BR112012011395A2

BR112012011395A2 - uso de uma fonte de l3 e/ou l5 como uma vacina ou como um diagnóstico para uma doença parasítica

Info

Publication number: BR112012011395A2
Application number: BR112012011395-0A
Authority: BR
Inventors: Carlos Alonso Bedate; Manuel Soto Alvarez; Laura Ramire Garcia
Original assignee: Laboratorios Leti, S.L.
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2020-09-01
Also published as: TN2012000217A1; BR112012011395B1; CN107551264A; US20120263746A1; AU2010317962A1; CY1118402T1; CN102712684A; MX2012005522A; JP2013510823A; IL219770A0; EP2499158B1; US10604551B2; IL219770A; EA022221B1; JP5875987B2; HK1176074A1; PE20121553A1; CA2780740C; AP3464A; SA110310855B1

Abstract

  USO DE UMA FONTE DE L3 E/OU L5 COMO VACINA OU COMO DIAGNÓSTICO PARA UMA DOENÇA PARASÍTICA A ínvenção refere-se à composição compreendendo uma fonte L3 e/ou L5 e opcionalmente um adjuvante para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença parasitica e seu uso para diagnóstico da mesma.

Description

4 P USO DE UMA FONTE DÉ L3 E/OU L5 COMO VACINA OU COMO

DIAGNÓSTICO PARA UMA DOENÇA PARASÍTICA Campo da invençãQ A invenção se refere a uma fonte L3 e/ou L5 para 5 a preparação de urn medicamento ou um remédio para o tratamento, prevenção e/ou uso de diagnóstico de uma doença parasítica. Antecedentes cia invenção Leishmaniose compreende várias doenças causadas

1.0 por parasitas protozoários intracelulares que pertencem ao gênero Leishmania que infectam principalmente macrófagos de uma variedade de mamíferos incluindo seres humanos e cães. Dependendo amplamente da espécie do oarasita e do estado de imunocompetência do hospedeiro humano, o espectro da doença varia de leishmaniose cutânea de auto-cura (LC) até leishmaniose visceral fatal (LV) ou calazar (18). Leishmaniose viscerocutânea canina (LVC) causada por Leishmania infancum e L. chagasi é uma zoonose emergente importante encontrada em países em torno da bacia do Mediterrâneo, no Oriente Médio e na América Latina (16): sendo cães o principal reservatório desses parasitas que desempenham um papel ceritral na transmissão para seres humanos por moscas de areia de flebotomíneo (44). O resultado da infecção é determinado por interações entre o sistema imune hospedeiro e as diferentes espécíes de parasita, ainda que a patogênese de leishmaniose permanece não definida e o conhecimento dos mecanismos envolvidos na respostas imune a T,eishmania em seres humanos e cães é ainda limitado. Genericamente, a imunidade de proteção é associada a uma resposta imune mediada por uma célula clássica que induz ativação de macrófagc por citocinas deriva.das de célula T. l?or outro Iado, doença sem cura é a$.sociâdá à geração de respostas humoEais intensas (15,24).

b. t

A pesquisa para o desenvolvimento de vacinas de segunda geração, com base em frações de parasíta brutas ou em antígenos de parasíta definidos, foi endereçada para a identífú:ação de moléculas de parasita secreta em uma

5 superfície diferente das que foram testadas cotno candídatos de vacina em vários modelos experimentais utilizando diversos adjuvantes (1, 17, 20, 43, 45, 46, 49, 50). A triagem de bibliotecas de expressão com sorôs de animais ou seres humancs infectados permitiu também a seleção de alguns antigenos como vacinas candidatas (exarríinado erri (9)). Entre esses, aqueles que extraiam principalmente uma resposta ímune do tipo Thl erri células de paciente humano ou de camundonços infectados, independente de sua localização celular, foram envolvidas na geraçãc de respostas de proteção em modelos de animais diferentes (48, 51, 52). Por outro lado, alguns dos antígenos isclados são proteirias conservadas int.ràcelulare" que estimulam predominantemente respostas hurnorais em seres humanos ou cães que sofrem de respostas hurr-orais mediadas por Th2 ou LV em camundongos experimentalmente infectaclos {3, 33, 35, 37, 39)- A resposta humoral inadequada induzida contFa os mesmos em cães que sofrew. cie leishmaniose resulta em imunopatologia,

principalmente devido aos efeítos adversos de complexos imunes comQ uveíte (13), lesões no sistema nervoso centraí

(14) ou nefrite (21, 22, 30, 31). Foi recentemente mostrado que a presença de complexos imunes IçG em sereq humanos com

VL correlaciona com incapacidade de resolver infecções, demonstrando que complexos imunes podem ser prejudiciais para o hospedeiro infectado (27)- Ape3ar de não serem consideradas pri-meiramente COjKlO boas candidatas à vacina, proteínas que induzem uma resDosta humoral elevada durante ~ o proce-sso ínfecciaso foram associadas à indução de uma respo'sta .de prçjteção.

Por exemplo, t\mulinas de parasita e

4 K histona H2B foram reconhecidas pelos clones de célula-T derivados de um doador i-mune (36). Alérn disso, rK39 causa proliferação e produção de IFN-Y por células T dos camundongos imunes (23). Foi também mostrado que imunização 5 genética com genes de parasita K2B, Fl3 e H4 induz proteção em modelos de leishrnaniose visceral de murino (62). Além disso, a imunizaçào do receDtor para cinase C ativada - (LACK) (29), algumas proteinases de cisteína de parasita (38, 41) ou as histonas que formam nucleossomo de parasíta (11, 19) administradas com adjuvantes promotores de Th1 geram respostas ímunes que correlacionam para proteção contra leishmaniose cutânea em modelos de murino.

Entre os antígenos evolutivos conservados de Leishmania, várías linhas de evidência sugerem que proteínas ribossomais são moléculas imunologicamente relevantes durante ínfecção por Leishmania. Em alguns casos, constítuintes ribossomais podem contribuir para a disfunção do sistema imune hospedeiro através de sua capacidade em modular atividades de célula e Iiberação de citocina dutante infecçào. Desse modo, injeçãQ da proteína ribossomal L. major S3a em camundongos BALB/c induziu a expansão policlonal de clones de célula-l3 e inibiú a prolíferação de células-T (10). Além disso, imunização genética com uma vacina de DNA codificando para a proteína ribossomal 60S putativa L31 exacerbou a doença em modelos de camundongos pela indução de citccinas Th2 e IL-IO (41,63). Além disso, algumas proteínas ribossomais de parasita como as proteinas P ácidas de parasita foram relacionadas à geração de respostas humorais intensas em cães e seres humanos que sofrem de leishmaniose (examinado em (39)). Entretanto, foi mostrado também que várias proteínas ribossomais testa.das não foram capazes de induzir uma reposta de proteção imunogênica ou, a resposta de

L h e proteção imunogênica obcída foi sub-ideal (55,41). Apesar de todas as tentàtivas até o presente, não há ainda vacinas valiosas contra uma doença parasitica como leishmaniose, Portanto, há ainda necessídade importante por 5 tal vacina.

Descríção da invenção Nesse trabalho, os requerentes mostran surpreendentemente que duas proteírias ribossomais L. major L3 e L5 são antigênicas. lsso significa que cada dessas duas proteínas foi reconhecida pelos soros de individuos afetados COIlí leishuianiose. Aíém disso, no modelo de murino de leishmaniose cutânea, anticorpoq anti-L3 e antí-ljS do isotipo IgGl foram encontrados. A irnunização das ambas as proteinas em camundongos BALB/C, na presença de CpG-ODN, induziu uma resposta de Thl contra os mesmos. Camo resultado da vacinação, os camundongos foram protegidos contra o desenvolvimento cie LC após desafio com L. major.

Os requerentes Cemonstram ainda que as proteínas L. major também podem conferir proteção contra a infecção por L.

braziliensis. Os requerentes também demonstram que proteínas ribossomaís L3 e L5 sãcj altamente conservadas Delo menos entre diferentes espécies de Leishmania. Taís cornposíções são muito atraentes para serem utilizadas como composição farmacêutica preferivelmente como diagnóstico, vacina Qü uma aplicação terapêutica. A i.nvenção é adicionalmente descrita abaixo.

Uso Em um primeiro aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma fonte de L3 e/ou L5 e opciona1merLte um adjuvante para a preparaçào de um reinédio ou um medicamento para o tratamento ou prevenção cie uma doença parasítica ern um s,u,jeítow q 4 N Proteínas L3 e L5 são proteínas ribossomais. Proteínas ribossomais são proteínas citosólicas bem conservadas. Portanto, unia fonte L3 e/ou L5 pDde ser preparada de qualquer organismo eucariótico, seja planta ou 5 animal, seja de mamíferos, répteis, peixes, insetos ou qualquer outro organismo que tenha cromossomos, como protozoários, preferivelmente, uma fonte L3 e/ou L5 é obtida de um organismo que está próximo à doença, preferívelmente uma doença parasítica que cause organismo na árvore evolutiva. PortantQ, de interesse específico como fonte de uma fonte L3 e/ou L5 a ser utilizada na prevenção e/ou tratameato de uma doença parasítica são protozoários como P1asmodiuin e em particular mernbros da famílía de tripanossornatídeo, mais particularrnente espécíes diferentes do protozoário tripanosscmático Leishmania. Há mais de 20 espécies conhecidas de Leishmania, incluíndo espécies do subgênero .T,eishmania, compreendendo o l. major complexo, incluindo .t,, major, l. donovani complexo, incluindo L. chagasi, L. donovani e L. infantum, o complexo L. Mexicana, incluindo L. amazonensis e L. mexicana, bem como as subespécies Viannia, compreendendo o complexo L. braziliensis, incluincio l. brazilien.cis e L. peruviana e o complexo L. guyanensis, inciuindo L. guyanensis e L. panamensis. Ejspécíes de PIasmodium de interesqe específico são Plastuodium falciDarum & e plasmodium vivax. Em uma rnodalidade preferida, uma fonte L3 e/ou L5 é obtída de uma espécie de Leishmania, preferivelmente Leishmania major, Leishmania infantutn, Leishmania donovani, Leishmania mexicana, Leishmania chagasi e/ou Leishmania braziliensis.

Mais preferivelmente, uma fonte L3 é obtida de uma espécie de Leishmania, preferivelmente Leishmania major, Leishmania infantum .e./ou Leishmania Mexicana. Mais preferi-velmente uma fcmte L5 é obtida de uma espécie de Leishmania,

preferivelmente Leishmania major, Leishmania infantum, Leishmania braziliensis e/ou Leishmania mexicana. No exemplo 2, qs requerentes demonstraram a existência de homólogos L3 e L5 altamente conservados (identidade de pelo 5 menos 90%, vide a tabela ].) ern pelo menos três espécies de Leishmania dístintas- Em Qütra modalidade preferida, uma for.te L3 e/ou L5 é obtida de uma espécie de Plasmodium, A pessoa versada enterzderá que uma fcmte de L3 e/ou L5 também pode ser preparada por misturar uina fonte L3 e/ou L5 de lo váries cmganismos distintos como identificado aqui. O uso de uma fonte L3 e/ou L5 em urna vacina foi demonstrado aqui como tendo propriedades imunogênícas atraentes uma vez que mostrou índuzir uma tesposta de proteção imune em um sujeito tratado.

1.5 Q termo "uma fonte de L3 e/ou L5" pode ser substituído por "unia fonte de urr. L3 e/ou L5". Uma fonte L3 e/ou L5 compreende preferivelmente uma proteína L3 e/ou L5, um peptídeo derivado de L3 e/ou L") ou fragmento de proteína e/ou um ácido nucléico que codífica uma proteína L3 e/ou L5 ou peptídeo derivado Oll fragmento de proteína. Uma proteína L3 preferida é representada pela SEQ ID NO: 1. E,aSa proteína L3 preferida origina de Leishmania major e é preferivelmente codificada por SEQ ID NO: 2. Outra proteina L3 preferida é representada pela SEQ ID NO: 48. Essa proteina L3 preferida origina de Leishmania infantum e é preferivelmente codificada por SEQ ID NO: 49. Outra proteína L3 preferida é representada por SEQ ID NO: 50. Essa proteína L3 preferida origina de .Leishmania mexicana e é preferG-elmence codificada por SEÒ ID NO: 51.

Uma proteíria L5 preferida é representada por SEQ ID NQ:3. Essa proteína L5 prefericia origina de Leishmamia major e é preferivelmente codificada por SEQ ID NO:4. Outra proteína L5 preferida é representada por SEQ ID NO:52. Essa

)

K k proteína L5 preferida origina de Leishmania infantum e é preferivelmente codificad.a por SEQ ÍD NO:53. Outra proteína L5 preferida é represeritada por SEQ ID NO:54. Essa proteína L5 preferida origina de Leishmania mexicana e é 5 preferivelmente codificada por SEQ ID NO:55. Outra proteína L5 preferida é representada por SEQ ID NO:56. Essa pisoteina L5 preferida origina de Leishmania braziliensis e é preferivelmente codificada por SEQ ID NO:65. Em todo esse pedido, cada vez que se refere a uma sequência de nucleotídeo específica SEQ ID NO (torrie a SEQ ID NO:2 ou 4 ou 49 ou 51 ou 53 OLl 55 ou 65, como exemplo), pode-se substituir a mesma por uma sequência de nucleotídeo compreendendo uma seauência de nucleotídeo que tenha pelo menos 60% de identidade de sequência ou similaridade com a

SEQ ID NQ: 2 ou 4 ou 49 ou 51 ou 53 ou 55 ou 65. Em todc esse pedido, cada vez que se refere a i-uria sequência de aminoácido específica SEQ ID NO (tome a SEQ ID NO: í ou 3 ou 48 ou 50 ou 52 ou 54 ou 56 como exemplo), pode-se substituir a mesma por um polipeptidio compreendendo uma sequência de aminoácido que tenha pelo menos 60% de identidade de sequência ou similaridade com a sequência de aminoácido SEQ ID NO: I ou 3 ou 48 ou 50 ou 52 ou 54 ou 56. por conseguinte, em uma modalidade preferída, uma fonte L3 é um polipeptídio que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de sirnilaridade ou identidade de sequência com sequência de aminoácído SED IQ NO: 1 OU 48 OU 50 e/ou que é codificado por uma sequência de nucleotídeo que tenha pelo menos 60% de identidade como

SEQ ID NO: 2 ou 49 ou 51. Por conseguinte, em uma modalidade preferida 'jma fonte L5 é um polipeptidio compreend'endo urna sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de similaridade Oll t y identidade de sequência com sequência de amínoácido SEQ TD NO; 3 ou 52 ou 54 ou 56 e/ou que seja codificada por uma sequência de nucleotídeo que tenhã pelo men(js 60% de identidade com SEQ ID NO:4 ou 53 ou 55 oü 65.

5' Por conseguinte, em uma modalidade preferida, uma fonte L3 é um áeido nuclÁico compreendendo urna sequência de nucleotídeo que tem pelo rr.enos 60% de identidade cju similaridade de sequência com sequência de nucleotídeo SEQ ID NO:2 ou 49 ou 51 e/ou que codifica uma sequência de .i'o aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 1 ou 48 ou 50. Pof conseguinte, erri uma raodalidade preferida uma fonte L5 é um ác.ido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico que tenha pelo menos 60% de identidade ou similaridade de sequência com sequência de rmcleotídeo SEQ ID NO: 4 ou 53 ou 55 ou 65 e/ou que codifica uma sequência de arninoácido que tenha pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 3 Dü 52 ou 54 ou 56. Preferivelmeríte, a sequ.ância cie aminoãcido ou sequêncía de nucleotídeo tendo pelD menos 60% de identidade Cjú siwilaridade com unza sequência de nucieotideo ou aminoácido identificada específica é abrangida pela presente invenção e se diz que são funcionais quando a proteína ou polipeptídio codifícado, fragmento de proteína, e o peptideo é ainda capaz de provocar pelo menos a resposta imune obtida peia SE.Q ID NO: 1 ou 3 ou 48 c)ü 50 ou 52 ou 54 ou 56 pelo menc)s até certD ponto. Pelo menos até certo ponto significa preferivelmente que pelo menos 50%, pelo rnen.os 60%, 70%, 80%, pelo mencs 90% ou 100%. Provocar uma resposta imune é posteriorrnente definido aqui: um composto é funcíonal quando é capaz de provocar uma resposta i.mune em um sujeito tratado que siçnifica preferivelmente que é capaz de prcmover ou desencadear uma

M k b resposta imune Thi contra um antígeno dado L3 e/ou L5 e/ou que é capaz de evitar e/ou retardar o desenvolvimento de uma lesão dérmica ou de mucosa e/ou induz uma redução significativa da carga de parasita em uma lesáo dérmica 5 e/ou de mucosa e/ou em uma orelha e/ou em um linfonodo de drenagem (DLN) que preferivejmente drena quaisquer dessas regiões infectadas (derrria, região da mucosa, orelha), bem como em um árgão interno corno figado, baço, medula óssea, rim, cérebro, etc. uma sequência de aminoácido abrangida pela presente invenção pode compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substítuições e/ou inserções e/ou deleções e/ou aminoácidos de terininal N- ou C- adicionais ou frações quimicas para aumentar a estabilidade, soiubilidade e imunogenicidade.

Um fragmento de proteína L3 e/ou L5 ou um peptídeo derivado de L3 e/ou L5 como definido aqui é preferivelmente um fragmento que compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos de uma proteína L3 e/ou L5 correspondente e que é capaz de provocar uma resposta imune como definido anteriormer.te aqui. Em uma modalidade preferida, portanto, um fragmento de proteína L3 e/ou L5 Qü um peptideo derivado L3 e/ou L5 como definido aqui é preferivelmente um fragmento corripreendendo pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:l ou 3 ou 48 ou 50 ou 52 ou 54 ou 56.

Como modalidade preferida, um fragmento de proteína L3 preferido ou um peptídeo derivado de L3 preferido, compreende ou consiste nos últiínos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23,

b K b 22, 21, 20 aminoác.idos cQntíguDs da parte C-terminal de uma proteína L3. Ainda mais preferivelmente, compreer.de ou consiste nos últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 amimácídos 5 contíguos da SEQ Iij NO:l ou 48 ou 50. Ainda rnaís preferivelmente, compreende ou consiste em aminoácido 394- 419 da SEQ ID No:l. Como outra modalidade preferida, um fragmento de proteína L5 preferida ou um peptídeo derivado de L5 preferido, compreende ou consiste nos primeiros 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contíguos da parte N- terminal de uma proteína L5. Ainda mais preferivelmente, cornpreende ou consiste nos primeiros 40, 39, 3B, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 3C, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:3 ou 52 ou 54 ou 56. Ainda mais preferivelmente, compreende ou corjsiste em aminoácido 1-23 de SEQ ID NO:3. Como outra modalidade preferída, um fragmento de proteína L5 preferido ou um peptídeo derivado de L5 preferido compreende ou consiste 2Q nos últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 3Z, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 2C, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, Il, 10, 9, 8, 7, 6 aminoácidos contiguos da parte C-terminal de uma proteina L5. Air.da ínais preferivelmente, compreende OEl consiste nos últimos 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO:3 ou 52 ou 54 ou 56.

Ainda mais prefeFivelmente compreende ou consiste em amZnoácido 322-328 da SEQ ID NO:3. Em oucra mQdalidade preferida, uma fonte L3 e L5 compreende uma proteína compreendendo pelo menos um fragmento de proteína de uma ptot-eína L3 e pelo menos um fragmento de proteína de uina prcteína L5. Mais preferívelrnente, um fragmento de proteína i , 13 e um fraamento de proteína L5 foram fundidos juntos para fo.rmar uma proteína quiméri.ca. Por conseguinte, a invenção também abrange urrt ácido nucléico ou um ácido nucléico codifícando tal fonte L3 e L5.

