BR102015027298A2 - proteína recombinante, método e kit para diagnóstico de esquistossomose, composição vacinal e uso - Google Patents

Abstract

a presente invenção descreve a proteína recombinante sm10.3 (seq id n° 1), um método e um kit diagnóstico para detecção de esquistossomose utilizando tal proteína e uma composição vacinai contendo tal proteína e seu uso no tratamento elou prevenção da esquistossomose.

Description

“PROTEÍNA RECOMBINANTE, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA ESQUISTOSSOMOSE, COMPOSIÇÃO VACINAL E USO” [001J A presente invenção descreve a proteína recombinante SM1Q.3 (SEQ ID N° 1), um método e um kit diagnóstico para detecção de esquistossomose utilizando tal proteína e uma composição vacinai contendo tal proteína e seu uso no tratamento e/ou prevenção da esquistossomose.

[002] A esquistossomose é uma doença endêmica crônica que afeta mais de 200 milhões de pessoas» sendo que 600 milhões vivem em risco de infecção» em 76 países no mundo (ROSS, A.G. et al. Schistosomiasis in the People's Republic of China: prospects and challenges for the 21st century. Clin Microbioi Rev. v.14, n.2» p.270-95, 2001). Os principais agentes causadores da esquistossomose são Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum e Schistosoma haematobium. No Brasil, é calculada a existência de aproximadamente 12 milhões de infectados pelo S. mansoni (KLOETZEL, K. Schistosomiasis in Brazil: Does social development suffice? Parasito! Today. V.5, n.12. p.388-91, 1989). Os principais estados atingidos são Minas Gerais e Bahia, sendo que a infecção se estende até os estados do Maranhão e Pará.

[003] O Schistosoma mansoni é transmitido para o homem através da água contaminada com as larvas, onde se encontram caramujos do gênero Biomphalaria, hospedeiros intermediários do ciclo de vida do parasito. Na transmissão, o parasito na forma de cercária penetra através da pele do homem e se transforma em esquistossômulo. Este migra para os pulmões e depois para o fígado, onde o amadurecimento sexual é completo e ocorre a cópula entre os parasitos adultos macho e fêmea. A postura dos ovos no fígado seguido da retenção destes nos tecidos do homem é a principal causa das síntomatologias severas ocorridas na doença (GRYSEELS, B. et al. Human schistosomiasis. Lancei. V.23, n.368, p.1106-18, 2006). No momento da transmissão, pode ocorrer uma reação do tipo alérgica na pele desencadeada pela penetração do parasito.

Febre, dor de cabeça, calafrios, sudorese, fraqueza, falta de apetite, dor muscular, tosse e diarréia são os sintomas da esquistossomose em sua fase aguda. O fígado e o baço também aumentam de volume devido às inflamações causadas pela presença do parasito e de seus ovos. Se não for tratada, a doença pode evoluir para sua forma crônica, quando geralmente aparece sangue nas fezes . O doente sente tonturas, palpitações, impotência, emagrecimento e o fígado aumenta ainda mais. Alguns sintomas são decorrentes da obstrução das veias do baço e do fígado, sendo que o desvio do fluxo de sangue pode causar até varizes no esôfago. Nesse estágio, a aparência do enfermo torna-se característica: fraco, mas com uma enorme barriga, o que dá a doença seu nome popular de “barriga d'água”, [004] As estratégias utilizadas atualmente para o controle da esquistossomose consistem no controle da transmissão e da morbidade. O controle da transmissão visa interromper o ciclo evolutivo do parasito, impedindo que haja infecção de novos pacientes. Já para o controle da morbidade, o objetivo é impedir o aparecimento de formas hepatoesplênicas, o que é alcançado através da realização do diagnóstico e tratamento químico dos pacientes utilizando-se as drogas praziquanteí e oxaminiquine. Porém, essas estratégias possuem limitações, sendo a principal delas o desenvolvimento de resistência às drogas utilizadas para o tratamento (ISMAIL, M. et al. Resistance to praziquanteí: direct evidence from Schisiosoma mansoni isolated from Egyptian viilagers. Am J Trop Med Hyg. V.60, n.6, p.932-5, 1999; STELMA, F.F. et al. Efficacy and side effects of praziquanteí in an epidemic focus of Schistosoma mansoni. Am J Trop Med Hyg. V.53, n.2, p. 167-70, 1995). Bergquist e Colley (1998) mostraram que nas últimas décadas de tratamento químico contra a esquistossomose, o número de pessoas infectadas continuou o mesmo, deixando clara a necessidade de se desenvolver uma vacina anti-esquistossomótica (BERGQUIST, N.R.; COLLEY, D.G. Schistosomiasis vaccíne:research to development. Parasitol Today. V.14, n.3,p.99-104, 1998).

