de dicha enfermedad parasitaria, llamado diagnóstico de un sujeto sintomático. En este contexto, "sintomático" preferentemente significa un sujeto que tiene al menos cuatro de los síntomas como se definió anteriormente que incluye una forma de alteración cutánea como se definió anteriormente.

La persona con . experiencia entenderá que el tipo más importante de diagnóstico de sujetos asintomáticos , ya que ayudará a prevenir la diseminación adicional de la enfermedad y se podría ayudar y curar a los sujetos asintomáticos más eficazmente si son diagnosticados en dicho estadio.

En este uso, una fuente de L3 y/o L5 y/o de S4 y/o de S6 puede ser una proteína L3 y/o L5 y/o una S4 y/o una S6 o fragmento de proteína que son usadas para detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra como se explica en la siguiente sección.

Como alternativa, una fuente de L3 y/o de L5 y/o de S4 y/o de S6 puede ser una molécula de ácido nucleico que se usan para detectar la presencia de un ácido nucleico de L3 y/o L5 y/o de S4 y/o de S6 en una muestra como se explica en - la- si-guien-te · sección . . . . ... .. .....

Método En otro aspecto se provee un método para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto que usa una fuente de L3 y/o de L5, en donde el método comprende determinar si un anticuerpo que reconoce una fuente de L3 y/o de L5 está presente en una muestra obtenida a partir de un sujeto. Opcionalmente, una fuente de S4 y/o de S6 también puede ser usada en combinación con una fuente de L3 y/o de L5. Un método preferido de la invención es para un uso preferido de la invención preferentemente realizado in vitro o ex vivo. Una definición ha sido dada anteriormente en la presente.

En un método preferido, una fuente de L3 y/o de L5 está presente en una composición. En una forma de realización preferida, otro compuesto está presente en dicha composición. Como alternativa, no hay presente ningún otro compuesto en dicha composición.

En una forma de realización preferida, ot,ros compuestos se usan secuencial o simultáneamente con una fuente de L3 y/o de L5 con el objetivo de mejorar la especificidad del método. Es ventajoso por ejemplo usar otros compuestos que tendrán la capacidad de discriminar entre sujeto asintomático, oligosintomático o sintomático y sujeto vacunado. Más preferentemente, dichos compuestos no están presentes en una composición única junto con una fuente de L3 y/o -de 15. Cada una de las proteínas identificadas en la sección con el titulo composición se pueden usar en este contexto. Por ejemplo dichos compuestos se seleccionan de un grupo que consiste en una fuente de otras proteínas de un parásito que causa una enfermedad parasitaria (19) tal como Leishmaniasis .

Una fuente de una dada proteína tiene el mismo significado que una fuente de L3 y/o de L5 como se definió anteriormente en la presente. Una proteína preferida es en este contexto una histona tal como H2A, H2B, H3, H4, otra proteína ribosomal tal como Li2A (LiP) , LiP2b (LiP' ) , LiPO, L2, L7, L8, L16, S6, L19 y S .

Otro ejemplo es el uso de poliproteinas que contienen varios antígenos de parásitos (59, 61) . Un ejemplo de una poliproteína es proteína Q como se identifica en EP 1 141 305. Proteína Q o una parte o un fragmento de la misma o una fuente de proteína Q o una fuente de un fragmento de proteína Q se puede usar en combinación con una fuente de L3 y/o L5.

Los antígenos preferidos incluyen una proteína histona o un fragmento de la misma o una molécula de ácido nucleico que codifica para dicha histona. Más preferentemente, una proteína histona es H2A, H2B, H3 y/o H4 como se identifica en EP 1 687 023. Las histonas H2A, H2B, H3 y H4 son proteínas nucleares bien conservadas y su secuencia es bien conocida en el- arte, véase- referencia 39. Preferentemente las' histonas se obtienen de un organismo que es cercano en el árbol evolutivo al organismo que causa la enfermedad. Por lo tanto, los protozoarios son de interés particular como una fuente de histonas para ser usadas en el tratamiento de enfermedades parasitarias tales como leishmaniasis y en particular miembros de la familia tripanosomátide, como por ejemplo plasmodium, tal como Plasmodium falciparum o más en particular especies diferentes del protozoario tripanosomático Leishmania .

En un método de diagnóstico más preferido, una enfermedad parasitaria se diagnostica cuando hay presente una cantidad detectable de un anticuerpo que reconoce una fuente de L3 y/o de L5, preferentemente proteína o péptido o parte de proteína y/o cuando hay un aumento de la cantidad de dicho anticuerpo. En un sujeto control o sano, dicho anticuerpo generalmente no es detectable.

La detección de la presencia de dicho anticuerpo se realiza usando métodos conocidos por la persona con experiencia tal como un ELISA. Los modos preferidos de detección se describen en el ejemplo 1.

Un anticuerpo que reconoce una fuente de L3 y/o L5, preferentemente una proteína o péptido o parte de proteína, preferentemente significa que al menos hay presente un anticuerpo que es capaz de reconocer al menos ütí Cómpüesto presente en una fuente de L3 y/o L5. Dicho compuesto puede ser una proteína L3 y/o L5 o un fragmento de proteína o parte de proteína o péptido L3 y/o L5. Lo mismo se mantiene para un anticuerpo que reconoce una fuente de S4 y/o S6.

En otro método, se detecta una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 usando otra molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 preferentemente es una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula L3 y/o a L5 como se la identificó previamente en la presente o . una parte de las mismas. Ora molécula de ácido nucleico preferentemente es un cebador que se diseña para ser capaz de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 en una reacción de PCR o mediante transferencia Northern. Lo mismo se mantiene para un cebador que es capaz de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de S4 y/o S6. Los cebadores preferidos para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 comprenden o consisten en las siguientes secuencias: Secuencias de cebadores para detectar específicamente una L3 mediante PCR Directo, 5'- AACACGAAGGAGGGCAAGGTC-3' (nucleótidos 418 a 438 de la secuencia LmL3) (SEQ ID NO: 38) Reverso 5'- CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3' (reverso y complementario a los nucleótidos 1242 a 1263 de la secuencia LmL3) (SEQ ID NO: 39) Secuencias de cebadores para detectar específicamente una L5 mediante PCR Directo, 5'- TGCACGCTGGCAAATTGGGTAC -3' (nucleótidos 10 a 31 de la secuencia LmL5) (SEQ ID NO: 0) Reverso 5' -CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG -3' (reverso y complementario a los nucleótidos 464 a 483 de la secuencia LmL5) (SEQ ID NO: 41) Secuencia de cebadores para detectar específicamente una L3 mediante transferencia Northern . 5'- CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3' (reverso y complementario a los nucleótidos 1242 a 1263 de la secuencia LmL3) (SEQ ID NO:42) Secuencia de cebadores para detectar específicamente una L5 mediante transferencia Northern 5' -CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG -3' (reverso y complementario a los nucleótidos 464 a 483. de la secuencia LmL5) (SEQ ID NO:43). La detección de un incremento del nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 preferentemente se define como un cambio detectable del nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico en comparación con el nivel de expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un sujeto control. Usualmente un sujeto control no comprenderá dicha molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5. Preferentemente, un incremento del nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de L3 y/o L5 significa un incremento de al menos 5% del nivel de expresión de la secuencia nucleotídica usando PCR.

Ensayo En otro aspecto, se provee un dispositivo de ensayo para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto, en donde el dispositivo comprende una fuente de L3 y/o L5. Opcionalmente, también puede haber presente una fuente de S4 y/o S6 en este dispositivo de ensayo en combinación con una fuente de L3 y/o L5. Se puede detectar la presencia de un anticuerpo que reconozca específicamente dicha fuente mediante cualquier método estándar conocido por las personas con experiencia en el arte (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, que se incorpora a la presente ¿orno referencia) . Los métodos apropiados incluyen ensayos de cromatografía de afinidad co-electroforesis (ACE) y ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) . Preferentemente, este ensayo comprende un ELISA. Más adelante se describen más ensayos en forma más extensa.

En una forma de realización preferida, un ensayo •ihvolücra el uso de una fuente de L3 y/o L5 inmóvil!2ada sobre un soporte sólido para unirse y para eliminar un anticuerpo de la muestra. Dicho anticuerpo unido se puede detectar entonces usando un reactivo de detección que se una al complejo anticuerpo/fuente de L3 y/o L5 y contiene un grupo reportero detectable. Los reactivos de detección apropiados incluyen a anticuerpos que se unen al complejo anticuerpo/fuente de L3 y/o L5 y polipéptido libre marcado con un grupo reportero (por ejemplo, en un ensayo semicompetitivo) . De forma alternativa, se puede usar un ensayo competitivo, en donde un anticuerpo que - se una a una fuente de L3 y/o L5 está marcado con un grupo reportero y se deja que se una a la fuente de L3 y/o L5 inmovilizada después de la incubación de la fuente con la muestra. La extensión en la que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado a dicha fuente de L3 y/o L5 es una indicación de la reactividad de la muestra con la fuente de L3 y/o L5 inmovilizada.

Un soporte sólido puede ser cualquier material conocido por las personas de experiencia ordinaria en el arte al que se puede unir la fuente de L3 y/o L5. Po ejemplo, un soporte puede ser un pocilio de prueba de una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra apropiada. De forma alternativa, un soporte puede ser una ésfera ó disco, tal como de vidrio, fibra de vidrio, látex o un material plástico tal como poliestireno o polivinilcloruro . Un soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como los que se exponen, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. No. 5.359.681.

Una fuente de L3 y/o L5 se puede unir al soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas para las personas con experiencia en el arte. En el contexto de la presente invención, el término "unido" se refiere tanto a asociación no covalente, tal como adsorción, como a unión covalente (que puede ser una unión directa entre el antigeno y los grupos funcionales del soporte o puede ser una unión mediante un agente de entrecruzamiento) . Se prefiere la unión por adsorción a un pocilio de una placa de microtitulación o a una membrana. En dichos casos, la adsorción se puede conseguir poniendo en contacto una fuente de L3 y/o L5, en una solución amortiguadora apropiada, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo apropiada. El tiempo de contacto varia con la temperatura, pero es típicamente entre 1 hora y 1 día. En general, poner en contacto un pocilio de una placa de microtitulación plástica (tal como poliestireno o polivinilclocuro) con una cantidad de una fuente de L3 y/o L5 en el rango entre 10 ng y 1 g, y preferentemente 100 ng, ¦es suficiente - para unir una cantidad adecuada de -u-na -fuente de L3 y/o L5. Aquí también, cuando se da una cantidad de una fuente de L3 y/o L5, la misma define la cantidad total de una fuente de L3 y/o L5 que se usa.

La unión covalente de una fuente de L3 y/o L5 a un soporte sólido por lo general se puede conseguir primero haciendo reaccionar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, del polipéptido. Por ejemplo, una fuente de L3 y/o L5 puede unirse a un soporte que tiene un recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o mediante la condensación de un grupo aldehido del soporte con una amina y un hidrógeno activo del polipéptido -(véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) at A12-A13) .