5 Em uma modalidade preferida, um'a fonte de l3 e/ou L5 compreende pelo menos utna proteína L3 e/ou L5 e./ou pelo menos um fragmento de proteína de L3 e/ou L5. Em uma modalidade mais preferida, urna fonte de L3 e/ou L5 compreende pelo menos duas proteínas L3 e/ou L5 e/ou pelo rnenos dois fragmentos de proteína de L3 e/ou L5. Essa modalidade se refere a uma fonte baseada em proteína, preferivelmente uma vacína baseada em proteína, Deve ser mencionado que em uma rnodalidade preferida urna Ííonte de L3 e/ou L5 como identificado aqui não poderia ser entendída corno abrangendo um Extrato de Proteíma RibQssoma1 (RPE) como identificado em WQ 2009/090175. Um RPE é obtenivel por realizar as seguintes etapas utilizando uma célula de parasita que causa uma d.oença parasítica quando presente em um sujeito: a. Misturar urna célula de parasita com um tampão de lise, K). Centrifugar a mistura obticia para obter urn extrato citosólico, c. Preparar um RPE a partir do extrato citosólico obtido. Portanto, em uma modalidade preferida, uma fonte de L3 e/ou L5 não é um RPE como definido acima. Em outra modalidade preferida, uma fonte de L3 e/ou L5 compreende pelo menos um ácido nucléico que codifica L3 e/ou L5 pelo menos um ácido nucléíco que codifica urn fragrnento de proteína de L3 e/ou L5. Em uma modalidade mais preferida, urria fonte de L3 e/ou L5 compreende pelo menos d'ois ácidos nucléíeos codificando uma

I b proteina L3 e/ou L5 e/ou pelo menos dois fragmentQs de proteína que codificaín ácido nucléico de L3 e/ou L5. E-ssa modalídade se Fefere a ama fonte baseada em ácido nucléico, prefeüvelmente uma vacina baseada em ácido nucléico.

5 A fonte de L3 e/ou L5 pode ser uma protei.na, uma digestào da proteína e/ou um fragmento da mesma, que pode estar em uma forma purificada ou pode ser compreendido em uma composição bruta, preferivelmente de orígem biQlógica, como um lisado bacteriano, lisado de levedura, lísado de fungo, sonicado ou fixado. Alternativamente, uma fonte L3 e/ou L5 pode ser quir.icamente sintetizada ou enzimaticamente prcduzicia in vitro. A fonte de uma proteína L3 e/ou L5, ou fragmento da mesma, também pode ser um ácido nucléico que codifica, ou fraamerito do mesmo, a partir de i5 um gabarito de DNA ou RNA. As moléculas de DNA ou RNA podem ser DNA 'nu', preferivelmente compreendido em vesículas ou lipossomas, ou podem ser compreendidos ein um vetor. O vetor pode ser qualquer vetor de RNA ou DNA (recombinante) conhecido na técnica, e grefetivelmente é um plasmídeo; em que genes que codificam antígenos de latência sàcj operativamente ligados a sequências reguladoras que cop.ferêm expressão e tradução dos mensageiros codificados.

C) jTetor também pode ser qualquer vírus de RNA ou DNA, como, porém não lirnitado a, Adenovírus, vírus Adeno-Associado (AAV), um retrovirus, urn lentivirus, um virus Ankara de Vacínia modificado (F'IVA) ou vírus de afecção diftérico- variólica aviária, ou qualquer outro vetor viral c.apaz de conferír expressão de polipeptídios em llü sujeito escolhido. VetoFes de DNA podem ser não integrantes, coitkj 3C vetores de replicação epissomal, ou podem ser vetores que integram no genòma hospedeiro por integração aleatória ou por recombinação hcmóíoga.

P ? Moléculas de DNA que compreendem genes codificando uma proteina L3 e/.ou L5, ou fragmentos das mesmas de acordo com a presente invenção, opcionalmente incorporadas em um vetor como um vi-rus ou plasmídeo, podem

E ,J ser integradas em uní genoma de um sujeito. Ein uma modalidade preferida da invenção, tal hospedeiro pode ser um microorgani"mo. Preferivelmente tal microorganismo recombinante é uma Micobactéria, por exemplo, da espécie M, tuberculosis M. smegmatis (Yue. Y.e outros, (2007), J.

Virol, Meth., 141: 41-48, Cayabiyab Y.e outros, (2006), J.

Virol., 80: 1645-1652) ou M. bovis e mais preferivelmente m. bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) ou M. smegmatis, capaz de fornecer a um hospedeiro os polipeptídios ou fragmeotos do mesmo de acordo com a invençào. BCG recombinante e métodos para recombinação são conhecido.q na técnica; por exemplo, em WO 2004094469. Tal microorganismo recombinante pode ser formulado como uma vacina recombinante viva e/ou atenuada viva, corno por exemplo, em Jacobs e outros. 1987, Nature, 327(6122):532-5). O vetor também pode ser compreendido em um hospedeiro de origem bacteriana, como, porém não limitado a, bactérias de Shigella ou Salmonella atenuadas vivas e/ou recombinantes. Qualquer adjuvante conhecido pode ser utilizado na presente invenção. A pessoa versada conhece vários adjuvantes apropriados. Adjuvantes são mais preferivelmente selecionados da seguinte lista de adjuvantes: peptídeos catiônicos (antimicrobianos), saponina e ligar.tes de receptor semelhante à Toll (TLR) como, porérn não limitado a poli(l:C), moti.vos CpG, LPS, lipídeo A, lipopeptídeo Pam3Cys, e flagelinas bacterianas ou partes das mesmas, e seus derivados tendo modificações quimicas. Outros adjuvantes preferidos para uyj nc) método e nas compt>sições de acordo com a invenção são: misturas com BCG vivo ou

P P morto, complexos de imünoglabulina com os antígenos de latência ou partes dos mesm'os, ÍC3l (da www.intercell.com; em WO 03047602), QS21/ME'L (US 2003095974), DDA/MPL (WO 20050049Ii), DA/TDB (WO 2005034911; HQlten-Andersen e outros, 2004 Infect Immun. 2004 Mar;72(3):16Cl8-17.) e LAG3 soIúvel (CD223) (da www.Immunotep.com; US 2002192195) Além disso, outro adjuvante preferido inclui o uso de Corynebacteríum paryum ou Propionobacterium acnes (64, 65,

66). 1A são adjuvantes particularmente preferidos aqueles que são conhecidos por atuarem via os receptores semelharites à Toll.

Adjuvantes qüe são capazes de ativação do sistema imur'.e inato podem ser bem âtivâCQs particularmente via receptores semelhantes à Toll {TLR'3),

incluindo TLR'S i-iO e/ou via uma proteína 2IG-1 (gene induzível por ácido retinóico-l) e/ou via um teceptor de endotelina.

Os compostQ3 capazes de atívar receptores TLR e modificações e derivados dos mesmos estão bem documentados na técnica, TLRI pode ser ativado por lir)oproteínas bacterianas e formas acetiladas das mesmas, TLR2 pode, além disso, ser ativado por glicolipídeos bacterianos Gram positivos, LP", LPA, LTA, firrtbrias, proteínas de membrana externa, proteínas cie choque tèrmico de bâe:térias ou do hospedeiro, e lipoarabinomananos micobacterianos.

TLR3 pode ser atiT7ado por dsRNA, em particular de origeín viral, ou pelo composto quimico polí(l:C). TLR4 pode ser ativado por

LPS Gram negativo, LTA, proteínas de choque térmico do hospedeiro ou de origem bacteriana, proteínas de envelope ou capa viral, taxol Qü derívados dos mesmos, oligossacarídeos contendo kialuronano e fibronectinas.

TLR5 pode ser ativado com flagelos ou flagelinas bacterianas.

TLR6 pode ser ativado por lipoproteínas micobacterianas e fator solúvel instável em caÍoE de Streptococcus grupo b

$ P (gbs-f) ou staphylococcus modulins. TLR7 pode ser ativado por imidazoquinolinas e derivados. TLR9 pode ser ativado por DNA CpG não metílado ou complexos de cromatina — IgG. Em particular, TLR3, TLR4, TLR7 e TLR9 desempenham um paDe1 5 importante em mediar uma resposta imune inata contra infecções virais, e compostos capazes de ativar esses receptores são particularmente preferidos para uso na invenção. Adjuvantes particularmente preferidos corupreendem, porém não são limitadQs a, ccmpostos sinteticamente produzidos compreendendo CISRNA, poli(l:C), DNA CpG não metilado que acionam receptores TLR3 e TLR9, IC31, um agonista TLR9, IMSAVAC, um agonista "TLR4. Em outra modalidade preferida, os adjuvantes são fisicamente Iigados a uma fonte L3 e/ou L5 como definído anteriormente aqui. A ligação física de adjuvantes e compostos co-estimuladores ou grupos funcionaís, ao" peptídeos compreendendo epítopo HLA classe I e HLA classe II fornece uma resposta imune aumentada por estimulação simultãnea de células que apresentam antígeno, ern particular células den.dríticas, que

2.0 internalizam, metabolizam e exibem antígeno. Outro composto modificador imune preferido é um inibidor de adesão de céiula T, mais preferivelrnente um inibidor de um receptor de endotelina como BQ-788 (67). BQ-788 é N-cís-2,6-dimetil piperidino carbonil-L-gama-metilelucil-D -l-metoxi carbonil triptofanil-D-norleucina. Entretanto, qualquer derivado de BQ-788 ou composto BQ-788 modificado também é abrangido no escopo dessa invenção. Qutros adjuvantes incluem MPL-SE (Glaxo Smithkline Biologicals, Bélgica) ou EMO05 (IDRI America).

Em uma modalídade preferida, um adjuvante é um adjuvante promotor de T'h1 (como um adjuvante que cornpreende um motivo ODN CpG). Um adjuvante promotor de Thl foi definido na literatura (68) como um adjuvante que é capaz

L r de promver ou acionar uma resposta imune Th1 contra um antígeno dado quando utilizado juntamente com esse antigeno (aqui uma fonte L3 e/ou L5) como detectado em sobrenadantes de esplenócitos çjp um sujeito zratado quando cultivado com

O J c anttgeno. Coino cor.t-role, a promoção Qú acionamento cíe uma.

resposta ímune Thl é avaliada em uma população de esplenócitos do mesmo sujeíto que não foi tratado eorn o antígeno e o adjuvante, ou com a mesma população sornente tratada corri o antígerLo. O acionamento ou promoção de uma resposta ímune Th1 é preferivelmente definida pela indução de IFNy como detectado por cultivar esplenócitos de um sujeito tratado corn o antígeno e/ou por induzír a produção de imunoglobulinas IgG2a especificas de antígeno. A ãvaliação da indução dessa ci-tocina é prefierivelmer.te realizada por ELISA em esplenócitos como descrito no exemplo. A avaliação da induçào de IgG2a é preferivelmente realizada por ELISA ou Western BlQt como descrito no exenplo 1. A indução de IFNy e/ou IgG2a após estimulação de esplenóeitos com uma fonte L3 e/ou L5 e um adjuvante preferivelmente significa que o adj'avante é quâlificado corno um adjavar'-te que promove Thl. Alternativamente O'.l em combinação com a primeira definição de acionar ou promover uma resposta imune Thi dada acíma, o acionamer)tQ cu promoção de uma resposta imune Thl pode ser adicionalmente definida pela ausência (ou a ausência de uma indução) de uma resposta imune Th2. Uma resposta imune Th2 é caracterizada por um aumento detectável em indução de IL-4, IL-IO e/ou a produção de imunoglobulinas IgGl detectáveis quando conlparadQ com espler'.ócitos não tratados. A avaliaçào da indução cie IL-4 e/ou IL-A) é preferivelrrtente realizada por ELISA em- esplenócitos .como ciescrito no exemplo. A avaliação da t , b Ç indução de um IgGl é preferivelmente realizada por ELISA ou Western Blot comc descrito no exemplo 1. Alternativamente ou em combinação com duas primeiras definições de acionar ou promQveE urría resposta 5 imune Th1 dada acima, o acioriamento ou promoção de uma resposta i.nune Thi pode ser adicionalmente definida pela geração de um aumento em razão de IFNy/IL-1O e/ou razão de IFNy/IL-4 e/ou uma diminui.ção na razão de IgG1/IgG2 contra um antigeno definido, nesse caso uma fonte de L3 e/ou L5.

10 Em uma modalidade preferida, uma alteraçãc' (aumento ou diminuição como indicado acima) em quaisquer dessas razões de mais de 2 indica que um adjuvante tem propriedades Thl.

A avaliaçãa da irídução de cada uma das citocinas rriencionadas é preferivelmente realizada por ELISA em 15 esplenócitos ccmo descrito no exemplo. A avaliação da indução de uma imunoglobuíina IgGi ou IgG2 é preferivelmente realizada por ELISA ou Western Blot como descrito no exemplo 1. Em uma modalidade preferida, um adjuvante que 20 proirtove Thl é, ou conipreende, ou consiste em um oligodesoxinucleotídeo. Mais preferivelmente, uín oligodesoxinucleotídeo (ODN) compreende, ou consiste em CpG no qual q C é rião metilado (CpG ODN): 3'-purina-Cpg- 5'pirimidina. Um oligodesoxinucleotídeo preferido é, ou 25 compreende, ou consiste em uma sequência de ODN modificada por fos£orotioato. O uso de oIiaodesoxinucleotídeos tendo tal modificação é vantajoso urua vez que os Dligodesoxinucleçjtídeos utilizados são maijs estáveis do que oligonucleotideos não modifícados e conseqüentemente não 30 serão faciZmente degradacios após estarem na corrente sanguínea. Um adjuvante que promove Th-l prefericlo consiste em, ou compreende, pelo menos uir, motivo CpG, pelo menos doís, ou pelo menos três. Sequências preferidas do ODN

K Ç j imunQ'est.Wula'dor {5' a 3') foram TCAACGTTGA (SEQ ID NO:5) e

GCTAGCGTTAGCGT (SEQ ID NO:6). A pessoa versada Mq é lirnitada às seqvências explicitamer-te descritas aquí.

Ele/ela pode projetar outras sequências e subseqüentemente

5 testar as mesmas em relação a sua rjropriedade de promover

Th-l como definido anteriormente aqui.

Esse adjuvante identifi-cado preferido CpG ODN é altamente atraente uma vez que fcii demonstrado no exemplo qu·" a co-inocuíaçãQ de LRPE com esse adjuvante que promove Thl induz p:roteção contra um desafío com parasitas L. major em cepas cie camündongo tanto de BALB/c como C57BL/6. Nos ciois modelos, a proteção correlaciona com uma produção específica de IFN-y.

Em 3ALB/c, uma restríção na produção de IL-4 e IL-IO também fcji detectada.

A invençãc} provê üsQ de uma fonte L3 e/ou L5 apropriada ccmo 1) preventivo (profilático), 2) p6s- exposição/infecçM ou 3) vacína curativa/cerapêutica.

Uma vantagem da presente invençào é que permite a preparação de um preparado médico para o trat,amento de um espectro mais

2Q amplo de doenças parasíticas, ísto é, um preparacio médico ccm especificidade de espéci'e cruzada.

Em muitas doenças parasíticas, uma vacina criada contra uma espécie específica, somente funcioria contra aquela espécie específica.

Um exemplo de uma doença parasítica na qual este é q caso é a leislmaniose.

No momento, a doença é controlada por drogas, porém o zratarnento com droga não evíta a disseminação da cioença e em muitos casos não é muito eficaz.

Em uma modalidade preferida, uma doença parasítica é leishmanicse Q'-l malária.

Mais preferivelmente,

uma doeriça paEasítica é causada por uma espécíe de Leishmania ou por Plasmodium.

Em uma modalidade preferida adicional, uma doença parasitica é causada ,por uma espécie diferente da espécie da qual uma fonte L3 e/ou L5 é

4 4 ¶ I derivada. Em particular, leishmaniose causada poe umá espêci.e do gênero Leishmania pode ser tratada utilizando urria cc)mDosição baseada em uma fonte L3 e/ou L5 de outra espécie de Leishmania uma vez que como demonstrado na parte 5 experimental (vide exemplo 2) houíólogos L3 e L5 de várias espêcíes de Leishmania são altamente .conqervadas (pelo rnenos 90% de identidade, vide a tabela 1). Além disso, c:s requerentes já demonstraram ria parte experimental (vide os exemplos 1 e 3) que proteínas L3 e L5 de Leishmania major 10 são capazes de proteger contra uma infecção por Leishmania -major ou Leishmania braziliensis. Em uma modalidade, Ieishmaniose causada por l. major é tratada com sucesso com uma composição que compreencie uma fonte L3 e/ou L5 de L. infantum, L. chagasi, t,. amazonensis ou L. braziliensis. Em 15 outra modalidade, leishrnaniose causada por L. chagasi ou L.

amazonensis, é tratada com sucesso com uma composição cjue compreende uma fonte L3 e/ou L5 de L. infantum. Em outra modalidade, leishmaniose causada por l. major ou l. braziliensis é tratada com sucesso com uma composição que 20 compreende uma fonte L3 e/ou L5 de l. major. Alternativamente, outras doenças parasíticas, corno malária, podem ser tratadas coifi sucesso com uma composição base.ada erri uma fonte de L3 e/ou L5 de outra espécie, por exemplo, baseada em uma fonte L3 e/ou L5 de L. infantum ou L. major 25 ou L. mexicana ou L. braziliensis. No corítexto da invenção, um sujeito significa ser um ser humano ou urn animal. Um animal que é abrangído no escopo da invenção inclui um mamífero, preferivelrnente um cão. 30 Em uma rrtodalidade preferida, um remédio (ou preparado médico ou composição farmacêutiga ou rriedicamento) como definido aqui é utilizado para aumentar a capacidade de um sistema imune de um ser humano ou animal Lut-ar contra t 4 b À uma infecção e/ou uma doença, mais preferivelmente üma infecçào parasítica e/ou uma doença parasítica, Em particular, pode ser utílizado para administração em um sujeito humano ou animal.

Um medicamento camo definido aqui

5 é preferivelmente administrado por via parenteral, por exemplo, por ínjeção cu infusão por via íntravenosa, subcutânea, íntraperitoneal, iDtramuscular, intra-arterial ou intralesio.nal.

Um rnodo de administração preferido é subcutâneo.

A invençãD não é limítada a um modo de

10 administração específico de uma fonte L3 e/ou L5. Um modo de aclminístração preferido é administração oral utilízando uma cápsula ou uín comprimido.

Alternativanente, uma fonte de L3 e/cm L5 pode ser administrada localmente vía cateter ou uma bomba, ou um supositório.

Alterríativamente, uma 15 fmte L3 e/ou L5 pode ser administrada topicamente.

A formuíação de tima fonte L3 e/ou L5 ou de uma composição compreendendo urna fonte L3 e/ou L5 depende do modo de administração pretendido e aplicação (terapêutica). Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não

20 tóxica, compatível apropriada para diszribuir uma fonte L3 e/ou Tj5 para um sujeito.

Por exemplo, água estéril, ou sóLidos inertes ou excipientes podem ser utilizados como o veículo, normalmente corriplementado com adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, agentes de tamponamento,

25 agentes de díspersão e similares.

Composições estarão em forma líquida, por exemplo, uma suspensão estabilizada de uma fonte 13 e/ou L5; ou uma composição compreendendo uma fonte L3 e/ou L5: ou em forma sólida e/ou seca; por exemplo, pó.

E'ara administração oral e retal, uma fonte L3

30 e/ou L5 pode ser administrada em formas de dosagem sólida,

como cápsulas, comprimidos, supositórios e pÓs, ou em formas de dosagem líquida, como elixit:es, xaropes, creme, pomada e suspensões.