[005] Desde os anos 70, vários estudos têm sido realizados com o objetivo de avaliar a complexidade e ímunogenicidade do tegumento do S. mansoni. O tegumento do verme adulto consiste em um sincício citoplasmático coberto por uma única membrana de dupla camada (MCLAREN, D.J.; HOCKLEY, D.J. Blood flukes have a double outer membrane. Nature. V.8, n.269, p. 147-9. 1977). Antígenos de membrana e antígenos associados à superfície presentes no tegumento do S. mansoni têm um grande potencial no desenvolvimento de vacinas, por estarem expostos ao sistema imune do hospedeiro, como também são de grande importância nos estudos biológicos da interface parasito-hospedeiro, [006] Os primeiros estudos relacionados â ímunogenicidade do tegumento do S. mansoni foram baseados na vacinação direta de animais com o tegumento do parasito purificado e análises de western blot (HACKETT, F. et al. Schistosoma mansoni: antigen preparations which induce antibodies to schistosomula surface antigens. Exp Parasitol. v.60, n.3, p.294-303, 1985; PAYARES, G. et al. Antigenicity and immunogenicíty of the tegumental outer membrane of adult Schistosoma mansoni. Parasite Immunol. v.7, n.1, p.45-61, 1985; SIMPSON, A.J. et al. Antibody response against schistosomulum surface antigens and protective immunity following immunization with highly irradiated cercariae of Schistosoma mansoni. Parasite Immunol. v.7, n.2, p. 133-52, 1985; SIMPSON, A.J. et al. The recognition of Schistosoma mansoni surface antigens by antibodies from patients infected with S. mansoni and S. haematobium. Trans R Soc Trop fwfed Hyg. v.80, n.2, p.261-70, 1986; SMITHERS, S.R. et al. Protective immunization of mice against Schistosoma mansoni with purified adult worm surface membranes. Parasite Immunol. v.11, n.4, p.301-18, 1989; SMITHERS, S.R. et al. Immunoblotting ídentifies additional antigens recognised by mice protectively vaceinated with adult Schistosoma mansoni tegumental membranes. Parasitol Res. v.78, n.5, p.454-6, 1990). Estes estudos revelaram alguns antígenos importantes reconhecidos pelo soro de animais vacinados e pacientes com a forma crônica da doença, [007] Com o avanço das técnicas de biologia molecular, vários antígenos presentes no tegumento do S. mansoni foram caracterizados, GAPDH (GOUDOT-CROZEL, V. et al, The major parasite surface antigen associated with human resístance to schistosomiasis is a 37-kD glyceraldehyde-3P-dehydrogenase. J Exp Med. v.170, n.6, p.2065-80, 1989), Sm25 (ALl, P.O. et al, Structure of Sm25, an antigenic integral membrane glycoprotein of adult Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitot. v,45, n.2, p.215-22, 1991), Sm22 (JEFFS, S.A. et al. Molecular cloning and characterisation of the 22-kilodalton adult Schistosoma mansoni antigen recognised by antibodies from mice protectively vaccinated with isolated tegumental surface membranes. Mol Biochem Parasitol. v.46, n1, p. 159-67, 1991), paramiosina (LACLETTE, J.P. et ai. Paramyosin is the Schistosoma mansoni (Trematoda) homologue of antigen B from Taenia soiium (Cestoda). Mol Biochem Parasitol. v.44, n.2. p.287-95. 1991), Sm15 (ΑΒΑΤΗ, F.G. et al. Structure of the gene encoding a putative Schistosoma mansoni tegumental antigen precursor. Mol Biochem Parasitol, v.60, n.1, p.81-91, 1993; ΑΒΑΤΗ, F.G. et al. Partial characterization and kinetics of expression of Sm 15, a Schistosoma mansoni tegumental antigen. Parasitol Res. v.80, n.1, p.64-9, 1994), Sm23 (LEE, K.W. et al. Schistosoma mansoni: characterization of the gene encoding Sm23, an integral membrane protein. Exp Parasitol. v.80, n.1, p. 155-8, 1995), actina (OLIVEIRA, G C; KEMP, W M. Cloning of two actin genes from Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol. v.75, n.1, p. 119-22, 1995), Sm10 (KOHLSTÀDT, S. et al. Characterization of a schistosome T cell-stimulating antigen (Sm 10) associated with protective immunity in humans. Mol Biochem Parasitol. v.84, n.2, p. 155-65, 1997), Sm13 (ΑΒΑΤΗ, F.G. et al. Characterization of Sm13, a tegumental antigen of Schistosoma mansoni. Parasitol Res. v.86, n.9, p.745-52, 2000), Sm16 (RAO, K.V. et al. Suppression of cutaneous inflammation by intradermal gene delivery. Gene Ther. v.9, n.1, p.38-45, 2002), Sm8 (ΑΒΑΤΗ, F.G. et al. Partial molecular characterization of Sm8, a tegumental antigen of Schistosoma mansoni. Mem Inst Oswaido Cruz. v.97, rs.1, p.91-3, 2002), Sm29 (CARDOSO, F.C. et al. Schistosoma mansoni tegument protein Sm29 is abie to induce a Th1-type of immune response and protection against parasite infection. PLoS Negl Trop Dis. v.1, n.2, e.30, 2008. doi: 10.1371 /journal.pntd.0000308), Sm-TSP-1, Sm-TSP-2 e outras proteínas menos caracterizadas (SMYTH, D. et al. Isolation of cDNAs encoding secreted and transmembrane proteins from Schistosoma mansoni by a signal sequence trap method. Infect Immun. v.71, n.5, p.2548-54, 2003) estão descritas na literatura. Importa ressaltar que muitas destas proteínas mencionadas não possuem características de proteínas associadas à membrana (ausência de hélices transmembranas e de sítios para âncoras lipídicas).