En ciertas formas de realización, un ensayo es un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) . Este ensayo se puede llevar a cabo poniendo primero en contacto "una - -fuente do L3 y/o L5 que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, comúnmente el pocilio de una placa de microtitulación, con la muestra, de modo que se deja que anticuerpos específicos para dicha fuente de L3 y/o L5 dentro de la muestra se unan a la fuente de L3 y/o L5 inmovilizada. Después se elimina la muestra no unida de la fuente inmovilizada y se agrega un reactivo, de detección capaz de unirse al comple o- anticuerpo inmovilizado-fuente de L3 y/o L5. Se determina entonces la cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido usando un método apropiado para el reactivo de detección específico.

Una vez que se ha inmovilizado la fuente de L3 y/o L5 sobre el soporte, típicamente se bloquean los sitios de unión proteicos remanentes del soporte. Se puede emplear cualquier agente bloqueante apropiado conocido para las personas con experiencia en el arte, tal como albúmina sérica bovina (BSA) o Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . La fuente de L3 y/o L5 inmovilizada se incuba entonces con la muestra, se deja unir un anticuerpo (si está presente en la muestra) a dicha fuente. Se puede diluir una muestra con un diluyente apropiado, tal como solución salina amortiguada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (o sea, tiempo de incubación) es ese periodo- de tiempo que es suficiente para permitir detectar la presencia de anticuerpo dentro de una muestra. Preferentemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que es de al menos 95% del que se consigue en el equilibrio entre anticuerpo unido y sin unir. Las personas con experiencia ordinaria en el arte reconocerán que se puede determinar fácilmente el tiempo necesario para conseguir- el equilibrio ensayando el nivel -de ¦ unión que"-existe durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, por lo general" un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es suficiente.

Después se puede eliminar la muestra no unida mediante lavado del soporte sólido con una solución amortiguadora apropiada, tal como PBS con Tween 20 al 0,1%. Después se puede agregar reactivo de detección a un soporte sólido. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se una al complejo anticuerpo inmovilizado-fuente de L3 y/o L5 y que se pueda detectar por alguna de una variedad de medios conocidos por las personas con experiencia en el arte. Preferentemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (tal como, por ejemplo, Proteina A, Proteina G, inmunoglobulina, lectina o antigeno libre) conjugado a un grupo reportero. Los grupos reporteros preferidos incluyen enzimas (tal como peroxidasa de rábano) , sustratos, cofactores, inhibidores, marcas, radionucleótidos,- grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del agente de unión al grupo reportero se puede llevar a cabo usando métodos estándar conocidos por las personas con experiencia en el arte. Los agentes de unión comunes también se pueden comprar conjugados con una variedad de grupos reporteros de muchas fuentes (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA y Pierce, Rockford, ÍL> . · El reactivo de detección se incuba entonces con el complejo anticuerpo inmovilizado fuente de L3 y/o L5 durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar al anticuerpo unido. Una cantidad de tiempo apropiada por lo general se puede determinar a partir de las instrucciones del fabricante o mediante el ensayo del nivel de unión que existe a lo largo de un periodo de tiempo. Luego se elimina el reactivo de unión sin unir y se detecta el reactivo de detección unido usando el grupo reportero.

El método que se emplea para detectar al grupo reportero depende de la naturaleza del grupo reportero. Para los grupos radiactivos, son generalmente apropiados los métodos de conteo por centelleo o autoradiográficos . Se pueden usar métodos espectroscópicos para detectar marcas, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. Se puede detectar biotina usando avidina acoplada a un grupo reportero .diferente (comúnmente un grupo radiactivo o- fluorescente o una enzima) . Los grupos reporteros con enzima en general se pueden detectar mediante el agregado de sustrato (en general durante un periodo de tiempo específico) , seguido por análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de reacción .

Para determinar la presencia o ausencia de un anticuerpo •específico para una enfermedad - paras-i- aria tal como Leishmaniasis en una muestra, en general se compara la señal que se detecta a partir del grupo reportero que permanece unido al soporte sólido con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una forma de realización preferida, el valor de corte preferentemente es el promedio de la señal media que se obtiene cuando se incuba la fuente de L3 y/o L5 inmovilizada con una muestra de un sujeto no infectado. En general, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones estándar por arriba del valor de corte predeterminado se considera positiva (o sea, reactivo con una fuente de L3 y/o L5) . En una forma de realización preferida alternativa, el valor de corte se determina usando una Receiver Operator Curve, de acuerdo al método de Sackett et al., Clinical Epidemiology : A Basic Science for Clinical Medicine, páginas 106-7 (Little Brown and Co., 1985). Brevemente, en esta forma de realización, el valor de corte se puede determinar a partir de una gráfica de pares de tasas positivas verdaderas (o sea, sensibilidad) y tasas positivas falsas (100% de especificidad) que corresponde a cada valor de corte posible para el ensayo de prueba diagnóstico.

El valor de corte en la gráfica que está más cercano a la esquina izquierda superior (o sea, el valor que encierra al área mayor) es el valor de corte más exacto, y una muestra que genera una señal que es mayor que el valor de corte determinado por este método se puede considerar positiva. En forma alternativa, el valor de corte se puede mover hacia la izquierda a lo largo del gráfico, para minimizar la tasa de fasos positivos, o a la derecha, para minimizar la tasa de flasos negativos.

En una forma de realización relacionada, se lleva a cabo un ensayo en un formato de flujo pasante o de prueba en tira, en donde se inmoviliza una fuente de L3 y/o L5 sobre una membrana tal como nitrocelulosa . En la prueba de flujo pasante, los anticuerpos dentro de la muestra . se unen a la fuente de L3 y/o L5 inmovilizada a medida que la muestra pasa a través de la membrana. Un reactivo de detección (por ejemplo, proteina A-oro coloidal) se une luego al complejo anticuerpo-fuente de L3 y/o L5 a medida que la solución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. La detección de reactivo de detección unido se puede llevar...a cabo entonces, .como se describió previamente. En el formato de prueba en tira, se sumerge un extremo de la membrana a la que hay fuente unida en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene reactivo de detección y al área de polipéptido inmovilizado. La concentración de reactivo de detección en una fuente de L3 • y-/o--L5 i-ndica -la presencia de un anticuerpo - especifico pa-rá- un antigeno de un parásito que causa una enfermedad parasitaria tal como Leishmaniasis en la muestra. Típicamente, la concentración de reactivo de detección en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que se puede leer visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, se elige la cantidad de una fuente de L3 y/o L5 inmovilizada sobre una membrana para que genere un patrón discernible en forma visual cuando una muestra contiene un nivel de anticuerpo que sea suficiente para generar- una señal positiva en un ELISA, como se describió previamente. Preferentemente, la cantidad de una fuente de L3 y/o L5 inmovilizada sobre una membrana está en el rango entre 25 ng y 500 ng. Dichas pruebas típicamente se pueden llevar a cabo con una cantidad muy pequeña (por ejempl'o, una gota) de suero o sangre del sujeto.

La exposición de cada elemento del dispositivo de ensayo cuando se lo aplica a una fuente de L3 y/o L5, -también se puede aplicar a una fuente de S4 y/o S6 si se usa una fuente de S4 y/o S6 en combinación con una fuente de L3 y/o L5 en este dispositivo de ensayo.

Cualquier sujeto o médico puede usar este dispositivo en la oficina/hogar, y repetir el uso de dicho dispositivo tan frecuentemente como sea necesario.

Usualmente se usan moléculas adicionales en- un ensayo como control positivo o negativo. Un control positivo típico puede ser un anticuerpo que reconoce una molécula que se sabe que está presente en una muestra a analizar. Un control negativo típico puede ser un anticuerpo que reconoce una molécula que se sabe que está ausente en una muestra a analizar .

Definiciones generales En el contexto de la invención, una proteina o fragmento de proteina está representada por una secuencia de aminoácidos.

En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico está representada por una secuencia de ácido nucleico o nucleotidica que codifica para una proteina o un polipéptido o un fragmento de proteina. Una molécula de ácido nucleico puede comprender una región regulatoria.

Se comprenderá que cada molécula de ácido nucleico o proteina o fragmento de proteina que se identifica en la presente por un Número de Identidad de secuencia (SEQ ID NO) dado no se limita a esta secuencia especifica tal como se expone. Cada secuencia génica o secuencia de nucleótidos como se identifica en la presente codifica para una proteina o polipéptido o fragmento de proteina dado o es ella misma una proteina o un fragmento de proteina. A lo largo de esta memoria - descriptiva¦, cada- vez que se hace referencia · a un secuencia de nucleótidos especifica SEQ ID NO (tomar SEQ ID N0:2 o 4 como ejemplo), se la puede reemplazar por: i. una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con SEQ ID NO: 2 o 4 o 49 o 51 o 53 o 55 o 65 (como ejemplo) . ii. una secuencia de nucleótidos de la cual la hebra complementaria hibridiza con una molécula de ácido nucleico con la secuencia de (i); iii. una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético. iv. una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos SEO ID N0:2 o 4 o 49 o 51 o 53 o 55.o 65..

A lo largo de esta memoria descriptiva, cada vez que se hace referencia a una secuencia de aminoácidos especifica SEQ ID NO (tomar SEQ ID NO:l o 3 o 48 o 50 o 52 o 54 o 56 como ejemplo), se la puede reemplazar por: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud dé secuencia con la ¿ecuencia de aminoácidos -de SE ID-NO:1 o 3 o 48 o 50 o 52 o 54 o 56.

Cada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que se describe en la presente en virtud de su porcentaje de identidad o similitud (al menos 60%) con una dada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos, respectivamente, tiene en un forma de realización preferida adicional una identidad o una similitud de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de identidad o similitud con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos dada, respectivamente. En una forma de realizació preferida, la identidad o similitud de secuencia se determina comparando la longitud completa de las secuencias como se las identifica en la presente.

"Identidad de secuencia" se define en la presente como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteina) o de dos o más secuencias de acido nucleico (polinucleótido) , .:.según se determina mediante la. comparación de las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula en base a la longitud completa de dos SEQ ID NO dadas o parte de las mismas. Parte de las mismas preferentemente significa al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de ambas SEQ ID NO. En el arte, "identidad" también significa el grado de parentesco de secuencia - entre- -secuencias de aminoácidos --o -- de - ácidos nucleicos, como sea el caso, según se determina mediante la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias.

La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácido conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo pero no como limitación, los que se describen en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. . , and Griffin, H. G., eds . , Human Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , editores... M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) .

Los métodos preferidos para determinar identidad se diseñan para dar la coincidencia más larga entre las secuencias que se ensayan. Los métodos para determinar identidad y similitud se codifican en programas de computación disponibles públicamente. Los métodos -de- programa de computación preferidos para determinar identidad y similitud entre dos secuencias incluyen por ejemplo el paquete de programas GCG (Devereux, J. , et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) . El programa BLAST X está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). También se puede usar el bien conocido, algoritmo de Smith Waterman para determinar identidad.