Outra forma pode ser uma forma semi-

J

F q N J sólida ou semi-líquida em que um L3 e/ou L5 está presente como uma forma líquida em ou sobre um suporte sólido como um adesivo.

Um medicamento pode ser combinado com um m=io 5 farmaceuticamente aceitável ou veículo de distribuição por técnicas convencionaís conhecidas na téenica.

Por exemplo, uma fonte L3 e/ou L5 e opcionalmence um adjuvante pode ser dissolvido em sclução salina de tampão fosfato (PBS). Os métodos para preparar composições administráveis por via

10 parenteral são bem conhecidos na técníca e descritos em mais detalhes em várias fontes, incluindo, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed.

AR Gennaro, 20" edição, 2000, Williams & Wilkins, PA, EEJA.

Um medicamento é preferívelmente admínistrado em uma dose terapeuticamente

15 eficaz, isto é, urria que aumentará a capacidade do sístema imune humano ou animal para combater uma infecção e/ou uma doença como definido aqui. preferivelmente, uma dose terapeuticamente eficaz de um preparado médico da invenção é capaz de provocar uma resposta imune como definido aqui:

20 uma dose é terapeuticamente eficaz quando é capaz de elicíar uma resposta imune em um sujeito tratado que significa preferivelmente que é capaz de promover OLl acionar uma resposta imune Thl contra um dado antígeno L3 e/ou L.5 e/ou que é capaz de evitar e/ou retardar o 25 desenvolvimento de uma lesão dérmica ou de mucosa e/ou induz uma redução significativa da carga de parasíta em uma lesão dérmica e/ou de rnucosa e/ou em uma orelha e/ou em um linfonodo de drenagem (DLN) que drena preferivelmente quaisquer dessas regiões infectadas (dérmic'a, região da 30 mucosa, orelha), bem corno em um órgão interno como fígado,

baço, medula óssea, rim, cérebro, etc.

A avaliação da presença de uma lesão dérmica é descrita no exernplo 1 (vide a figura 4: inchaço de pata). A avaliação de uma carga de

? § S " 0 parasita é descrita no exemplo (vide a figura 4). Uma dose terapeuticamerjte eficaz de um medicamento da. invenção evitará preferivelmente o desenvolvimento de uma lesão dérniica e/ou induzirá preferivelmente uma redução de carga 5 de parasita em uma orelha de aproxinadamente 3 ordens de n\agAitude e/ou de aproximadamente uma magnitude similar em uín DLN após um período de tempo compreendendo primeirametite uma vaciriaçãQ utilizando 'ama composição da invenção seguida por uína infecção seqüencial com um parasita e urri tempo c'e 10' espera de aproximadamente 6 semanas. Em uma modalidade preferída, um medicaínento, cqiiiq definido aqui., é unia vacina. Em uma modalidade mais preferida, pelo menos 12 µg de uma fonte L3 e/ou L5 está sendo uti.lizado em uma vacina. A quantidade de uma fonte L3 e/ou L5 utilizada se refere à 15 quantidade total de L3 e L5 utilizada- Err. uma modalidade ainda mais preferida, pelo menos 12-20 µg de uma fonte L3 e/ou L5 devem ser uti1izadQs para fornecer uma resposta imune opcionalmente em combinação com pelo menos 50 µg de um adjuvante, preferivelmente um adjuvante que promove Thl 20 coino, por exernplo, Cpg CDN. (jma vacina, como definida aqui, pode ser uma vacina profilática Dü terapêutica. O volume no qual uma fonte L3 e/ou L5 e opcionalmente um adjuvante, preferivelmente urrí adjuvante que promove Thl pode ser dissolvido pode variar de 100-500 microlit,ros.

25 Coinposíção Em um aspecto adicional, é fornecida uma composição que compreende uma fonte L3 e/ou L5 e opcionalmerite um adjuvante, preferivelmente, um adjuvante que promove Thi. Uma fonte L3 e/ou L5 e um adjuvante já 30 foram definidos aqui. Em uma modalidade preferida, uma composição consiste em uma fonte L3 e/ou L5 e um adjuvante que promove Th> Um adjuvante que proinove Thi preferido é um CpG ODN. Uma composição preferida compreende ou consiste

4 b L t em uma fonte L3 e/ou L5 e opcionalmente um adjuvante, preferivelmente um adjuvante que promove ThI dissolvido em

PBS.

Em uma modalidade preferida adicional, também é abrangido pela presente invenção que uma fonte L3 e/ou L5 e

.5 um adjuvante, preferivelmente um adjuvante que promove Thl sejam seqüencialmente administrados.

E'ortanto, qs doís componentes não necessitam estar fisicamente presentes em uma única composição desde que ambos sejam administrados a um sujeito. 10 Tal corrtposição pode compreender aínda um adjuvante e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Tal composição é preferivelmente para uso como medicarnento.

O medicamento é preferívelmente uma vaciria.

Medicamento, adjuvante e vacina já foram extensamente 15 definidos aqui.

Uma composição pode estar na forma líquida, sólida, semi-líquida ou semi-sólida como já defínido aqui.

Em uma modalidade preferida, outros compostos são utilizados seqüencialmente ou simultaneamente com uma fonte L3 e/ou L5 para melhorar a especifícidade do tratamento 20 terapêutico O'-l profilático.

É vantajoso, por exemplo, utilizar outros compostos que aumentarão adicionalmente a resposta imune do sujeito tratado.

Mais preferivelmente, taís compostos não estão presentes em uma composição única juntarnente com uma fonte 13 e/ou L5. Por exemplo, os 25 compostos são selecionados de um grupo que consíste em uma fonte de outras proteínas de um parasita que causa uma doença parasítica (19) como Leishmaniose.

Uma fonte de uma proteína dada recebe o mesmo significado que uma fonte de L3 e/ou L5 como definidQ anteriorrnente aqui.

Uma proteína

30 preferida é nesse contexto uma histona como H2A, H2B, El3, H4, outra proteína ribossomal como L12A, (LiP), Lip2b (LiP'), LipO, L2, L7, L8, L16, S6, L19 e S4.

Z b 'ã ' j Uma proteina H2A preferida é representada pela SEQ id NO: 7. Um ácido nucléic'o preferido que codifique um H2A é representado pela SEQ ID NO: 8. Urna proteina H2B preferida é representada por SEQ ID NO: 9. Um ácido 5 nucléico prefetido que codifique um H2B é representado por SEQ ID NO: 10. Uma proteína H3 preferida- é representada por SEQ ID NO: 1I. Um ácido nucléico preferido codificando um H3 é representado pela SEQ ID NO: 12. Uma proteina H4 preferida é representada peia SEQ ID NO: 13. Urrt ácido 10 nucléico preferido que codifique um Fl4 é representado pela SEÇ ID NO: 14. Um L12A preferida também chamada proteína L1P2A é representada pela SEQ ID NO: 15 ou 16. Um ácido nucléico preferido que codifique uma L12A é representado pela SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 17 é uma sequência genômica.

15 A pessoa versada poderia derivar sequências de codificação preferidas dessa sequência genômica. Tais sequências de codificação preferidas correspondern a l1ili ácido nucléico que codifica uma codificação de mRNA para uma proteína L12A representada pela Srq ID NO: 15 OLl 16: uma dci nuc1ecNídeo 20 791 a 1111 e uma de 1662 a 1982 da SEQ ID NO: 17.

Uma proteína Lip2b preferida é representada pela SEQ ID NO: 18. Um ácido nucléico preferido que cQdífique uma LiP2b é representado pela SEQ ID NO: 19. Uma proteina LiPO preferida é representada pela SEQ ID NO: 20. Um ácido 25 nucléico preferido que codifique um LiPO é representado pela SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 19 e 21 são sequências genômicas. A pessoa versada poderia derivar outras sequêneias de codificação preferidas a partir dessas 30 sequências genômicas. Tais outras sequências de codificação preferidas corres'pondem a um ácido nucléico que gQdifica urn mRNA codificando para a proteina respectiva: essas

L e P [ s'equências de ácido nucléíco são representadas pela SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72 e 73, respectivarnente. Uma proteína L2 preferida é repeesentada por SEQ ID NO:22. Um ácido nucléico preferido que codifique L2 é F representada por SEQ ID NO:23. Uma proteína L7 preferida é representada por Srq ID NO:24. Urn ácido nucléico pFeferido que codifique um L7 é representada por SEQ ID NO:25. Uma proteína L8 preferida é representada pcye SEQ ID NO:26. Um ácido nucléico preferido que codifique um L8 é representada 10 por SEQ ID NO:27. Uma proteína LI6 preferida é representada por SEQ ID NO:28. Um ácido nucléico preferido que codifique L16 é representada por SEQ ID NO:29. Uma proteína L19 preferida é representada por SEQ ID NO:30. Um ácído nucléico preferido que codifique LI9 é representada por SEQ 15 ID NO:31. Orr'.a proteína S4 preferida é representada por SEQ ID NO:32. Um ácido nucléico preferi-do que codifique S4, é representada por SEQ ID NO:33. Uma proteína S6 preferida é representada por SEQ ID NO:34. Um ácido nucléico preferidQ que codifique S6 é representada por SEQ ID NO:35.

20 Outro exemplo é o uso de poli-proteínas contendo vários antígenos de parasita (63,65). Um exemplo de uma poli-proteína Q ccmo identificado em EP 1 141 305. Uma molécula de ácido nucléico que codifica proteína Q é representada por SEQ ID NO:36. Uma proteína Q codificada 25 correspondente é representada por SEQ ID NO: 37. A proteína Q ou uma parte ou um fragmento da mesma ou uma fonte de proteína Q ou uma fonte de um fragmento de proteína Q pode ser utilízada em combinação com uma fQnte de L3 e/ou L5.

Outro exemplo de uma poli-proteína é Leísh-llOf {69). 30 Leish-llOf ou uma parte ou um fragmento da mesma ou uma fonte de Leish-llOf ou urna fonte de urn fragmento de Leish- llOf pode ser utilizado em combinação com uma fonte de L3 e/ou L5.

? 2 b q \ 0 Nq próximo parágrafo, uma fonte de uma proteína de histona é tQmada ccjmo exemplo de uma proteina que póde ser utílizada em combinação com uma fonte de uma proteína L3 e/ou L5. C) mesmo é válidc para outras proteinas 5 definidas acima, preferivelmente outras proceínas ribQssomais do que L3 e/ou L5. Compostos preferidos incluem uma proteína de histona ou fragmento da mesma, ou uma molécula de ácido nucléico que cQdifica a histona ou o fragmento de histona. Mais preferivelmente, uma proteina de 10 histona é H2A, E!2B, Êí3 e/o'à H4 como identificado em EP 1 687 023. Histonas H2A, H2B, H3 e H4 sâo proteínas nucleares bern conservadas e sua sequência é beni conhecida na técnica, vide a reZerência 39. ?referive4nente, as histonas são obtidas' de um organismo que está próximo ao organismo que 15 causa a doença na árvore evolutiva. E'ortanto, de interesse específico como fonte de histonas a serem utiíizadas no tratar.ento de doenças parasíticas como Ieíshmaniose são protozoários e em particular menibros da família tripanossomatídeo, mais em particular espécies diferentes 2Q do protozoário tripanossomático LeishmaDia.

Cutros compostos preferidos incluem outra proteína ribossomal ou fragmento da mesma O'd uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína ou Tragmento da mesrna. Os exemplos de oucra proteína ribossomal incluem Lí9 25 e S4. Outros compostos preferidos incluem um Extrato de Proteína Ribossomal como identificado em WO 2009/090175.

Cada dos compostos ou fDnte3 de cada "lesses cornpostos pode ser utilizado em combinação ccjm uma fonte de 30 L3 e/ou L5. O uso combinado pode ser sequencial ou simultâneo. Em uma modalidade preferida, uma fonte L3 e/ou L5 é utilizada e-m combinação com uma fonte s4 e/ou S6. Mais d ê

F ,¶ m 4 preferivelmente, uma fonte L3, L5, S4 e S6 são utilizadas em combinação.

Em outra modalidade mais preferida, uma fonte L3, 15 e S4 são utílizadas em combinação.

Em outra rnedalidade mais preferida, uma fonte L3, L5 e S6 g.ãO

'5 utilizadas em combinação.

Os requerentes demonstraram (vide exemplo 5) que o uso combinado de L3, L5 e S4 estava fornecendo proteção sinérgica em comparação com o uso de L3 ou L5 ou S4 individualmente.

Nesse contexto, uma proteína S4 preferida é representada pela SEQ ID NO: 32. Um ácido . 1'0 nucléico preferido que codifi-que um S4 é representado pela SEQ ID NO: 33. Uma proteína S6 preferida é representada por SEQ ID NO: 34. Um ácido nucléico preferido que codifique um S6 é íepresentado pela SEQ ID NO: 35. O termo "fonte" quando utilizado em "uma fonte S4 e/ou S6" tem o me.smo 15 signifícado que o termo "fonte" quando utilizado ern "uma fonte L3 e/ou L5"'. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, uma fonte S4 é um polipeptídio que cornpreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade ou

20 similaridade de sequência com sequências de aminoácidos SEQ

ID NO: 32 e/ou que é c'odi-fícado por uma sequência de nucleotideos que tern pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 33. Por conseguinte, ein uma modalidade preferida uma 2$ fonte S6 é um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade Qü similaridade de sequência com sequência de aminoácida SEQ

ID NO: 34 e/ou que é codíficado por uma sequência de nucleotideo que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID

3'0 NO: 35. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, uma fonte S4 é um ácicio nucléico que compreende uma sequência de nucleotideo que tem peló me'nos 60% de similaridade ou r *

* l ' 4 ídentidâde de sequência com sequência de ríucleotídeos SEQ.

ID NO: 33 e/ou que codifica uma sequêncía de aminoácido que tem pelo menos 60's de identidade com SEQ ID NO: 32. Dependendo do tipo de fonte utilizacia (baseada em 5 proteína ou baseada em ácido nucléico), a pessoa versada saberá qual tipo de formulação é apropriada.

Uma fonte pode ser administrada como tal (ácido nucléico ou proteina nua). Álternativamente, uma fonte baseada em ácidc: nucléico pode ser adrr'.inistrada atilizando uína construção de ácido 10 nucléico como definido aqui.

Fonte S6 Em um aspecto adicional é fornecida uma fcnte S6 ou uma corr.posição eompreendendo ou consístindo em uma fonte S6 porém nâo compreendendo uma fonte L3 e/ou L5 e/ou S4. Os

15 requerentes demonstraram (vide exemplo 4) que o uso de S6 individualmente estava fornecendo prQteção contra infecçãc' por Leishmania.

O termo "fonte" quarido utilizado em "uma fonte S6" tem o mesmo significado que d termo "fonte" quando 20 urilizado em "uma fonte L3 e/ou L5". Cada do uso cju rrtétodo ou tipos de composições definidos aqui compreendendo uma fonte L3 e/ou 15 também se aplíca a uma fonte S6. Por conseguinte, em uma modalidade preferida uma

25 fonte S6 é urn polipeptídio que ccmpreende uma sequência de aminoácido que tem pelo rnenos 60% de similaridade ou identidade de sequência corn sequência de aminoácidos SEQ ID

NO: 34 e/ou que é codificado por uma sequência de nucleotídeo que tetu pelo menos 60% de identidade com SEQ ID

30 NO: 35. Por conseguinte, em uína rrtodalidade preferida uma fonte S6 é um ãcido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico que tem pelo menos 60% de identidade ou q e

4 0 "á similaridade de sequência com sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 35 e/ou que codifica uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID NO: 34. Método 5 Em outro aspecto, a invenção provê um método para evitar e/ou tratar uma doença parasítica e/ou retardar seu avanço e/ou é capaz de provocar urna resposta imune como definido aqui: um método é terapeut'camente eficaz quando é capaz de provocar uma resgosta ijnune em um sujeito tratado 10 que significa preferivelmente que é capaz de promover ou acionar uma resposta imune Th1 contra um dado antígeno L3 e/ou L5 e/ou contta uma fonte 13 e/ou L5 dada e/otl que é capaz de evitar e/ou retardar o desenvolvimento de uma lesão dértníca ou de mucosa e/ou induz uma redução 15 significativa da carga de parasita em uma lesão dérmica e/ou de mucosa e/ou eni uma orelha e/ou em um linfonodo de drenagem (DLN) que preferivelmente drena quaisquer dessas regiões infectadas (dérmíca, região da mucosa, orelha), bem comQ em um órgão ínterno coíno fígado, baço, medula óssea, 20 rirn, cérebro, etc., na presente invenção.

Nesse método, uma vacina da invenção furiciona como urna vacina terapêutica.

Tipicarnente, há um períodõ de tempo entre infecção e doença.

Nesse caso, uma vacina ataaria como um produto imune farmacológico que evitaria e/ou trataria a doença 25 e/ou retardaria seu avanço por provocar no hospedeiro urna resposta imune que neutraliza o efeito patológico da infecção.

Uma vacina terapêutica difere de uma vacina profilática em que uma vacina terapêutica indazirá proteção em um paciente que já tem a infecçáo ou a doença.

A

30 invenção abrange tanto uma vacina terapêuti-ca quanto uma profilática.

Nesse método, opcionalmente uma fonte S4 e/ou

S6 pode ser utilizada em combinação com uma fonte L3 e/ou

L5.

'í 6

X 0 ' (

Uso Em um aspecto adícional, é fornecido um uso adicicr-al de uma fonte L.3 e/ou L5 para ciiagnosticar uma doença parasítica em um sujeito.

Uma doença parasitica, uma

5 fonte L3 e/ou L5 e um sujeito foram definidQs anteriormente aqui.

Nesse uso, opciorialmente uma fonte S4 e/ou S6 pode ser utilízado em combinação com uma fonte 13 e/ou L5. Uma vantagem da presente invenção é aue permite atingir urn diagnóstico especíZico e prematuro de um

10 espectro rr.ais amplo de doenças parasíticas.

Um exemplo de uma doença parasitica na qual este é o caso é a leishjrlaniQse.

Em uína modalidade oreferida, uma doer.ça parasítica é leishmaniose ou malária.

Mais prefeFive1mente,

uma doença parasitica é c.ausacía por uma espécie de 15 Leishmania ou por um Plasmodium.

Em uma modalidade preferida adicional, uma doença parasítica é causada por uma espécie diferente da espécie da qual uma fonte L3 e/ou

L5 é derivada.

Em particular, leishinaniose causada por uma espêcie do gênero Le-ishmania Dode % ser diagnost4cada

20 utilizando uma composição baseada em uma fonte L3 e/ou L5 de o'jtra espécie de Leishmania.

Em uma rnodalidade, leishmaniose causada por l. major é diagnosticada com sucesso com uma composição que cQmpreende uína fonte L3 e/ou

L5 de l. major, l.. infantum, L. braziliensis ou L. 25 mexicana.

Alternativamente, outras doenças parasíticas, eomo malária, podem ser diagríosticadas com sucesso com uma composição baseada em urr.a fonte de L3 e/ou L5 de outra espécie, por exemplo, baseada em uma fonte L3 e/ou L5 de L. infantum, L. major, l. braziliensis ou L. mexicana. — 30 Em princípio qualquer sujeitD poderia ser diagnosticado utílízando a invenção.

O método de diagnÓstico pode ser aplicado tão freqüentemente quanto necessário em um sujeito.

Preferiveímente, um sujeito r (

\ C K t diagnosticado é um sujeito com suspe'ita de ter um risco de ter sido infectado com q parasita causando a doença parasítica.

Um sujeito com suspeita de ter um riscQ de ter sido infectado com cj parasita pode viver em uma área 5 endêmica ou estar visitando urna área endêmica.

Uma área endêmica inclui Nort-e da África, da Algér:ía até Arábia Saudita, Quênia, Sudão, Etiópia.