[008] As propriedades imunológícas de algumas proteínas de membrana do S. mansoni têm sido investigadas desde a última década. Koster e colaboradores (1993) caracterizaram a imunoreatividade do soro de pacientes contra o antígeno de superfície Sm23, mostrando que os títulos de anticorpos anti-Sm23 em pacientes infectados varia muito (KÕSTER, B. et al. Schistosoma mansoni: immunoreactivity of human sera with the surface antigen Sm23. Exp Parasitol. v.77. n.3, p.282-94, 1993). A Sm13 foi investigada por Abath e colaboradores (2000), onde foi verificada a presença de anticorpos antí-Sm13 no soro de pacientes esquistossomóticos (ABATH, F.G. et ai. Characterization of Sm 13, a tegumental antigen of Schistosoma mansoni, Parasitol Res. v.86, n.9, p.745-52, 2000). A Sm25 recombinante foi testada em ensaios de vacinação em camundongos por Suri e colaboradores (1997), produzindo altos títulos de anticorpos, mas sem nenhuma proteção após desafio com cercárias SURI, P.K. et al. Evaluation of recombinant protein r140, a polypeptide segment of tegumental glycoprotein Sm25, as a defined antigen vaccine against Schistosoma mansoni. Parasite Immunol. v.19, n.11,:p.15-29, 1997).

[009] Os avanços da ciência envolvendo os projetos genoma e transcriptoma, assim como estudos proteômicos têm proporcionado muitas informações importantes na identificação de antígenos para o desenvolvimento de vacinas, métodos diagnósticos e entendimento da relação parasito-hospedeiro em diversas doenças (BERRIMAN, M. et al. The gertome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Na ture. v.16, n.460, p.352-8, 2009; VERJOVSKl-ALMEIDA, S. et al. Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet. v.35, n.2, p. 148-57, 2003; HALL, S.L. et al. Insights into blood feeding by schistosomes from a proteomic analysis of worm vomítus. Mol Biochem Parasitol. v.179, n.1, p.18-29, 2011; WILSON, R.A. Proteomics at the sehistosome-mammalian host interface: any prospects for diagnostics or vaccines? Parasítology. v.139, n.9, p,1178-94, 2012). Como verificado por estes grupos, candidatos vacinais incluem proteínas que são preferencialmente secretadas ou expostas na superfície, como também expressas em estágios do parasito que infectam mamíferos. Proteínas ortólogas às toxinas, receptores para fatores do hospedeiro, moléculas envolvidas em adesão celular, proteínas de membrana ou expostas à superfície e enzimas são postuladas como sendo candidatos potenciais para o desenvolvimento de vacinas.

[010] O documento de patente US5,597,570 relata o desenvolvimento de uma vacina contra Schistosoma. Uma proteína que inclui epítopos da proteína P28, um vírus da família poxviridae contendo o gene que codifica a dita proteína, uma célula incorporando um vetor para expressão da proteína, um método para preparação da proteína, uma sequência de DNA codificadora para a proteína P28, uma composição farmacêutica, anticorpos contra a proteína e sua aplicação por diversas formas como agente de diagnóstico para esquistossomose são apresentadas no documento.

[011] O documento US5730984 descreve uma vacina contra infecção por heimintos, compreendendo a proteína Sm14 de S. mansoni. A invenção relata um material antígênico derivado de heimintos capaz de induzir resposta efetiva e proteção de longa duração contra parasitos, em particular antígenos que medeiam imunidade contra heimintos. Além disto, uma composição imunogêníca apta a conferir proteção parcial contra helmintos patogênicos, compreendendo uma soma efetiva da proteína isolada Sm 14, protegendo contra S, mansoni, também incorpora o documento de patente.

[012] O documento US5804200 refere-se à obtenção e uso de proteínas e vacinas de parasitos nematóides imunogênicos derivados de proteínas isoladas de nematóides parasitos em mamíferos, nos estágios de larva L3 e L4, incluindo uma proteína de aproximadamente 20,5 kDa. As proteínas da invenção são identificadas com uso de materiais biológicos utilizados para destruir ou prejudicar o parasito nematóide num hospedeiro, [013] O documento US6372219 tem como objeto uma proteína isolada de secreções do parasito humano S. mansoni, com funções imunomoduladora e anti-inflamatória, e. Esta proteína, designada Sm18.8, é liberada pelos parasitos ao entrarem em contato com a pele humana.

[014] Contudo, nenhum dos documentos supracitados refere-se ao antígeno recombinante SmtO.3 e seu uso como um fator imunogênico contra a esquistossomose, e/ou em kits e métodos diagnósticos para esquistossomose, como proposto na presente tecnologia.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015] Figura 1: A Figura 1 representa o perfil de expressão de Sm10.3 em diferentes fases do ciclo de vida de S. mansoni. O RT-PCR quantitativo mostra os níveis relativos de transcritos de Sm 10.3 em diferentes fases do ciclo de vida de S. mansoni (ovos, miracídio, cercária, esquistossômulo e verme adulto). Diferenças estatisticamente significativas em comparação com miractdios são indicadas por asteriscos, e diferenças estatisticamente significativas em relação aos ovos, cercária e vermes adultos são indicados por # (p< 0,05). As barras de erro indicam desvio padrão das médias íntraensaios.