Los parámetros preferidos para comparación de secuencias polipeptidicas incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff and Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); Penalidad por No Coincidencia: .1.2.; y ..Penalidad por Longitud de No Coincidencia: 4. Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como programa "Ogap" de Genetics Computer Group, localizado en Madison, WI. Los parámetros antes mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de aminoácidos (junto con ninguna penalidad para no coincidencia en los extremos) .

-Los- parámetros preferidos para comparaciones de ácidos nucleicos incluyen a los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Matriz de Comparación: coincidencias =+10, no coincidencia =0; Penalidad por No Coincidencia: 50; Penalidad por Longitud de No Coincidencia 3. Disponible como programa Gap de Genetics Computer Group, localizado en adison, is. Previamente se dieron los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

Opcionalmente, en la determinación del grado de similitud de aminoácidos, -la persona con experiencia en el arte también puede tomar en cuenta sustituciones de aminoácidos denominadas "conservativas", como será claro para una persona con experiencia en el arte. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la posibilidad de intercambiar residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticás es "glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales- -básicas es lisiná, arginina, e -hi-st-idiri - y un' grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteina y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos preferidos incluyen a: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina , y asparagina-glutamina . Las variantes de sustitución de las secuencias de aminoácidos que se exponen en la presente son unas en las cuales se ha eliminado al menos un residuo de las secuencias expuestas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferentemente, el cambio de aminoácidos es conservativo. Las sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son como sigue: Ala a Ser; Arg a Lys; Asn a Gln 0 His; Asp a Glu; Cys a Ser o Ala; Gln a Asn; Glu a Asp; Gly a Pro; His a Asn o Gln ; lie a Leu o Val; Leu a lie o Val; Lys a Arg; Gln o Glu; Met a Leu o lie; Phe a Met, Leu o Tyr; Ser a Thr; Thr a Ser; Trp a Tyr; Tyr a Trp o Phe ; y, Val a lie 0 Leu..

Construcción de ácido nucleico Una construcción de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína o un fragmento de proteína como se define en la presente. Una construcción de ácidos nucleicos que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína o fragmento de- proteífta-- dada como se define -en- la- presente--- asegu-rará - la-expresión de la molécula de ácido nucleico dada, y de la proteína o fragmento de proteína correspondiente en un sujeto tratado. En una forma de realización más preferida, una construcción de ácido nucleico comprende más de un molécula • de ácido nucleico, en donde cada molécula de ácido nucleico codifica para una proteina o fragmento de proteina dada. En una forma de realización aun más preferida, una construcción de ácido nucleico comprende dos, tres, cuatro moléculas de ácido nucleico, en donde cada molécula de ácido nucleico codifica para una proteina o fragmento de proteina dada. En una forma de realización preferida, una construcción de ácido nucleico comprende un cásete de expresión, en donde dicho cásete de expresión comprende cada molécula de ácido nucleico necesaria. Cada molécula de ácido nucleico está operativamente ligada con otra molécula de ácido nucleico presente. Más preferentemente, un promotor apropiado está ligado operativamente con el cásete de expresión para' asegurar la expresión de la molécula de ácido nucleico en un suj eto .

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en sus sentidos no limitantes para significar que los puntos después de la palabra están incluidos, pero los puntos que no se mencionan • e-specif-icamente no están excluidos, -Además'- el--- verbo "consistir" se puede reemplazar por "consistir esencialmente en", significando que un producto o una composición o una fuente de L3 o L5, como se define en la presente, puede comprender componente ( s ) adicional (es ) a los específicamente identificados, en donde dicho (s) componente (s) no alteran la característica única de la invención.

Además, la referencia a un elemento mediante el articulo indefinido "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solamente uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "uno" por lo tanto usualmente significa "al menos uno".

Todas las referencias de patentes y de literatura que se citan en la presente memoria descriptiva se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.

La invención está ilustrada además por el siguiente ejempl.Q,_. que., no" se debe interpretar como limitante.. del alcance de la presente invención.

Descripción de las figuras Figura 1. Expresión y purificación de proteínas rLmL3 y rLmL5recombinantes de Leishmania major. Geles de poliacrilamida teñidos con Coomasie blue al 13% de lisado de Escherichia coli transíectadas con vector pQELmL3 (panel L3) o- QBimLS- (pane-1 L5) después- de inducción --(- -nea-s--1 )-, después de pasaje por columnas de agarosa con Ni-NTA (líneas 2) y rLmL3 y rLmL5 recombinantes purificadas (líneas 3) .

Figura 2. Antigenicidad de las proteínas L3 y L5. (a) Se infectaron doce ratones BALB/c a través de s.c. con 5 x 104 promastigotes de L. major de fase estacionaria en la almohadilla plantar derecha y se obtuvieron sueros ocho semanas después de la inoculación. Se determinaron las relatividades de anticuerpos IgGl e IgG2a del suero de los ratones con leishmaniasis (MCL) cutánea contra rLmL3 y rLmL5 en forma individual mediante ELISA. También se representa la falta de reactividad del suero de los mismos ratones antes de la infección. Reactividad por ELISA de suero de perros con CVL sintomática y sueros control contra proteínas recombinantes rLmL3 (b) y rLmL5 (c) .

Figura 3. Producción de citoquina inducida por vacunación en ratones BALB/c. Se inmunizaron por s.c. ratones BALB/c (seis por grupo) tres, veces, con .10 \xg de rLmL3 +.50' ig de CpG-ODN (L3 + CpG) o 10 ]ig de rLmL5 + 50 pg de CpG-ODN (L5 + CpG), con 50 g de CpG-ODN (CpG) o con PBS (Solución salina) . Se obtuvieron células de vaso cuatro semanas después de la vacunación y se cultivaron in vitro durante 48 horas en presencia de rLmL3 (a, c y e) , rLmL5 (b, d y f ) y en medio solo. Se evaluó el nivel de IFN-? (a y b) , IL-4 (c y d) e IL-10 -(e y f )· mediante- ELISA- en los sobrenadantes- de -cultivos-. Cada barra representa la media ± SD de los datos de ratones individuales .

Figura 4. Curso de infección con L. major en ratones BALB/c vacunados después de la inoculación, (a el edema de la almohadilla plantar se da como la deferencia de espesor entre la almohadilla plantar infectada y la contralateral no infectada. (b Se determinó individualmente el número de parásitos viables en el nodulo linfático de drenaje poplíteo de la pierna infectada y del vaso mediante dilución limitante en la semana ocho después de la inoculación. (*, P < 0,01) Figura 5. Respuestas inmunes celulares producidas por infección en ratones vacunados con L3 + CpG ODN. Se establecieron cultivos de células de bazo en la semana ocho después de la inoculación con parásitos. Las células no se estimularon (medio) o se estimularon en forma separada con LRP (Proteínas Ribosomales de Leishmania) (12 µ? mi"1), SLA (Antígenos ."Solubles _de. .Leishmania) (12 .. uc mi"1) , MRP.

(Proteínas Ribosomales de Ratón) (12 µ? mi"1) o L3 (6 pg mi-1) durante 48 horas en 5% de C02, a 37°C. Se midieron los niveles de IFN-? (a, ) IL-4 (b) y IL-10 (c) en sobrenadantes de cultivo mediante ensayo de captura inmunosorbente ligado a enzima. Cada barra representa el promedio más la desviación estándar de los niveles de citoquina determinados en seis -catones -indi-viduales por grupo. - — - - -- -- — Figura 6. Respuestas inmunes celulares producidas por infección en ratones vacunados con L5 + CpG ODN. Se establecieron cultivos de células de bazo en la semana ocho después de la inoculación con parásitos. Las células fueron no estimuladas (medio) o se estimularon en forma separada con LRP (12 pg ml"1) , SLA (12 pg ml"1) , MRP (12 \ig mi"1) o L5 (6 g mi"1) durante 48 horas en 5% de C02, a 37°C. Se midieron los niveles de IFN-? (a), IL-4 (c) y IL-10 (b) en los sobrenadantes de cultivo mediante ensayo de captura inmunosorbente ligado a enzima. Cada barra representa el promedio más la desviación estándar de los niveles de citoquina determinados en seis ratones individuales por grupo .

Figura 7 Cursos de infección con L.brazlliensls en ratones BALB/c vacunados después de la inoculación. (?) Las lesiones inflamatorias en orejas infectadas. El tamaño de lesiones (én milímetros) se expresa como .el promedio "± SD de un experimento que se llevó a cabo con cinco ratones. * P < 0,05 entre ratones vacunados con rLmL5 + CpG-ODN o rLmL3 + CpG-ODN y ambos grupos control. (B) Carga de parásitos en la dermis de la oreja cuantificada a cinco semanas después de la infección. Los resultados se expresan como la media ± SD de cinco orejas por grupo. * P < 0,05 disminución significativa —en £Q- r-LmL5 + -CpG-OD -y ambos grupos- de ratone¾ · con-t-jyol . - -· Figura 8 Localización ribosómica de las proteínas LmL3 y LmL5. Se separaron por electroforesis 1 µg de la proteína rLmL3 (A) , 1 µ? de la proteína rLmL5 (B) y 10 pg de extractos de LRP de Leishmania major (A y B) en geles SDS-PAGE en gradiente lineal entre 10 y 13%. La tinción con Coomasie blue de los geles se muestra en los paneles izquierdos (A y B) . Se transfirieron geles equivalentes y se enfrentaron con el suero de ratones inmunizados con rLmL3 (panel a -LmL3) (A) y con la fracción de un anticuerpo anti LmL5 purificado por afinidad de cinco suero de leishmaniasis visceral canina (panel -LmL5) (B) .

Figura 9 Análisis de los parámetros de infección en ratones vacunados con las proteínas ribosomales S6, L2 , L7 , L8 y L6 en presencia de CpG. (A) El desarrollo de lesiones en los grupos infectados se monitoreó en forma semanal hasta la semana ocho después de la infección. Las diferencias de edema de almohadilla plantar entre S6 más..Cp.G .ODN . y .grupós control, (solución salina y adyuvante) fueron estadísticamente significativas a las ocho semanas después de la infección (*P < 0,05) . (B) Determinación de la carga de parásitos en DLNs y en bazos analizados ocho semanas después de la infección. Las diferencias en las cargas de parásitos en los bazos del grupo vacunado con S6 más CpG ODN y los grupos control (solución .salina -y adyuvante.) fueron -estadísticamente -significativas (*P < 0,05). Para claridad, solo se muestra la SD del grupo de solución salina y del grupo vacunado con S6 más CpG ODN.

