WO2015029002A1 - Gene modificado de leishmania ssp., processo para obtenção de proteína e uso como antígeno em composição vacinal ou em imunodiagnóstico - Google Patents

Gene modificado de leishmania ssp., processo para obtenção de proteína e uso como antígeno em composição vacinal ou em imunodiagnóstico Download PDF

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gene
vaccine
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Ana Paula Salles Moura Fernandes
Ricardo Tostes Gazzinelli
Leonardo MIRANDA DAMASCENO
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Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
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    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/008—Leishmania antigens

Definitions

  • the present invention describes a nucleotide sequence resulting from the modification and reduction of the gene encoding Leishmania protein A2, as well as its process of obtaining and its uses and a vaccine composition containing the protein obtained from this modified gene.
  • the modifications introduced allow the more efficient execution of molecular biology techniques, such as PCR, cloning and heterologous expression, as well as the expression of A2HIS-OZ protein in prokaryotic cells with higher yield. These aspects are especially interesting for quality control and protein production on an industrial scale.
  • the A2HIS-OZ protein obtained from this modified gene may be used as a vaccine antigen in the prevention of canine or human leishmaniasis or as an antigen for visceral leishmaniasis immunodiagnosis.
  • Leishmaniasis are endemic parasitic diseases in about 88 countries, of which 72 are developing countries. They are caused by a variety of protozoan species belonging to the genus Leishmania and are clinically presented as cutaneous, mucocutaneous, or visceral infection (World Health Organization. Program for surveillance and control of leishmaniasis. Access: ⁇ http: / /who.int/emc/diseases/leish/index.html 2005>). Alterations in spleen, liver and bone marrow function are observed in infected patients, and infection may become chronic and cause long-term irregular fever, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, anemia, leukopenia, edema, progressive weakness and weight loss.
  • Infected individuals may also remain asymptomatic, although about 20% of individuals in endemic regions develop the classic form of the disease (SUNDAR, S.; RAI, M. Laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis. Archive of Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 9, no. 5, 2002).
  • Infected dogs even asymptomatic, have a large amount of parasites in the skin, which favors the infection of the vector insect from this reservoir and, consequently, the transmission to humans (TESH, R. Control of Zoonotic Visceral Leishmaniasis: Is It Time to Change Strategies - The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 52, pp. 287-292, 1995).
  • CVL canine visceral leishmaniasis
  • CVL canine visceral leishmaniasis
  • Treatment is costly and often treated and clinically healed dogs relapse, remaining sources of infection for the vector, and increase the risk of selection of strains resistant to such drugs, with serious implications for human treatment (GRAMICCIA , M.; GRADONI, L. The Current Status of Zoonotic Leishmaniases and Approaches to Disease Control, International Journal for Parasitology, v. 35, pp. 169-180, 2005).
  • Leishmune ® uses as a vaccine active a purified antigenic complex, including proteins, which corresponds to the Fucose-Manose Ligand (FML) complex present on the parasite surface (Federal University of Rio de Janeiro.
  • FML Fucose-Manose Ligand
  • composition containing fractions of leishmania cells FML antigen "fucose mannose ligand” or “fucose mannose ligand”, use of the FML antigen and its subfractions and components for the specific immunodiagnosis applications of human and animal visceral leishmaniasis, for vaccination, treatment or immunotherapy applications canine and human visceral leishmaniasis (BR No. PI 9302386-3 A, 17 June 1993).
  • the disadvantage of this product is that once vaccinated with it, the animal will develop heavy response by specific antibodies against the parasite, making it seropositive. Thus, the serological diagnosis will indicate the infection (false positive) and the vaccinated dogs should be sacrificed.
  • the A2 antigen was initially identified in Leishmania (Leishmania) donovani, by Charest & Matlashewski (1994), from a cDNA library of amastigote forms of this species. Multiple copies of the A2 gene are clustered on chromosome 22 (850 kb) of L. (L.) donovani, and these genes are also conserved in the species L. (L.) infantum, L. (L.) chagasi, L. (L.) amazonensis and L. (L.) mexicana (CHAREST, H.; MATLASHEWSKI, G. Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene.
  • the A2 protein is composed of a ten amino acid sequence, repeated 40 to 90 times, depending on the "A2 family" gene that encodes it (CHAREST, H .; MATLASHEWSKI, G. Developmental expression gene in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene Molecular and Cellular Biology, v. 14, no. 5, pp. 2975-2984, 1994; ZHANG et al Identification and overexpression of the amastigote-specific A2 protein in Leishmania donovani. and Biochemical Parasitology, v. 78, pp. 79-90, 1996).
  • the Leish-Tec ® vaccine was developed against canine leishmaniasis and its vaccine formulation is composed of recombinant protein A2, produced in Escherichia coli, and associated with adjuvants, such as saponin (Federal University of Minas Gerais. Process for recombinant vaccine against visceral leishmaniasis). canine containing the recombinant antigen A2 and allowing serological distinction between vaccinated animals from infected animals (BR No. PI 0603490-0 A, 21 July 2006).
  • WO02 / 078735 entitled “Leishmania vaccines” describes a DNA vaccine that triggers an immune response against Leishmania donovani infection. This vaccine is based on a vector containing an A2 gene nucleotide sequence in addition to a sequence encoding the human papillomavirus E6 gene.
  • the present invention describes a nucleotide sequence obtained from modifications made to the gene encoding the Leishmania A2 protein.
  • this new sequence differs from all others found in the state of the art and cited above, it allows for more efficient accomplishment of molecular biology techniques such as PCR and cloning, and the higher yield heterologous expression of A2HIS protein in prokaryotic cells. . Therefore, the present invention differs from all that has been mentioned and found in the state of the art.
  • Figure 1 is a schematic representation of the pET-A2HIS-OZ expression plasmid map constructed from the insertion of the modified A2HIS gene into the pET9a24a expression vector. Caption: T7 Promoter - T7 expression promoter; RBS - ribosomal binding site; MCS - multiple cloning site; T7 Transcription termination; F1 ORI - origin of replication F1; KN (R) - kanamycin resistance coding gene; pBR322 Ori - E. coli origin of replication.
  • Figure 2 is an immunodetection assay analyzing fermentor expression of A2HIS-OZ protein using anti-6xHIS antibody. Caption: KDa - kilo Daltons; M - molecular marker; S - soluble fraction; I - insoluble fraction; The numbers correspond to the induction time with IPTG. The arrow indicates A2HIS position.
  • Figure 3 is an image of the result of A2HIS-OZ protein purification after electrophoresis (SDS-PAGE, 12% gel and coomassie stained). The arrow indicates the position of A2HIS-OZ. Caption: KDa - kilo Daltons; M - molecular marker; 1 - total protein before purification; 2 - Flow through the nickel chelate column; 3 - fraction of elution of A2HIS-OZ protein from nickel chelate column; 4 - fraction of elution of A2H IS-OZ protein after dialysis for next step of purification on anionic resin column; 5 - fraction of elution of A2HIS-OZ protein from anionic resin column.
  • Figure 4 is the image of the A2HIS-OZ protein stability test result after electrophoresis (SDS-PAGE, 12% gel and coomassie stained). The arrow indicates A2HIS-OZ position. KDa - kilo Daltons; M - molecular marker; 1 - 500 ng A2HIS (standard); 2 - 500 ng A2HIS-OZ after storage at 4 ° C in aqueous solution for three months.
  • Figure 5 shows the test in which A2HIS-OZ protein was electrophoresed (SDS-PAGE, 12% gel) and transferred to nitrocellulose membrane. The protein was reacted with sera from dogs vaccinated with the Leish-Tec ® vaccine, which contains the original A2HIS protein, or placebo or anti-A2 monoclonal antibody.
  • Figure 6 shows the result of western blot analysis of A2HIS-OZ protein employing pooling of human sera from symptomatic VL patients (channel 2) or from uninfected control subjects (channel 1).
  • Figure 7 shows graphs of ELISA-determined anti-A2 antibody levels following vaccination of BALB / c mice with the A2HIS protein associated with Alum + CpG or MPLA adjuvants.
  • Figure 10 shows graph representing the results of IFN-gamma production by splenocytes of mice receiving PBS (G1); A2HIS-OZ (G2); ALUM + MPL + 10 ⁇ g A2HIS-OZ (G3); ALUM + MPL (G4); ALUM + MPL + ⁇ 0 ⁇ Q original rA2HIS (G5); and original ALUM + MPL + 50 ⁇ g rA2HIS (G6).