[016] Figura 2: A Firgura 2 refere-se à purificação de rSm10.3. O painel A mostra o gel SDS-PAGE a 12% corado com coomassie blue. A banda de 26 kDa corresponde a rSm10,3, O painel B mostra a análise de western blot. A banda marcada representa rSm10.3 purificada, quando reconhecida por anticorpos anti-histidina.

[017J Figura 3: A Figura 3 é referente à imunolocalzação de Sm10,3 em vermes adultos de S. mansoni e em esquistossômulos. Anticorpos policlonais de camundongos anti-r$m10,3 e secundários anti-camundongo acoplados a Afexa 488 (imagem em verde) foram usados para marcar a proteína nativa Sm10.3, como mostrado em C, D, G, Η, K, L. O soro de camundongos naive foi usado como um controle negativo, mostrado em A, B, E, F, I, J. Núcleos foram corados com DAPI (imagem em azul), e fibras de actína do tecido muscular foram coradas com faloidina conjugada com rodamina (imagem em vermelho). As setas brancas indicam a localização de Sm1Q.3 nos tecidos internos dos esquistossômulos e na superfície e lúmen do esôfago e tegumento intestinal de vermes adultos.

[018] Figura 4: A figura 4 representa o perfil de soros de pacientes com esquistossomose reativos para rSm1G.3. Análise da resposta de anticorpos em soros de pacientes infectados (INF), e indivíduos não infectados (NI). As barras de erro indicam D.P, * estatisticamente significativo (p < 0,05).

[019] Figura 5: A Figura 5 descreve a vacinação com rSm10.3 que induz uma imunidade protetora em camundongos. Em A, os soros de dez animais de cada grupo de vacinação foram testados por ELISA para avaliar os níveis de anticorpos IgG específicos para rSm10,3. As setas indicam quando as três imunizações foram administradas e a infecção foi realizada. Os resultados apresentados são representativos de dois experimentos independentes. Em B, lgG1 e lgG2a foram titulados por ELISA e os seus valores foram utilizados para calcular razão de lgG1/lgG2a. As setas indicam quando as três imunizações foram administradas e a infecção foi realizada. Em € e D observa-se a carga parasitária de dois experimentos independentes de camundongos imunizados com rSm10.3 e desafiados com 5. mansoni. Em E está apresentada a redução na contagem de ovos por grama de tecido hepático em dois experimentos biológicos independentes. As barras de erro indicam o desvio padrão intra-ensaio. us asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos vacinados e o grupo controle (ps 0,05).

[020] Figura 6: A Figura 6 refere-se à análise histológica do tecido hepático de camundongos vacinados com rSm10.3. A- refere-se à amostra representativa do grupo controle de PBS. C- refere-se à amostra representativa de camundongo vacinado com rSm10.3. Em B e D observa-se as áreas de fibrose em vermelho. Em E tem-se um gráfico representativo da redução do número de granulomas nos camundongos vacinados. Em F tem-se o gráfico representativo da redução na área de granuloma em camundongos vacinados. Em G tem-se o gráfico representativo da redução na fibrose do granuloma dos camundongos vacinados. As barras de erro indicam o desvio padrão intra-ensaio. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos vacinados e o grupo controle (pl 0,05).

[021] Figura 7: A Figura 7 descreve o perfil de citocinas em camundongos imunizados com rSm10,3. A- refere-se à produção de Interferon gama (IFN-y), B à produção de Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α), C à produção de Interleucina 10 (IL-10) e D à produção de Interleucina 5 (IL-5), em resposta ao meio, rSm10.3 (25 ug/ml), Concanavatina-A (ConA) e Lipopolisacarídeos (LPS), conforme indicado. A diferença estatisticamente significativa entre as citocinas produzidas por células de baço de camundongos vacinados com rSm10.3 e o grupo controle é denotada por um asterisco (p< 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[022] A presente invenção descreve a proteína recombinante SM10.3 (SEQ ID N° 1), um método e um kit diagnóstico para detecção de esquístossomose utilizando tal proteína e uma composição vacinai contendo tal proteína e seu uso no tratamento e/ou prevenção da esquístossomose.

[023] A seleção da proteína Sm 10.3 foi feita através de análises genômicas de sequências anotadas, utilizando ferramentas de bioinformátíca e os bancos de dados do GenBank, dbEST {data base Expressed Sequences Tags), KOG (Eukaryotic Orthologous Groups) e UNIPROT (Universal Protein Resource) / GOA (Gene Ontology Anotation) como fontes de informação.

[024] Assim, uma proteína recombinante SM10.3 foi expressa em bactérias (Escherichia coh) e após a otimização das condições de expressão e purificação por cromatografia de afinidade em colunas de níquel, observou-se um bom rendimento e excelente pureza, conforme demonstrado por eletroforese em gel de poliacrilamida e western blot (Figura 2).

[025] O método proposto para diagnosticar a esquistossomose caracteriza-se por compreender as seguintes etapas; a) ligação de anticorpos anti-schistosoma de uma amostra a um ou mais polipeptídios compreendendo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID N° 1 isolada ou em combinação com outros antígenos, os quais estão ligados a um suporte sólido ou um carreador; b) adição de um anticorpo secundário ou uma proteína que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da etapa (a); c) detecção dos anticorpos anti-schistosoma na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).