Inclui ainda o Sul da Europa: países do rnediterrãneo como Espanha, França, Grécia, etc.

Tambérrt inclui América Central (todos c)s 10 países) e do Sul: Brasil, Venezuela, Peru, Bolívia, Colômbia, Norte da Argentina, Paraguai, Uruguai.

Parte central até o Sul da Ási-a ocidental: Índia, Irã, Iraque, Mongólia, Afeganistào, Nepal, Bangladesh.

No contexto da invenção, um uso como definido 15 aqui é preferivelmente um uso in vitro ou ex vivo.

Significa preferivelmente que o uso é realizado em uma amostra do sujeito.

Amostras preferídas incluem sangue,

soro, plasrna, saliva, fluído cérebro-espinhal ou urína.

Mais preferivelmente, a amosrra é uma amostra de sorcj ou 20 sangue obtida de um sujeito.

Em uma modalidade preferida, um diagn6stico é atingído antes da aparição de um sintoma da doença parasítica, c denomirtado diagnóstico pEé-sintorrLátíco ou diagnóstico de um sujeíto assintomático.

Nesse contexto, 25 "pré-sintornático" significa preferivelmente pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três días, pelo merios quatro dias, pelo menos cinco, dias, pelo menos seis dias, pelo menos sete dias, pelo menos oito dias, pelo menos nove dias, pelo menos dez dias, pelo menos 15 dias, pelo menos

30 20 dias, pelo menos 25 dias, pelo menos 30 dias ou mais antes da aparição de um primeiro sintoma.

Um primeiro sintoma ou um primeiro sinal clínico associado a urr.a doença parasítica como leishmaniose pode ser selecionado da

32,'89

C Q \ 4 K ) seguinte lista: febre, esplenomegalia, hepatcmeg-alia, linfadempatia, conjuntivite, dermatit'e onicogrifose, ceratoconjuntivite, apatia e caquexi.a, A maioria deles pode ser simplesmente detecíacia por exame exterm físico. Cada 5 conjuncivite, dermatite, onicogriÁ'ose, ceratoconjuntívite é uma forma de alteração cutânea. Um pri-lleiEo sintoma preferido ligado à leishmaniose é linfadenopatia. Pode ser detectado por exame exte.rno físico como apalpação.

10 Em outra modalidade preFerida, um diagnóstico é atingido antes áa aparição de alguns dos sintomas da doença parasítica, o demminado diagnóstico de urn sujeito oligossincomático. Nesse contexto, "oligossintomático" significa preferivelmente um sujeito tendo um máximo de 15 três dos sintomas como definidos acima. Err. outra modalidade preferida, um diagnóstico é atingido ar'.tes da aparição de todos os sintQmas da doença parasítica, q dencminado diagnóstico de um sujeito sintomático, Nesse contexto, "sintomático" significa 20 preferivelmente um sujeítQ tendo pelo menos quatro dos sintomas como d-efinídos acima incluindo uma forma de alteração cutânea corrio definída acima. A pessoa versada entenderá quê o tipo Inai3 importante de diagnóstíco é o díagnóstico de sujeitos 25 assintomáticos, uma vez que ajudará a evitar a disseminação adicional da doença e sujeitos assintomáticos poderíam ser ajudados e curados mais eficientemente se forem diagnosticados em tal estágio.

Nesse uso, uma fonte L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 30 gode ser uma proteina ou fragmento de proteína L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 que sãc uti-1izaclos para detectar a presença de um anticorpo em umz amostra como explicado na próxima seção.

\ è q K Àlternativamente, uma fonte L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 pode ser uma molécula cie ácido nucléico que são utilizadas para detectar a presença de um ácido nucléico L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 em uma amostra como explicado na 5 próxima seção. Método ,. Em um aspecto adicional é fornecido um método para diagnosticar uma doença parasítica em um sujeito utilizando uma fonte L3 e/ou L5, o método compreeridendo lc determínar se um anticorpo reconhecendo uma fonte L3 e/ou L5 está presente em urna amostra obtida do sujeito. Opcionalmente, uma fonte S4 e/ou S6 pode ser também utilizado em combinação com uma fonte L3 e/ou L5. Um método preferido da invenção é para um uso preferido da invenção 15 preferivelmente realizado in vitro ou ex vivo. Uma definição foi dada anteriormente aqui. Em um métodQ preferido, uma fonte L3 e/ou L5 está presente em urna cmmposição. Em uma modalidade preferida, outro composto está presente na composição. 20 Alternativamente, nenhum outro composto está presente ria composíção. Em uma modalidade preferida, outros compostos são utilizados sequencialmente ou simultaneamente com urna fonte L3 e/ou L5 para melhQraE a especificidade do método. É 25 vantajQso, por exemplo, utilízar outros compostos que serão capazes de discriminar entre um sujeito assintomático, oligossintomátíco ou sintomático e um sujeito vacinado. Mais preferivelmente, tais compostos não estão presentes em uma composição única juntamente com uma fonte L3 e/ou L5.

30 Cada das proteínas ideritificada na seção intitulada composiçãô pode ser utilizada nesse contexto. Por exemplo, os compostos são selecionados de um grupo que consiste em uma fonte de outras proteinas de uin parasita causando uma

L R í L \ r doença parasítica (19) comq. Leishmaniose. Uma Zonte de uma dada protein.a recebe o mesmo significado qae uma fonte de L3 e/ou L5 como detiríido anteriormente aqui. Uma proteína preferida nesse contexto é uma histona como H2A, H2B, H3, 5 H4, outra proteína ribossomal coulq L12A, {Lip), LiP2b (LiP'), LipO, L2, L7, L8, Ll6, S6, L19 e S4. Outro exemplo é o uso de poli-proteínas contendo várims antigenos de parasita (59,61). Um exemplo de uma poli-pmteína é proteína Q como identificada em EP 1 141 305. A proteína Q lj ou uma parte ou um fragmento da mesma ou uma fonte de pmteína Q ou uma fonte de urri fragmento de proteína Q pode s.er utilizado em combinação corn uma fonte de L3 e/ou L5.

Antígenos preferidos incluem uma proteína de histona ou fragmentos da mesma ou uma molécula de ácido

1.5 nucléico codificandc a histona. Mais preferivelmente, uma proteína de histona é H2A, H2B, H3 e/ou H4, como identificado em EP 1 687 023. Histonas H2A, H2B, H3 e H4 são proteírías nucleares bern conservadas e sua sequência é bem conhecida ria técnica, vide a referência 39. 20 Preferivelrnente, as histonas são obtidas de um organismo que está próximo ao organismo que causa doença na árvore evolutiva. Portanto, de interesse especifico como uma fonte de histonas a serem utilizadas no tratamento de doenças parasíticas como leishnianiose são pEQtQzQáríos e em 25 particular membros da família tripanossomatídeo, como por exemplo, plasmódio, como Plasmodium falciparum ou mai-s em particular espécies diferentes do protozoário tripanossomátíco Leishmania. Em um método de diagnóstico njais preferido, uma 30 doença parasícica é c'.iagnosticada quando uma quantidade detectável de um anticorpo que reconhece uma fonte L3 e/ou L5, preferivelmente proteína ou peptídeo ou parte de proteína está presente e/ou quando um aumento da quantidade q

\ Ç t t do anticorpo está presente.

Em um sujeito de controle ou saudável, o anticorpo genericamerite não é detectãvel.

A detecção da presença do anticorpo é realizada utilizando métodos conhecidos pela pessoa versada cqiro

5 ELISA.

Modos de detecção preferidos são deseritos ncj exemplo 1. Um anticorpo que reconhece uma fonce L3 e/ou L5,

preferivelrnente uma proteína ou peptídeo ou parte de proteína significa preferivelrriente que pelo menos um 10 anticorpQ está presente que é capaz de reconhecer pelo menos um composto presente em uma fonte L3 e/ou L5. C) composto pode ser uma prot\=ína 13 e/ou 15 ou um fragmento de proteína L3 e/ou L5 ou parte de proteína ou peptídeo. o mesmo é válido para um anticorpo que reconhece uma fonte S4

15 e/ou S6. Em outro método, uma molécula de ácido nucléico L3 e/ou L5 é cietectada utilizando outra rnolécula de ácido nucléicci.

Uma molécula de áci-do nucléico L3 e/ou L5 é preferivelmente uma molécula de ácido nucléico codificando

2'0 uma molécula 13 e/ou L5 como identificacio anteriormente aquí ou uma parte da mesma.

Outra molécula de ácido nucléico é preferivelmente um íniciador desianacío como sendo capaz de detectar a presença de uma molécula cie ácido riucléico L3 e/ou L5 em uma reação E'CR ou por Northern

25 blotting, O mesmo é válido para ain iniciador capaz de detectar a presença de uma molécula de ácido nucléico S4 e/ou S6. Iniciadores preferidos para detectar a presença de uma molécula de ácido nucléico L3 e/ou L5 compreendem ou consistem nas seguintes sequê.ncias:

30 Sequências de iniciador para detectar especificamente um L3 por PCR Sentido, 5'-AACACGAAGGAGGGCAAGGTC-3' (nucleotídeos 418 a 438 da sequência LmL3) (SEQ ID NO:38)

36/8-9 ¶ d 4 b

Anti-sentido 5'-CTTCTTCGCG'GCCTTTGCCTTG-3' (reverso e ccmplementar a riucle'otídeos 1242 a 1263 da sequência LmL3) (SEQ ID NO:39) Sequência de iniciador para cietectar 5 especificamente um L5 pQr PCR Sentido, 5'-TGCACGCTGGCAAATTGGGTAC-3' (nucleotídeos 10 a 31 da sequência LmL5) (SEQ ID NO:40) Anti-sentido 5'-CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG-3' (reverso e complementar a nucleotídeos 464 a 483 da 10 sequência LMJ5) (SEQ ID NO:41) Sequências de irliciadoF para detectar especificamente um L3 por Northern blot 5'-CTTCTTCGCGGCCTTTGCCTTG-3' (reverso e complementar a nucleotídeos 1242 a 1263 da sequência LmL3)

15 (SEQ ID NO:42) Sequências de iniciador para detectar especif±carrtente um L5 pcr Northern blot 5'-CTT CTT CGT GCG CAC AGC AG-3' (reverso e cornplementar a nucleotídeos 46E a 483 da sequência LmL5)

20 (SEQ ID NO: 43). A detecção ou um aumento d.o nível de expressão de urna molécula de ácido nucléico L3 e/ou L5 é preferivelmente definida como send.Q uma alteração detectável do nível de expressão da molécuj-a de ácido nucléico como comparado com Cj nível de emressão H da 25 molécula de ácído nucléico em um sujeito de controle.

Noruiaimente um sujeito de controle não compreenderá tal molécula de ácido nucléico L3 e/ou L5. Preferivelmente, um aumento do nível de expressão de uma molécula de ácido riucléico L3 e/ou L5 significa um aumento de pelo menos 5%

30 do nível de expressão da sequência de nucleotídeo utilizando ?CR.

Ensaio

-¥ W

.h: à á f

Em um aspecto adiciooal, é fornecido um dispositivo de ensaio para diagnosticar uma doença parasítica em um sujeito, em que o dispositívo compreende uma fonte L3 e/ou L5. Opcionalmente, uma fonte S4 e/ou S6

$ pode também estar presente nesse dispositivo de ensaio em combinação com uma fonte L3 e/'oá L5. A presença de um anticorpo reconhecen"lo especificamente a fonte pode ser detectada por quaisquer métodos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Harlow e 10 Lane, Antibodies: A Laboratctry inanual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, que é íncorporado aqui a título de referência). Métodos apropriados incluem ensaios de co- eletroforese de cromatografia por afinidade (ACE) e ELISA (Ensaio de Iniuno sorvente ligado por enzima). 115, Preferivelmente, c) ensaio compreende um ELISA.

Vários ensaios são mais extensamente descritos abaixo.

Em uma modalidade preferida, um ensaio envolve o uso de uma fonte L3 e/ou Tj5 imobilizada eín um suporte sólido para Iigar-se a e rerncver um anticorpo da amostra.

O

20 anticorpo ligado pode ser então detectado utilizando um reagente de detecção que se liga ao comp1exQ de fonte L3 e/ou L5/anticorpo e contém um grupo repórter detectável.

Reagentes de detecção aDropriados incluem anticorpos que se ligam ao complexo de fonte L3 e/ou L5/anticorpo e 25 poli-peptídio livre rotulado com um grupo repórter (por exemplo, em um ensaio semi-competitivo). Alternativamente,

um ensaio competitivo pode ser utilizado, no qual um anticorpo que se liga a uma fonte L3 e/ou L5 é rotulado com um grupo repórter e deixado ligar-se à fonte L3 e/ou L5

30 imobilizada após incubação da fonte com a amostra.

A extensão na qual os componentes da amostra inibem a ligação do anticorpo rotuladQ à fonte L3 e/ou L5 é indicativa da reatividade da amostra com a fonte L3 e/ou L5 imobilizada,

\ d' K r

Um suporte sólido pode ser qualquer material conhecido por aqueles com conhecimentos comuns na té.cnica ao qval uma fonte L3 e/cu L5 pode ser fixada.

Por exemplo, um suporte pode ser urna cavidade de teste em uma placa de

5 microtítulo ou uma nitrocelulose c)ü outra membrana apropriada.

Alternativamerite, utn supcrte pode ser unía conta ou disco, comc vidro, fibra de vidro, látex ou um rnaterial plástico corno poliestifenc) ou cloreto de polivi.nila.

Um suporte também pode ser uma partícula magnética ou um 10 sensor de fibra ótica, como aqueles revelados, por exemplo, na patente US no. 5.359.681. Uma fonte L3 e/cm L5 pode ser ligada ao suporte sólido uti1izando uma variedade de técnicas conhecidas pqe aqueles versados na arte.

No contexto da presente invenção,

'j5 o tetmo "ligadj' se refere à associação tanto não covalente corrto adsorção, como fixação covalente (que pode ser uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais no suporte ou pode ser uma ligação por meio de um agente de reticulação). A ligação por adsorção a uma cavidade em uma

20 placa de wicrotítulo ou a uma membrana é preferida.

Em tais casos, a adsorção pode ser obtida por contatar uma fonte L3 e/ou L5, em um tampão aDropriado, corn o suporte sólido por uma quantidade de tempo apropriado.

O tempo de contato varia coin temperatura, porém é tipicamente entre 1 hora e 1

25 dia.

Em geral, o contato de uma cavídade de uma placa de mícrotítulo de plástico (como poliestireno ou cloreto de polívinila) com uma quantidade de uma fonte L3 e/ou L5 que varia de 10 ng a 1 g, e preferivelmente 100 ng, é suficiente para ligar uma quantidade adequada de uma fonte

30 L3 e/ou L5. Aqui também quando uma quantidade de uma fonte L3 e/ou L5 é dada, define a quantidade total de uma fonte L3 e/ou L5 utilizada.

Ap 0 b Q. 4 f

A fixação covalente de uma fonte L3 e/ou L5 a um suporte sólido pode ser genericamente obtida por reagir primeiramente o suporte com um reagente bifuncional que reagirá tanto com o suporte como urri grupo Funcional, como

5 um grupo de amino ou hidroxila, no polipeptídio.

Por exemplo, uma fonte L3 e/ou L5 pode ser ligada a um suporte tendo urn revestimento de poIímero apropriado utilizando benzoquinona ou por conciensação de um grupo de aldeído no suporte com uma amina e um hidrogênio ativo no polipeptidio io (vide, por exemplo, Pierce Immunocechnology Catalog and Handbook (1991) em A12-A13). Em certas modalidades, um ensaio é um ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA). Esse ensaio pode ser realizado primeiramente contatando uma fonte L3 e/ou L5

15 que foi imobilizada em um suporte sólido, comumente a cavidade de uma placa de microtítulo, com a amostra, de tal modo que anticorpos específicos para a fonte L3 e/ou L5 na amostra sejam perrnitidas ligar à fonte L3 ê/Qíl LS imobilizada.

A amostra não Iigada é entâo reuiovida da fonte

20 imobilizada e um reagente de detecção capaz de ligar-se ao complexo de fonte L3 e/ou LS-anticorpo imobilizado é adicionado.

A quantidade de reagente de detecção que permanece ligada ao suporte sólido é então determinada utilizando um método apropriado para c) reagente de detecção

25 específico.

Após a fonte L3 e/ou L5 ter sido imobilizada no suporte, os sítios de ligação de proteina restantes no suporte são tipicamente bloqueados, Qualquer agente de bloqueio apropriado conhecido pof aqueles com conhecimentos

30 comuns na técnica, como albumina de soro bovino (BSA) ou Tween 20 (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO) pode ser empregado.

A fonte L3 e/ou L5 imobílizada é então incubada com a alrlQstLa, e o antícorpo (se presente na amostra) é e ¶

X 4 Abl r deixado ligar-se à fonte. Uma am0stra pode ser dil.uída com um diluente apropr'iad.o, como soi'jção salina tamponada com fosfato (Pí3S) antes da incubação. Em geral, um tempo de contatc apropí:i.ado (isto é, tempo de incubação) é aquele 5 período de tempo que é suficiente para permitir detectar a presença de a3ticQrpo ern 'ü-m,a amQstra. Preferivelrnente, ç) tempo de contato é suficiente para obter um nível de ligação que é pelo rnerios 95% daquele obtido em equilíbrio entre anticorpo Iígado e não ligado. Aqueles com IO conhecimentQs comuns na técnica reconhecerão que o tempo necessárío para obter equilibrio pode ser prontamente determinado por ensaiar o nivel de ligação que ocorre durante um periodo de tempo. Em temperatura ambiente, um tempo de incubação de aproximadamente 30 minutos é 15 ger.ericamente suficiente. A amostra não ligada pode ser então remòvida por lavaçem do suporte sólido Com um tampão apKQpriado, como pbs contendo 0,1% de Tween 20. O reagente de detecção pode ser então adicionado a um suporte sólido. Um reagente de 20 detecção apropriado é qualquer composto que se ligue ao complexo de fonte L3 e/ou L5-anticorpo imobílizado e que poss:â 3er detectado por qualquer de uma variedade de meíos conhecidos por aqueles versados na técnica. preferivelmente, q reagente de detecção eontém um agente de 25 ligação (como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imurtoglobulina, lectina ou antigeno livre) conjugado com um grupo repórter. Grupos repórteres preferídos incluem enzimas (como peroxidase de raiz forte), substratos, co- fatores, inibidores, ccrantes, radionuclídeos, grupos 30 Iuminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação de agente de ligação com grupo repórter pcde ser obtida utilízando métodos padrâo conhecidos por aqueles com conhec±mentos comuns na técnica. Agentes de lioação comuns

\ & N ·

também podem ser adquiridos e conjugados com uma varíedade de grupos repórteres de muítas fontes (por exemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA e Pierce, Rockford, IL). O reagente de cietecção é então incubado com o

5 complexQ de fonte L3 e/ou LS-anticorpo imobílizado por um período de tempo suficiente para detectar q anticorpo ligaciQ.

Um período de tempo apropriado pode ser genericamente determinado a partir das instruçõe3 do fabricante ou por ensaiar o nivel de ligação que ocorre

10 durante um período de tenípm Reagente cie deteeção não ligado é então removido e reagente de detecção ligado é detectado utilízando o grupo repórter. o método empregado para detectar o grupo repórter depende da natureza do grupo repórter.

Para grupos

15 radioativos, métodos auco-radiográficos ou de contagem de cintilação sào genericamente apropriados.

Métodos espectroscópicos podem ser utilizados para detectar corantes, grupos Iuminescentes e grupos fluorescerites.