  • the present invention describes a nucleotide sequence resulting from the modification and reduction of the gene encoding the Leishmania A2 protein, as well as its method of obtaining and its uses and a vaccine composition containing the protein obtained from this modified gene.
  • the modifications introduced facilitate molecular manipulation and enable the most efficient execution of molecular biology techniques such as PCR and cloning. These techniques are very important in the steps of quality control and traceability of seed lots and stocks in industrial scale production.
  • the modifications increase gene stability during heterologous expression by fermentation in prokaryotic cells.
  • A2HIS-OZ the coding sequence was optimized DNA (SEQ ID NO: 1 Q) for better expression in E. coli, and in vitro synthesized. Optimization consisted of replacing codons that are more commonly used by bacteria than by eukaryotic organisms, thus finding greater abundance of carrier RNAs for protein translation into bacteria (Table 1).
  • Table 1 Relationship between codons and their respective amino acids in the original molecule and the synthesized molecule.
  • TCC Serine TCC TCC, AGT, TCT, AGC, TCA
  • each amino acid is encoded by a smaller number of codons compared to the synthetic molecule.
  • the proline amino acid is encoded only by the CCG codon in the original sequence; therefore it was replaced alternately by codons CCT, CCA and CCG, which encode this same amino acid in the optimized sequence.
  • Another example refers to the alternation between TCC, AGT, TCT, AGC, TCA codons for serine in the optimized molecule, whereas only TCC, TCT codons are found in the original molecule (Table 1).
  • the A2HIS-OZ protein obtained from this modified gene is approximately 24 KDa, ie its size is reduced from the original.
  • the amino acid sequence vgpqsvgpls / vgplsvgpqs repeats several times and is encoded by more than 20 repeats of the "gttggcccgcagtccgtcggcccgctctct" nucleotide sequence, which shows little variation, as shown in Table 2.
  • this nucleotide sequence is used in this nucleotide sequence. few synonymous codons for each of the amino acids present, as shown in Table 1.
  • Another modification consists of a coding sequence of six histidine residues (histidine tail) that has been added in the C-terminal region, upstream to the stop codon, to facilitate initial antigen purification.
  • Table 2 Comparison between repeats encoding amino acid sequence vgpqsvgpls / vgplsvgpqs in the original sequence and in the optimized sequence.
  • the reduced size of A2HIS-OZ protein obtained from this optimized sequence has the advantage of lower exposure to the action of proteases present in the recombinant host.
  • the protein has physicochemical properties that facilitate its purification and thus its obtaining in a high degree of purity and increase its stability in solution.
  • A2HIS-OZ may be used as a vaccine antigen in the prevention of canine leishmaniasis and as an antigen for immunodiagnosis of leishmaniasis.
  • the process for obtaining A2HIS-OZ basically consists of transforming a bacterium with an expression vector into which the modified gene has been inserted (SEQ ID NQ 1), inducing protein expression and purifying it.
  • the protein obtained may be used for immunodiagnosis and prophylaxis of leishmaniasis.
  • A2HIS-OZ protein coding synthetic sequence (SEQ ID NO: 1 Q) was inserted between sites Nde ⁇ and Not ⁇ pET9a24a the vector expression.
  • 1 ⁇ g of plasmid pUC57 was linearized with Notle Nde ⁇ enzyme and subjected to agarose gel purification.
  • the purified fragment was ligated to the pET9a24a vector, linearized with the same enzymes and purified the same way at 4 ° C overnight with the enzyme T4 DNA Ligase.
  • the Escher ⁇ chia coli C41 (DE3) strain was transformed with the expression plasmid obtained ( Figure 1).
  • 50 ⁇ _ of a chemocompetent E. coli C41 culture was transformed with 2 ⁇ _ of the ligation system containing the plasmid of Figure 1.
  • the cultures were subjected to 1 minute heat shock at 42 ⁇ °. C and returned to the ice bath for 2 minutes. They were then plated on Luria Bertani Agar (LB) containing 5C / g / ml ampicillin for selection of resistant cells. Selected colonies had the plasmid extracted using a commercial kit and subjected to digestion testing with the enzymes used for cloning for insert release.
  • Sequencing of the plasmid expression region confirmed the insertion and correct identity of the A2HIS-OZ coding sequence.
  • E. coli C41 (DE3) clones containing pET-A2HIS were subjected to small (erlenmeyer 250ml_) and medium (2L fermenter) expression experiments.
  • a bottle containing 700 mL of fermentation medium (FeSO4.7H2O - 0.08g, sodium hexametaphosphate - 2.4g, ammonium chloride - 1, 68g, citric acid monohydrate - 1,38g, 30% ammonium hydroxide 1,6ml_, yeast extract - 12g, MgSO4.7H 2 O - 0.64g, 0.1M MnCl2.4H 2 O- 8 ⁇ _ and deionized water qsp 700ml_) plus 500 ⁇ _ Antifoam 204, one bottle of sterile glucose solution (16% w / v), one bottle containing 80ml_ of inoculation medium (FeSO4.7H2O - 0.1 g / L, sodium hexametaphosphate - 3 , 0g / l, ammonium chloride 2.1g / l, citric acid monohydrate - 1.73g / l
  • glucose concentrate Glucose - 550.0g / L, FeSO4.7H 2 O - 0.2g / L, MgSO4.7H 2 O - 21.0g / L, Desodium citrate.2H 2 O - 5.2g / L, 0.1M MnCl2.4H2O - 24.2% v / v, 6.0g / L am
  • Expression of recombinant A2HIS protein in the fermenter was obtained after induction of bacterial culture with IPTG (isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside) at a final concentration of 0.6 to 1 mM. In this step, the temperature is reduced to 30-32 ° C and the pH controlled to 6.80-6.90 by the addition of glucose concentrate. The fermentation is completed with the full use of glucose concentrate.
  • IPTG isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside
  • the fermenter culture was cold centrifuged and the supernatant discarded.
  • Cells were resuspended in lysis buffer (50 mM Tris-CI pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) in a ratio of 10 mL buffer to each wet gram of biomass. Then the cell suspension was homogenized three times.
  • the homogenate was cold centrifuged and the supernatant discarded.
  • the pellet was resuspended in wash buffer (100 mM Sodium Phosphate pH 7.2, 0.5 M NaCl, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100) at a ratio of 10mL / gram pellet.
  • wash buffer 100 mM Sodium Phosphate pH 7.2, 0.5 M NaCl, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.5% Triton X-100
  • the resulting pellet was resuspended in binding buffer (20 mM Sodium Phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5 mM Imidazole, 8 M Urea) in a ratio of 10 mL / gram pellet. This suspension was mixed at room temperature for 1-2 hours. The suspension was cold centrifuged, the resulting pellet discarded and the supernatant collected for purification.
  • binding buffer (20 mM Sodium Phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5 mM Imidazole, 8 M Urea
  • Table 3 Comparison of physicochemical parameters of rA2 and A2HIS.
  • Example 2 Purification was performed in two steps. In the first, due to the presence of the histidine tail present in the C-terminal portion of the A2HIS-OZ protein, it was initially purified using chelated nickel resin in liquid chromatography. This allowed to remove most of the proteins from E. coli. The final supernatant obtained in Example 2 was injected into a column containing chelated nickel resin and at a constant flow equal to half of the maximum flow allowed by the column. After complete injection of the sample, the column was washed with three (3) column volumes of binding buffer (20 mM Sodium Phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5 mM Imidazole, 8 M Urea). a constant flow equal to the maximum allowed by the column.
  • binding buffer (20 mM Sodium Phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl, 5 mM Imidazole, 8 M Urea).
  • the elution buffer (20 mM Sodium phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.5 M Imidazole, 8 M Urea) was injected into the column and the fraction containing A2HIS-OZ antigen (peak absorbance at 280 nm) was collected.
  • anion exchange resin liquid chromatography was performed and the process optimized.
  • the A2HIS-OZ antigen-containing fraction from the first purification step was diafiltered using running buffer (50 mM Tris-CI pH 8.0, 4 M Urea). The sample was injected into the column containing anion exchange resin. Because the A2HIS-OZ protein obtained has an isoelectric point at pH 8.5 and the buffer has a pH around 8.0, it does not interact with the column and the remaining contaminant proteins from the first purification step bind to the resin. anion exchange. Therefore, A2HIS is found in flow through, which is the fraction that does not interact with the resin.
  • A2HIS-OZ protein obtained from the modified gene (SEQ ID NO : Q 1) described in Example 1 was tested by assessing reactivity of antibodies induced by vaccination of dogs with Leish-Tec ® vaccine. Serum samples from dogs receiving three doses of the vaccine were pooled for western blot analysis.