[026] A enzima que está conjungada ao anticorpo secundário ou à proteína é selecionada do grupo compreendendo acetilcolinesterase, lactato dehidrogenase, β-galactosidase, glicose oxidase, fosfatase alcalina e, preferencialmente, peroxidase. Já o mar cador é selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes. Por fim, o reagente para detectar a enzima ou o marcador é selecionado do grupo compreendendo qualquer substrato cromógeno que seja reconhecido por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados, sendo preferencialmente o ortofenilenilenodiamino.

[027] As amostras utilizadas nessa metodologia são selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.

[028] A proteína recombinante definida pela SEQ 1D N° 1 pode ser utilizada em kit diagnóstico, que deve compreender: • um suporte sólido ou um carreador contendo a proteína recombinante que compreende a sequência SEQ ID N 0 1, isolada ou associada a outros antígenos; • Um anticorpo secundário ou uma proteína conjugados a uma enzima ou a um marcador; • Um reagente para detectar a enzima ou o marcador.

[029] O suporte sólido pode ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, poiipropileno e/ou poliestireno. Preferencialmente, pode consistir em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.

[030] A enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína pode ser selecionada do grupo compreendendo acetiicolinesterase, iactato dehidrogenase, ft-gatactosídase, glicose oxidase, fosfatase alcalina e/ou, preferencialmente, peroxidase. Já o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes.

[031] O reagente para detectar a enzima ou o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados, sendo preferencialmente o ortofenilenilenodiamino.

[032] A proteína recombinante SM1G.3 (que compreende a SEQ ID N° 1) pode também ser utilizada em uma composição vacinai para tratamento e/ou prevenção da esquistossomose, caracterizada por compreender, além desta proteína, adjuvantes e/ou excipientes farmacológica e farmacêuticamente aceitáveis, preferencialmente o adjuvante de Freund. A composição vacinai proposta pode ser administrada pelas vias subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, transdérmíca ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados.

[033] Estudos em pacientes residentes em áreas endêmicas para a esquistossomose mostraram bons resultados da presente tecnologia no desenvolvimento de um kit diagnóstico por ELISA (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay).

[034] A presente invenção pode ser melhor compreendida pelos exemplos abaixo, de forma não limitante. EXEMPLO 1 - SELEÇÃO DA PROTEÍNA SM10.3 [035] A seleção da proteína Sm10.3 foi feita através de análises genômicas de sequências anotadas, com ferramentas de bioinformática, com acesso aos bancos de dados do GenBank, dbEST (data base Expressed Sequences Tags), KOG (Eukaryotic Orthologous Groups) e UNIPROT (Universal Protein Resource) / GOA (Gene Ontology Anotation) como fontes de informação. Foi selecionada a proteína Sm 10.3, cuja sequencia de aminoácidos está registrada com o número de acesso AAA29855.1 no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/160931), representada pela SEG ID N°1.

[036] A identificação empírica de regiões ou domínios típicos de proteínas de membrana, secretadas ou citosólícas é de grande importância para um estudo mais próximo da estrutura e funções reais dos antígenos selecionados. No caso das proteínas de membrana, a presença de peptídeo sinal, sítios de âncora GPI, região transmembrana e sítios de glicosilação são características muito importantes para sua identificação. A procura de domínios conservados nestas proteínas também é capaz de revelar características para a determinação da função e importância biológica de antígenos peptídicos.

[037] Nesse sentido, foram realizadas análises da estrutura primária de aminoácidos da SM10.3 utilizando o ExPASy (Expert Protein Analysis System), sendo este um sítio público de programas de bioinformática com acesso livre (GASTEIGER, E. et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. v.1, n.31, p.3784-8, 2003). A presença do peptideo sinal (sequência de exportação para o meio extraceiular) foi identificada através do programa SignalP 3.0 (BENDTSEN, J.D. et al. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol. v.16, n.4, p.783-95, 2004; NIELSEN, H. et al. A neurai network method for Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. In! J Neurai Syst. v.8, n.5, p.581-99, 1997). A presença de hélices transmembranas e sítios de âncora GPI (Glicosilfosfatidilinísotol) foi analisada utilizando os programas TMHMM e DGPI (KROGH, A. et al. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model. application to complete genomes. J Mol Biol. v.19, n.3, p.567-80, 2001), nesta ordem. Potenciais sítios de 0-glÍcosiiação e N-glicosiiação foram identificados através do YinOYang (disponível em; <www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang>) e NetNGIyc 1.0 (disponível em: <http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIyc/>), respectivamente. Finalmente, o programa SYFPEITHI foi usado na predição de epitopos de ligação ao MHC (Major Histocompatibiíity Complex) de Classe II humano, ou HLA (Human Leukocyte Antigen) (RAMMENSEE, H. et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics. v.50, n.3, p.213-9, 1999).

Observou-se que o antigeno SM10.3 apresenta peptideo sinal N-terminal de 22 aminoácidos (MGSPLDDRFNDVNTINKKQFTE) e 3 potenciais sítios de O-glicosilação (S26, T82 e S204).