BiQtina pode ser detectada utilizando avidina, acoplada a

20 um grupo repórter diferente (comumente uui grupo radioativo ou fluorescente ou umã enzima). Grupos repórteres de enzima podem ser genericamente deteetados pela adição de substrato (genericamente por um periodo de tempo específico), seguido por análise espectroscópica ou outra análise dos produtos

25 de reação.

Para determinar a presença ou ausência de um anticorpo específico para uma doença parasítica como Leishmaniose em uma amostra, o sínal detectado a partir do grupo repórter que permanece Iígado ao suporte sólido é

3'0 genericamente comparado com um sinal que corresponcie a um valor de corte predeterminado.

Em uma modalidade preferida, c) valor de corte é preferivelmente q sinal médio obtido quandô a fonte L3 e/ou L5 imobilizada é incubada com urna

42/8° \ á 5 , amostra de um sujeito não infe.ctado. Em geral, uma amostra que gera um sinal que é três desvios padrão acima do valor de corte predeterminado éb considerada positiva (isto é, reativo com uma fonte L3 e/ou L5). Em uma {rLodalidade '5 preferida alternativa, o vaior de corte é determinado utilizando 'üma Curva de Operador Receptor, de acordo corn o método de Sackett e outros., Clinical Epideinio1ogy: A Basic Science for Clinical Mêdicine, pág. 106-7 (Little Brown and Co., 1985). E.m resumo, nessa modalidade, o valor de corte

1.0 pode ser determinado de um grá.fico de pares de taxas positivas verdadeiras (isto é, sensibilidade) e taxas posítivas falsas (100% de especificidade) que corresponde a cacia valor de corte possivel para q eesultado de teste de diagnóstico.

15 O valor de corte no gráfico que é c) mais próximo ao canto esquerdo superior (isto é, o valor que encerra a área rnaior) é q valor de corte mais pEecíso, e uma amostra que gera um sinal que é maís eievado do que o valor de ccjrte determinado por esse método pode ser considerado 2D positivo. Alternativamente, o valor de corte pode ser deslocado para a esquerda ao longo do gi:áfico, para mir.iraizar a taxa falsa positiva, ou para a direita, para minimizâr a taxa falsa negatíva. Ein urrta modalidade relacionada, um emaio é 25 realizado em um formato de teste de tira ou fluxo direto, em que uma fonte L3 e/ou L5 é imobílizada em uma membrana como nitrocelúlose. No teste de f uxo direto, antícorpos na amostra se ligam a fonte L3 e/ou L5 i-mobilizada à medida que a arnostra passa através da membrana. Um reagente de 30 detecção (por exemplo, proteína A-coloidal ouro} então se liga ao complexo de ariticorpo da fonte L3 e/ou L5 à medida que a solução contendo reagente de detecção flui através da mehbrana. A detecção de reagente de detecçào Ligado pode r. \ * $ ser então realizada como descrito acijnà. No formato de teste de tiÈâ, uma extremidade da membrana à qual .a fonte é ligada é imersa em uma solução contendo a amostra. A am.ostra migra ao longo da membrana através de uma região 5 contendo reagente de detecção e para a área de polipeptídio imobilizado. A concentração de reagente de detecção em uma fonte L3 e/ou L5 indica a presença de um anticorpo específico para üm antígeno de urri parasita causando uma doença parasítica como Leishmaniose na amostra.

10 Típicamente, a concenttação de reagente de detecçào naquele local gera um padrão, como uma linha, que pode ser Iída visualmente. A ausência de tal padrão indica um resultado negativo. Em geral, a quantidade de uma fonte L3 e/ou L5 imobilizada eín uma membrana é selecionada para gerar um 15 padrão visualmente discernível quando uma amostra contém um nível de anticorpo que seria suficiente para gerar um sinal pQsitivo em um ELISA, como discutidQ acima. Preferívelmente, a quantidade de um L3 e/ou L5 imobilizado em uma membrana varia de 25 ng a 500 ng. Tais testes podem 20 ser tipicamente realizados corn uma quantidade muito pequena (por exernplo, uma gota) de sangue ou soro de sujeito. A revelação de cacia elemento do dispositivo de ensaio quando aplicado a uma fonte L3 e/ou L5 também pode ser aplicada para uma foríte S4 e/ou S6 se uma fonte S4 e/ou 25 S6 for utilizada em combinação cqki uma fonte L3 e/ou L5 nesse dispositivo de ensaio. Qualquer sujeito ou médico poderia utilizar esse dispositivo no consultório/casa, repetir o uso de tal dispositivo tâo freaüentemente quanto necessário.

30 Normalmente moléculas adieionais são utílizadas em um ensaio como um controle posítivo ou negativo. Um controle posi-tívo típico poderia ser um antícorpo reconhecendo uma molécula que é conhecida como estando

't [ ¶ , presente em uma amostra a ser testada. Um coatrole negativo típico poderia ser 'urtí ar.t.icarpo reconhecendo uma molécula que é conhecida como estando ausente em uma amostra a ser testada.

5 Definições qerais No conm"xto da invençáo, uma proteína ou urrí fragmento de proteína é representado por uma sequência de aminoácidos. No contexto da invenção, uma molécula de ácido 10 nucléico é repr'esentada por um ácido nucléico ou sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um polípeptídio ou um fraguiento de proteína. Uma molécula de ácido nucléico pode compreender uma região reauladora. Deve ser entendido que cada molécula de ãcido 15 nucléico ou proteína ou fragmento de proteína como identificado aqui por urri Número de Identidade de Sequência dada (SEQ ID NC) ríão é Iimitado a essa sequência específica como revelado. Cada sequência de gene ou sequência de nucleotideo como identificacio aqui codifica urna proteína ou 20 polipeptídio Qlj fragrúento de proteína dado ou é ele próprio uma proteína Qu um fragmento de proteína. Em tcAO esse pedido, cada vez que se refere a uma sequência de nucleotídeo eqpecífícç) SEQ ID NO (tome SEQ ID NO: 2 ou 4 como exemplo), pcjde-se substituir por: 25 i. Uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade ou similarídade de sequência COUl SEQ ID NC: 2 ou 4 ou 49 ou 51 ou 53 ou 55 ou 65 (como exemplo).

30 ii, Uma sequência de nucleotídeos cuja fita complementar hibridiza com uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i);

B , # I , % , iíi. Uma sequência de nucleotídeos, cuja sequêricia difere da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) devído à degeneração do código genético.

5 iv. Uma sequêncía de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que tem pelo mer.os 60% de identidacie ou Mmilaridade de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos 10 SEQ ID NO: 2 ou 4 ou 49 ou 51 ou 53 ou 55 ou

65. Em todo esse pedido, cada vez que se refere a urna sequência de aminQácidos específica SEQ ID NO (tome SEQ ID NO: 1 ou 3 ou 48 ou 50 ou 52 ou 54 ou 56 como exemplo), 15: pode—se substituir por: Um polipeptidio compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de ídentidade ou similaridade de seq'uência com sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1 ou 3 ou 48 ou 50 ou 52 ou 54 ou 56.

20 Cada sequência de ríucleotícleos ou sequência de aminoácidos descrita aqui em virtude de sua percentagem de identidade ou si.nilaridade (pelo menos 60%) com uma dada sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos, respectivamente, tern em uma modalidade preferida adicional 25 uma identidade ou uma similaridade de pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ou simílarídade com a sequência de nucleotídeos ou amínoácidos, dada, respectivamente. Em uma modalidade preferida, identidade ou simílaridade de sequência é 30 determinada por comparar o comprimento inteiro das sequências corr'.o identificado aqui. "Identidade de sequência" é definida aqui como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos

?j , ¶ r

(polipe.ptídio ou proteína) de duas ou mais sequências de ácido nucléico (polinucleotídeo), como determinado por comparar as sequências.

Eifi uma mociali.dade preferida, ídenticiade de sequência é calculada com bâse no comprimento 5 cotal de duas SEQ id NO dadas ou em parte da mesma.

Parte da mesma signifíca preferivelmente pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de ambas as SEQ ID NO.

Na técnica, "identidade" tambérn significa o grau de relação de sequência entre sequências de aminoácidos ou ácido 10 nucléico, conforme possa ser o caso, como determinado pelo casamento entre séries de tais sequências. "Similaridade" entre duas sequências de aminoácidos é determinada por comparar a sequência de arríinoácídos e seus substitutos de aminoácidos conservados

15 cle um pcjipeptídio para a sequência de um segundo polipeptídio. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calcuiadas por métodos conhecidos, íncluindo porém não limitados àqueles descritos em (CQmputational Molecular Biology, Lesk, A.

F4., ed., Oxford University 20 Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome projects, Smith, D.

TN., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,

A.

M.,e Griffin, H.

G., eds., Hüruana Press, New jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, 25 G., Academíc Press, 1987; e Sequenc.e Analysis Primer, gEj.bskc)v, m. e Devgreux, j., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, Fi., e Lipman, D., SIAM j.

Applied Math., 48:1073 (1988). Métodos preferidos para determinar identidade são

30 projetados para fornecer q maior casamento entre as sequências testadas.

Os métodôs para determinar identidade e similaridade são codificados en'. programas de computador disponíveis ao público.

Métodos de programa de coníputador h- 1 JL b preferidos para determinar identidade e similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o pacote de programa GCG (Devereux, j.,e outí:os., Nucleic Acids Research 12 (I): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, blastn, e FASTA (Altschul, S. 5 F.e outros., J.

Mol.

Biol. 215:403-410 (1990). O programa BLAST X é disponível ao p'áblico a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S.,e outros., NCBI NLM NIEI Bethesda, MD 20894; Altschul, S.,e outros., j.

Mol.

Biol. 215:403-410 (1°90). O algoritmo Suiith Waterman bem 10 conhecido tambérn pode ser utilizado para determinar identidade.

Parâmetros preferidos para comparação de sequência de polipeptídio incluem os seguintes: algoritmo: Needleman e Wunsch, j.

Mol.

Biol. 48:443-453 (1970); matriz

15 de comparação: BLOSSUM62 de Flentikcff e Hentikoff, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA. 89:10915-10919 (1992); penalidade de lacuna: 12; e penalidade de extensão de lacuna: 4. Urn programa útil com esses parâmetros é disponível ao público corno o programa "Ogap" da Genetícs Computer Group, 2U Iocalizada em Madison, WI.

Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros implícitos para comparações de aminoácidos (juntaruente com nenhurr.a penalidade para lacunas finais). Parâmetros preferidos para comparação de ácido 25 nucléico incluem os seguintes: algoritmo: Keedleman e Wunsch, j.

Mol.

Biol. 48:443-453 (1970): matriz de comparação: casamentos=+l0, descasamento=0; penalidade de lacuna: 50; penalidade de extensão de lacuna: 3. Disponível ccmo o programa GaD de Genetics Computer Group, localizado

30 em Madison, Wis.

São dados acima os parâmetros implícitos para comparações de ácido nucléíco.

Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácido, a pessoa versada também pode r y wj C 'H 0 levar em consideração as denomínadas substituições de aminçjácidQ "conservativas", como será evidente para a pessoa versada.

Substituições de aminoácído conservativas se referem à capacidade de permuta de resíduos tendo 5 cadeias laterais similares.

Por exempLo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifátícas é glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; um grupo de ar.ír.oácidos tendo cadeias laterais alifáticas e com hidroxílas é a serina e a treonina; um grupo de aminoácidos lO tendo cadeias laterais cor,tendo amida é asparagina e glutamina; um aruDo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um- grupo cie aruinoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidir,a: e urn grupo de aminoácidos tend3 15 cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metíonina.

Grupos de substít'aiçào de aminoáCdos conservativos preferidos são: va1iRa-leucina-isQ1eucína, fenilanina- tirosina, lisina—arginina, alanina-valina e asparagina- glutamina.

Variantes de substituição da sequência de 20 aminoácido revelada aqui são aqueles nôs quais pelo menos um residuo nas sequências reveladas fcji removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar, Preferivelmente, a alteração de aminoácido é conservativa.

Substituições conservativas preferidas para cada dos amínoácídos de 25 ocorrência natural são conic a seguir: Ala para Ser: Arg para Lys; Asn para Gln ou His; Asp para Glu; Cys para Ser ou Ala; Gln para Asn: Glu para Asp; GIy para Pro; His pata Asn ou Gln; Ile para Leu ou Val; Leu para Ile ou Val; Lys para Arg; gín ou Giu: Met para Leu ou Íle; Phe para Met,

30 Leu ou Tyr; Ser para Thr; Thr para Ser; Trp para Tyr; Tyr para Trp ou Phe; e, Val para Ile ou Leu.

Construção de ácido nucléico

'b \ 4 · 0 Uma construção de ácido nucléíco Compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um fragmento de proteína como definidQ aqui. Uma construção de ácido nucléico compreendendo uma molécula de ácido nucléíco 5 codificando para uma dada proteína ou fragmento de proteína como definido aqui assegurará expressãQ da molécula de ácido nucléico dada, e da Droteína ou fragmento de proteína - correspondente em um sujeito tratado. Em uma modalidade mais preferida, uma construção de ácido nucléico compreende l'O mais de uma molécula cie ácido nucléico, cada molécula de ácido nucléico codificando para uma dada proteína ou fragmento de proteína. Ern uma modalidade ainda mais preferida, uma ccjnstrução de ácido nucléico compreeEde duas, três, quatro moléculas de ácido nucléico, cada 15 molécula de ácido nucléico codificado para uma dada proteína ou fragmento de proteína. Em uma modalidade preferida, urüa construção de ácido nucléico compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão coIrLpreerldendo cada molécula de ácido nucléico necessário. Cada molécula 20 de ácido nucléico é operativarnente ligada com outra molécula de ácido nucléico presente. Mais preferivelmente, um promotor apropriado é operativamente liaado com o cassete de expressão para assegurar expressão da molécula de ácido nucléico em um sujeito.

25 Nesse documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjuaações é utilizado em seu sentido rião Límitador para sígnificar que itens após a palavra são incluídos, porém itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, o verbo "consistir" pode ser 30 substituído por "consístit essencialmente ern" significando que um produto ou uma composição ou uma fonte L3 ou L5 como definido aqui pode compreender componente(s) adicional(is) do que aqueles especificamente identificados, O(S)

mmponente(s) adicional(is) rjão alterandó' a caràcterística exclusiva da inyenção. Além disso, referência a um elemento pelo artigo incíefinido "um" ou "uma" não exclu± a possibilidade de que mais de um do elemento esteja presente, a menos que o contexto clararnente exija que haja 1aíá e somente um dos elemt"ntDs. O articío indefinido "um" ou "uma" desse modo nornalmente significa "peío menos um". Todas as refíerências de literatura e patente citadas no presente relatório descritivo são aquí incorporadas a título de referência na íntegra. A invenção é adicionalmente ilustrada pelo seguinte exemplo, que não deve ser interpretado como limitando q escopo da presente invençãô. Descrição das figuras Fígura 1. Expressão e puríficação de proteinas rlmL3 e rLmL5 de LeishmanZa majoe recombínantes. géis de poliacrilamida a 13% coloridos com azul Coomassie lísados de pQELmL3 (painel L3) ou pQELmL5 (painel L5) lisados de E,qcherichia coli transfectados com vetor após indução (linhas I), após passagem por colunas de agarose N1-NTA (linhas 2) e rLinL3 e rLmL5 recombinantes purificados (linhas 3). Fígura 2. Antígenícídade das proteínas L3 e L5.

(a) Doze camundongos BALB/C foram infectados por via subcucânea com 5 x 104 promastigotas de L. major na fase estacionária na pata esquerda e soros forarn obtidos oito semanas após o desafio. Relatividades de antícorpo IgGl e IgG2 dos soros de camundongos com leishmniose cutânea (LCM) contra rLmL3 e rLmL5 fc)ram determinadas individualmente por ELISA. A falta de reatividade dos soros dos mesmos camundongos antes da infecção tambérn é representada, A Eeatividade de ELISA de soros de càes com

LVC sintomático e s'oros de controle contra rLmL3 (b) e rl,mL5 (C) proteínas r'ecombínantes.

Figura 3. Produção de cítocina induzida por vacínação em eamundongos BALB/c.

Camundongos BALB/C (seis

5 por grupo) foram iiüunizados por via subcutânea três vezes com 10 µg de rLmL3 -t- 50 µg de CpG-ODN (L3 + Cpg) ou 10 µg de rLmL5 + 50 µ.g de CpG-ODN (L5 -í- CpG), com 50 µg de CpG-

ODN (CpG) ou com.

PBS (solução salina). Células do baço foram obtidas quatro semanas apõs a vacinação e cultivadas lO in vitro por 48 h na presença de rLmL3 (a, c e e), rLrnL5

(b, d e f) e em rneio individualmente.

O nível de IFN-j' (a e b), IL-4 (c e d) e IL-ID (e e f) foi avaliado por ELISA em sobrenadantes de cultura.

Cada barra representa a média+S0 de dados de camundongos individuais.

Figura 4. Curso de ínfecção L. major em camundongos vacínados BALB/C após desafio. (a) inchaço de pata é dado como a diferença de espessura entr(" as patas contralaterais infectada e não infectada. (b) o riúmero de parasitas viáveis no linfonodo de drenagem poplíteo da perna e baço infectados foram individualmente determinados por limitar a diluição na semana oito pós-desafio. (*,1?<0,01). Figura 5. Respostas ímunes celul-ares provoeadas por ínfeeção em camundongos vacinados com L3 + çpG ODN.

Culturas de células de baço forarri estabelecidas na semana Qito ap6s desafio de parasita.

As células foram não estímuladas (meio) ou separadamente estirnuladas com LRP

(Proteinas Ríbossomais de Leishmania) (12 µg ni"'), SLA

(Antígenos de Leishmania Solúveis) (12 µg ml"'), MRP

(Proteínas Ríbossomais de Camundongo) (12 µg mi"4 ou L3 (6 µg ml"1) por 48 horas em CO2 a 5%, a 37°C.

Níveis de IFN-y

(a), IL-4 (b) e IL-IO (c) foram med"idos em sobrenadantes de

IÇ q % I cultura por captura de ensaio imunossorvente ligado por enzima.

Cacia barra representa a média mais o desvio padrão de níveis de citocina deterininados em seis camundongos ináividuais por grupo,

5 Fígura 6. Respostas ímune celulares provocadas por ínfecção em eamundongos vacinados com L5 + CpG ODN.

Culturas de células de baçc foram estabelecidas na s.emana oito após desafio com parasita, As células foram não estimuladas (meío) ou separadamente estimuladas com LRP (12 10 µg ml"'), SLA (12 µg ml"'), MRP (12 µg ml"') ou L5 (6 µg ml"

1) por 48 horas em 5% de ccm a 37°C.

Níveís de IFN-y (a),

IL-4 (C) e IL-IO (b) forarrí medidos em sobrenadantes de cult'ara por captura de ensaio imunossorvente ligado pdf enzirna.

Cada barra representa a média mais o desvio padrão

15 de riíveis de citocina determinados em seis camundongos individuais por grupo.

Figura 7. Curso de infecção por L. brazZííensís e camundongos vacinados c= BALB/C após desafío. (A} Lesões inflamatórias nas orelhas infectadas.

Tamanhos de

20 lesão (em milímetros) são expressos comcj a média + SD a partit de um experimento realizado côm cinco camundongos. "P < 0,05 enEre camundongos vacinados com rLmL5 + CpG-ODN ou rLmL3 + Cpg-ODN e os dois grupos de controle. (B) Carga de parasita na derme da orelha quantificada na semana cinco

2'5' p6s-infecção.

Os resultados são expressos como a média + SD de cinco orelhas por grupo. *p < 0,05 di]ninuiçãQ significativa entre rLml,5 + CpG-ODN e os dois grupos de camundongos d-e ccjntroie.