  • the recombinant A2HIS-OZ protein 250-500 ng was subjected to 12% SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), applying a voltage of 80V for sample stacking and 120V for resolution.
  • the electrophoretic profile was transferred in an ice bath to a transfer buffer nitrocellulose membrane (25mM Tris Base; 192mM Glycine; Methanol 20%), applying 300mA current for 2 hours.
  • the post-transfer membrane was incubated in blocking buffer (5% milk powder; 0.01% Tween 20) for 2 hours. After 3 wash steps with 0.05% PBS Tween, the membrane was incubated either with the diluted dog sera pool (1: 100) or with anti-A2 monoclonal antibody diluted in blocking buffer (1: 2000).
  • the membrane was incubated with either dog anti-IgG or mouse anti-IgG antibody, both coupled to human peroxidase (HRP) in 1: 2000 dilution for 1 hour.
  • HRP human peroxidase
  • the membrane was wrapped in plastic material, where a solution was applied.
  • Enhanced Chemiluminescense (ECL) revealing, letting it act for 5 minutes in the absence of light. After exposure of the photographic film, even in the absence of light, it was revealed in a revealing solution as directed by the manufacturer (Carvalho et al., 2002, Diag. Microbiol. Inf. Dis. V. 43, 2002).
  • A2HIS-OZ protein is specifically recognized by sera from dogs vaccinated with the original A2HIS, since both proteins have the same amino acid sequence, which is recognized by antibodies from vaccinated dogs. Therefore, sera from dogs vaccinated with the vaccine, which contains the original A2 recombinant protein, cross-reacted with the A2HIS-OZ protein, indicating that it retains the antigenic properties associated with the former.
  • mice Female 6-8 week-old BALB / c mice were vaccinated with recombinant protein associated with different adjuvants. For this test, the mice were separated into 3 groups of 10 animals: in group 1 100 ⁇ _ of sterile PBS1 X were applied; in group 2, 10-20 ⁇ g A2HIS-OZ protein, 30% v / v alum and 18 ⁇ g CpG were administered; In group 3, 10-20 ⁇ g of protein A2 HIS-OZ and 1 -2 ⁇ g of MPLA (monophosphoryl lipid A) were applied. The 3 groups were inoculated subcutaneously in the back. After 30 days, all animals received a new homologous dose by the same route. b.1) Evaluation of humoral response
  • Humoral response was assessed by ELISA to determine induction of anti-A2 antibodies by vaccination.
  • 4 animals from each group were bled by orbital plexus and the blood was centrifuged for serum extraction, which was used for ELISA IgG in quadruplicate.
  • 96-well plates were sensitized with A2HIS-OZ protein (1 ⁇ g / ml) diluted in carbonate buffer (0.1 M; pH 9.6).
  • serum samples were pooled, diluted in blocking buffer (1: 50) and plated.
  • HRP human anti peroxidase
  • IFN-gamma producing cells were quantified from the splenocytes of vaccinated mice.
  • cell culture plates were previously sensitized overnight at 4 ° C with 5 ⁇ g / mL anti-IFN- ⁇ capture antibody solution in PBS1 X. The following day, the plates were carefully washed with sterile PBS and incubated with medium. RPMI (supplemented with 5% Beef Fetal Serum) in a CO2 oven. The plates were incubated until sowing, approximately 2 hours, when another washing step was performed, prior to the addition of the cell culture.
  • the supernatant was discarded again and the splenocyte pellet was resuspended in 3 ml complete medium. After sediment removal, a new centrifugation step was performed and the new pellet resuspended in 1 ml of plating medium (RPMI; SFB - 10%; IL-2 - 0.2%). Cultured cells were quantified by automatic counter and the concentration was adjusted by the addition of plating medium, so that 10 6 cells were applied per well.
  • plating medium RPMI; SFB - 10%; IL-2 - 0.2%).
  • Concanavalin A positive control
  • RPMI medium negative control
  • recombinant protein A2HIS-OZ recombinant protein A2HIS-OZ
  • CD-8 recombinant protein A2HIS-OZ
  • CD4-1 and CD4-2 peptides synthetically obtained with based on prediction studies previously performed (RESENDE, DM et al., Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN- ⁇ and cytolytic activity by CD8 + T cells. Vaccine, v. 26, p 4585-4593 2008).
  • IFN- ⁇ production ( Figure 10) was evaluated in groups of mice receiving PBS (G1), 10 ⁇ g of A2HIS-OZ protein (G2), alum, MPL and ⁇ 0 ⁇ g A2HIS-OZ (G3). , alum, MPL (G4) and alum, MPL and ⁇ 0 ⁇ g original rA2HIS (G5). Splenocytes from mice were restimulated in culture with both proteins. At similar doses (G3 and G5) the two proteins are observed to be equivalent in immunogenicity as measured by IFN- ⁇ production.
  • IFN- ⁇ is cytokine produced by both CD4 and CD8 T cells, which is essential for inducing resistance to Leishmania infection.
  • the results indicate that vaccination led to activation of both cell types (RESENDE, DM et al., Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN- ⁇ and cytolytic activity by CD8 + T cells. Vaccine, v. 26, p. 4585-4593 2008).
  • mice remaining after sacrifice and spleen collection were used.
  • 6 animals from each group were subcutaneously challenged by the right paw with 1 x 10 7 LL infantum promastigotes, at a stationary phase.
  • the parasite load was evaluated in the spleen and liver.
  • 96 wells were coated with PVC plastic film and incubated in a BOD oven at 23-24 ° C for 7-10 days After the incubation period, the plates were read under an optical microscope and the titer of each organ was last determined. Positive dilution for the presence of viable parasites.

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Abstract

A presente invenção descreve uma sequência nucleotídica resultante da modificação e redução do gene que codifica a proteína A2 de Leishmania, bem como seu processo de obtenção e seus usos e uma composição vacinal contendo a proteína obtida a partir deste gene modificado. As modificações introduzidas viabilizam a execução mais eficiente de técnicas de Biologia Molecular, como PCR, clonagem e expressão heteróloga, bem como permitem a expressão da proteína A2HIS-OZ em células procarióticas com maior rendimento. Esses aspectos são especialmente interessantes para o controle de qualidade e produção da proteína em escala industrial. A proteína A2HIS-OZ obtida a partir deste gene modificado poderá ser utilizada como antígeno vacinal na prevenção de leishmaniose canina ou humana ou como antígeno para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral.

Description

GENE MODIFICADO DE Leishmania ssp., PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE PROTEÍNA E USO COMO ANTÍGENO EM COMPOSIÇÃO VACINAL OU
EM IMUNODIAGNÓSTICO
A presente invenção descreve uma sequência nucleotídica resultante da modificação e redução do gene que codifica a proteína A2 de Leishmania, bem como seu processo de obtenção e seus usos e uma composição vacinai contendo a proteína obtida a partir deste gene modificado. As modificações introduzidas viabilizam a execução mais eficiente de técnicas de Biologia Molecular, como PCR, clonagem e expressão heteróloga, bem como permitem a expressão da proteína A2HIS-OZ em células procarioticas com maior rendimento. Esses aspectos são especialmente interessantes para o controle de qualidade e produção da proteína em escala industrial. A proteína A2HIS-OZ obtida a partir deste gene modificado poderá ser utilizada como antígeno vacinai na prevenção de leishmaniose canina ou humana ou como antígeno para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral.
As leishmanioses são doenças parasitárias endémicas em cerca de 88 países, dentre os quais 72 são países em desenvolvimento. São causadas por uma variedade de espécies de protozoários pertencentes ao género Leishmania e se apresentam clinicamente como lesões cutâneas, mucocutâneas ou sob a forma de infecção visceral (World Health Organization. Program for the surveillance and control of leishmaniasis. Acesso em: <http://who.int/emc/diseases/leish/index.html 2005>). Alterações nas funções do baço, fígado e da medula óssea são observadas nos pacientes infectados, sendo que a infecção pode tornar-se crónica e causar febre irregular de longa duração, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, anemia, leucopenia, edema, debilidade progressiva e emagrecimento, podendo levar à morte na ausência de tratamento. Indivíduos infectados podem também permanecer assintomáticos, embora cerca de 20% dos indivíduos em regiões endémicas desenvolvam a forma clássica da doença (SUNDAR, S.; RAI, M. Laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis. Archive of "Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 9, n. 5, 2002). Cães infectados, mesmo assintomáticos, apresentam grande quantidade de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor a partir deste reservatório e, consequentemente, a transmissão para o homem (TESH, R. Control of Zoonotic Visceral Leishmaniasis: Is It Time to Change Strategies? The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 52, p. 287-292, 1995). O tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC), independente do fármaco utilizado, não é viável como medida de controle da doença. O tratamento tem custo elevado e, frequentemente, cães tratados e clinicamente curados sofrem recaídas, permanecendo como fontes de infecção para o vetor, além de aumentar o risco de seleção de linhagens resistentes a tais fármacos, com sérias implicações para o tratamento do homem (GRAMICCIA, M.; GRADONI, L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. International Journal for Parasitology, v. 35, p. 1 169-1 180, 2005).