[038] As análises de transcrição da Sm10.3 nos estágios do parasito mostram que esta é expressa em todas as fases que estão em contato com o hospedeiro mamífero, príndpalmente em esquistossômulos de fase pulmonar (Figura 1).

[039J Desta forma, bloqueando-se a atividade deste antígeno, seria possível combater a esquistossomose em fases recentes da infecção causadas pelo esquistossômulo, não permitindo o desenvolvimento de formas mais severas da doença.

EXEMPLO 2 - PRODUÇÃO DA PROTEÍNA SM10.3 RECOMBINANTE

[040] A obtenção de proteína recombinante foi realizada em sistema procarioto, podendo ser utilizado qualquer outro sistema de expressão recombinante, procarioto ou eucarioto, capaz de produzir a proteína recombinante em questão. Para obtenção da proteína SM10.3, o fragmento do cDNA correspondente à região 24 - 283 da sequência de aminoácidos da proteína foi subclonado no vetor de expressão pET21a, que expressa a proteína recombinante com uma fusão C-terminal de seis histidínas, em E. coii. Para tanto, foi feita uma PCR (reação em cadeia da polimerase) que amplifica o fragmento da SM 10.3 desejado utilizando iniciadores específicos para as extremidades do fragmento (forward 5'-GT CGACGGAAGT CCACTT GACGATCGATT C-3’ e reverso 5’- GGATCCTATTGATTTGTCGTAATAGTATTT-3’). A subclonagem no vetor de expressão e a confirmação da sequência de DNA foram feitas de acordo com Sambrook e colaboradores (SAMBROOK, J. et al. Molecular Cioning: A Laboratory Manual. Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Nova York, 1989).

[041] Para indução da expressão da SM10.3, 1 litro de cultura contendo meio LB e bactéria BL21(DE3) com o plasmídeo recombinante foi crescido à 37°C até a ODeoo de 0.5 - 0.8. Após atingir OD6oo desejada, a cultura foi induzida com IPTG durante 5 horas. Posteriormente, as células foram coletadas por centrifugação e ressuspendidas em tampão de lise. As células foram lisadas por sonicação e a SM 10.3 recombinante contida nos corpos de inclusão foi ressupendida em tampão desnaturante (12,5 mM Na2HP04, 12,5 mM de NahhPO^ 0,5 M NaCI, 40 mM imidazol, 8M uréia).

[042] A purificação da SM10.3 recombinante foi feita em sistema de afinidade para cauda de seis histidinas em cromatografia de coluna de niquel sob condição desnaturante, podendo ser usado qualquer outro sistema de purificação capaz de purificar a SM10.3 recombinante. Primeiramente, a coluna de níquel foi equilibrada com o tampão desnaturante citado anteriormente seguida da solução contendo a proteína recombinante. Após lavagem da coluna com tampão de ligação para eliminação de contaminantes, a proteína recombinante foi desligada da coluna com tampão de eluição, A dessalinizaçio da SM 10.3 purificada foi realizada em coluna de gel filtração, podendo ser usado qualquer outro método de dessalinização que seja capaz de trocar o tampão de eluição por um tampão fisiológico. Para tal, a coluna de gel filtração foi equilibrada com tampão fisiológico, seguida da proteína purificada.

[043] Portanto, a proteína recombinante SM10.3 foi expressa em bactérias (Escherichia coti) e após a otimização das condições de expressão e purificação por cromatografia de afinidade em colunas de níquel, observou-se um bom rendimento e excelente pureza como demonstrado por eletroforese em gel de poliacrilamida e western blot (Figura 2).

EXEMPLO 3 - DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE DIAGNÓSTICO PARA ESQUISTOSSOMOSE UTILIZANDO A PROTEÍNA RECOMBINANTE SM10.3 E O MÉTODO ELISA

[044] Para avaliar a ocorrência de infecção por Schistosoma mansoni, a presente invenção contempla, ainda, a produção de um kit diagnóstico, consistindo numa metodologia de detecção de anticorpos IgG específicos contra a SM10.3 no soro de pacientes sintomáticos para a esquistossomose utilizando a técnica de ELISA (Enzyme-Unked Inmunosortoent Assay). Estes pacientes residem em áreas endêmicas para a esquistossomose. O kit é composto de placa de microtitulação de 96 poços ou qualquer outro suporte sólido como tubos, esferas, papéis de nitrocelulose ou nylon; tampão de bloqueio com 10% soro fetal bovino ou qualquer outra solução com proteínas que não interfiram na reação antígeno-anticorpo; tampão carbonato bicarbonato pH 9,6 ou qualquer outro tampão ou método que permita a adsorção da SM 10,3 em suporte sólido; SM 10,3 recombinante purificada e dessaiinizada; soro teste e soro controle diluídos 1:50 em tampão-tween podendo ser usado qualquer tampão em pH fisiológico para diluição; anti-immunoglobulína humana conjugada à peroxidase ou qualquer outro conjugado que tenha especificidade para imunoglobulinas humanas e use outras enzimas, como acetilcolinesterase, lactato dehidrogenase, β-galactosidase, glicose oxidase e fosfatase alcalina; substrato ortofenilenilenodiamino ou qualquer outro substrato cromógeno que seja reconhecido pela enzima usada no conjugado; ácido sulfúrico ou qualquer outra solução que paralise a reação, A leitura dos resultados é feita em espectrofotômetro ou qualquer outro instrumento capaz de medir a intensidade da cor gerada pela reação enzimática.