Figura 8. Localízaçãó ribossomal das proteínas

30 ImL3 e IúnL5. Um µg da proteínâ rLinL3 (A), 1 µg da proteína rLmL5 (B) e 10 µg de extratos de Leíshmanía major lrp (A e i3) forarrt submetidos à eletrotorese ew géis SDS-EIAGE d.e

V g gradiente 10-13% lineares.

Coloração de azul Coomassie dos géis é mostrada ncs painéis esquerdos (A e B). Géis equivalentes foram borrados e sondados com os soros de camundongos imunizados com rLmL3 (painel a-LrnL3) (A) e com

5 urna fração de antícorpo anti LmL5 purificado por afinidade de cinco soros de Leishmaniose visceral canina (painel a- LM5) (B). Figura 9. Análíse dos parâmetros de infecção em camundongos vacinados com as proteínas ríbossomais S6, L2, 10 L7, L8 e L6 na presença de CpG. (A) Desenvolvimento de lesão nos grupos infectados foi monitorada semanalmente até semana Qito após infecção.

As diferenças no inchaço de pata entre S6 mais CpG ODN e grupos de controle (solução salina e adjuvante) foram estatisticamente significativas na 15 semana oito aoós infecção (*P < 0,05). (B) Determinação da carga de parasita nos DLNs e baços analisadQs oito semanas após infecçâo.

As diferenças em cargas d¢= parasita nos baços do grupo vacinado com S6 mais CpG ODN e o baço de grupos de controle (sol-ução 3alina e adjuvante) Í%ram 20 estatisticamente significativas ('P < 0,05). Para cIareza, somente q SD (desvio padrão) do grupo de solução salina e do grupo vacinado corn S6 mais CpG ODN é mostrado.

Figura 10. Respostas imunes provoeada3 por vacinação de S6 maís CpG ODN.

Amostras de soro foram 25 obtidas de camundongos imunizados com S6 mais CpG ODN, CpG ODN e solução salina quatro semanas após a administração da última dose.

Soros forarr'. índividualmente testados por ELISA para determinar a presença de anticorpos IgG, IgGl e IgG2a específicos anti-S6. (*P < 0,05). As díferenças

30 estatísticas signi-ficativas entre o grupo de S6 mais CpG

ODN e grupos de controle (solução salina e CpG). (B) Células de baço foram não estiinuladas (meio) ou estiínuladas com S6 por 48 horas em CÕ2 a 5%, a 37°C.

Níveis de IFN-y,

.

MI '¥ W 'Y ' 7 IL-4 e IL-IO foram medidos em sobrenadantes de cultura por captura de ensaio imunossorvente ligado por enzima. Cada barra representa a média rnais desvio padrão de níveis de citocina determinados eni quatro camundorígos individuais por 5 grupcc (*P < 0,05). Diferenças estatistícas signíficativas entre o grupo S6 mais CpG QDK' e grupos de controle (soiuçãQ salina e CpG). Fígura 11. Desenvolvimento de Iesão erri camundongos imunízados eom L3, L5 e S4 índívíduaímente ou 10 em preparado3 místurados na ausêncía ou presença de CpG.

Lesões foram monitoradas semanalmente até a semana seis após infecção, (A) Grupos de camundongos de controle e grupos de camundongcs vacinadQs com as proteinas recombinantes sem adjuvante. (B) Grupos de camundongos de 15 controle e grupos de canunciongos vacinados com a proteína recombinante mais CpG ODN (*P < 0,05). As diferenças no inchaço de pata eritre grupos de L3 mais CpG ODN, L5 mais CpG ODN, L3 mais L5 mais CpG ODN ou L3 mais L5 mais S6 mais CpG ODN e controle (solução salina e adjuvante) foram 20 estatisticamente significativas na semana seis após infecção. Fígura 12. Cargas de parasítas nos camundongos vaeinados. Cargas de parasita fotam determinadas no baço e no DLN na semana sete após infecçâo. (A) Grupos de 25 camundongos de contrcle e grupos de camundongos vacinacios com as proteínas recombinantes sem adjuvante. (B) Grupos de camundongos de controle e grupos cie camundangos vacinados corn as proteinas recombínantes mais CpG ODN. (*P < 0,05). Diferenças nas cargas de paras'ita de baço entre grupos de 3(J L3 mais CpG ODN, L5 mais CpG ODN, L3 mais L5 mais CpG ODN ou L3 ínais L5 maís S6 mais CpG ODN e controle (solução salina e adjuvante) foram estatisticamente sigríificativas. (*P < 0,05). Diferenças nas cargas de parasita poplítea entre grupos de L3 mais L5 mais CpG ODN ôu L3 maís L.5 mais S6 mais CpG ODN e c.ontrole (so'iuçãQ sa.lina e adjuvantel foram estatisticamente significativas.

Figura 13. Representação díagramátíca das 5 construções químérícas propostas.

Os íniciadQres projetados e os sítios cortados selecionados para clonagem são mostrados.

ExemE1os Exemplo 1: clonagem de proteínas L3 e L5 de Leíshmanía major e efeíto de proteção con£erído pom essas proteínas contra ínfecção por Leíshmanía major Material e métodos Cepas de camundongos e parasitas.

Camundongos BALB/C fêmeas (com 6-8 semanas de idade) foram adquiridas de Harlan Interíiaur'-a Tbérica S.A. (Barcelona, Espanha). Parasitas de L. major (IWHOM/IR/-/173) foram mantidos em um estado virulento pdl" passagem em camundongos BALB/C.

Arnastigotas L. major foram obtidos e transfDrmados em promastigota por cultura a 26°C em íneio de Schneider (Gibco, BRL, Grand Island, NY, EUA) suplementado com soro de vitelo fetal a 20%. CpG-ODN.

CpG-ODN modificado por fosforotioato (5'- TCAACGTTGA-3' e 5'- GCTAGCGTTAGCGT-3') (SEQ ID NO:5, 6) forani sintetizados por Isogen (F,olanda). Clonagem de sequências de DNA que codificam proteínas ribossomais L. rnajor L3 e L5. O quadro de leitura aberta (QLA) codificando as proteínas L3 e L5 l. major foram obtidas do barico de dados do genoma de l. major (www.genedb.org/genedb/leish) usando as sequências de proteínas L3 e 15 de S. cerevisiae cQmD sondas (56). Para expressão de proteíRas de rLmL3 e rLmL5

¶ 0 k ¶ R 'i P suas regiões de c,odificação (RC) foram amplificadas pot PCR utiíizando como gabarito o DNA de l. major (MHOM/IL/80(Friedlin)). DNAS aIn!j1ífícados foram clonados no plasrnídeo pBluescript (Stratagene, La Jolla CA) e 5 seqüenciados antes da clonagem no vetor de expressão pQE30 (QIAGEN, Hílden, Alemanha). Pela clonagem do RC LmL3 os iniciadores emprega"los foram: sentido, 5'- CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG -3' (posições 1 a 20 do LmL3 10 RC (LmjF34.288QÀ (SEQ ID NO: 44); anti-sentido, 5'- AACTGCAGTTACTTCTTCGCGGCCTTTG -3' (reverso e complementar a posições 1241 a 1260 do LmL3 RC (LmjF34.2880)) (SEQ ID NO:45). sítios de restrição BatnELI e Pstj (sublínhados) foram incluídos para fins de clonagem. 15 Para clonagerr, do RC I,mL5 qs iniciadores ernpregados foram: sentído, 5'-CGGGATCCATGTGCACGC TGGCAAATTG -3' (posições 1 a 2C do RC Lmlj5 (Lrr.jF35.1890)) (SEQ id NO:46); anti-sentido, 5'-CCCAAGCTTTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3' (reverso e complernentar a posições 968-987 do RC LmL5 20 (LmjF35.L890.319)) (SEQ id NOM7). Sitios de restrição BamHI e Hindlll (sublinhados) fotam íncluídos para fins de clonagem.

Purífícação de proteína As proteínas rLmL3 e rljrnL5 foram superexpressas 25 em Escherichia coli transformada com plasmídeos de pQE-LmL3 ou com pQE-LmL5 e purificadas sob condições de desnaturar sobre colunas de agarose Ni-ácido nitrilotriacético (Ni- NTA) (Q±agen). Após ligação a N1-NTA proteínas recombinantes de agarose foram redobradas na coluna de 30 afiniclade como descrito (57). As proteínas recornbinantes foram passadas atravês de uma coluna de polimixina-agarose (Sigma, St.

Louis, Mo). Teor de endotoxina residual (<12 pg/µg de proteina recombinante) foi rnedido pelo Ensaio de k V ¥ bb ¶ 0

Amebócito Limulus.

Cromogênico QuantitativQ QCL-IQOO (BioWhittaker, Walkersville, Md.). Imunizações, desafio de parasita e quantíficação de parasita 5 Dois grupos de camundongos BALB/c independentes (seis por grupo) foram inoculados por via subcutânea (s.c.)

na pata direita com 10 µg de rLmL3 ou 10 µg de rLmL5 misturado com 25 µg de cada CpG-ODN.

Como controle dois grupos de camundongos adicionais foram inoculados com 25 µg 10 de cada CpG-ODN individualmente, ou com tampão de solução salina de fosfato (PBS). Cada qrupo foi reforçado duas e quatro semanas após com a mesrna dose utilizada para sensibilização.

O desafio de parasita foi realizado por inoculação por via subcutânea com 5 x 104 promastigotas de

15 fase estacionáría de l. major (WHOM/IR/-/173) na pata esquerda (não tratada) quatro semanas após a última inoculação.

O inchaço de pata foi medido com um calíbrador métrico e calculado coitio espessura da pata esquerda menos espessura da pata direita, O número de parasitas foi 20 determinado nas orelhas, linfonodos de drenagem {DLN) e baço por limitar ensaio de diiuição como descrito (70). Antígenos de Lei.shmaniose e protefnas de ribossomo de camundongo.

Para preparação de L. major lrp, 109 25 promastigotas foram colhidos, lavados duas vezes em PBS pré-resfriado e resuspensos em "L nil de tampão de lise NP40 (10 mM Tris HCl, pE 8,0, 150 mM NaCl, 1,5 mM Mgcl2 e 0,5% NP40) e pipetado para cima e para baixo 10 vezes.

Após lises, as amostras foram microcentrifugadas a 3.000 x g por 30 2 min. a 4°C para sedimentar os ríúcleos.

O sobrenadante foi duas vezes micrQcentrifugadc) a 13.000 x g por 15 min. a 4"C e os ríbossomos f.oram preparados do sobren.adante citosólico como descrito em [57]. Em resumo, citosol foi submetido à centrifugação em alta velocidade a 90.00'0 rpm por 30 min. a 4"C em um rotor Beckrrian TL1CI0.3. O sedimento bruco ribossomal foi suspenso novamente em tampão a (20 mM Tris- 5 HCl, pH 7,4, 500 mM ACNH,, 100 mM MgC1,, 5 rnM B- mercaptoetanol) e centrifugada através de um gradíente de sacarose descontínua (20/40%) em tampão A a 90.000 rpm a 4°C em um rotor TL1O0.3. Os sedimentos de ribossomos lavados foram ciissolvidos em PBS e sonicados até a io degradação total do RNA ríbossomal.

Extratos de proteínas ribossomais de camundongo (PRC) foram preparados de 5 x 107

RAW 264,7 cé:ulas de rrtacrófago de murino utilízando o me'smo procedirriento.

Proteínas totais de l. majc'r (antígeno de Leishmania solúvel [ALS]) foram preparados corno descrito (70). Em resumo, promastigotas de l. major (10l0) foram lavados dua3 vezes em PBS, suspensos novamente em 500 ml de PBS e lisados por três ciclos de congelamento e descongelamento.

Após Iise de célula, antígenos solúveis foram separados a partit da fração insolúvel por centrifugação por 15 min. a 12.000 x g utilizando uma microcentrííuga.

Sobrenadantes foram divididos em alíquotas e armazenados a -70°C.

Medição de eitocinas em sobrenadantes .'J liberação de IFN-y, IL-1O e IL-4 foi medida nos sobrenadantes de culturas de célula de esplenócítos com as proteínas recombinantes utilizancio kits de ELISA ccmerciaí (Diaclone, Besançon, Frar.ça). Em resumo, 3 x 106 células de baço foram semeadas em placas de 48 cavidades durante 48 h a 37°C na presença de rLrnL3 (6 µg ml"l) ou rLmL5 (6 µg ml"1)

ou meio individualmente, Detecção de respostas de anticorpo anti-L3 e anti-L5 em camundongos e cães

0 X 0 iu b

Amostras de soro canino foram coletadas de 20 cães clinicamente sintomático3 naturalmente ínfectados com Leishmania infantum na regíâo de Extremadura (Espanha). Anirnais infectados foram clínica e analiticamente avaliados 5 no Departamento de Parasitologia da Escola Veterinária, Universidade de Extremadura, Cáceres, Espanha.

Todos qs soros foram positivos quando testados por imunofluorescência indireta, e a presença de formas de amastigota do parasita foi cQnfírrrlada por observação direta lO em nodos linfóides poplítea e prescapular.

Soros de controle foram obtidos de 8 animais saudáveis mantídos no

Departamento de Parasitologia (Uníversidade de Extremadura). Soros de 12 caniundongos BALB/c experimentalmente

15 infectados com 5 x 10' promastigotas de fase estacionária de L. major ("WHOM/IR/-/173) foram coletados na semana oito após infecção.

Como controle os soros dos mesmos camundongos foram coletados antes da infecção.

Placas ELISA padrão foram revestidas durante a

20' noite em temperatura ambiente corn 100 µ1 de cada uma das proteínas ribossomais recQrr\binantes (2 µg ml"1 em PBS). Amostras de soro de murino e canino foram ensaiados a 1/200 diluição em PBS-Tween 20 (0,5%) - caseína (5%). Igg-anti- cão conjugado com peroxidase de raiz forte (1/1000), IgGl

25 anti-camundongo (1/1000) e IgG2a-anti-camundongo (1/500) adquirido da Nordi-c Immunological Laboratories (Tilburg, Holanda) foram utilizados como anticorpos secundários.

Dicloridrato de diamina ortofenila (OPD) (Dako, A/S, Glostrup, Dinamarca) foi utilizado corno substrato de

30 peroxidase para ensaios de ELISA. apõs 15 min, a reação foi parada COUl a adição de 100 µ1 de H2SO4 IM e a absorvêneía foi lida a 450 nm.

t

L Ànálise estatistica A análise eStatística foi r'ealiza'da por um teste. t de St'adent. As diferenças foram consideradas significativas quando P < 0,05. S Resultados e discussão ldentificação, clonagem e expressão das pmoteínas LmL3 e LmL5. Para a identificação das regiões de codífícação L3 e L5 l. major qs requerentes realizaram uma busca BLASTP 10 utilizando como sondas as sequências de aminoácidos L3 e L5 de S. cerevisiae (YOR063w e YPL131W, respectivamente) [58]. Duas entradas diferente3 (LmjF34.2880 e LmjF35.l890) anotacios como p7"oteínas LmL3 e LmL5 putativas foram resgatadas com valores significatívos de marcações BLAST. 15 Com base nos dados de sequência de banco de dados, iniciadores PCR foram projetados para amplificar LmL3 e LrnL5 RC, inclaindo sítío de corte para enzimas de restrição diferentes para fins de clonagem. DNAS amplificados foram subclonacíos em pBluescript e seqüenciados. A proteína L3 20 putativa L. major possui 419 aininoácidos tendo um peso molecular de 47.5 kOa e um ponto isoelétrico previsto de

11.67. Proteína 35 putativa L. major possui 328 aminoácidos, com um peso molecular de 36,6 kDa e um ponto isoelétrico previstc de 10,69. A comparação das sequêncías 2'5 de aminoácidos deduzidas L3 e L5 de l. major eom suas cópias de S. c(=revisiae revelou um grau elevado de homologia: 57% de identidade, 73,5% de similaridade para a proteína L3; 51,2% de identidade, 66,3% de símilaridade para a proteína L5 {vide Alinhamentos). O alinhamento 30 agresentado aqui mostra que as proteínas L3 e L5 L'eishmania contêm alguns dominios com um grau elevado de similaHdade, Também foi notável observar que as duas proteíDas de parasita eram mais longas do que as proteínas de levedura,

Ç t k apresentando resíduos de aminoácídos extras na extremidade terminal-carboxi para o LmL3 e nas duas extre'midades para o LmL5. A estrutura pri-mária incomum de proteínas de Leishmania que pertencem a famílias de proteína conservada 5 parece ser imunologicamente relevante, uma vez que as respostas humoral e celular eliciadas contra essas proteínas durante infecção são específicas contta o parasita sem reatividade cruzada com as proteínas homólogas a partir das cópias de hospedeiro {39, 36, 58).

10 CR LmL3 e Lw.L5 foram subclonados no vetor de expressào YQ30. As sequências de aminoácidos das proteínas recombinantes deduzidas são mostradas nas partes C e D do alinhamento. As duas proteínas apresentam como N-terminal um terminal que inclui as 6 histidinas utilizadas para 15 purificaçào de cromatografia por afinidade.

Subseqüentemente, as duas proteínas foram s'uperexpressas em culturas de E. coli e purificadas. Como mostrado na fiaura 1, as proteínas rLmL3 e rLmL5 püri-ficadas mostraram uma massa molecular aparente de 48 kOa e 38 kDa, 20 respectivamente, de acordo com a presença de 12 aminoácidos trecho his-terrninal extra em suas regiões N-terminais. A pureza da proteína foi demonstrada, uma vez que uma faixa única foi observada para proteína recombinante purificada em urn gel SDS-PAGE colorido com azul Coomassie (figura 1).

25 LmL3 e LmL5 são reconhecidos por soros de leishmaniose visceral canina (LVC) e pol soros de camundongos BALB/C infectados com l. major (LCM) Para determinar a antigenicidade de proteínas L3 e L5 de l. major em cães afetados por LV, as proteínas 30 rLmL3 e rLmL5 recombinantes foram empregadas como antígenos em ensaios de ELISA utilizando o soro de 20 càes infectados com L. infantum. CQmo controle, a reatividade de soros obt'idos de 8 çães saudáveis contra proteínas recombinantes

Y0 % Nb foi ensaiada. Dqs soros de LVC 75% (15/20) reconheceram a proteína rLmL3 (figura 2b) e 90% (18/20) reconhecerarn a proteína rLniL5 com valores de z:eatíviciade mais elevados do que c valor de corte (figura 2c). O espectro dos valores de 5 abscrbâncía entre aquele contra rLmL3 e rLmL5 foram diferentes, visto que a reatividade de soros de LVC contra rlirnL5 era mais elevada (rnédia = 0,61 + 0,36) do que aquela obtida para rLmL3 (média = 0,28 ±0,10). Pode-se concluir que ambas as proteínas de parasíta são expostas ao sistema 10 imune durante íeíshmanióse natural canina, sendo a proteína LmL5 um imunógeno mais prevalente do que LmL3. Embora um número iimitado de gQro fcjssê empregado aqui, os ciados obtídos godem ser tcmados comcj indicação de que ambas as pr\"jteínas de parasita recombinante podem ser utílizadas, em 15 combinação com outros antígenos, para o desenvolvimento de testes de sorodiagnóst.ico de LVC.

A seguir Os requerentes analisaram a antigenícidade das prQteínas LmL3 e LmL5 utílizando os soros de camundongos BALB/c que sofrem de leishmaniose 20 cutânea (LCM) devido à infecção de l. ínajor. Paca essa finalidade, a presença de anticorpos IgGl e IgG2a contra as proteírias recombinantes foi analisada por ELISA. As duas proteínas foram reconhecidas pelos soeo de LCM sendo os anticorpos eliciados ccntra as mesmas predominantewente do 25 isotipo IgGl (figura 2a). Nenhuma reatividade contra as mesmas foi observada nos mesmos camundongos antes da ínfecção (fígura 2a). Uma vez que a indução de anticorpos IgGl e IgG2a é utilizada como marcador de respostas imunes tipo Th2 ·G tipo Thl, respectivamente (8), 05 requerentes 30 podem incíuir que durante infecçãc por l. major uma resposta humoral semelhante a Th2 é induzida contra esses antígenos em camundongos BALB/C.