O procedimento mais utilizado no controle da LVC, inclusive regulamentado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e adotado pelo Ministério da Saúde do Brasil, é a eliminação dos cães soropositivos para antígenos de Leishmania, os quais são detectados por meio do diagnóstico sorológico ou pela presença de sintomas clínicos. No entanto, tais procedimentos acarretam profunda tristeza e indignação aos seus donos que, por vezes, preferem omitir a doença aos órgãos competentes, até a proximidade da morte dos animais quando, nesses casos, já se tornaram importantes transmissores do parasita (TESH, R. Control of Zoonotic Visceral Leishmaniasis: Is It Time to Change Strategies? The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 52, p. 287-292, 1995).
O desenvolvimento de uma vacina que seja eficaz em proteger o cão e, consequentemente, diminuir as taxas de transmissão para o homem ainda é de grande relevância para o controle da leishmaniose. No Brasil, os Ministérios da Saúde e da Agricultura preconizam, de acordo com a portaria interministerial 034/2008, que esta vacina, uma vez aplicada nos cães, seja capaz de induzir uma resposta imunológica eficaz em reduzir o parasitismo tecidual e a transmissão do parasita ao inseto vetor, o que pode ser evidenciado por meio de xenodiagnóstico, reação em cadeia da polimerase (PCR) ou imunohistoquímica. Adicionalmente, esta vacina deve ser capaz de permitir a distinção sorológica dos cães vacinados daqueles infectados, empregando métodos laboratoriais de baixo custo, disponíveis na rede pública e que não onerem o sistema de saúde do País. Portanto, a adoção de uma vacina como nova medida de controle da Leishmaniose não deve interferir nas medidas de controle vigentes.
A maioria das pesquisas focando o desenvolvimento de vacinas baseia- se na identificação de moléculas do parasita e em protocolos de imunização que tenham a capacidade de induzir resposta imune celular Th1 , requisito essencial para indução de proteção à doença. Entretanto, vacinas contra LVC são de difícil desenvolvimento e por isso, ainda raras. Uma delas, a Leishmune®, utiliza como ativo vacinai um complexo antigênico purificado, incluindo proteínas, que corresponde ao complexo Fucose-Manose Ligante (FML) presente na superfície do parasita (Universidade Federal do Rio de Janeiro. Composição contendo frações de células de leishmania, denominadas antígeno FML "fucose mannose ligand" ou "ligante de fucose-manose", uso do antígeno FML e de suas subfrações e componentes para as aplicações em imunodiagnóstico específico da leishmaniose visceral humana e animal, para aplicações em vacinação, tratamento ou imunoterapia contra a leishmaniose visceral humana e canina. BR n. PI 9302386-3 A, 17 jun. 1993). A desvantagem deste produto é que, uma vez vacinado com ele, o animal desenvolverá pesada resposta por anticorpos específicos contra o parasita, tornando-o soropositivo. Assim, o diagnóstico sorológico acusará a infecção (falso-positivo) e os cães vacinados deverão ser sacrificados.
Além disso, a não diferenciação por métodos tradicionais de animais infectados daqueles vacinados gera um grande problema para a saúde pública. O diagnóstico preconizado pelos órgãos públicos é o sorológico, sendo que os inquéritos epidemiológicos realizados pelo Ministério da Saúde se baseiam, em parte, nos resultados sorológicos de cães. Logo, com o advento da vacinação pela Leishmune® e tendo em vista o efeito anteriormente citado, os resultados obtidos não são reais. Por meio de outros exames, como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou imunocitoquímica, é possível diferenciar os cães soropositivos devido à vacinação ou infecção. No entanto, a execução destes exames exige técnicas aprimoradas, equipamento e reagentes de elevado custo, além de técnicos capacitados para garantir fidelidade de resultados, tornando seu uso em saúde pública de difícil implantação e de elevado custo financeiro.
O antígeno A2 foi identificado inicialmente em Leishmania (Leishmania) donovani, por Charest & Matlashewski (1994), a partir de uma biblioteca de cDNA de formas amastigotas desta espécie. Cópias múltiplas do gene A2 estão agrupadas no cromossomo 22 (850 kb) de L. (L.) donovani, sendo que esses genes são conservados também nas espécies L. (L.) infantum, L. (L.) chagasi, L. (L.) amazonensis e L. (L.) mexicana (CHAREST, H.; MATLASHEWSKI, G. Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene. Molecular and Cellular Biology, v. 14, n. 5, p. 2975-2984, 1994; GHEDIN, E. et al. Antibody response against a Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clinicai and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 4, n. 5, p. 530- 535, 1997). A proteína A2 é composta por uma sequência de dez aminoácidos, repetida de 40 a 90 vezes, dependendo do gene da "família A2" que a codifica (CHAREST, H.; MATLASHEWSKI, G. Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage- specific gene. Molecular and Cellular Biology, v. 14, n. 5, p. 2975-2984, 1994; ZHANG et al. Identification and overexpression of the A2 amastigote-specific protein in Leishmania donovani. Molecular and Biochemical Parasitology, v. 78, p. 79-90, 1996).
A vacina Leish-Tec® foi desenvolvida contra leishmaniose canina e sua formulação vacinai é composta pela proteína recombinante A2, produzida em Escherichia coli, e associada a adjuvantes, como a saponina (Universidade Federal de Minas Gerais. Processo para vacina recombinante contra a leishmaniose visceral canina contendo o antígeno recombinante A2 e que permite a distinção sorológica entre animais vacinados de animais infectados. BR n. PI 0603490-0 A, 21 jul. 2006). Por se tratar de um antígeno específico do estágio amastigota de várias espécies de Leishmania, os anticorpos gerados nos cães pelo processo de vacinação com este antígeno não são reativos nos testes de diagnóstico sorologico da infecção, uma vez que os testes disponíveis na rotina laboratorial da rede pública de saúde brasileira utilizam antígenos provenientes da forma promastigota do parasita. Portanto, os cães vacinados com Leish-Tech® permanecem soronegativos após o processo de imunização e portanto, possibilita a diferenciação sorológica entre os animais vacinados com A2 daqueles infectados.
Também são encontrados no estado da arte alguns documentos relacionados à utilização do antígeno A2 como reagente para vacinação contra a leishmaniose. A patente US5733778, intitulado "A2 gene of leishmania which is differentially-expressed in amastigote form", reivindica uma sequência de nucleotídeos do gene A2, isolado e purificado de Leishmania donovani, bem como a sequência de aminoácidos codificada por ele. Também reivindica o plasmídio pGECO 90 contendo este fragmento de DNA e sua expressão em bactérias.
Já o pedido WO02/078735, intitulado "Leishmania vaccines" descreve uma vacina de DNA que desencadeia resposta imune contra infecção por Leishmania donovani. Esta vacina se baseia em um vetor que contém uma sequência de nucleotídeo do gene A2 além de uma sequência que codifica o gene E6 do papilomavírus humano.
O pedido WO9506729, intitulado "Differentially expressed leishmania genes and proteins", reivindica a utilização, como vacina, do antígeno A2 sob a forma de proteína recombinante ou DNA e também de parasitas atenuados cujo gene de virulência foi inativado.
No pedido de patente PI 0603490-0, intitulado "Processo para vacina recombinante contra a leishmaniose visceral canina contendo o antígeno recombinante A2 e que permite a distinção sorológica entre animais vacinados de animais infectados", se menciona a produção de A2 recombinante por fermentação. A sequência codificante deste antígeno foi clonada no vetor de expressão de proteínas pET. A cepa BL21 de Escheríchia co//' foi transformada e, dessa forma, a proteína A2 foi expressa com cauda de 6 aminoácidos histidina na posição N-terminal que permite a purificação da proteína recombinante por meio de cromatografia de afinidade com níquel. Entretanto, o processo ora proposto é melhorado em relação ao descrito em PI 0603490-0, de modo que permite a obtenção da proteína com maior rendimento e maior pureza.