[045] O ensaio imunoenzímático com o kit proposto foi realizado em 7 fases. Na fase 1, as placas de microtitulaçáo de 96 poços foram adsorvtdas por 16h à 4°C com 100 μΐ de SM 10.3 recombinante numa concentração de 5 pg/mL em tampão 0.1 M carbonato bicarbonato (pH 9.6) por poço.

[046] Na fase 2, o sobrenadante foi desprezado e as placas bloqueadas com 10% de soro fetal bovino em PBS (pH 7.4) por 2 h à temperatura ambiente. Após bloqueio, na fase 3, as placas foram lavadas 3x com PBS adicionado de 0,05% tween20 (PBST) e após secagem, os soros diluídos (1:50) foram adicionados em duplicata, 100 μ!_ por poço, e incubados por 1 h à temperatura ambiente. Após incubação, na fase 4, as placas foram lavadas 3x com PBST e foram adicionados 100 pLpor poço de anticorpo de camundongo antí-lgG humano conjugado à peroxidase na concentração de 1:10.000, seguido por uma incubação de 1 hora a 37°C.

[047] Após incubação, na fase 5, as placas foram lavadas e reveladas com ortofenilenilenodiamino (OPD) acrescido de 0.05% peróxido de hidrogênio em tampão citrato 0,1M pH 5. A revelação foi interrompida na fase 6, com 5 % H2S04 apôs 30 min de incubação. A leitura do teste ocorreu na fase 7, à 492 nm.

[048] Utilizando-se esta técnica, verificou-se aita produção de anticorpos do isotipo IgG específicos para a SM 10.3 recombinante em pacientes esquistossomóticos (diagnosticados por 3 exames de Kato-Katz), comparados a indivíduos saudáveis sem histórico da doença, o que permite diferenciar entre indivíduos doentes e indivíduos saudáveis (Figura 4).

[049] Estudos em pacientes residentes em áreas endêmicas para a esquistossomose mostraram bons resultados da presente tecnologia no desenvolvimento de um kit diagnóstico por ELISA (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay).

EXEMPLO 4 -M ÉTODO DE IMUNIZAÇÃO E ENSAIOS PRÉ-CLÍNICOS DE VACINAÇÃO EM ANIMAIS EXPERIMENTAIS

[050] A metodologia usada para a vacinação de animais (neste caso, camundongos da linhagem C57BL/6 entre 6 e 8 semanas de idade), que utiliza a SM10.3 recombinante e adjuvante de Freund completo e incompleto, foi feita em quatro fases e em dois experimentos biológicos independentes, aplicando três doses em intervalos de 15 dias, seguido do desafio dos animais ao final da quarta etapa (45 dias). O objetivo é manter uma elevada produção de anticorpos específicos e ativar o sistema imunológico celular, garantindo a formação da memória imunológica. Contudo, esta metodologia também pode ser realizada com outra quantidade qualquer de doses, desde que e stas sejam suficientes para manter uma elevada estimulação.

[051] A primeira fase consistiu no preparo da composição vacinai para imunização, compreendendo 10-50 pg de proteína SM 10.3, adjuvante de Freund completo e excipiente adequado (tampão fosfato salina). Na segunda fase, 15 dias após a primeira dose, procedeu-se a aplicação da segunda dose desta vacina compreendendo 10-50 μ§ de proteína SM10.3, adjuvante de Freund incompleto e excipiente adequado (tampão fosfato salina). Na terceira fase, 30 dias após a primeira dose, procedeu-se a aplicação da segunda dose de reforço da vacina contendo 10-50 μ§ de proteína SM10.3 , adjuvante de Fre-und incompleto e excipiente adequado (tampão fosfato salina). Após 45 dias da primeira dose, procedeu-se o desafio dos animais vacinados e grupo controle, o qual foi vacinado apenas com adjuvantes e excipiente, com 100 cercarias de Schistosoma mansoni.

[052] A composição vacinai contendoSM10.3 foi administrada via subcutânea, porém, pode ser administrada por qualquer outra via capaz de induzir a produção de anticorpos e uma resposta celular específicos para a SM10.3. O adjuvante de Freund associado a SM10.3 é utilizado para potencializar a formação da resposta imunológica humorai e celular, sendo que este pode ser substituído por qualquer outro adjuvante capaz de ativar a formação de uma resposta imunológica humorai e celular satisfatória.

[053] Os dois ensaios pré-clínicos independentes revelaram a produção de altos níveis de anticorpos IgG totais, lgG1 e lgG2a específicos contra a SM10.3, além de uma redução do número de vermes adultos em torno de 32% e 25,5% em animais vacinados com a SM1G.3 comparados ao grupo controle com animais não-vacínados (Figura 5). Observa-se também uma redução de 43,6% e 32,9% na ovoposição em animais vacinados com a SM10.3 (Figura 5E) e uma redução no número de granulomas presentes no fígado em tomo de 23,8% e 39,8% de redução na fibrose destes granulomas em animais vacinados com a SM10.3 (Figura 6). Os resultados apresentados referem-se ao primeiro e segundo ensaio biológico e a comparação estatística foi feita em relação aos dados do grupo controle.