«

4 !, í q r ímunização com as pro teína s ribossomais recombinantes rLmL3 e rLmL5 na presença de CpG ODN induz. uma resposta do tipo Thl contra os mesmos em camundongos BALB/C 5 Uma vez que uma resposta humoral mediada por Th2 contra os mesmos é eliciada errí camundongos BALB/C infectados os requerentes an.alisaram o efeito da imunização de rLmL3 e rLrriL5 na presença de um adjuvante que induz Thl (CpG-ODN). Para essa finalidade grupos de seis camundongos

10 foram independentemente imunizados com rLmL3 e rLrrtL5 em cornbinação com CpG-ODN.

Como controle, grupos de seis camundongos foram imunizados com CpG-ODN individualmente e com PBS (tampão empregado como excipiente). Após três doses as respostas celulares ocasionadas pela imunização foram 15 analisadas.

Células de baço foram obtídas e cultivadas na presença e na ausência dos antígenos rLmL3 ou rLmL5 correspondentem Células de baço de camundongos ímunizadas com rLmL3+CpG-ODN produziram um nível elevado de IFN-gama após estimulação cQm q antígeno rLmL3 (figura 3a). O nível

20 de IFN-gama siínilar foi detectado nos sobrenadantes de culturas de células de baço de camundoncros imuniz.ados com rLniL5 + CpG-ODN apõs estímulação de rLmL5 (figura 3b). Ao contrário, células de baço de camundongos imunizados com o adjuvante ou o excipiente produziram níveis baixos de IFN-

25 gama em resposta a estimulação de rLrriL3 ou rLmL5 (figura 3ab). Com relação à produção de IL-4 r.íveís ruuito baixos dessa citocina foraní detectados após estimulação com rLmL3 ou rLmL5 de células de baço obtidas de camundongos imunizados com rLmL3 + CDG-ODN (figura 3c) ou rLmL5+CpG-ODN

3:0' (figura 4d), respectivamente.

Finalrnente, nenhuma produção específica de Il-10 foi detec.tada em qualquer grupo (fígura

3ef). Desse modo, pode-se concluir que o adjuvante Cpg-ODN b

L 8 inclina a resposta imune contra os antígeno& recombinantes em direção a uma resposta de Thl. Vaginação com rLmL3 -f CpG-ODN e rL-nL5 + CpG-ODN prc'tege camundongos BALB/C contra dc'safio de Tj. ínajor 5 Os requerentes analísaram se a administração de proteínas recQmbinal2tes foi capaz de induzir proteção contra infecção por t,, major nos camundongos BALB/c suscetíveis. O inchaço de pata de camurdongos vacinados com rLmL3+cpg-ODN ou rLmL5+CpG-ODN foi significativamente rriais 10 baixo em ccmparação com c) inchaço da pata CÍQ E'BS ou grupos de cQntFo1e de CpG-ODN (Figura 4a). Além disso, uma reduçào de aproximadamente 2-log em carga de parasita fcii observada nas células de Iinfonodo de drenagem dos camundongôs imunizados com rLrnL3+CpG-ODN ou rLmL5+CpG-ODN. Finalmente, 15 nenhum parasita pode ser detectado em baço ao passo que parasitas foFarn detectados em baço dos camundongos dos dois grupos de ccntrole (figura 3b). Pode-se cQncluir que camundongos imunizados com as proteinas LmL3 e LmL5 parasitas expressas como proteínas r("cominantes misturadas 20 com CpG-ODN foram protegidas contra uma infecção por L. major. Nos camundongos vaeinados a patologia dérmica estava ausente ou era rmito baixa. Nesses camundongos a presença de parasitas foi limitada ao linfonodo de drenagem poplítea. A proteção observada foi sirr.ilar àquela obtida 25 pela ímunização de camundongos com um coquetel de DNA de plasrnideo codificando as histonas nucleossomais de Leishmania (19), a proteína PO administrada como uma vacina de DNA (54) e extrato de LRP combinado com CpG-ODN (55). Desse modo, os requerentes caracterizaram dois 3Q constituintes ribossomais cuja irnunização pode contribuir parra um desenvolvimento mais racional de vacinas defínidas moleculares eficazes contra leishmaniose.

¶

L Análise dos parâmetros iinunológicos associados à proteção Para determinar os parâmetros imunológicos associados à proteçào da produção de citocina (IFN-y, IL-4 5 e IL-IO) acionada por SLA, LRP, MRP e proteina recombinante correspondente (L3 e L5) foi analisada nos grupos de camundongos de controle e vacinados na semana 8 após desafio. Células de baço de camundongos vaciriados com L3 e L5 produziram mais SLA, LRP e IFN-y específico de antígeno 10 recombinante do que aqueles de carnundongos de controle na semana oito após desafio (Íiigura 5a) para L3 e figura 6a para L5). Verificou-se que a produção de IFN-y é induzida especificamente por proteínas ribossomais de Leishmania, uma vez que a estimulaçáo de culturas de células de baço 15 com MRP não resultou na produção dessa citocina (figura 5a para L3 e figura 6a para L5). Além disso, níveis mais baixos de SLA e IL-1O específico de LRP (figura 5b para L3 e figura 6b para L5) e IL-4 (figura 5c para L3 e figura 6c para L5) foram encontrados nos sobrenadantes de células de 2'0' baço obtidas de camundongos protegidos quando ccmparado CQltl camundongos de cQntrole (CpG e solução salina). Além disso, a produção dependente de L3 e L5 específica de MRP de IL-IO e IL-4 era muito lenta nos camundongos protegidos. Desse modo, pode-se concluir que após infecção o fenótipo 25 protetor foi associado à indução de respostas de Thl de L3 e L5 que foram capazes de controlar as respostas IL-4 e Il- lO induzidas pelo parasita. Alinhamentos de dados de sequência de LmL3 e LmL5. Âlinhamentos de sequência de aminoácido de proteínas 30 L3 (A) e L5 (B) de Leishmania major com seus ortólogos de Saccharomyces cerevisiae. Aminoácídos conservados são soInbreadQs. o número de aminoácidos do LmL3 e LmL5 são indicados. As sequências de arninoácidos L. majc'r foram

¶ t b previstas de suas sequências de DNA correspondentes. (C e D) sequências de aminoácídos ou as sequências de aminoácido previstas das proteínas LmL3 (rLmL3) (C) e LmL5 (rLmL5) (D) reccmbinantes expressas em bactérias. A sequêncía Ms- 5 terminal extra Localizada em seu N-terminal é iridícada em negrito e sublinhada. O número de aminoácidos das proteínas rLmL3 e rLmL5 é indicado.

A LníL3 wueKE%RHgÜgF.LpRAsRQTR'gnmFpKDDA'rQKpH.LT'SwvF*gMTKIw'DvDÈ&swNKK SCL3 NsgRkYÉAÈ gRíg@,LpdKKAsI».RY"KAFpKDgRsxD'jALT$gLgm%TIwDLHR!pgsEFxKR Éi Fpy?ILEAkpMvIvgíygYRQT2'\'gLKTIgTv#&KTs€ 7RRRY"YmKQsAQLN.sRQkQF#TK Êy¥!mvTvvDTgkNHvgíNg¥vETFRgLR,sLTTvviaEáLs DÈvKsmKigà:YKSKKKAE,T--KYs&KYA EgKvAEAkTLNAFAK:a\s.v :RVI-AÈTÒLRKLRNllRVGvKKAHvQÊ"I2WGGSVE»#IAWcSLLÉkEYRV QDG&GIEK,E=IKKYAS'CVRxlLVHToIRKT- -- ?LAQKKAHLAgIQLNg@sI:sEÈç\'DwNEHFEmAyl gav.*às&cnvcsvTKgHgTEgw"KRw'gv'AcLpRkTkRgLRRvÂeÍ"gAwÁÈÂRwYTvmgQHgYxHR [mÈ0NEMIRAIÀ,vTKglu3FEgvT:uigjgTKiapR%µiRgijRKvAçÍigAwERRFNgwsvmgQRgYHsR ¶.QLNKK.ÍY.QIGRwAwpN,Q&TTTYDL¶ÁWITÈM-G'àNgYgTvQBYvMLKGsv3gpRRKm"%"[RRpMA TsIÈHKI"YRvgKg-DDE-AN%-Ts®RTmITpNgÈgH¥gEIwg'FIMv$acIpgNR4Iv#KRKsLY pQ¥sRQLKEKTv"LKF-Í#s$KrgHgRÊ*KE'HQwFG'pLWDRIRLRKEwRw TNgsRKAIEEvsuwIDTAsKEÈKgREQmExHAMíTLKKRL- E3 Lmlj5 McTLANwvRAIIKxHsTLAEiTLEM?!EvmKNEm7m/mmE=Ú¥mRQMjçLg=ms% SCL5 sFQÊD-«ssA:Yss#áTpw*$gKT-p*QgKRLy·Ts'{mKYNTe @R'Z*"t&Agg;vwK,I"ygg3yvwxy-uEêEA'gI'EIqgB'NYw:tA}m#4LáÊ#LZA"KtE#TAD qr=mF~FcewssThgBu:LNYsKEtÉRYg'í:TK¢="wm'umw7QF&gLDE KF®'mADk)s¥:sAmTmKDEgDDEER@É,»'Kgvg:m3?T-q*vi*vLK¢kTNgmY&:gRpÊ.gE# TYKmÉvEgE¥:ELTEAvEDgpR------- p.EwR"óIgíQRTrrgMYÊgALÉ¢AgD'gaY l?ÈisEgKÊE 'gYNKgKssL6ÁwnÊDR3í:É:w&"Yk.E¥LKQví<EéusNp2pKcvQ"àsK¥~LpEsI*Mymê'lm% -. GwDFE=EIépELLR8YIE¢,gwsQm----EÈLADDDEEREsELWgYLÁDDIDAD"sEDI9,Ts&BÃ'Í g mqps-AsLpNcA«"Eg'j?--HKsKTKKbs,/K~KÈg#IRERLgK gDp"AgpTEw-nkEQYmEswBQTk%s"mgÈmHv='m

C rLmL3 MRGSHHHHHHGSMSHCKFEHPRE1GHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMV 60 FKAgMTHIvRDàDRE'gsKvµKKEvvEpvTILEAppMvívgIvgYRQTpvgLKTIgTvwAH 120 HTSVEFRRRYYKNWKQSAQLAFSRQKQFANTKEGKVAEARTLNAFAKKASVIRVIAHTQL 180 RKLRNHRVGVKKAHVQMQVNGGSVAAKIALAKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKG 240 FígTEgvvKRwgvAcLpRKTHRgLRK\/Ac:gAwHFARvMYTvARAgQ[qgYHFIRTQLlqKKIY 300 QIGRSVAVEPNQATTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDYVMLKGSVSGPRRRVMTLRRP 360 b4APQTSRQLKEKIVLKFID'I'SSKÍGHGR"QTKKEKNQW"FGPLKKDRIRREERLRKERAAK 420 AVZRKAKAAKK 431

D rLmL5 MRgsEHHHHHgsMcTL-ANwvmrIKKEsTLAHTL£MpFvKvvKNwYEKRFQvKYRRRRE 60 gKTDYHARRQbwLQDKTKFgspKYRLvvRITNKDIIAQIvQAKIvgDEyvMAA-YAHF,LpA 120 FGIEHGLTNYAAAYATGI,Lt.ARRTLAKLGTADKFQGAKEADGSYSAVRTKKDDEGDDEER 180 FpE"KAILD\/gLARTTTgARvFgvLKgAvDggyAvpHRpNRFpgYNKEKssLDAKvHRDRI 240 FGKHVADYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKYMKVLPESIEGMYKKAHAAIRADPSKSLP 300 KKÀKKEGVAHKSYKTKKLSGAEKMAAMKVAAIRERLGK 340 q k

P Ex=p1o 2: Análise de homólogos L3 e L5 Alinharaento de homô1oqos L3 e L5 Os requerentes analisaram o grau de conservaçãcj de proteínas ribossorriais L3 e IjS entre diferentes espécies 5 de Leíshmanía. Para essa Einalidade, as sequências de amirioácídos da proteína L3 a partir de L. infantuin e .r,.

mexicana (SEQ ID b'O: 48 e 50) e a proteína L5 de L. infantum (clone JPCM5[MCAN/ES/98/LLM-877]), L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2904) e L. mexicana {MHOM/GT/2001/U1103) (SEQ 10 ID NO: 52, 56 e 64) forarn resgatados por uma análise in silico do banco de dados de genôma (www.genedb.org) e comparado com as sequências de arninoácidos de ortólogos L.

niajor (SEQ idno: 1 para L3 e SEQ ID NO: 3 para L5) (conferir alinhamencos na página seguinte, parte A e B). e 15 Exceto pela existência de uma extensão de N-terminal na proteína L5 de l. major, uin grau elevado cie conservação fói observado entre as espécies diferentes. A tabela IA-B mostra as percentagens de identídade e similaridade entre qs ortólogos L3 e L5, respectivamente.

20 Localização do L3 e L5 de L.eishmania ma,jor nos ribossomos Para demonstrar que o LmL3 e LmL5 recombinânte empregado nesse trabal1",o correspondem às proteínas localizadas nos ribQ3somos parasitas os reqaerentes errípregaram anticorpos específlcos para as proteínas 25 recoír.binantes em western blot contendo as proteínas recombinar'.tes e extratos de LRP. A figura 8A mostra que ancicorpos anti-LmL3 obticios de camunclongos imunizados com a proteína recombinante reconheceram uma faixa única com o peso molecular esperado (47.5 kOa) nos extratos de LRE?, 30 Resultado similar Íloi observado para a proteina L5 (figura 8B). Uma faixa única de 36.6 koa foi observada nos extratos de LRP quando os requerentes empregaram antícorpos anti- Línlj5 purificados de sofos de càes naturalmente infectados

. 4 com L.infantum por cromatografia de afinidade ern uma coluna rLmL5-Sefarose 4b como anteriormente descri-to (71). Como Qc}ntrc:Le positivo, nos dois casos, a proteína recombinante correspondente foi reconhecida pelos anticorpos 5 específicos. Comparações de sequêncía de LeZshznanía L3 e L5. Alinhainentos de sequência de aminoácidos de l. major, l. infantum e L. mexicana L3 (A) (SEQ ID NO: 1, 48 e 50) e L. major, l. braziliensis, L. infantum e L. mexicana L5 (B) IO (SEQ ID NO: 3, 56, 52 e 54). A proteina LmL3, as sequências de proteina L3 putativas de L. infantum (GeneDB icientificador Linj32 V3.3320) e L. mexicana (GeneDB identificador LmxM33.2900), e a proteína Lml,5 e as sequências de proteína L5 putativas de L. braziliensis 15 (GeneO13 identificador LbrM34 V2.1790), L. infantum (GeneDB identificador Linj35 V3.I870) e L. mexicana (GeneDB identificador LmxM34.1880) foram alinhados utilizando os ajustes padrão de ClustalW (programa DNAstar). Substítuições de aminoácidos são sombreadas.

A l. majoL MSHCKFEHPRFIGÉíLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLFSFMVF L. infantum MSFJCKFEHPRHGHLGFLPRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPELTSFMVF L. mexicana MSHCKFEHPRHGHLGFLpRKRSRQIRGRARAFPKDDATQKPHLTSFMVF l. jnajor KAGMTHIVRDVDRE'GSKVNKKEVVEPVTI!,EAPPMVIVGIVGYRQTPVGL l. i.¶faRram MGMTEIVRDV3RPGSKVNKKEWE?VTILEA-PPMVIVGIVGYRQTPVGL L.mexicanâ KAGMT HIVRDVDRPGSKVNKKEVVEPVTILEAPPMVIVGIVGYRQTPVGL L. ma jor KTIGTVWA!ülTSVEFRRRYYKNWKQSAQLAFSRQKQFANTKEGKVT L, 1Mantum KT I'GTVWAHHTSVEFRRRYY~<QSP.QL-AFSRQKQFANTKEGWAEART L. mexica.na KTIGTVWAHHTSVEFRRRYYKNWKQSAQLAFSRQKQFANTKEGRI'AEART .L. ma jor LNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAHVQEIQVNGGSVAAKIAL L. infantuíü LNAFAKKASVIRVIAHTQLRKLRNHRVGVKKAFIVQEIQVNGGSVAAKIAL l, mexicaria LNAFÀKKASVIRVIAF.TQLRKLRNH RVGVKKAHVQEIQ:INGGNYAAKIAL l. ma jor AKSLLEKEVRV DSVE'QQSEACDVCSVT KGHGTEGVVKRWGVACLPRKTHR l. infantum AKSIÃjEXEVRVDSVFQQSEhCDVCSVTKGHGTEGVVKRWGVACLPRKTHR

7Q/89

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B L . mexi.carza AKSLLEKEVRVDSVFQQSEACDVCSVTKGHGTEGVVKRWGVA.CLPRKTF;R l. major gLR'Ky"AcIgAwHpwvMYTvAmgQHgYEHRTQLNKKI YQIGRSVAVEPN l. infanttm GLRKVACIGAWH FARvvYTvARAgQHgYEHRTQLNKKl YQIGRSVAVEPN l. mexicana GLRKVACIGAWHPARVMYI'VARAGQHGYHHRTQLNKKI YQIGRSVAVEPN l. Nâjor QATTTYDLTAKTrTpMggFvgYçTvRNDYvMLKgsvsgpRRqvMTLRRpM L. 1Mantum QATTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTVRNDWMLKGSVSGPRRRVMTLRRPM l. wexicana QÃTTTYDLTAKTITPMGGFVGYGTWNDYVMLKGSVSGPB.RA%I,RRPM l.. wajor ApQTsRQLKEK1vLKFLDTssKIgEígRTQTKKEKNQwFgpLKKDRIRREE L. infantum APQTSRHLKEI(I'/LWIDTSSI<IGÈlGRFQT"KXEKNQWFGPLKKDRIRREE L. mexicana APQTSRQLKEKIVLKFIDTSSKIGHGRFQTKXEKSQWFGPLKKDRIRREE l. majox RLRKERAARAVERKAKAAKK L. inEantum RLRKERAARP.VER:KAK'AKK F' L, mexicana RLRKERAARAVERX.MKAAKK