Figura 10. Respuestas inmunes producidas por vacunación con S6 más CpG ODN. Se obtuvieron muestras de suero de ratones inmunizados con S6 más CpG ODN, CpG ODN y solución salina cuatro semanas después de la administración de la última dosis. Los sueros se ensayaron individualmente mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpos IgG, IgGl e IgG2a específicos anti-S6. (*P < 0,05) Diferencias estadísticamente significativas entre el grupo con S6 más CpG ODN y los grupos control (solución salina y CpG) . (B) Las células de bazo fueron no estimuladas (medio) o estimuladas con S6 durante 48 horas en 5% de C02, a 37°C. Se midieron los niveles de IFN-?, IL-4 y IL-10 en los sobrenadantes de cultivo mediante ensayo de captura inmunosorbente ligado a enzima. Cada barra representa el promedio más la desviación estándar de"- los """niveles .de citoquina determinados en cuatro ratones individuales por grupo. (*P < 0,05) Diferencias estadísticamente significativas entre el grupo con S6 más CpG ODN y los grupos control (solución salina y CpG) .

Figura 11. Desarrollo de lesiones en ratones inmunizados con L3 , L5 y S4 en forma individual o en preparaciones mezcladas en ausencia c presencia de CpG, Se monitorearon las lesiones en forma semanal hasta seis semanas después de la infección. (A) Grupos de ratones control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes sin adyuvante. (B) Grupos de ratones control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes más CpG ODN. (*P < 0,05) Las diferencias en el edema de almohadilla plantar entre los grupos con L3 más CpG ODN, L5 más CpG ODN, L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y control (solución salina y adyuvante) fueron estadísticamente significativas a seis semanas después de la infección.

Figura 12. Cargas de parásitos en los ratones vacunados . Se determinaron las cargas de parásitos en el bazo y en los DLN en la semana siete después de la infección. (A) Grupos de ratones control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes sin adyuvante. (B) Grupos de ratones control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes más CpG ODN. (*P < 0,05) Las diferencias en l'as cargas de parásitos de bazo entre los grupos con L3 más CpG ODN, L5 más CpG ODN, L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y control (solución salina y adyuvante) fueron estadísticamente significativas. (*P < 0,05) Las diferencias en las cargas poplíteas de parásitos entre los grupos con L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y control (solución.- salina y adyuvante) fueron estadísticamente significativas .

Figura 13. Representación diagramática de las construcciones quiméricas propuestas. Se muestran los cebadores diseñados y los sitios de corte elegidos para clonar .

Ej emplos Ejemplo 1: clonado de proteínas L3 y L5 de Leishmanxa major y efecto protector conferido por estas proteínas contra infección por Leishmania major Materiales y Métodos Cepas de ratones y parásitos .

Se compraron ratones BALB/c hembra (entre 6 y 8 semanas de edad) de Harían Interfauna Ibérica S.A. (Barcelona, España) .

Los parásitos de L. major (WHOM/IR/-/173) se mantuvieron en estado virulento mediante pasaje en ratones BALB/c. Se obtuvieron amastigotes de L. major y se """transformaron -a promastigote mediante cultivo a 26 °C en medio de Schneider (Gibco, BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 20% de suero fetal bovino.

CpG-ODN.

Se sintetizaron CpG-ODN modificados por fosforotioato (5' -TCAACGTTGA-3' y 5'- GCTAGCGTTAGCGT-3 ' ) (SEQ ID NO: 5, 6) mediante Isogen. ( Países Ba-jo-s) - - - Clonado de secuencias de ADNs que codifican para proteínas L3 y L5 ribosomales de L. major.

Se obtuvo el marco de lectura abierto (ORF) que codifica para las proteínas L3 y L5 de L. major de la base de datos. i del genoma de L. major (www.genedb.org/genedb/leish) usando las secuencias de las proteínas L3 y L5 de S. cerevisiae como sondas (56) . Para la expresión de las proteínas rLmL3 y rLmL5, se amplificaron sus regiones codificantes (CR) mediante PCR usando como molde el ADN de L. major (MHOM/IL/80 (Friedlin) ) . Los ADNs amplificados' se clonaron en el plásmido pBluescript (Stratagene, La Jolla CA) y se secuenciaron antes de clonar en el vector de expresión pQE30 (QIAGEN, Hilden, Alemania) .

Para el clonado de la CR de LmL3 los cebadores que se emplearon fueron: directo, 5'- CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG -3' (posiciones 1 a 20 de la CR de LmL3 (Lmj F3 .2880 ) ) (SEQ ""'-ID NO: 44); reverso, 5'- AACTGCAGTTACTTCTTCGCGGCCTTTG -3' (reverso y complementario a las posiciones 1241 a 1260 de la CR de LmL3 (Lmj F34.2880 ) ) (SEQ ID NO:45). Se incluyeron los sitios de restricción Bamtil y PstI (subrayados) para propósitos de clonado.

Para el clonado de la CR de LmL5 los cebadores que se emplearon fueron: directo, 5'- CGGGATCCATGTGCACGC TGGCAAATTG .-3/ (posiciones 1.a .20 -de la._CR. de LmL5 - (Lmj F35.189-0) ) (SEQ - ID NO:46); reverso, 5 ' -CCCAAGCTTTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3 ' (reverso y complementario a las posiciones 968 a 987 de la CR de LmL5 (Lmj F35.1890.319) ) (SEQ ID NO: 47). Se incluyeron los sitios de restricción BamHI y HindIII (subrayados) para propósitos de clonado.

Purificación de proteínas .

Se sobreexpresaron las proteínas rLmL3 y rLmL5 en Escherichia coli transformada con el plásmido pQE-LmL3 o pQE- LmL5 y se purificaron bajo condiciones desnaturalizantes en columnas de agarosa con Ni-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen) . Después de la unión a la agarosa Ni-NTA las proteínas recombinantes se plegaron nuevamente sobre la columna de afinidad como se describió previamente (57). Se pasaron las proteínas recombinantes a través de una columna de polimixina-agarosa (Sigma, St. Louis, o.). El contenido de endotoxina residual (<12 pg/pg de proteína recombinante ) se midió mediante el Quantitative " Chromogenic Limulus Amebocyte Assay QCL-1000 (BioWhittaker, alkersville, Md. ) .

Inmunizaciones , inoculación con parásitos y cuantificación de parásitos .

Se inocularon por vía subcutánea (s.c.) dos grupos de ratones BALB/c independientes (seis por grupo) en la almohadilla plantar derecha con 10 pg de rLmL3 o 10 pg de rLmL5 mezclado con 25 ug de cada CpG-QDN. Como control, se inocularon dos grupos adicionales de ratones con 25 pg de cada CpG-ODN solo, o con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se reforzó cada grupo a las dos y cuatro semanas posteriores con la misma dosis que se usó en la • primera inoculación. Se llevó a cabo la prueba con parásitos mediante inoculación s.c. con 5 ? 104 promastigotes de fase estacionaria de L. major (WHOM/IR/-/173 ) en la almohadilla plantar izquierda (no tratada) cuatro semanas después de la última inoculación. El edema de almohadilla plantar se midió con un calibre métrico y se calculó como el espesor de la almohadilla plantar izquierda menos el espesor de la almohadilla plantar derecha. Se determinó el número de parásitos en los oídos, los nodulos de drenaje linfático (DLN) y en bazo mediante ensayo de dilución limitante como se describió previamente (70) .

Antígenos de Leishmanial y proteínas ribosomales de ratón. ¦ ' " Para la preparación de LRP de L. major, se cosecharon 109 promastigotes, se lavaron dos veces en PBS pre-enfriado y se resuspendieron en 1 mi de amortiguador de lisis NP40 (Tris HC1 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, gCl2 1,5 mM y NP40 al 0,5%) y se pipetearon hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Después de la lisis, se microcentrifugaron las muestras a 3.000 ? g durante ...2 minutas . a .4 _°C para pele.tear ... los...-núcleos . ..Se-centrifugó dos veces el sobrenadante a 13,000 * g durante 15 minutos a 4 °C y se prepararon los ribosomas a partir del sobrenadante citosólico como se describió en [57], Brevemente, se envió el citosol a centrifugación de alta velocidad a 90.000 rpm durante 30 minutos a 4°C en un rotor Beckman TL100.3. Se resuspendió el pellet ribosomal crudo en solución amortiguadora A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, AcNH4 500 mM, MgCl2 100 mM, ß-mercaptoetanol 5 mM) y se centrifugó a través de gradiente discontinuo de sacarosa (20/40%) en solución amortiguadora A a 90.000 rpm a 4 °C en un rotor TL100.3. Se disolvió el pellet de los ribosomas lavados en PBS y se sónico hasta degradación completa del ARN ribosomal. Se prepararon extractos de proteínas ribosomales de ratón (MRP) a partir de 5 *107 células de macrófagos murinos RAW 264.7 usando el mismo procedimiento.

Se prepararon proteínas totales de L. major (antígeno soluble de Leishmania [SLA]) como" se describió previamente (70). Brevemente, se lavaron promastigotes de L. major (1010) dos veces en PBS, se resuspendieron en 500 mi de PBS y se Usaron mediante tres ciclos de congelado y descongelado. Después de la lisis de las células, se separaron los antígenos solubles de la fracción insoluble mediante centrifugación durante 15 minutos a 12,000 x g usando una microcent.rífuga Se alicuotaron ..los .sobrenadantes ...y... sé almacenaron a - 70°C.

Medida de citoquinas en sobrenadantes Se midió la liberación de IFN-?, IL-10 e IL-4 en los sobrenadantes de células esplenocitos estimuladas con las proteínas recombinantes usanso conjuntos de componentes de ELISA comerciales (Diaclone, Besangon, Francia). Brevemente, se sembraron 3 * 106 células de bazo en placas de 48 pocilios durante 48 horas a 37°C en presencia de rLmL3 (6 g mi-1) o rLmL5 (6 µ? mi-1) o medio solo.

Detección de respuestas de anticuerpo anti-L3 y anti-L5 en ratones y perros Se colectaron muestras de suero canino de 20 perros clínicamente sintomáticos naturalmente infectados con Leishmania infantum en la región de Extremadura (España) . Se evaluaron clínicamente y analíticamente los perros infectados en el Departamento de Parasitología de la Escuela de Veterinaria, Universidad de- Extremadura, Cáceres, España. Todos los sueros fueron positivos cuando se los ensayó mediante inmunofluorescencia indirecta, y se confirmó la presencia de formas de amastigote del parásito mediante observación directa en nodulos linfoides poplíteos y prescapulares . Se obtuvieron sueros control de 8 animales sanos mantenidos en el Departamento de Parasitología .(.Universidad .de Extremadura.) ..... .... . - Se colectó suero de 12 ratones BALB/c infectados experimentalmente con 5 * 104 promastigotes en fase estacionaria de L. major (WHOM/IR/-/173 ) en la semana ocho después de la infección. Como control se colectó suero de los mismos ratones antes de la infección.

Se recubrieron placas estándar de ELISA durante una noche a temperatura ambiente con 100 µ? de cada una de las proteínas ribosomales recombinantes (2 pg mi-1 en PBS) . Se ensayaron muestras de suero canino y murino a dilución 1/200 en PBS-Tween 20 ( 0 , 5% ) -caseína (5%). Como anticuerpos secundarios, se usaron anti-IgG de perro (1/1000), anti-IgGl de ratón (1/1000) y anti-IgG2a de ratón (1/500) conjugados con peroxidasa de rábano comprados de Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, Los Países Bajos) . Para los ensayos de ELISA se usó ortofenil diamina dihidrocloruro (OPD) (Dako, A/S, Glostrup, Dinamarca) como sustrato para peroxidasa. Después de 15 minutos, se detuvo la reacción con el agregado de 100 µ? de H2S04 1 y se leyó la absorbancia a 450 nm.