[054] Ensaios de imunolocalização utilizando soros purificados de animais experimentais vacinados com a SM10.3 recombinante e antes do desafio com S, mansoni, mostraram que esta proteína está presente no epitélio e luz intestinal do verme adulto, assim como em estruturas internas do esquistossômulo de fase pulmonar do S. mansoni (Figura 3). Desta forma, o sistema imune pode reconhecer facilmente este antígeno e desencadear uma resposta imune efetora no combate ao parasito, eliminando os vermes adultos e diminuindo as possibilidades de reprodução e eliminação de ovos. Estes resultados indicam o potencial da proteína SM 10.3 na produção de uma vacina contra esquistossomose.

EXEMPLO 5 - AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE CELULAR DE ANIMAIS IMUNIZADOS COM A COMPOSIÇÃO VACINAL CONTENDO SM10.3 RECOMBINANTE

[055] Ao final da terceira fase de imunizações e antes do desafio dos animais com S. mansoni foram extraídas células do baço de alguns animais de cada grupo experimental para avaliação da resposta imunológica celular. A produção de citocinas pela cultura de esplenócitos de animais imunizados foi avaliada com os estímulos, rSm10.3 ou controles positivos Concanavalina-A (ConA) ou Lipopolisacarídeos (LPS). Após as imunizações, altos níveis de Interferon gama (IFN-γ) (733,G7±56,18 pg/mt) e Fator de Necrose Tecidual alfa (TNF-a) (780,5±100,62 pg/mL) foram detectados nos sobrenadantes de células de animais imunizados com a composição vacinai contendo rSm10,3 e estimuladas com essa proteína em comparação com células de animais imunizados com PBS (Figura 7). O estimulo com rSm10.3 induziu o aumento de Interleucina 5 (IL-5) (81,97±8,22 pg/mL) nas células de animais imunizados com a composição vacinai em relação ao controle (Figura 7). Estes resultados indicam que rSm10.3 promove o desenvolvimento de um perfil de resposta misto Th1/Th2 em células T de camundongos imunizados com a composição vacinai. Quanto aos níveis de Interleucina 10 (IL-10) avaliados, verificou-se que a proteína composição vacinai induz níveis elevados de Interleucina 10 (IL-10), quando comparado com o grupo controle em experimento realizado após a terceira imunização com a composição vacinai (997,09±272,07 pg/mL) e PBS (92,351+15,049 pg/mL) (Figura 7).

REINVIDICAÇÕES

Claims (15)

1. Proteína recombinante caracterizada por compreender a SEQ ÍD N° 1.

2. Método para diagnóstico de esquistossomose caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) ligação de anticorpos anti-schistosoma de uma amostra a um ou mais polipeptidios compreendendo a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID N° 1 isolada ou em combinação com outros antígenos, os quais estão ligados a um suporte sólido ou um carreador; b) adição de um anticorpo secundário ou uma proteína que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da etapa (a); c) detecção dos anticorpos anti-schistosoma na amostra citada na etapa (a) utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).

3. Método para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 2, etapa “a”, caracterizado petas amostras serem seiecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.

4. Método para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 2, etapa “b”, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo acetilcolinesterase, lactato dehidrogenase, β-galactosidase, glicose oxidase, fosfatase alcalina e, preferencialmente, peroxidase.

5. Método para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 2, etapa “b’\ caracterizado pelo marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimiolumínescentes.

6. Método para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 2, etapa “c”, caracterizado pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos antischistosoma ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas da reivindicação 4 ou algum dos marcadores da reivindicação 5, preferencialmente o ortofenilenilenodiamino.

7. Kit para diagnóstico da esquistossomose caracterizado por compreender: a) um suporte sólido ou um carreador contendo a proteína recombinante que compreende aa sequência SEQ ID N° 1 isolada ou associada a outros antígenos; b) um anticorpo secundário ou uma proteína conjugados a uma enzima ou a um marcador, c) um reagente para detectar a enzima ou o marcador.

8. Kit para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 7, item a, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou polistíreno.

9. Kit para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 7, item a, e reivindicação 8, caracterizado pelo suporte sólido consistir preferencialmente em placas de microtítulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.

10. Kit para diagnóstico de esquistossomose, de acordo com a reivindicação 7, «tens b e c, caracterizado pelas enzimas, marcadores e reagentes serem selecionados dos grupos descritos nas reivindicações 4, 5 e 6.

11. Composição vacinai contra esquistossomose, caracterizada por compreender a proteína recombinante definida na SEQ ID N° 1, e adjuvantes e/ou excipientes farmacológica e farmacêutícamente aceitáveis.

12. Composição vacinai contra esquistossomose, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo adjuvante ser preferencialmente adjuvante de Freund.

13. Composição vacinai contra esquistossomose, de acordo com as reivindicações 11, caracterizada por poder ser administrada pelas vias subcutânea, intramuscular, íntravenosa, intraperitoneal. transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados.

14. Uso da proteína recombinante definida na reivindicação 1, caracterizado por ser na preparação de kit diagnóstico e/ou de composições vacinais contra esquistossomose.

15. Uso da composição vacinai definida na reivindicação 11, caracterizado por ser no tratamento e/ou na prevenção da esquistossomose.