A presente invenção descreve uma sequência nucleotídica obtida a partir de modificações introduzidas no gene que codifica a proteína A2 de Leishmania. Além dessa nova sequência diferir de todas as outras encontradas no estado da técnica e citadas anteriormente, ela permite a realização mais eficiente de técnicas de Biologia Molecular, como PCR e clonagem, e a expressão heteróloga, com maior rendimento, da proteína A2HIS em células procarióticas. Portanto, a presente invenção se difere de tudo o que foi mencionado e encontrado no estado da arte.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 é uma representação esquemática do mapa do plasmídeo de expressão pET-A2HIS-OZ, construído a partir da inserção do gene modificado de A2HIS no vetor de expressão pET9a24a. Legenda: T7 Promoter - promotor de expressão T7; RBS - sítio de ligação ribossomal; MCS - sítio múltiplo de clonagem; T7 Term - terminação de transcrição; F1 ORI - origem de replicação F1 ; KN(R) - gene codificador de resistência à kanamicina; pBR322 Ori - origem de replicação de E. coli.
A Figura 2 representa um ensaio de imunodetecção analisando a expressão em fermentador da proteína A2HIS-OZ utilizando anticorpo anti- 6xHIS. Legenda: KDa - kilo Daltons; M - marcador molecular; S - fração solúvel; I - fração insolúvel; os números correspondem ao tempo de indução com IPTG. A seta indica posição da A2HIS.
A Figura 3 é a imagem do resultado da purificação da proteína A2HIS-OZ após eletroforese (SDS-PAGE, gel 12% e corado com coomassie). A seta indica a posição da A2HIS-OZ. Legenda: KDa - kilo Daltons; M - marcador molecular; 1 - proteína total antes da purificação; 2 - Flow through da coluna de quelato de níquel; 3 - fração da eluição da proteína A2HIS-OZ da coluna de quelato de níquel; 4 - fração da eluição da proteína A2H IS-OZ após diálise para próxima etapa de purificação em coluna de resina aniônica; 5 - fração da eluição da proteína A2HIS-OZ da coluna de resina aniônica. A Figura 4 é a imagem do resultado do teste de estabilidade da proteína A2HIS-OZ após eletroforese (SDS-PAGE, gel 12% e corado com coomassie). A seta indica posição da A2HIS-OZ. KDa - kilo Daltons; M - marcador molecular; 1 - 500 ng de A2HIS (padrão); 2 - 500 ng de A2HIS-OZ após armazenamento a 4°C em solução aquosa por três meses.
A Figura 5 mostra o teste em que a proteína A2HIS-OZ foi submetida a eletroforese (SDS-PAGE, gel 12%) e transferida para membrana de nitrocelulose. A proteína foi submetida a reação com soros de cães vacinados com a vacina Leish-Tec®, que contém a proteína A2HIS original, ou placebo ou com o anticorpo monoclonal anti-A2.
A Figura 6 mostra o resultado da análise por western blot da proteína A2HIS-OZ empregando pool de soros humanos de pacientes com LV sintomática (canaleta 2) ou de indivíduos controle não infectados (canaleta 1 ).
A Figura 7 mostra gráficos relativos aos níveis de anticorpos anti-A2, determinados por ELISA, após vacinação de camundongos BALB/c com a proteína A2HIS associada aos adjuvantes Alúmen + CpG ou MPLA.
A Figura 8 mostra gráfico relativo à quantificação de células produtoras de IFN-γ quando submetidos a diferentes estímulos (ELISPOT). Legenda: * - P < 0,05, quando comparado com o estímulo por RPMI; n = 4 animais.
A Figura 9 mostra gráfico relativo à produção/dosagem de IFN-γ em sobrenadante de cultura de esplenócitos de camundongos imunizados quando submetidos a diferentes estímulos (ELISA). Legenda: * - P < 0,05, quando comparado com o estímulo por RPMI; n = 4 animais.
A Figura 10 mostra gráfico que representa os resultados da produção de IFN-gama por esplenócitos de camundongos que receberam PBS (G1 ); A2HIS- OZ (G2); ALUM + MPL + 10μg A2HIS-OZ (G3); ALUM + MPL (G4); ALUM + MPL + ^ 0μQ rA2HIS original (G5); e ALUM + MPL + 50μg rA2HIS original (G6).
A Figura 11 mostra gráfico que representa os resultados da quantificação da carga parasitária do baço e fígado de camundongos vacinados com A2HIS- OZ (A2HIS-OZ/MPLA ou A2HIS-OZ/CPG/Alumen) e desafiados com Leishmania L. infantum. Os resultados foram expressos em função da média entre os logarítimos negativos do título para o órgão de cada grupo. O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi utilizado com intervalo de confiança de 95%. n = 6 animais.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve uma sequência nucleotídica resultante da modificação e redução do gene de que codifica a proteína A2 de Leishmania, bem como seu processo de obtenção e seus usos e uma composição vacinai contendo a proteína obtida a partir deste gene modificado. As modificações introduzidas facilitam a manipulação molecular e viabilizam a execução mais eficiente de técnicas de Biologia Molecular, como PCR e clonagem. Essas técnicas são muito importantes nas etapas de controle de qualidade e rastreabilidade de lotes e estoques sementes, na produção em escala industrial. Além disso as modificações aumentam a estabilidade do gene durante a expressão heteróloga, por fermentação, em células procarióticas.
Para a obtenção do antígeno, denominado A2HIS-OZ, a sequência de DNA codificadora foi otimizada (SEQ ID NQ1 ), para melhor expressão em E. coli, e sintetizada in vitro. A otimização consistiu na substituição de códons que são mais utilizados por bactérias do que por organismos eucariontes, encontrando assim maior abundância de RNA transportadores para tradução da proteína em bactérias (Tabela 1 ).
Tabela 1 : Relação entre os códons e seus respectivos aminoácidos na molécula original e na molécula sintetizada.
Aminoácido Códons utilizados na Códons utilizados na molécula molécula original sintetizada
Valina GTT, GTC GTT,GTC,GTA,GTG
Glicina GGC, GGT GGT, GGA, GGA
Prolina CCG CCT, CCA, CCG
Glutamina CAG CAG, CAA
Serina TCC, TCT TCC, AGT, TCT, AGC, TCA
Lisina CTC TTG, TTA, CTG
Na sequência original, observa-se que cada aminoácido é codificado por um número menor de códons em comparação com a molécula sintética. Por exemplo, o aminoácido prolina é codificado somente pelo códon CCG na sequência original; sendo assim, foi substituído alternadamente pelos códons CCT, CCA e CCG, que codificam esse mesmo aminoácido na sequência otimizada. Outro exemplo refere-se à alternância entre os códons TCC, AGT, TCT, AGC, TCA para serina na molécula otimizada, enquanto apenas os códons TCC, TCT são encontrados na molécula original (Tabela 1 ).
A proteína A2HIS-OZ obtida a partir deste gene modificado tem aproximadamente 24 KDa, ou seja, seu tamanho é reduzido em relação ao original. Na proteína original, a sequência de aminoácidos vgpqsvgpls/vgplsvgpqs se repete diversas vezes, sendo codificada por mais de 20 repetições da sequência de nucleotídeos "gttggcccgcagtccgtcggcccgctctct", a qual apresenta poucas variações, como demonstrado na Tabela 2. Ademais, nesta sequência nucleotídica são utilizados poucos códons sinónimos para cada um dos aminoácidos presentes, como demonstrado na Tabela 1. Esse grande número de repetições idênticas aumenta a probabilidade de pareamento equivocado das sequências internas da molécula, bem como de oligonucleotídeos iniciadores {primers) durante as reações de PCR ou sequenciamento. Como consequência, diversos produtos são formados durante essas reações, dificultando a análise e interpretação precisa dos resultados. Na sequência otimizada, essa limitação foi contornada uma vez que o número de vezes em que uma mesma sequência de nucleotídeos se repete foi limitando, implicando seu menor tamanho. Também, a substituição e a alternância de códons sinónimos entre as repetições permitiu um pareamento mais preciso da molécula e dos oligonucleotídeos (Tabela 2).
Outra modificação consiste em uma sequência codificadora de seis resíduos de histidina (cauda de histidina) que foi adicionada na região C-terminal, upstream ao códon de parada, para facilitar a purificação inicial do antígeno.
Tabela 2: Comparação entre as repetições que codificam a sequência de aminoácidos vgpqsvgpls/vgplsvgpqs na sequência original e na sequência otimizada.