B l. major Mç,TwNwy#z'I,tiKRsÍmT:LEMpE"jwvKNK '' ¥E?FVKVVKNK L, bmziíiensis l, infantum ME'FVKVVKNK l, mexicanâ M?E'VKVVKNK l. major AYFKRFQV[(YRRRREGKTDYKARRQMVLQDKTKE'GS PKYRLVVRÍTNKDI L. brazilienais AYFKRFCIVKYRRRREGKI' DY PLARRQMVLQDKTKFGS PKYRLVVR*NXDI Il. 1Mantum AYFKRIQVKYRRRREGKT DYEÍARRQMVLQDKTKFGS PKYRLVVRITNKDI L. mexicâna AYÊKqFQv"KYRRRREgKTD'Ls!è.RRQMv"LQD:<IKFgs PKYRLVVRTTNXDI l.. mdjQr TAQIVQAKIVGDEVVMAAYARELPAFGIEHGLTNYAAAYATGRTL L- hraz£lZensis LAQIVQAKIÀGDEVLMAAYARELPAFGI£HGLTNY~YATGLI.LARRTL L. infantum í.4QIvQAKIvgDEvvmYAHELpAFgIEHgLTNYmYATgLLLARRTL l. mexicana IA-QIV\2Ah"IVGDEW~.YAHEL.PAFGIEFIGLTNY-~YATGLL~RTL l. mãjor AKLGIADKFQGAKEADGS YSAVRTKKDDEG3DEERFP?KAILDVGLARTT L. brazilie.'ísis AKLSIADKFQGAKEADGS YSAVRTKKDD GDDEARF?FKAILDVGLARTT L, io£aMurn AKLgIADKFQgAKEADgsYsAvRTKKD3EgDDEERF?FKAILDvgLAaTT l. mexicana èKLgIADKFQgAKEADgsYsAv"RTKKDDEgDDEERF?FKAILDvgIARTT L, ma jor TGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRI?NRFPGYNKEKSSLDAKVHRDRIFGKHV L, braziliensis TgARvFgvLKgµyDggTsvpHRpNRFpgY$KEKsÂLDAKvHRDRI FGKHV L. infantum TGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRPNRFPGYNKEKS'SLDAKVHRDRIFGKHV l . inexi cana TGARVFGVLKGAVDGGMAVPHRPN"RFPGYNKEKS SLDAK'/HRDRI FGKHV k 0 l- majot »YwQvt<EassNpDEKcvQFsKY=Kv[,pF,sIEgMYKmHmImDp l. braziliensis AEYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSKYMEAKVÃPESIEÇMYKMHAAIRADP L. infantum AEYLKQVKEEASSNPDEKCVQFSRYMAAKVLPESIEGMYKKAHAAIRAW L. mexicana AEnKQmEAssmDEKwQFsKYMmwLpERIEgMYKMHmIMDp l. major sKsL?KKAKKEgvAEiKsYKTKKLsgAEKKAKvAAI RERLGK L. braMliensis sKsLE'KKAKKEgaREKsYK'rKKMsgAEKRAAAmKvAAIRERLgK :r:: ?S L. infàntum sKsLmcA.KKEgvÊ\HKsYKTKKLsgAEKRAAAmKvAAI RERLGK L± mexicana sKsL,pKKAKKEsmKsYKTKKLsgAEKRAAAKAKvAAIK Tabela 1

A ImL3 l. majo= L . ínfantum L . mexí cana L . ma j o:r 100,0% 99, 5% 98, 6% (100,0%) (99, 5%) (99, 5%) L. ínfantzm 100, 0% 98, 1% (100,0%) (99, 0%) L . mexí cana 100,0% (100,0%)

B Os valores de identidade e similaridade (entre parênteses) são mostrados.

tmL5 L. L. L. L. ma jor ínfan tum hrazíliensís mexi cana L . ma jor 100,0% 99,3% 94,8% 99,3% (100,0 (100,0%) (97,4%) (99,7%) %) L. ínfantum 100,0% 94, 8% 99,3% (100,0%) (97,4%) (99,7%) L. beazi-Zíensí s 100,0% 94,8% (100,0%) (97,0%) L . mexi cana 100,0% (100,0%) 5 Exeuíplo 3: Vacínação com rlml,3 + CpG-ODN e rtmL5 + CpG-ODN protege camundongos BALB/c contra desafío com L. bvazílíensís.

Os requerentes analisaram o efeito da ímunização das proteínas recombinantes L. major rLmL3 e rLmL5 10 combinadas com um adjuvante que induz Thl (CpG-ODN) no desenvolvimento de leishmaniose cutânea causada por è 4 b infecção corn L. braziliensis.

Para essa finalídade grupos de cinco camundongos foram independentem.ente imunizados ccjm

10 ug de rLmL3 ou 10 µg de rLmL5 em combinação com 5C) µg de

CpG-ODN (25 µg de CpG-l [5'-TCAACGTTGA-3'] maís 25 µg de

5 CpG-2 [5'- GCTAGCGTTAGCGT-3')] (SEQ ID NO: 5 e 6)). Cqiiid control-e, grupos de cínco camundongos foram imunizados com 50 µg de CpG-ODN inciívidualmente Qü com PBS (tampãe enipregado co-mo excipiente). 08 camundonços foram inoculados na derme da orelha (orelha esquerda). Cada grupo foi 10 reforçado duas e quatro sewLanas após com a mesma ciose utilizada para sensibílização.

O desafio de parasita foi realizado por injeção na orelha direita (não tratada) com 105 de promastigotas estacionárias de L. braziliensis

(MHOM/BR/0I/BA788) combinado com dois pares de glândulas

1,5 salivares de inosca de areia Lutzomya intermedia.

Nesse modelo de iniiecçào, após desafio de parasitas, carnundongos BALB/C desenvolvem lesão inflamatória na3 orelhas infectadas que progrediram constantemente e atingiram um máximo aproximaciamente na 3emana 5. Posteriormente, o

20 tamanho da lesão regredíu e a cicatrização completa da orelha foi observada aproximadamente na semana 9 pós- infecção (72). Os requerentes analisaram o desenvolvimento de Iesão cutânea nos quatro cnmpos de carnundongos até 5 semanas após desafio de parasita medindo a espessura da

25 lesào com um calibrador métrico.

Como níostrado na fígura 7A, lesães de orelha de camundongos vacinados com rLmL3 + CpG-QDN ou rLmL5 + CpG-ODN eram significativamente inferiores em comparação com P3S em grupos de cemtrole de CpG-ODN.

Além disso, cargas de parasita foram analisados na

30 semana 5 após infecção nas orelhas infectadas.

O número de parasitas foi deterininado por Lirriitar ensaio de diluição como descrito (73). Uma diminuição nas cargas de parasita p µ foi observada em camundongos va.cinados quando comparados com grupos de eontrole. Diferenças Eoram encontradas como significativas no grupo de rLmL5 + CpG-ODN com relação aos grupos de controle (F' < 0,05, teste T-student). A ém disso, 5 nenhum parasita pode ser detectado na orelha em quatro de cinco ca.mundongos (gr'ípo rLrrL5+ CpG-ODN) e um de c.inco camundongos no grupo rLmL3 + CpG-ODN (figura 7B). Desse modo, foi concluído que camundongos vacinados com proteínas ribossomais L3 e L5 l. major expressas eomo proteinas IO recombinantes e combinadas com CpG-ODN foram protegidas contra um desafio heterólogo com L. braziliensis. Exemplo 4: Proteção parcial eonferída por Leíshmanía majQ= s6 contra infecção por LeíshmanZa major Cinco grupos de camundongos (n=4 por grupo) foram 15 independentemente imunizados com 10 µg de S6 (SEQ ID NO: 34), L2 (SEQ ID NO: 22), L7 (SEQ ID NO: 24), L8 (SEQ ID NO: 26) e L16 (SEQ ID NO: 28) na presença de CpG ODN como identificado anteriormente por SEQ ID NO:5 e 6 (50 µg). Como cantrole, um grupo de camundongos foi imunizado com o 20 adjuvante e outro grupo foi. imunizado com o excipiente (soLução sa1^La-PBS). Três doses foram administradas com intervalos de 2 semanas. Todas as imunizações foram realizadas na pata direita. Um mês após a última dose, camundongos foram infectados com l05 promastigotas de fase

25. estacionária de L. major injetado por via subcutânea na pata esquerda. O desenvolvimento de lesão dérmica foi avaliado por medir inchaço de pata até a setnana oíto após desafio (figura 9A). Camundongos de todos os grupos desenvolveram lesões inflamatórias, embora o inchaço de 30 pata de camundongos que foram vacinados ccjm S6 mais CpG ODN Eoi significativamente mais baixo do que aquele observado em 'controles e em camundongos imuni'zados com as quatro outras proteínas. Além disso, cargas de parasita nos

* ¢ » 0 4 Iinfonodos de drenagerr. (DLN) e nos baços dos camundongos foram analisados. Animais imunizados com S6 -mais CpG ODN mostraram uma reduçào de 2 log no núniero de parasitas em baço em cemparaçào com solução salina e çrupcs de CpG QDN, 5 respectivamente (figura 9B}. E.ntretanto, as caraas de parasita encontradas ncj DLN do grupo S6 mais CpG ODN foram similares àqvelas observadas em controles. A partir desse ensaio, pode-se concluir que a vacinação com a proteina recombinante S6 na presença de 10 adjuvante CpG ODN estava índuzindo um estado imune que resulta em uma proteção parcial contra LC devido à infecção de l- major nos camundongos BAL3/C: presença de lesões inflamatórias inferiores no 1Dca: de infecção e cargas de parasita mais baixas no baço do que em controles. Pór outro

15. lado, a vacinação com os outros q'-iatro antígenos (LS, L7, L8 e L16) não resultou em desafios sígnificativos no avanço de LC em relação a controles. E'ara analisar a respoQtas imunológicas induzidas por vacinação, as respostas celulares e humorais provocadas 2C erri camundongos por vacinação com S6 + CpG ODN foram comparadas com camundcmges imunZ.zados ccun o adjuvante e o diluente de vacina. A figura 10 mostra que a formulação de vacina estava induzindo uma resposta rtiisturada de Th1/Th2 contra a proteína S6, urna vez que anticorpos rgg2a e IgGl 25 específicos anti-s6 foram detectados nos soros dos camundongos vacinados (vide a figura IOA). Alén dissQ, embora IFN-garna fosse produzido após S6 estimulação in vitro de células de baço estabelecida a partir dos câmundongos vacinados a presença de citocina IL-4 30 detectável também foi observada nos sobrenadantes de cultura {vide a figura 108). Pode-se concluir que a vacinação induziu uma resposta Thl predorninante contra a proteína S6, porém uma p µ h leve estimulação de uma resposta de Th2 contra a proteína foi também observada (níveis detectáveis de anticorpos IgGl específicos de S6 e I.L-4 específico de S6). Ex~p1o 5: Vacínas baseadas ¢ proteínas 5 recombínantes L3, L5 e S4 de Leíshuíanía major. Para analisar em mais detalhe a proteção induzida pelas proteínas ribossorriais L3, L5 e S4, um novo experimento de infecção-imunização foi realizado. Doze grtipos de camundongos (n=4 por grupo) foram ineluídos na 10 análise. Errt todos os casos os camundongos forani inunízados por via subcutânea três vezes (com separação de duas semanas) na pata direita. Os seguintes grupos foram erisaiados: " Excipiente de vacina: solução salina. 15 * Adjuvante de vacina: CpG-ODN. Por dose: 50 µg of CpG QDN (25 µg CpG-ODN-I [5'-TCAACGTTGA--3'] (SEQ ID NO:5) e 25 µg of CpG-ODN-2 [5'- GCTAGCGTTAGCGT-3'] (SEQ ID NO:6). " L3 (SEQ ID NO:l). Por dose: 10 µg de proteína 20 recombinante. * L3 + CpG ODN. Por dose. 10 µg de pr.oteína recombinante e 50 µg de CpG ODN. * L5 (SEQ ID NO:3). Por dose: 10 µg de proteína recombinante.

25 * L5 + CpG ODN. por dose. 10 µg de proteína recombinante e 50 µg de CpG CDN. " S4 (SEQ ID NO: 32). Pof dose: 10 µg de proteína recombinante.

* S4 + CpG ODN. Por dose. 10 µg de proteína 30 reconibinante e 50 µg de CpG ODN- * L3 + L5. Por dose: 10 µg proteínas r.ecoubinantes. t.Qt-a.ís; 5 µg .c.ada proteína,.

¥ m * y t' * L3 4 L5 + CpG ODN. Por dose. 10 µg de proteína recombinante total e 50 µg de CpG ODN.

* L3 + L5 + S4. Por dose: 10 µg proteína recornbinante total; 3.3 µg cada prote.ína.

5' * L3 4- l5 + s4 + Cpg odn. Por dose. 10 µg de proteína recombinante total e 50 µg de CpG ODN.

Em resumo, os três antígenos foram ensaíados na presença ou na ausência de CpG ODN. Além disso, combinações de L3+L5 e L3+L5+S4 foram analisaáos na presença e na 10 ausência de CpG ODN. Um mês apõs a última dose, os camundongos foram infectados com 105 promastigotas de fase estacionária de l. major injetado por via subcutânea na pata esquerda. O desenvolvímento de lesão dérmica foi avaliado 15 por medir o inchaço de pata até semana seis após desafio. Na figura I1A c)" dois grupos de controIe (solução salina e CpG ODN) e os cinco grupQs vacinados com os antígenos sem o ací>vante é mostrado. Nenhuma diferença fcji observada nas Iesões ínflamatórias entre grupcs de controle e qs cinco 20 grupos de camundQngQs vacinados com as proteínas na ausência de adjuvante. Na figura 118 os dois grupos de controle (solução salina e CpG ODN) e os cinco gEupos vacinados com os ant,íçenos combinados com o adjuvante é rnostrado. Nesse caso, todos os grupos de camundongos 25 vacinados com as proteínas recombinantes na presença do adjuvante mostraràm uma redução no inchaço de pata exceto o çrupo S4+CpG OIJN. As Iesões inflamatórias inferíores foram observadas nos grupos L5+CpG ODN, L3+L5+CpG ODN e L3+L5+S4+CpG ODN.

30 Cargas de parasita no DLN e nos baços de todos os grupos de camundongos foram analísadas na semana sete após infecção. Nenhama diferença estatística foi encontrada entre os camundQngos incluídos rios grupos de controle e camundongos imunizados com as proteínas ribossomais sem adjuvante (figura 12A). por outro lado, camundo'ngos irnunizados com as proteínas ribossomais mais CpG ODN mostraram uma diminuição significativa nas cargas de 5 parasita em baço, exceto no grupo S4 mais CpG ODN (figura 12B). Em relação às cargas de parasita no lin£onodo poplítea, os requerentes encontraram uma diminuição significativa em grupos que Íoram vacinados com a combinação de dois (L3 + L5) ou três (L3 + L5 + S4) 10' proteínas ribossomais mais CpG ODN. Os3 camundongos vacinados com L3 mais CpG ODN e L5 rnais CpG ODN também mostraram cargas de parasita maís baixas do que controles.

Entretanto, devido ao grau elevado de variabilidade encontrada entre os diferentes animais, os resultados não foram estatisticamente signíficati-vos. Esses ensaios devem ser repetidos com um número mais elevado de camundongos para analisar a influência das vacinas nas cargas de parasita locaís, uma vez que em ensaios anteriores, os requerentes encontraram diferenças estatisticas entre ZO camundongos vaeinados com 13 maís CpG QDN e L5 mais CpG ODN e controles. Em relação aQ uso de vacinas baseadas em antígenos individuais ou ca-administração de antígenos diferentes, os resultados dos requerentes indicam que as vacinas combinatórias estão induzindo um grau de proteçáo mais elevado do que vaoinas compostas em antígenos individuais. Exeínplo 6: projeto de procedimentos de cIonagem para a construção de moléculas recoínbinantes eornbínando os quatro antígenos ribossomais de proteção já caracterizados (L3, L5, S4 e S6 de Leíshmania major). Com base em resultados anteriores, os requerentes planejaram preparar novos produtos rec'ombinantes com b'ase b

K K 0 k em proteínas Leishmania major L3 (SEQ id NO:l), L5 (SSQ ID NO:3), S4 (SEQ ID NO: 32) e S6 (SEQ ID NO:34). Primeíramente, as inserções de D'NA cDdificaRdo para as quatro proteínas serão cLonadas erri um vetor de 5 expressào eucariõtica (pcDNA-3; Stratagene). Esse vetor, que permite a expressão das proteínas de Leishmania ern céluias de mamíferos, pode ser empregado para testar vacinas de DNA. Em segundo Iugar, os requerer.tes projetaram um 10 procedimento para cicjnàr proteínas quiméricas diferentes com combinaçào diferente dos quatro antígenos (fi-gura 13). As quimeras de gene serão primeiramente clonadas em pBluescript (um plasmídec> de análise) e posteriormente as inserções de DNA serão clonadas em dois plasmideos de 15 expressão difererites: . pQE30; um plasmideo de expressão procariótico. . pcDNA3, um plasmídeo cie expressão eucariótico, Essa estracégía de clonagem permitirã que os requerentes tenham vacinas de IJNA como proteínas 20 recombinantes expressas em E. coli com as combinações antigênicas propostas. Os seguintes iniciadores foram utilizados: LmL3 Avançado 5'-CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGÁG-3' (SEQ ID NO:57) 2,5 Reverso 5'-GCGATATCTCCCTTCTTCGCGGCCTTTGCC-3'(SEQ ID NO:58) LmS4 Avançado 5'-GCGATATCGGGATGGCCAAGAAGCACCTCAAG-3"(SEQ ID NO:59) Reverso 5'-CGGAATTCTCCCTTGCGGGCCCTGCGGG-3'(SEQ ID

3.0 NO:60) LmS6 Avançado 5'-CGGRATTCGGGATGAAGCTCAACATCGCGTAC-3'(SEQ ÍD NO:61)

Reverso 5'-GCGATATCTCCCTTCTTCTGGAATGCTGCCAC-3'(SEQ ID NO:62·) LmL5 Avançadô 5'-GCGATATCGGGATGTGCACGCTGG'CAAATTG3'(SEQ ID 5 NO:63) Reverso 5'-GGGGTACCGGATCCTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3'(SEQ ID NO:64) A proteína quiméríca resultante é representada por uma sequência de aminoácido que consiste na SEQ ID NO:

67. Essa proteína quimérica é codificada por um ácido r.ucléico representado pqf uma moLécula de ácido nucléico que consiste na SEQ ID NO: 66. Referências

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma fonte de L5 e/ou L3 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou retardar uma doença parasitária.

5 2. Uso de uma fonte de L5 e/ou L3 caracterizado por ser na preparação de um dispositivo para diagnosticar in vitro uma doença parasitária.

3. Uso, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma fonte de L3 é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência de pelo menos 60% ou semelhança com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e/ou que é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID N0:2 e em que uma fonte de L5 é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem identidade ãe sequência de pelo menos 60% ou semelhança com a sequência de aminoácidos SEQ ID N0:3 e/ou que é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60% de identidade com SEQ ID N0:4.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma fonte de S4 e/ou S6 é combinada com uma fonte de L3 e/ou L5.

5. Uso de uma fonte de S6 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou retardar uma doença parasítica.

6. uso de uma fonte de S6 caracterizado por ser na preparação de um dispositivo para diagnosticar in vitro uma 5 doença parasítica.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4 e/ou 5, caracterizado pelo fato de que um adjuvante está presente.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 5 e/ou 7, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante promotor de Th1.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o adjuvante promotor de Th1 é um CpG ODN.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 5 e 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a fonte de L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 é uma vacina.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a fonte de L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 é uma proteína, um fragmento de proteína, um peptídeo ou um ácido nucleico.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a fonte de L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 é obtida a partir de espécies de Leishmania.

13. Uso, de acordo com qualquer urna das reivindicações 1 a 12, caracterizado p~lo fato de que a doença parasitária é causada por espécies diferentes do que as espécies das quais a fonte de L3 e/ou L5 e/ou S4 e/ou S6 é derivada.

5 14. Composição caracterizada por compreender urna fonte de L3 e/ou L5 e um excipiente ou veículo farrnaceuticarnente aceitável.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que urna fonte de S4 e/ou S6 é incluída na referida composição.

16. Composição caracterizado pelo fato de que compreende urna fonte de S6 e um excipiente ou veículo farrnaceuticarnente aceitável.

17. Composição, de acordo com qualquer urna das rei vindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende um adjuvante.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante promotor de Th1.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante promotor de Th1 é um CpG ODN.

20. Dispositivo de ensaio para o diagnóstico de urna doença parasítica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende uma fonte de L3 e/ou LS.

21. Dispositivo de ensaio, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que uma fonte de S4 e/ou S6 também está presente no dispositivo.

22. Dispositivo de ensaio para o diagnóstico de uma doença parasítica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende uma fonte de S6.