Análisis estadístico El análisis estadístico se llevó a cabo mediante una prueba t de Student . Las diferencias se consideraron significativas para P < 0,05.

Resultados y discusión Identificación, ... clonado y expresión de las proteínas LmL3 y LmL5.

Para la identificación de las regiones codificantes de L3 y L5 de L. major se llevó a cabo una búsqueda por BLASTP usando como sondas las secuencias de aminoácidos de L3 y L5 de S. cerevisiae (YOR063w y YPL131w, respectivamente) [58].

Se rescataron dos entradas diferentes (Lmj F34.2880 y LmjF35.1890) ingresadas como posibles proteínas LmL3 y LmL5 con valores significativos de puntuaciones BLAST. En base a los datos de secuencia de la base de datos, se diseñaron cebadores de PCR para amplificar las CR de LmL3 y LmL5, incluyendo el sitio de corte para las diferentes enzimas de restricción con propósitos de clonado. Se subclonaron los ADNs amplificados en pBluescript y se secuenciaron . La posible proteína L3 de L. major posee 419 aminoácidos que tienen un peso molecular de 47,5 kDa y un punto isoeléctrico predicho de 11,67. La posible proteína L5 de L. major posee 328 aminoácidos, con un- pesó'" molecular de 36,6 kDa y un punto isoeléctrico predicho de 10,69. La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de L3 y L5 de L. major con sus contrapartes de S. cerevisiae revelaron un alto grado de homología: 57% de identidad, 73,5% de similitud para la proteína L3; 51,2% de identidad, 66,3% de similitud para la proteína L5 (Véanse los Alineamientos) . El alineamiento que se .presenta, . n la presente muestra que....las. proteínas. _.L3 y._L5 de Leishmania contienen algunos dominios con un alto grado de similitud. También fue importante observar que ambas proteínas de parásito eran más largas que las proteínas de levadura, presentando residuos extra de aminoácidos en el extremo carboxilo-terminal para la LmL3 y en ambos extremos para la LmL5. La inusual estructura primaria de las proteínas de Leishmania que pertenecen a las familias de proteínas conservadas parece ser inmunológicamente relevante, debido a que las respuestas humoral y celular que se producen contra estas proteínas durante la infección son específicas contra el parásito sin reactividad cruzada con las proteínas homologas de sus contrapartes huéspedes (39, 36, 58) .

Se subclonaron LmL3 y LmL5 CR en el vector de expresión pQE30. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas recombinantes deducidas se muestran en las Partas C y D del alineamiento. Ambas proteínas presentan en su extremo N-terminal un rótulo- -que incluye las 6 histidinas que se usan para purificación por cromatografía de afinidad. Subsiguientemente, se sobreexpresaron ambas proteínas en cultivos de E. ccli y se purificaron. Como se muestra en la Figura 1, las proteínas ' rLmL3 y rLmL5 purificadas mostraron una masa molecular aparente de 48 kDa y 38 kDa, respectivamente, de acuerdo con la presencia de 12 aminoácidos extra .de la extensión his-tag en -sus giones N-terminales. Se demostró la pureza de la proteína debido a que se observó una sola banda para ambas proteínas recombinantes purificadas en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie blue (Figura 1) LmL3 y LmL5 son reconocidas por suero canino con leishmaniasis visceral (CVL) y por suero de ratones BALB/c infectados con L. major (MCL) .

Para determinar la antigenicidad de las proteínas L3 y L5 de L. major en perros afectados por VL, se emplearon las proteínas rLmL3 y rLmL5 recombinantes como antígeno en ensayos de ELISA usando el suero de 20 perros infectados con L. infantum. Como control, se ensayó la reactividad del suero obtenido de 8 perro sanos contra ambas proteínas recombinantes. De los sueros de CVL, 75% (15/20) reconocieron a la proteína rLmL3 (Figura 2b) y 90% (18/20) reconocieron a la proteína rLmL5 con valores de reactividad mayores que el valor de corté (-Figura- 2c) . El espectro de los valores de absorbancia entre los que eran contra rLmL3 y rLmL5 fue diferente, ya que la reactividad del suero CVL contra rLmL5 fue mayor (media = 0,61 ± 0,36) que la que se obtuvo para rLmL3 (media = 0,28 ± 0,10). Se puede concluir que ambas proteínas de parásito se exponen al sistema inmune durante la leishmaniasis natural canina, siendo la proteína LmL5 un inmunogeno más . preyalente que la LmL3. A pesar .de . que aquí se empleó un número limitado de sueros, los datos que se obtuvieron se pueden tomar como una indicación de que se pueden usar ambas proteínas recombinantes de parásito, en combinación con otros antígenos, para el desarrollo de pruebas serodiagnósticas de CVL.

Luego, los inventores analizaron la antigenicidad de las proteínas LmL3 y LmL5 usando los sueros.de ratones BALB/c que sufren leishmaniosis cutánea (MCL) debido a infección con L. major. Para ese propósito, se analizó la presencia de anticuerpos IgGl e IgG2a contra ambas proteínas recombinantes mediante ELISA. Ambas proteínas fueron reconocidas por el suero de MCL siendo los anticuerpos que se produjeron contra las mismas predominantemente del isotipo IgGl (Figura 2a) . No se observó reactividad contra ellas en los mismos ratones antes de la infección (Figura 2a) . Debido que se usa la inducción de anticuerpos IgGl e IgG2a como un marcador de respuestas inmunes- de - tipo Th2 y de tipo Thl, respectivamente (8), los inventores pueden concluir que durante la infección por L. major se induce una respuesta humoral de tipo Th2 contra estos antígenos en ratones BALB/c.

La inmunización contra las proteínas ribosomales recombinantes rLmL3 y rLmL5 en presencia de CpG ODN induce una respuesta de tipo Thl contra ellas en ratones BALB/c.

Debido, a que se produce una respuesta humoral, mediada por Th2 contra las mismas en ratones BALB/c infectados, los inventores analizaron el efecto de la inmunización de rLmL3 y rLmL5 en presencia de un adyuvante que induce Thl (CpG-ODN) . Para ese propósito se inmunizaron independientemente grupos de seis ratones con rLmL3 y rLmL5 en combinación con CpG-ODN.

Como control, se inmunizaron grupos de seis ratones con CpG-ODN solo y con PBS (solución amortiguadora que se empleó como excipiente) . Después de tres dosis se analizaron las respuestas celulares producidas por la inmunización. Se obtuvieron células de bazo y se cultivaron en presencia y en ausencia de los correspondientes antigenos rLmL3 o rLmL5. Las células de bazo de ratones inmunizados con rLmL3+CpG-ODN produjeron un alto nivel de IFN-gama después de la estimulación con el antigeno rLmL3 (Figura 3a) . Se detectó un nivel similar de IFN-gama en los sobrenadantes de cultivos de células de bazo de ratones inmunizados con rLmL5 + CpG-ODN después de-- -^estimulación con rLmL5 (Figura 3b). --Por"' eP contrario, las células de bazo de ratones inmunizados con el adyuvante o el excipiente produjeron bajos niveles de IFN-gama en respuesta a estimulación con rLmL3 o rLmL5 (Figura 3ab) . Con respecto a la producción de IL-4, se detectaron niveles muy bajos de esta citoquina después de la estimulación, con rLmL3 o rLmL5, de células de bazo que se obtuvieron., de , ratones inmunizados con rLmL3+CpG-0DN... (Figura 3c) o rLmL5+CpG-0DN (Figura 4d) , respectivamente. Finalmente, no se detectó producción especifica de IL-10 en ningún grupo (Figura 3ef) . Por lo tanto, se puede concluir que el adyuvante de CpG-ODN sesga la respuesta inmune contra los antigenos recombinantes hacia una respuesta Thl.

Vacunación con rLmL3 + CpG-ODN y rLmL5 + CpG-ODN que protege a ratones BALB/c contra la inoculación con L. major.

Los inventores analizaron si la administración de ambas proteínas recombinantes era capaz de inducir protección contra infección por L. major en ratones BALB/c susceptibles,.. El edema de almohadilla plantar de ratones vacunados con rLmL3+CpG-ODN o rLmL5+CpG-ODN fue significativamente menor en comparación con el edema de almohadilla plantar de los grupos control con PBS o CpG-ODN (Figura 4a). Además, se observó una reducción de aproximadamente 2-log en la carga de parásitos en el drenaje de células de nodulo linfático de los ratones inmunizados- -•'Con-;xLmL3+CpG-0DN o rLmL5 + CpG-ODN. 'FiTiaim nie, no se pudieron detectar parásitos en los bazos mientras que se detectaron parásitos en bazo de ratones de ambos grupos control (Figura 3b) . Se puede concluir que los ratones inmunizados con las proteínas de parásito LmL3 y LmL5 expresadas como proteínas recombinantes mezcladas con CpG-ODN estuvieron protegidos contra una infección por L.. En los ratones vacunados no hubo patología dérmica o la misma fue muy baja. En estos ratones, la presencia de parásitos estuvo restringida a los nodulos linfáticos de drenaje poplíteo. La protección que se observó fue similar a la que se obtuvo mediante inmunización de ratones con un coctel de ADN plasmídico que codifica para las histonas de nucleosoma de Leishmania (19), la proteína PO administrada como una vacuna de ADN (54) y un extracto de LRP combinado con CpG-ODN (55). Por lo tanto, los inventores han caracterizado dos constituyentes ribosomales cuya inmunización puede contribuir a un desarrollo más racional de eficaces vacunas definidas molecularmente contra leishmaniasis .

Análisis de los parámetros inmunológicos asociados con la protección .

Para determinar los parámetros inmunológicos asociados con la protección se analizó la producción de citoquinas (IFN-Y, IL-4 e IL-10) producidas por SLA, LRP, MRP y la correspondiente- proteína recombinante (L3 y L5) · ern-l-os1 g-rupos de ratones vacunados y control en la semana 8 después de la inoculación. Las células de bazo de ratones vacunados con L3 y L5 produjeron más SLA, LRP y IFN-? específico para antígeno recombinante que las de ratones control en la semana ocho después de la inoculación (Figura 5a para L3 y Figura 6a para L5) . La producción de IFN-? se halló inducida específicamente por ...las proteínas ribosomales de e i shwenia , debido , a que .. la estimulación de los cultivos de células de bazo con MRP no resultó en la producción de esta citoquina (Figura 5a para L3 y Figura 6a para L5) . Además, se hallaron menores niveles de IL-10 específica para SLA y LRP (Figura 5b para L3 y Figura 6b para L5) y IL-4 (Figura 5c para L3 y Figura 6c para L5) en los sobrenadantes de células de bazo obtenidas de ratones protegidos en comparación con ratones control (CpG y solución salina) . Además, la producción dependiente de L3 y L5, especifica de MRP, de IL-10 e IL-4 fue muy baja en los ratones protegidos. Por lo tanto, se puede concluir que después de la infección el fenotipo protector se asoció con la inducción de respuestas Thl contra L3 y L5 que fueron capaces de controlar las respuestas de IL-4 e IL-10 inducidas por el parásito.