Repetições codificadoras na I Repetições codificadoras na
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gttggctcgcagtccgtcggcccgctctct gttggcccgcaggctgtagggccactttcc gttggcccgctctctgttggcccgcagtcc gttggtcctcaatcagtgggaccgttaagc gtcggcccgctctctgttggtccgcagtcc gtaggaccgcaagctgtggggccattaagt gttggcccgctctccgttggcccgctctcc
De modo geral, o tamanho reduzido da proteína A2HIS-OZ obtida a partir desta sequência otimizada tem como vantagem uma menor exposição à ação de proteases presentes no hospedeiro recombinante. Ademais, a proteína apresenta propriedades físico-químicas que facilitam sua purificação e, logo, sua obtenção em alto grau de pureza e aumentam sua estabilidade em solução. A A2HIS-OZ poderá ser utilizada como antígeno vacinai na prevenção de leishmaniose canina e como antígeno para imunodiagnóstico de leishmanioses.
O processo para obtenção da A2HIS-OZ consiste, basicamente, em transformar uma bactéria com um vetor de expressão no qual foi inserido o gene modificado (SEQ ID NQ1 ), induzir a expressão da proteína e purificá-la. A proteína obtida poderá ser utilizada tanto no imunodiagnóstico como na profilaxia de leishmanioses.
Para melhor compreensão, seguem alguns exemplos, não limitantes, da presente invenção.
EXEMPLO 1 : Construção de vetor contendo o gene modificado de A2HIS
Para a produção da proteína A2HIS-OZ, a sequência sintética codificadora (SEQ ID NQ1 ) foi inserida entre os sítios Nde\ e Not\ no vetor de expressão pET9a24a. Para isso, 1 μg do plasmídeo pUC57 foi linearizado com as enzima Notle Nde\ e submetido à purificação em gel de agarose. O fragmento purificado foi ligado ao vetor pET9a24a, linearizado com as mesmas enzimas e purificado da mesma forma, a 4°C "overnight", com a enzima T4 DNA Ligase.
A cepa de Escheríchia coli C41 (DE3) foi transformada com o plasmídeo de expressão obtido (Figura 1 ). Após a ligação, 50μΙ_ de uma cultura quimiocompetente de E. coli C41 foi transformada com 2μΙ_ do sistema da ligação contendo o plasmídeo da Figura 1. Após 30 minutos de incubação em gelo, as culturas foram submetidas a choque térmico de 1 minuto a 42°C e retornadas ao banho de gelo por 2 minutos. Em seguida, foram plaqueadas em Ágar Luria Bertani (LB) contendo 5C^g/ml_ de ampicilina para a seleção das células resistentes. As colónias selecionadas tiveram o plasmídeo extraído utilizando kit comercial e submetidas ao teste de digestão com as enzimas usadas para clonagem para a liberação do inserto.
O sequenciamento da região de expressão do plasmídeo confirmou a inserção e a correta identidade da sequência codificadora do A2HIS-OZ.
EXEMPLO 2: Expressão da proteína A2HIS-OZ codificada pelo gene modificado
Os clones de E. coli C41 (DE3) contendo o pET-A2HIS foram submetidos a experimentos de expressão de pequena (erlenmeyer 250ml_) e media (fermentador 2L) escala.
Ao biorreator, no qual a saturação de O2 e o pH foram previamente calibrados, são conectadas uma garrafa contendo 700 mL de meio de fermentação (FeSO4.7H2O - 0,08g,hexametafosfato de sódio - 2,4g, cloreto de amónio - 1 ,68g, ácido cítrico monohidratado - 1 ,38g, hidróxido de amónio 30% 1 ,6ml_, extrato de levedura - 12g,MgSO4.7H2O - 0,64g, 0,1 M MnCl2.4H2O- 8μΙ_ e água deionizada qsp. 700ml_) acrescido de 500μΙ_ de Antifoam 204, uma garrafa de solução de glicose esterilizada (16% p/v), uma garrafa contendo 80ml_ de meio de inoculação (FeSO4.7H2O - 0,1 g/L,hexametafosfato de sódio - 3,0g/L, cloreto de amónio 2,1 g/L, ácido cítrico monohidratado - 1 ,73g/L, hidróxido de amónio 30% - 0,2% v/v, extrato de levedura - 15g/L, glicose - 20g/L, MgSO4.7H2O- 0,8g/L, 0,1 M MnCl2.4H2O- 0,001 % v/v e água deionizada qsp. 1000ml_) acrescido de Kanamicina - 100pg/mL e Cloranfenicol - 36pg/ml_ ao qual foram inoculados os clones de E. coli transformados com o vetor de expressão pET-A2HIS e uma garrafa contendo 250ml_ de concentrado de glicose (Glicose - 550,0g/L, FeSO4.7H2O - 0,2g/L, MgSO4.7H2O - 21 ,0g/L, citrato desódio.2H2O - 5,2g/L, 0,1 M MnCl2.4H2O - 24,2% v/v, carbonato de amónio 6,0g/L, hexametafosfato de sódio - 6,0g/L e água deionizada qsp. 10OOmL), previamente adicionada a 250ml_ de um Concentrado de Extrato de Levedura (420g/L) e contendo Kanamicina (100pg/mL) e Cloranfenicol (36pg/mL). Essa cultura foi incubada sob agitação a temperatura 32-37QC. Todos esses meios e soluções são bombeados para o fermentador, onde ocorre a fermentação sob pressão de O2 (18-20%), temperatura (32-37QC) e agitação constantes, controlando-se o pH entre 6,80-6,90.
A expressão da proteína recombinante A2HIS no fermentador foi obtida após a indução da cultura de bactérias com IPTG (isopropil-p-D- tiogalactopiranosídeo) em uma concentração final de 0,6 a 1 mM. Neste passo, a temperatura é reduzida para 30-32°C e o pH controlado a 6,80-6,90, através da adição do concentrado de glicose. A fermentação é finalizada com a utilização completa do concentrado de glicose.
A cultura do fermentador foi centrifugada a frio e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspendidas em tampão de lise (50 mM Tris-CI pH 8,0, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) em uma proporção de 10 mL de tampão para cada grama úmida de biomassa. Em seguida, a suspensão de células foi homogeneizada por três vezes.
O homogeneizado foi centrifugado a frio e o sobrenadante descartado. O pellet foi ressuspendido em tampão de lavagem (100 mM Fosfato de sódio pH 7,2, 0,5 M NaCI, 1 mM β-mercaptoetanol, 0,5% Triton X-100) em uma proporção de 10mL/grama de pellet. A suspensão foi centrifugada a frio e o sobrenadante descartado.
O pellet resultante foi ressuspendido em tampão de ligação (20 mM Fosfato de sódio pH 7,5, 0,5 M NaCI, 5 mM Imidazol, 8 M Uréia) em uma proporção de 10 mL/grama de pellet. Esta suspensão foi misturada à temperatura ambiente por 1 -2 horas. A suspensão foi centrifugada a frio, o pellet resultante foi descartado e o sobrenadante foi recolhido para a purificação.
Testes de imunodetecção com anticorpos específicos para a cauda de histidina (anti-6xHIS) confirmaram tamanho, identidade e expressão do antígeno A2HIS-OZ (Figura 2). Parâmetros físico-químicos desta proteína também foram comparados com aqueles da proteína recombinante A2 (rA2) presente na vacina Leish-Tec® (Tabela 3).
Tabela 3: Comparação de parâmetros físico-químicos de rA2 e A2HIS.
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EXEMPLO 3: Purificação da proteína A2HIS-OZ
A purificação foi efetuada em duas etapas. Na primeira, devido à presença da cauda de histidina presente na porção C-terminal da proteína A2HIS-OZ, esta foi inicialmente purificada utilizando resina de níquel quelado em cromatografia líquida. Isso permitiu remover a maior parte das proteínas provenientes de E. coli O sobrenadante final obtido no Exemplo 2 foi injetado em uma coluna contendo resina de níquel quelado e a um fluxo constante igual à metade do fluxo máximo permitido pela coluna. Após a injeção completa da amostra, a coluna foi lavada com três (3) volumes de coluna de tampão de ligação (20 mM Fosfato de sódio pH 7,5, 0,5 M NaCI, 5 mM Imidazol, 8 M Uréia), a um fluxo constante igual ao máximo permitido pela coluna. Após a lavagem, o tampão de eluição (20 mM Fosfato de sódio pH 7,5, 0,5 M NaCI, 0,5 M Imidazol, 8 M Uréia) foi injetado na coluna e a fração contendo o antígeno A2HIS-OZ (pico de absorbância em 280 nm) foi coletada.
Na segunda etapa de purificação, para a remoção dos contaminantes remanecentes, realizou-se cromatografia líquida em resina de troca aniônica cujo processo foi otimizado. A fração contendo o antígeno A2HIS-OZ proveniente da primeira etapa de purificação foi diafiltrado usando tampão de corrida (50 mM Tris-CI pH 8,0, 4 M Uréia). A amostra foi injetada na coluna contendo resina de troca aniônica. Pelo fato de a proteína A2HIS-OZ obtida ter ponto isoelétrico em pH 8,5 e o tampão ter pH em torno de 8,0, ela não interage com a coluna e as proteínas contaminantes remanescentes da primeira etapa de purificação se liguem à resina de troca aniônica. Portanto, a A2HIS é encontrada no flow through, que é a fração que não interage com a resina.
Testes de eletroforese por SDS-PAGE confirmaram o grau de pureza da proteína A2HIS-OZ (A Figura 3).
EXEMPLO 4: Estabilidade da proteína A2HIS
Uma alíquota do antígeno A2HIS-OZ purificado foi congelado a -70°C e uma outra alíquota de mesmo volume mantida a 4°C. Ambas foram mantidas nestas condições por um período de 3 meses. Após este período, as alíquotas foram analisadas por gel de poliacrilamida corado com coomassie. Este teste indicou claramente estabilidade do antígeno A2HIS-OZ na sua formulação atual e na condição de tamponamento (tampão de corrida - 50 mM Tris-CI pH 8,0, 4 M Uréia) em ambas as temperaturas testadas (Figura 4).
Para comparação, os mesmos testes de estabilidade foram realizados com o antígeno rA2 (Leish-Tech) e eles mostraram a instabilidade e a degradação deste antígeno após um mês de armazenamento a 4°C (Dados não apresentados).
EXEMPLO 5: Avaliação de antigenicidade da A2HIS-OZ
a) Teste in vitro
A antigenicidade da proteína A2HIS-OZ obtida a partir do gene modificado (SEQ ID NQ1 ), descrito no Exemplo 1 , foi testada pela avaliação da reatividade de anticorpos induzidos pela vacinação de cães com a vacina Leish-Tec®. Amostras de soros de cães que receberam três doses da vacina foram empregadas em pool em análise por western blot. A proteína recombinante A2HIS-OZ (250-500 ng) foi submetida a eletroforese em gel SDS-Poliacrilamida - 12% (SDS-PAGE), aplicando-se uma voltagem de 80V para empilhamento das amostras e 120V para resolução.
Após o final do procedimento, o perfil eletroforético foi transferido em banho de gelo para uma membrana de nitrocelulose em tampão de transferência (25mM de Tris Base; 192mM de Glicina; Metanol 20%), aplicando-se 300mA de corrente durante 2 horas. A membrana pós-transferência foi incubada em tampão de bloqueio (5% leite em pó; 0,01 % Tween 20) durante 2 horas. Após 3 etapas de lavagem com PBS Tween 0,05%, a membrana foi incubada ou com o pool de soros diluídos de cães (1 :100) ou com anticorpo monoclonal anti-A2 diluído em tampão de bloqueio (1 :2000).
Após mais 3 etapas de lavagem, a exemplo das anteriores, a membrana foi incubada ou com anticorpo anti-lgG de cão ou anti-lgG de camundongo, ambos acoplados à peroxidase humana (HRP) em diluição 1 :2000, durante 1 hora. Após 3 etapas de lavagem com PBS Tween 0,05% e outras 3 com PBS puro, a membrana foi envolvida em material plástico, onde se aplicou solução reveladora Enhanced Chemiluminescense (ECL), deixando agir por 5 minutos na ausência de luz. Após exposição do filme fotográfico, ainda na ausência de luz, esse foi revelado em uma solução reveladora conforme instruções do fabricante (Carvalho et al., 2002, Diag. Microbiol. Inf. Dis. v. 43, 2002).
Em análises subsequentes, foram utilizados soros de cães vacinados com a vacina Leish-Tec® e com placebo e soros de pacientes humanos com leishmaniose visceral. Como demonstrado na Figura 5, a proteína A2HIS-OZ é reconhecida especificamente pelos soros dos cães vacinados com a A2HIS original, uma vez que as duas proteínas apresentam a mesma sequência de aminoácidos, a qual é reconhecida por anticorpos dos cães vacinados. Portanto, os soros de cães vacinados com a vacina, que contém a proteína recombinante A2 original, apresentaram reação cruzada com a proteína A2HIS-OZ, indicando que esta mantém as propriedades antigênicas associadas à primeira.
Além disso, como demonstrado na Figura 6, um pool de soros de pacientes com leishmaniose visceral também reagiu especificamente com a proteína A2HIS-OZ (observa-se, na canaleta 2, a reatividade dos soros dos pacientes com LV com a proteína A2HIS-OZ, de 24 KDa, e ao contrário, na canaleta 1 , a ausência de reatividade dos soros de indivíduos controle não infectados), indicando que a mesma, assim como a A2-HIS original, também pode ser empregada como antígeno em testes de diagnóstico sorológico. b) Teste in vivo
As propriedades antigênicas e imunogênicas da proteína A2HIS-OZ foram também avaliadas empregando o modelo animal. Camundongos fêmeas da linhagem BALB/c com 6-8 semanas de vida foram vacinados com a proteína recombinante associada a diferentes adjuvantes. Para esse teste, os camundongos foram separados em 3 grupos de 10 animais: no grupo 1 foram aplicados 100μΙ_ de PBS1 X estéril; no grupo 2, administrou-se 10-20 μg de proteína A2HIS-OZ, 30% v/v de alúmen e 18μg de CpG; no grupo 3 foram aplicados 10-20μg de proteína A2 HIS-OZ e 1 -2 μg de MPLA (monophosphoryl lipid A). Os 3 grupos foram inoculados por via subcutânea, na região dorso- posterior. Após 30 dias, todos os animais receberam nova dose homóloga pela mesma via. b.1) Avaliação da resposta humoral
A resposta humoral foi avaliada pelo método ELISA de modo a determinar a indução de anticorpos anti-A2 pela vacinação. Ao 15o dia após a primeira dose, 4 animais de cada grupo foram sangrados pelo plexo orbital e o sangue foi centrifugado para extração do soro, o qual foi utilizado para o ELISA de anticorpos IgG em quadruplicata. Para realização dos testes ELISA, placas de 96 poços foram sensibilizadas com a proteína A2HIS-OZ (1 C^g/mL), diluída em tampão carbonato (0,1 M; pH 9,6). Para cada grupo foi feito um pool com as amostras de soro, que foram diluídas em tampão de bloqueio (1 :50) e aplicadas na placa. Posteriormente, os anticorpos secundários anti-lgG total, anti-lgG1 e anti-lgG2a marcados com peroxidase humana (HRP) foram aplicados nos poços correspondentes, diluídos à 1 :2000 em tampão de bloqueio. Após a incubação, adicionou-se a solução de substrato (3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) + H2O2 diluídos em tampão citrato-fosfato pH 5,0) ao sistema. A reação foi interrompida com solução de H2SO4 1 :20 e a leitura da absorbância no comprimento de onda de 450nm foi realizada em espectrofotômetro de microplacas.
No 15Q dia após a segunda dose, o mesmo procedimento foi feito para comparação dos valores (Figura 7). Observou-se que níveis elevados de anticorpos anti-A2 foram detectados após a primeira dose, nos grupos vacinados com proteína A2HIS-OZ (Alúmen + CpG + A2HIS-OZ e MPLA + A2HIS-OZ), em comparação com o grupo controle que recebeu apenas PBS (Figura 7). b.2) Avaliação da resposta celular
Células produtoras de IFN-gama foram quantificadas a partir dos esplenócitos dos camundongos vacinados. Para tal, placas de cultivo celular foram previamente sensibilizadas overnight a 4°C com solução de anticorpo de captura anti-IFN-γ a 5μg/mL em PBS1 X. No dia seguinte, as placas foram cuidadosamente lavadas com PBS estéril e incubadas com meio RPMI (suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino) em estufa de CO2. As placas ficaram em incubação até o momento da semeadura, aproximadamente 2 horas, quando foi feita outra etapa de lavagem, antes da adição da cultura celular.