I Datos de alineamiento de secuencia de LmL3 y LmL5. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de proteínas L3 (A) y L5 (B) de Leishmania major con sus ortólogos de Saccharo yces cerevisiae . Los aminoácidos conservados están sombreados. El número de aminoácidos de LmL3 y LmL5 está indicado. Las secuencias de aminoácidos de L. major se predijeron a partir de sus correspondientes secuencias de ADN . (C y D) Secuencias de aminoácidos o las secuencias de aminoácidos predicha de las proteínas recombinantes LmL3 (rLmL3) (C) y LmL5 (rLmL5) (D) expresadas en bacteria. La secuencia extra his-tag localizada en su N-terminal está indicada -en negrita y subrayada. El número de •amino¾cidos de las proteínas rLmL3 y rLmL5 está indicado.

A LmL3 MSjCKFEH RHGHL RPGSKVNKK ScL3 MSHRkYÉAPRHGHLGFLP RPGSKFHKR EVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGLKTIGTVWAHHTSVEFRRRYYKN KQSAQLAFS RQKQFANTK EVVEAVTVVDTPPVVVVGVVGYVETPRGLRSLTTV AEHLSDEVKRRFYKN YKSKKKAFT —KYSAKYA EGKVAEARTLNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAHVQEIQVNGGSVAAKIALAK SLLEKEVRV QDGAGIERELARIK YASVVRVLVHTQIRKT PLAQKKAHLAEIQLNGGSI SEKVDWAREKFEKTVAV pSVFQQSEACDVCSjVTKGH^ ÁGQHGYHHR DSVFEQNEMIDA AVTKGHGFEGVTHRWGT KLPRKTHRGLRKVACIGAK AGQRGYHSR TQLNKKIYQIGRSVAVEP QÁTTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDYVMLKGSVSG VMTLRRPMA TSINHKIYRVGKG-DDEAKGA- TS DRTKKTITP GGFVHYGEIKNDFIMVKGCI PG RKRIVTLRKSLY PQÍSRQLKEKIVLKFJDTSSKIGHGRFQTKKEKNQ FjGPL^ RKA AAKK. . ... . .

TNTSRKALEEVSLK IDTASKFGKGRFQTPAEKHAFMGTLKKDL B LmL5 MCTLANWVRAIIKKHSTLAHTLE PFVKVVKNKAYFKRFQVKYRRRREGKTDYHARRQMVL » i QDKTKFGSP MAFQKDAKS SAYS SRFQT PFRRRREGKT DYYQRKRLVTQHKAKYNTP KYRLVVRITNKDIIAQIVQAKIYGDEVV^AAYAHELPAFGIEHGLTNYAAAYATGLLLARR TLAKLGIAD KYRLVVRFTNKDIICQIISSTITGDVVLAAAYSHELPRYGITHGLTNWAAAYATGLLIARR TLQKLGLDE KFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEERFPFKAILDVGLARTTTGARVFG.VLKGÁVDGGMA VPHRFNRFP - TYKGVEÉVEGEYELTEAVEpGPR ···- ¦ PFKVFLDIGLQR TTGARVFGALKGASDGGLYVPHSE RFP GYNKEKSSLDAKVHRDRIFGKHVADYLKQVKEEASSNPDEKCVQ-gSKYMÁAKVLPES;IEGMYKKÁHAAÍ GWDFETEEIDPELLR3YIFGGHVSQYM E^LADDDEERFSEL KGYLADDIDADSLEDIYTSAHEÁÍ RADPS-KSLPKKAKKEGVA--HKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK RApPAFKPTEKKFTKEQYAAESkKYRQTKLSKEERAARV C rLmL3 MRGSHHHHHHGSMSHCKFEHPRHGHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMV 60 FKAGMTHIVRDVDRPGSKVNKKEVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGLKTIGTVWAH 120 HTSVEFRRRYYKN KQSAQLAFSRQKQFANTKEGKVAEARTLNAFAK ASVIRVIAHTQL 180 RKLRNHRVGVKKAHVQEIQVNGGSVAAKIALAKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKG 240 HGTEGVVKR GVACLPRKTHRGLRKVACIGAWHPARVMYTVARAGQHGYHHRTQLNKKIY 300 QIGRSVAVEPNQATTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDYVMLKGSVSGPRRRV TLRRP 360" ··'¦· MAPQTSRQLKEKIVLKFIDTSSKIGHGRFQTKKEKNQWFGPLKKDRIRREERLRKERAAR 420 AVERKAKAAKK 431 D rLmL5 RGSHHHHHHGSMCTLANWVRAIT.KKHSTJ.AHTLEMPFVKVVKNKAYFKRFQVKYRRRRE 60 GKTDYHARRQMVLQDKTKFGSPKYRLVVRITNKDIIAQIVQAKIVGDEVVMAAYAHELPA 120 FGIEHGLTNYAAAYATGLLLARRTLAKLGIADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEER 180 FPFKAILDVGLARTTTGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRPNRFPGYNKEKSSLDAKVHRDRI 240 FGKHVADYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKYMAAKVLPESIEGMYKKAHAAIRADPSKSLP 300 ¦ .. KKAKKEGVAHKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK 340 7Ejemplo 2: análisis de homólogos de L3 y L5 Alineamiento de homólogos de L3 y L5 Los inventores han analizado el grado de conservación de las proteínas ribosomales L3 y L5 entre diferentes especies de Leishmania. Para ese propósito, se rescataron las ¦ -secuencias de aminoácidos de la proteína L3---de L. infantum, y L. mexicana (SEQ ID NO: 48 and 50) y la proteína L5 de L. infantum (clon JPCM5 [MCAN/ES/98/LLM-877 ] ) , L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2904) y L . mexicana (MHOM/GT/2001/U1103 ) (SEQ ID NO: 52, 56 and 54) mediante un análisis in silico a partir de las bases de datos de genoma (www. genedb. org) y en comparación con las secuencias de aminoácidos de ortólogos de L. major (SEQ ID N0:1 para L3 y SEQ ID NO: 3 pa a L5) (ver alineamientos en siguiente página, parte A y B) . Excepto por la existencia de una extensión N-terminal en la proteína L5 de L. major, se observó un alto grado de conservación entre las diferentes especies. La Tabla 1A-B muestra los porcentajes de identidad y similitud entre los ortólogos de L3 y L5, respectivamente.

Localización de las L3 y L5 de Leishmania major en los ribosomas .

Con el objetivo de demostrar que las LmL3 y LmL5 recombinantes que se emplearon en este trabajo corresponden a las proteínas que se localizan en los ribosomas de los parásitos, los inventores han empleado anticuerpos específicos para las proteínas recombinantes en transferencia western con las proteínas recombinantes y extractos de LRP. La Figura 8A muestra que los anticuerpos anti-LmL3 que se obtienen de ratones inmunizados con la proteína recombinante reconocieron una banda individual ••con-'- el peso molecular esperado (47,5 kDa) en los extractos de LRP. Se observó un resultado similar para la proteína L5 (Figura 8B) . Se observó una banda individual de 36,6 kDa en los extractos de LRP cuando se emplearon anticuerpos anti-LmL5 purificados de suero de perros infectados naturalmente con L. infantum mediante cromatografía de afinidad en una columna de rLmL5-Sefarosa 4B como se describió previ mente (71), Como control positivo, en ambos casos, la proteína recombinante correspondiente fue reconocida por los anticuerpos específicos .

Comparaciones de secuencias de Leishmania L3 y L5.

Alineamiento de secuencias de aminoácidos de L3 de L. major, L. infantum y L. mexicana (A) (SEQ ID NO: 1, 48 y 50) y L5 de L. major, L. braziliensis , L. infantum y L. mexicana L5 (B) (SEQ ID NO: 3, 56, 52 y 54) . Las secuencias de proteína LmL3, de la posible proteína L3 de L. infantum ( identificador de 5. GeneDB LinJ32_V3.3320 ) y L. mexicana ( identificador de GeneDB LmxM33.2900 ) , y las secuencias de la proteína LmL5 y la posible proteína L5 de L. braziliensis ( identificador de GeneDB LbrM34_V2.1790) , L. infantum (identificador de GeneDB LinJ35_V3.1870) y L. mexicana ( identificador de GeneDB 10 LmxM34.1880 ) se alinearon usando los parámetros por defecto de ClustalW (programa DNAstar) . Las sustituciones de ;-¦ aminoácido están sombreadas. ··-¦-¦¦·· ¦·-·¦ A 15 L. major MSHCKFEHPRHGHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMVF L. infantum MSHCKFEHPRHGHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMVF X. mexicana. 20 MSHCKFEHPRHGHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMVF . major KAGMTHIVRDVDRPGSKVNKKEVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGL . infantum KAG THIVRDVDRPGSKVNKKEVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGL L. mexi KAGMTHIVRDVDRPGSKVNKKEVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGL L. major KTIGTVWAHHTSVEFRRRYYKNWKQSAQLAFSRQKQFANTKEGKVAEART L. infantum KTIGTVWAHHTSVEFRRRYYKNWKQSAQLAFSRQKQFANTKEGKVAEART L. mex KTIGTVWAHHTSVEFRRRYYKN KQSAQLAFSRQKQFANTKEGR1AEART L. major LNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAHVQEIQVNGGSVAAKIAL L. infantum.

LNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAHVQEIQVNGGSVAAKIAL L. mexicana LNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAHVQEIQINGGNVAAKIAL L. major AKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKGHGTEGVVKR GVACLPRKTHR L. infantum AKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKGHGTEGVVKRWGVACLPRKTHR L. mexicana AKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKGHGTEGVVKRWGVACLPRKTHR L. major GLRKVACIGAWHPARVMYTVARAGQHGYHHRTQLNKKIYQIGRSVAVEPN L. infantum GLRKVACIGAWHPARVMYTVARAGQHGYHHRTQLNKKIYQIGRSVAVEPN L. mexicana GLRKVACIGAWHPARVMYTVARAGQHGYHHRTQLNKKIYQIGRSVAVEPN L. major QATTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDYVMLKGSVSGPRRRVMTLRRPM L. infantum QATTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDYV LKGSVSGPRRRVMTLRRPM ' L. mexicana QATTTYDLTAKTITP GGFVGYGTVRNDYVMLKGSVSGPRRRVMTLRRPM L. major APQTSRQLKEKIVLKFIDTSSKIGHGRFQTKKEKNQWFGPLKKDRIRREE . infantum APQTSRHLKEKIVLKFIDTSSKIGHGRFQTKKEKNQWFGPLKKDRIRREE L. mexicana APQTSRQLKEKIVLKFIDTSSKIGHGRFQTKKEKSQWFGPLKKDRIRREE RLRKERAARAVERKAKAAKK L. infantum RLRKERAARAVERKAKVAKK L. mexicana RLRKERAARAVERKAKAAKK B L. major MCTLANWVRAIIKKHSTLAHTLE PFVKVVKNK L. braziliensis PFVKVVKNK L. infantum MPFVKVVKNK L. mexicana MPFVKVVKNK - L. major AYFKRFQVKYRRRREGKTDYHARRQMVLQDKTKFGSPKYRLVVRITNKDI L. braziliensis AYFKRFQVKYRRRREGKTDYHARRQMVLQDKTKFGSPKYRLVVRTTNKDI L. infantum AYFKRFQVKYRRRREGKTDYHARRQMVLQDKTKFGSPKYRLVVRITMKDI L. mexicana AYFKRFQVKYRRRREGKTDYHARRQMVLQDKTKFGSPKYRLVVRITNKDI IAQIVQAKIVGDEVVMAAYAHELPAFGIEHGLTNYAAAYATGLLLARRTL L. braziliensis IAQIVQAKIAGDEVLMAAYAHELPAFGIEHGLTNYAAAYATGLLLARRTL L. infantum IAQIVQAKIVGDEVVMAAYAHELPAFGIEHGLTNYAAAYATGLLLARRTL L. mexicana IAQIVQAKIVGDEVVMAAYAHELPAFGIEHGLTNYAAAYATGLLLARRTL L. major AKLGIADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEERFPFKAILDVGLARTT L. braziliensis AKLGIADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDQGDDEARFPFKAILDVGLARTT L . - - ¦ infantum AKLGIADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEERFPFKAILDVGLARTT L. mexicana AKLGIADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEERFPFKAILDVGLARTT L. major TGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRPNRFPGYNKEKSSLDAKVHRDRIFGKHV „ .. . . . . braziliensis TGARVFGVLKGAVDGGISVPHRPNRFPGYSKEKSÁLDAKVHRDRIFGKHV L. infantum TGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRPNRFPGYNKEKSSLDAKVHRDRIFGKHV L. mexicana TGARVFGVLKGAVDGG AVPHRPNRFPGYNKEKSSLDAKVHRDRIFGKHV L. major AdYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKY AAKVLPESIEGMYKKAHAAIRADP L. braziliensis AEYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKYMEAKVAPESIECMYKFAHAAIRADP L. infantum AEYLKQVKEEASSNPDEKCVQFS¾YMAAKVLPESIEGMYKKAHAAIRADP L. mexicana AEYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKYMAAKVLPESIEGMYKKAHAAIRADP L. major SKSLPKKAKKEGVAHKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK L. braziliensis SKSLPKKAKKEGAKHKSYKTKKMSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK L. infantum SKSLPKKAKKEGVAHKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRER'LGK L. mexicana SKSLPKKAKKESVAHKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK TABLA 1 ? muestran" los vapores de identidad y similitud (entre paréntesis) .

Ejemplo 3: Vacunación con r L3 + CpG-ODN y r m 5 + CpG- ODN protege a ratones BALB/c contra inoculación con L. braziliensis .

Los inventores han analizado el efecto de la inmunización de las proteínas recombinantes rLmL3 y rLmL5 de L. major combinadas con un adyuvante que induce Thl (CpG-ODN) en el desarrollo de leishmaniasis cutánea causada por la infección con L. braziliensis . Para ese propósito se inmunizaron independientemente grupos cinco ratones con 10 yg de rLmL3 o 10 yg de rLmL5 en combinación con 50 yg de CpG-ODN (25 yg de CpG-1 [5' -TCAACGTTGA-3' ] más 25 yg de CpG-2 [5'- GCTAGCGTTAGCGT-3' ) ] (SEQ ID NO: 5 and 6)). Como control, se inmunizaron grupos de cinco ratones con 50 yg de CpG-ODN solo o con PBS (solución amortiguadora que se empleó como excipiente) . Se ·-- inocularon los ratones en la dermis dé - l oreja (oreja izquierda). Se reforzó a cada grupo dos y cuatro semanas después con la misma dosis que se usó para la primera inyección. Se llevó a cabo la inoculación con parásitos mediante inyección en la oreja derecha (sin tratar) con 105 promastigotes de fase estacionaria de L. braziliensis (MHOM/BR/01/BA788 ) combinados con dos pares de glándulas salivales de mosca de arena Lutzomya. Intermedia: En sste modelo de infección, después de la inoculación con parásitos, los ratones BALB/c desarrollaron una lesión inflamatoria en las orejas afectadas que progresó continuamente y alcanzó un máximo aproximadamente en la semana 5. De allí en adelante, el tamaño de la lesión tuvo una regresión y se observó una cicatriz de oreja completa aproximadamente en la semana 9 después de la infección (72). Los inventores han analizado el desarrollo de lesión cutánea en los cuatro grupos de ratones hasta las 5 semanas después de la inoculación con parásitos midiendo el espesor de la lesión con un calibre métrico. Como se muestra en la Figura 7A, las lesiones de las orejas de los ratones vacunados con rLmL3 + CpG-ODN o rLmL5 + CpG-ODN fueron significativamente menores en comparación con los grupos control con PBS o CpG-ODN. Además, se analizaron las cargas de parásitos en la semana 5 después de la infección en las orejas infectadas. Se determinó el número de parásitos mediante ensayo - de" dilución límite como se describió previamente (73) . Se observó una disminución de las cargas de parásitos en los ratones vacunados en comparación con los grupos control. Las diferencias se encontraron significativas en el grupo rLmL5 + CpG-ODN con respecto a ambos grupos control (P < 0,05, prueba t de student) . Más aun, no se pudieron detectar parásitos en la oreja en cuatro de cinco ratones (grupo rLmL5 .+ CpG-ODN) y en_. uno - de, . cinco" ratones -en el grupo rLmL3 + CpG-ODN (Figura 7B) . Por lo tanto, se concluyó que los ratones vacunados con las proteínas ribosomales L3 y L5 de L. major expresadas como proteínas recombinantes y combinadas con CpG-ODN estuvieron protegidos contra una inoculación heterologa con L. braziliensis .

Ejemplo 4: Protección parcial conferida por S6 de Leishmanla major contra infección por Leishmania major Se inmunizaron independientemente cinco grupos de ratones (n=4 por grupo) con 10 ]iq de S6 (SEQ ID NO: 34), L2 (SEQ ID NO: 22), L7 (SEQ ID NO: 24), L8 (SEQ ID NO: 26) y.L16 (SEQ ID NO: 28) en presencia de CpG ODN según identificación previa por SEQ ID NO: 5 y 6 (50 µq) . Como control, se inmunizó un grupo de ratones con el adyuvante y se inmunizó otro grupo con el excipiente ( PBS-solución salina). Se administraron tres dosis a intervalos de 2 semanas. Todas las inmunizaciones se llevaron a cabo en la almohadilla plantar derecha. Un- mes después de la última dosis, se infectaron l&s ratones con 105 promastigotes en fase estacionaria de L. major inyectados por vía subcutánea en la almohadilla plantar izquierda. Se evaluó el desarrollo de lesión dérmica mediante medida de edema de almohadilla plantar hasta la semana ocho después de la inoculación (Figura 9A) . Los ratones de todos los grupos desarrollaron lesiones inflamatorias, a pesar de que el..edema -de almohadilla plantar, de .las ratones que-. se vacunaron con S6 más CpG ODN fue significativamente menor que el que se observó en los controles y en los ratones inmunizados con las otras cuatro proteínas. También, se analizaron las cargas de parásitos en los nodulos de drenaje linfáticos (DLN) y en los bazos de los ratones. Los animales inmunizados con S6 más CpG ODN mostraron una reducción de 2-log en el número de parásitos en bazo en comparación con los grupos con solución salina y CpG ODN, respectivamente (Figura 9B) . Sin embargo, las cargas de parásitos que se hallaron en los DLN del grupo S6 más CpG ODN fueron similares a las que se observaron en los controles.

A partir de este ensayo, se puede concluir que la vacunación con la proteina recombinante S6 en presencia de adyuvante CpG ODN produjo la inducción de un estado inmune que resulta en una protección parcial contra CL causada por infección con L. major en los ratones BALB/c: presencia de menores -lesiones inflamatorias en el sitio de in-fecciórr y menores cargas de parásitos en el bazo, comparado con los controles. Por otro lado, la vacunación con los otros cuatro antigenos (L5, L7, L8 y L16) no resultó en cambios significativos en la progresión de CL en relación a los controles .

Con el objetivo de analizar la respuesta inmune inducida ,pQ.r .La yapunación, se compararen las respuestas humoral _y. celular que se produjeron en ratones mediante vacunación con S6 + CpG ODN con ratones inmunizados con el adyuvante y el diluyente de vacuna. La Figura 10 muestra que la formulación de vacuna indujo una respuesta mixta Thl/Th2 contra la proteina S6, debido a que se detectaron anticuerpos específicos anti-S6 IgG2a e IgGl en los sueros de los ratones vacunados (véase la Figura 10A) . Además, a pesar de que se produjo IFN-gama después de la estimulación con S6 in vitro de células de bazo que se establecieron a partir de los ratones vacunados, también se observó la presencia de citoquina IL-4 detectable en los sobrenadantes de cultivo (véase la Figura 10B) .

Se puede concluir que la vacunación indujo una respuesta predominante Thl contra la proteína S6, pero también se observó una leve estimulación de una respuesta Th2 contra la proteína (niveles detectables de IL-4 específica para 36 y anticuerpos "IgGl específicos para S6) . - :··' ""- Ejemplo 5: Vacunas en base a proteínas recombinantes L3, L5 y S4 de Lelshmania. major.

Con el objetivo de analizar con mayor detalle la protección inducida por las proteínas ribosomales L3, L5 y S4, se llevó a cabo un nuevo experimento de inmunización -infección. Se incluyeron doce grupos de ratones (n=4 por grupo ) en el análisis. En todos ]os casos se- inmunizaron- os ratones por vía subcutánea tres veces (separadas por dos semanas) en la almohadilla plantar derecha. Se ensayaron los siguientes grupos: ¦ Vacuna excipiente: solución salina.

? ¦ Vacuna adyuvante: CpG-ODN. Por dosis: 50 pg de CpG ODN (25 CpG-ODN-1 [ 5 ' -TCAACGTTGA-3 ' ] (SEQ ID NO: 5) y 25 g de CpG-ODN-2 [5'- GCTAGCGTTAGCGT-3 ' ] (SEQ ID NO: 6).

L3 (SEQ ID NO:l). Por dosis: 10 g de proteina recombinante .

¦ L3 + CpG ODN. Por dosis. 10 g de proteina recombinante y 50 µg de CpG ODN.

¦ L5 (SEQ ID NO:3). Por dosis: 10 µg de proteina recombinante .

¦ L5 + CpG ODN. Por dosis. 10 µg de proteina recombinante y 50 µg de CpG ODN.