Ao 21 ° dia após a segunda dose, 4 animais de cada grupo foram sacrificados, tendo o seu baço removido e imediatamente transferido para meio de cultura RPMI suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (SFB) em banho de gelo. Os órgãos foram macerados com lâminas de vidro foscas e o conteúdo foi centrifugado a frio. Após o descarte do sobrenadante, o material macerado foi ressuspendido em tampão de lise de eritrocitos (0,15M de NH4CI; 0,1 M de KHCO3; 0,1 M de Na2EDTA) e incubado em gelo durante 5 minutos. Para neutralizar a lise, foram adicionados 3 mL de meio RPMI + 5% de SFB e o conteúdo foi, então, centrifugado a frio. O sobrenadante foi novamente descartado e o pellet de esplenócitos foi ressuspendido em 3 mL de meio completo. Após remoção dos sedimentos, nova etapa de centrifugação foi realizada e o novo pellet ressuspendido em 1 ml_ de meio de plaqueamento (RPMI; SFB - 10%; IL-2 - 0,2%). As células em cultura foram quantificadas em contador automático e a concentração foi ajustada com a adição de meio de plaqueamento, de modo que 106 células foram aplicadas por poço.
Dentre os estímulos selecionados para a proliferação dos esplenócitos estão a Concanavalina A (controle positivo), o meio RPMI (controle negativo), a proteína recombinante A2HIS-OZ e os peptídeos CD-8, CD4-1 e CD4-2, obtidos sinteticamente com base em estudos de predição previamente realizados (RESENDE, D. M. et ai, Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN-γ and cytolytic activity by CD8+ T cells. Vaccine, v. 26, p. 4585-4593 2008). Esses estímulos foram aplicados aos poços correspondentes sobre o meio de plaqueamento previamente adicionado, ficando diluídos às seguintes concentrações finais: Concanavalina A - 5μg/mL; Proteína A2HIS-OZ - 1 (^g/mL; Peptídeos CD8, CD4-1 e CD4-2 - 10μΜ. As placas foram então incubadas em estufa com 5% de CO2 por um período de 18 horas.
Após o período de incubação, o conteúdo das placas foi descartado e as mesmas foram lavadas, primeiro com PBS + 0,05% Tween 20 e depois apenas com PBS. As placas foram, então, incubadas com anticorpo biotinilado anti-IFN- γ e, posteriormente, lavadas. O conjugado streptoavidina-peroxidase, diluído 1 :2000 em PBS1 X foi adicionado aos poços e após 1 h de incubação à temperatura ambiente e protegida da luz, as placas foram submetidas a novas etapas de lavagem e reveladas com solução reveladora (1 M de Tris-HCI pH 7,5; 10mg de 3,3'-Diaminobenzidina (DAB); 30μΙ H2O2 e H2O). A reação cromogênica foi interrompida com água corrente em abundância e a quantificação dos spots foi realizada em leitor de ELISPOT ImmunoSpot (CTL).
A partir das mesmas culturas oriundas do processamento realizado para o ELISPOT, 106 células foram retiradas e cultivadas com os estímulos anteriormente citados, em placas de cultivo celular com 96 poços. As placas foram incubadas em estufa de CO2 durante 72h e, após esse período, foram centrifugadas. O sobrenadante de cada poço foi coletado e transferido para nova placa de cultivo celular, de onde foram extraídas amostras para realização de ELISA Sanduíche para dosagem de IFN-γ. As leituras de absorbância no comprimento de onda de 450nm foram feitas em espectrofotômetro de microplacas.
Através da contagem de spots, observa-se uma quantidade elevada de esplenócitos produtores de IFN-γ após re-estimulação com A2HIS-OZ ou peptídeos derivados da proteína nos grupos imunizados com a proteína A2HIS- OZ (Figura 8). Além da proteína A2HIS-OZ, os peptídeos também estimularam a produção de IFN-γ, indicando que uma resposta específica ao antígeno vacinai foi induzida pela vacinação (Figuras 8 e 9).
Em outro teste, a produção de IFN-γ (Figura 10) foi avaliada em grupos de camundongos que receberam PBS (G1 ), 10 μg da proteína A2HIS-OZ (G2), alúmen, MPL e ^ 0μg A2HIS-OZ (G3), alúmen, MPL (G4) e alúmen, MPL e ^ 0μg rA2HIS original (G5). Os esplenócitos dos camundongos foram re-estimulados em cultura com as 2 duas proteínas. Observa-se que em doses similares (G3 e G5) as duas proteínas se equivalem sob o aspecto imunogenicidade, medida pela produção de IFN- γ.
Ressalta-se que IFN-γ constitui-se em citocina produzida tanto por células T CD4 quanto CD8 que é essencial para indução de resistência à infecção por Leishmania. Dada à especificidade dos peptídeos empregados, como determinado previamente, os resultados indicam que a vacinação levou à ativação de ambos os tipos celulares (RESENDE, D. M. et ai., Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN-γ and cytolytic activity by CD8+ T cells. Vaccine, v. 26, p. 4585-4593 2008).
EXEMPLO 6: Teste de vacinação
Para avaliação da proteção conferida pela vacinação contra infecção por Leishmania infantum, foram utilizados 6 camundongos restantes após o sacrifício e coleta do baço. Ao 21 ° dia após a segunda dose vacinai, 6 animais de cada grupo foram desafiados subcutaneamente, pelo dorso da pata direita, com 1 x107 promastigotas de L. L. infantum, em fase estacionária. A avaliação da carga parasitária foi feita no baço e fígado.
Trinta dias após o desafio, todos os animais foram sacrificados e tiveram o baço e o fígado removidos em ambiente estéril e imediatamente transferidos para recipientes separados. Para cada miligrama de tecido, adicionou-se 1 mL de meio Schneider completo (20% de SFB inativado; 200U/ml_ de Penicilina; 100μg/mL de Estreptomicina). Os órgãos foram, então, macerados com lâminas de vidro foscas e homogeneizados até formar uma suspensão de células. Dez microlitros de cada suspensão foram diluídos seriadamente em meio Schneider completo até completar as diluições I O-1 , 10"2, 10"3, 10"4, 10"5, 10"6, 10"7 e 10"8. As placas de 96 poços foram revestidas com filme plástico de PVC e incubadas em estufa B.O.D. a 23-24°C durante 7-10 dias. Após o período de incubação, as placas foram lidas em microscópio óptico e o título de cada órgão foi determinado pela última diluição positiva para a presença de parasitas viáveis.
Verifica-se uma redução significativa da carga parasitária no baço e fígado dos animais vacinados com A2HIS-OZ/MPLA e no fígado dos animais vacinados com A2HIS-OZ/CPG/Alumen (Figura 11 ). Esses dados demonstram que, além de imunogênica, a proteína A2HIS-OZ, quando associada a adjuvantes, é capaz de induzir proteção contra a infecção por Leishmania infantum.

Claims

REIVINDICAÇÃO
1. Gene modificado de Leishmania ssp. caracterizado por ser representado pela SEQ ID NQ1 e codificar uma proteína A2HIS otimizada e reduzida (A2HIS-OZ).
2. Composição vacinai caracterizada por compreender a proteína A2HIS- OZ, codificada pelo gene representado pela SEQ ID NQ1 , adjuvantes e excipientes farmacológica e farmaceuticamente aceitáveis.
3. Processo para obtenção de proteína caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a. Inserção do gene modificado (SEQ ID NQ1 ) em um vetor de expressão compatível com Escherichia coli, preferencialmente pET9a24a, por meio de digestão enzimática com enzimas de restrição, preferencialmente Nde\ e A/oíl;
b. Transformação de E. coli, preferencialmente a cepa C41 (DE3), com o DNA recombinante obtido na etapa a;
c. Cultivo da bactéria transformada obtida na etapa b em meio fermentativo;
d. Indução da expressão da proteína A2HIS-OZ codificada no gene modificado (SEQ ID NQ1 ) por meio de gradiente da concentração de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo) variando de 1 ,0 a 0,2mM;
e. Purificação da proteína A2HIS-OZ obtida na etapa d, após lise celular, por cromatografia de afinidade seguida por cromatografia de troca iônica.
4. Processo para obtenção de proteína, de acordo com a reivindicação 2, etapa "e", caracterizado pela cromatografia de afinidade ser com resina de níquel quelado para retenção da proteína A2HIS-OZ por meio da cauda de histidina e pela cromatografia de troca iônica ser com resina aniônica para retenção das proteínas indesejáveis.
5. Uso do gene modificado de Leishmania ssp. caracterizado por ser na produção de antígeno A2HIS-OZ para vacina ou kit imunodiagnóstico contra leishmanioses em cães e humanos.
6. Uso de composição vacinai caracterizado pela composição ser aquela descrita na reivindicação 2 e por ser na prevenção de leishmanioses em cães e humanos.
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