¦ S4 (SEQ ID NO: 32). Por dosis: 10 µg de proteina recombinante .

¦ S4 + CpG ODN. Por dosis. 10 µg de proteina recombinante y 50 µg de CpG ODN.

¦ L3 + L5. Por dosis: 10 µg de proteínas recombinantes totales; 5 µg de cada proteína.

¦ L3 + L5 + CpG ODN. Por dosis. 10 µg de proteína recombinante total y 50 µg de CpG ODN.

"L3" ' + L5 +" S4. ""'Por dosis: "10 g" de "proteínas recombinantes totales; 3,3 µg de cada proteína.

¦ L3 + L5 + S4 + CpG ODN. Por dosis. 10 µg de proteína recombinante total y 50 µg de CpG ODN.

Brevemente, se ensayaron los tres antígenos en presencia o en ausencia de CpG ODN. Además, se analizaron combinaciones de L3 + L5 y L3 + L5 + S4 en presencia y en ausencia de CpG ODN. Un mes después de la última dosis, se infectaron los ratones con 105 promastigotes en fase estacionaria de L. major inyectados por vía subcutánea en la almohadilla plantar derecha.

Se evaluó el desarrollo de lesión dérmica mediante la medida del edema de almohadilla plantar hasta la semana seis después de la inoculación. En la Figura 11A se muestran ambos grupos control (solución salina y CpG ODN) y los cinco grupos vacunados con los antigenos sin el adyuvante. No se observaron diferencias en las lesiones inflamatorias entre grupos control y los cinco grupos vacunados "con' las' "proteínas en ausencia de adyuvante. En la Figura 11B se muestran ambos grupos control (solución salina y CpG ODN) y los cinco grupos vacunados con los antigenos combinados con el adyuvante. En este caso, todos los grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes en presencia del adyuvante mostraron una reducción del edema de almohadilla plantar excepto el grupo S4+CpG.. ODN. Las menores lesiones in lamator-i-as se observaron en los grupos con L5+CpG ODN, L3+L5+CpG ODN y L3+L5+S4+CpG ODN.

Se analizaron las cargas de parásitos en los DLN y en los bazos de todos los grupos de ratones en la semana siete después de la infección. No se encontraron diferencias estadísticas entre los ratones incluidos en los grupos control y los ratones inmunizados con las proteínas ribosomales sin adyuvante (Figura 12A) . Por otro lado, los ratones inmunizados con las proteínas ribosomales más CpG ODN mostraron una disminución significativa de las cargas de parásitos en bazo, excepto en el grupo con S4 más CpG ODN (Figura 12B) . Con respecto a las cargas de parásitos en el nodulo linfático poplíteo, los inventores solo encontraron una disminución significativa en los grupos que se vacunaron con la combinación de dos (L3 + L5) o tres (L3 + L5 + S4) proteínas ribosomales más CpG ODN. Los ratones vacunados con L'3 má¾- CpG ODN y L5 más CpG ODN también ' mostraron menores. cargas de parásitos que los controles. Sin embargo, debido al alto grado de variabilidad que se encuentra entre los diferentes animales, los resultados no fueron estadísticamente significativos. Estos ensayos deben ser repetidos con un mayor número de ratones con el objetivo de analizar la influencia de las vacunas sobre las carga locales de. .parásitos, debido a. .que los ensayes, previos., los inventores encontraron diferencias estadísticas entre los ratones vacunados con L3 más CpG ODN y L5 más CpG ODN y los controles .

Con respecto al uso de vacunas en base a antígenos individuales o la coadministración de antígenos diferentes, los resultados de los inventores indican que las vacunas combinatorias están induciendo un mayor grado de protección que las vacunas compuestas por antigenos individuales.

Ejemplo 6: Diseño de procedimientos de clonado para la construcción de moléculas recombinantes que combinan los cuatro antigenos ribosomales protectores ya caracterizados (L3, L5, S4 y S6 de Lelsbmanla zajor) .

En base a los resultados previos, los inventores han planeado preparar nuevos productos recombinantes en base a las proteínas L3 (SEQ ID N0:1), L5 (SEQ ID N0:3), S4 (SEQ ID NO: 32) y S6 (SEQ ID NO: 34) de Leishmania major.

-^-Primero, se clonarán los insertos de ADN- que codifican para las cuatro proteínas en un vector de expresión eucariota (pcDNA-3; Stratagene) . Este vector, que permite la expresión de las proteínas de Leishmania en células de mamífero, se puede emplear para ensayar vacunas de ADN.

Segundo, los investigadores han diseñado un procedimiento para el clonado de las diferentes proteínas quiméricas con diferente . combinación- de los cuatro ant.ígenos (Figura 13) . Las quimeras génicas se clonarán primero en pBluescript (un plásmido de análisis) y luego los insertos de ADN se clonarán en dos plásmidos de expresión diferentes: ¦ pQE30; un plásmido de expresión procariota. ¦ pcDNA3, un plásmido de expresión eucariota.

Esta estrategia de clonado les permitirá a los inventores tener tanto vacunas de ADN como proteínas recombinantes expresadas en E. coli, con las combinaciones antigénicas propuestas.

... Se usaron los siguientes cebadores: LmL3. Directo 5' -CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG-3 ' (SEQ ID NO:57) Reverso 5' -GCGATATCTCCCTTCTTCGCGGCCTTTGCC-3' (SEQ ID NO: 58) LmS4 Directo 5 ' -GCGATATCGGGATGGCCAAGAAGCACCTCAAG- 3' (SEQ ID NO:59) Reverso 5' -CGGAATTCTCCCTTGCGGGCCCTGCGGG-3' (SEQ ID NO: 60) LmS6 Directo 5' -CGGAATTCGGGATGAAGCTCAACATCGCGTAC- 3' (SEQ ID NO: 61) Reverso 5' -GCGATATCTCCCTTCTTCTGGAATGCTGCCAC-3 ' (SEQ ID NO: 62) LmL5 Directo 5' -GCGATATCGGGATGTGCACGCTGGCAAATTG3 ' (SEQ ID NO: 63) ... ¦.Reverao . 5' -GGGG.TACC.G_GATCCT_TACTTGCCGAGGCGC.TCGC-3 '..(:SEQ TONO: 64) La proteína quimérica resultante se representa mediante una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 67. Esta proteína quimérica está codificada por un ácido nucleico que está representado por una molécula de ácido nucleico que consiste en SEQ ID NO: 66.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Uso de una fuente de L3 y/o L5, CARACTERIZADO PORQUE es para tratar o prevenir o retrasar una enfermedad parasitaria en un sujeto.

2. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE una fuente de L3 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la - secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:l y/o que está codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 2 y en donde una fuente de L5 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y/o que e«tá codificada por. una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 4.

3. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, CARACTERIZADO PORQUE se combina una fuente de S4 y/o S6 con una fuente de L3 y/o L5.

4. Uso de una fuente de S6, CARACTERIZADO PORQUE para tratar o prevenir o retrasar una enfermedad parasitaria en un sujeto.

5. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 1 a 4, CARACTERIZADO PORQUE está presente un adyuvante.

6. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO PORQUE la fuente de L3 y/o L5 y/o S4 y/o S6 es una vacuna.

7. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 1 a 6, CARACTERIZADO PORQUE la fuente de L3 y/o L5 y/o S4 y/o S6 es una proteina, un fragmento de proteina, un péptido, un - acido nucleico. : ·

8. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, CARACTERIZADO PORQUE el adyuvante es un adyuvante que 15 promueve Thx.

9. Uso de acuerdo a la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE el adyuvante que promueve Thi es un CpG ODN.

10. Una composición CARACTERIZADA PORQUE comprende una fuente de L3 y/o 1-5. 20 11. Una composición de acuerdo a la reivindicación 10,

CARACTERIZADA PORQUE una fuente de S4 y/o S6 está comprendida en dicha composición.

12. Una composición CARACTERIZADA PORQUE comprende o consiste en una fuente de S6.

13. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, CARACTERIZADA PORQUE además comprende un adyuvante.

14. Una composición de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADA PORQUE el adyuvante es un adyuvante que promueve Thi.

15. Una composición de acuerdo a la reivindicación 14, CARACTERIZADA PORQUE el adyuvante que promueve Thi es un CpG ODN.

16. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, CARACTERIZADA PORQUE además comprende un adyuvante o- vehículo aceptable farmacéuticamente .

17. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, CARACTERIZADA PORQUE para usar como una medicina.

18. Una composición de acuerdo a la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la medicina es una vacuna.

19. Uso de una fuente de L3 y/o L5 CARACTERIZADO PORQUE es para diagnóstico in vitro de una enfermedad parasitaria en un sujeto.

20. Uso de acuerdo a la reivindicación 19, CARACTERIZADO PORQUE además se usa una fuente de S4 y/o S6.

21. Uso de una fuente de S6, CARACTERIZADO PORQUE es para diagnosticar in vitro una enfermedad parasitaria en un suj eto .

22. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 19 a 21, CARACTERIZADO PORQUE la fuente de L3 y/o L5 y/o S4 y/o S6 se obtiene de una especie de Leishmania .

23. Uso de acuerdo a la reivindicación 22, CARACTERIZADO PORQUE la especie de Leishmania es Leishmania major, Leishmania infantum , Leishmania braziliensis o Leishmania mexicana .

24. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 19 a 23, CARACTERIZADO PORQUE la enfermedad parasitaria es leishmaniasis o malaria.

25. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 19 a 24, CARACTERIZADO PORQUE la enfermedad parasitaria está causada por una especie de Leishmania o por una de Plasmodium.

26. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 19 a 25, CARACTERIZADO PORQUE la enfermedad parasitaria está causada por una especie diferente a las especies de las que deriva la fuente de L3 y/o L5 y/o S4 y/o S6.

27. Un método para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto que usa una fuente de L3 y/o L5, CARACTERIZADO PORQUE comprende determinar si un anticuerpo que reconoce a dicha fuente está presente en una muestra que se obtiene de un sujeto.

28. Un método de acuerdo a la reivindicación 27, CARACTERIZADO PORQUE también se usa una fuente de S4 y/o S6.

29. Un método para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto que usa una fuente de S6, CARACTERIZADO PORQUE comprende determinar si un anticuerpo que reconoce a dicha fuente está presente en una muestra que se obtiene de un sujeto.

30. Un dispositivo de ensayo para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto, CARACTERIZADO PORQUE comprende una fuente de L3 y/o-L5.

31. Un dispositivo de ensayo de acuerdo a la reivindicación 30, CARACTERIZADO PORQUE también está presente una fuente de S4 y/o S6 en dicho dispositivo.

32. Un dispositivo de ensayo para diagnosticar una enfermedad parasitaria en un sujeto, CARACTERIZADO PORQUE comprende o consiste en una fuente de S6.

33.._ .Un ...ensayo de acuerdo a ...cualquiera .. de ...las reivindicaciones 30 a 32, CARACTERIZADO PORQUE es un ensayo ELISA.