CN113082202A - 一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法，涉及疫苗佐剂技术领域。所述复合水溶性动物疫苗佐剂，包括：乳酸‑羟基乙酸共聚物PLGA，树突状细胞靶向诱导肽DCpep，桔梗皂苷D，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP‑8和T细胞抗原肽TP‑7。本发明与常规油佐剂相比，不仅能够刺激中和抗体产生等体液免疫应答，还能够促进T细胞增殖，提高细胞因子(IFN‑γ、IL‑6)水平，激发细胞免疫应答，同时避免了因油佐剂疫苗引起的注射部位肉芽肿等不良反应，有效提高动物疫苗免疫效果。

Description

一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，特别涉及一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法的技术领域。

背景技术

疫苗佐剂是指先于疫苗抗原或同时应用，能非特异性地增强机体对该疫苗抗原的特异性免疫应答，增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质，在疫苗的研发和生产中具有重要的作用。对于多种动物传染病，由于没有合适的疫苗佐剂而影响了菌苗、毒苗、重组蛋白、多肽和DNA疫苗等的发展。因此，动物传染病的防控除了研发出高效安全的疫苗外，佐剂的研发也起着至关重要的作用。

目前动物疫苗佐剂主要分为非油乳佐剂和油乳佐剂两大类。非油乳佐剂主要包括铝盐佐剂等。铝盐佐剂主要有氢氧化铝胶和磷酸铝等，广泛用于人用和兽用疫苗的制备，主要诱导体液免疫应答，但皮下注射时常有肿胀或结块，抗原免疫原性弱时不足以提高其免疫原性，无法用于亚单位等新型疫苗，而且铝佐剂不能冷冻或冻干。因此，油乳佐剂逐渐被广泛用于人用和兽用疫苗的制备。

油乳佐剂包括矿物油佐剂、非矿物油佐剂。其中，弗氏完全佐剂(FCA)和不完全佐剂(FIA)是最为人熟悉矿物油佐剂；但是，FCA毒性较大，FIA又活性较差。同时，除了矿物油，其他油脂也可以制成油乳佐剂，比较常用的有角鲨烯和角鲨烷等。与矿物油佐剂相比，以角鲨烯和角鲨烷为油相的新型油乳剂既有良好的免疫效果，又没有严重的不良反应。但是，由于其原料价格较高，疫苗的成本会比传统矿物油佐剂疫苗高得多，影响其推广使用。

因此，研制一种即可提高动物疫苗的免疫应答效果，又没有严重的不良反应的新的油佐剂，是目前疫苗佐剂技术领域需要解决的技术问题。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提出一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法。

本发明采用技术方案为：一种复合水溶性动物疫苗佐剂，其特征在于，包括：乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，树突状细胞靶向诱导肽DCpep，桔梗皂苷D，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8和T细胞抗原肽TP-7。

在上述方案的基础上，所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8氨基酸序列为：GNVTPRVS；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7氨基酸序列为：SKRTSAL。

在上述方案的基础上，所述复合水溶性动物疫苗佐剂各成份的质量配比满足以下条件：总质量份按100份计，所述乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA为1.0-2.5份；所述树突状细胞靶向诱导肽DCpep为0.05-0.1份；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8为0.08-0.16份；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7为0.08-0.16份。

一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的复合水溶性动物疫苗佐剂和抗原。

在上述方案的基础上，所述复合水溶性动物疫苗佐剂和抗原的质量比为4：1-5：1。

在上述方案的基础上，所述抗原为PCV2 Cap蛋白。

一种上述所述的疫苗制备方法，包括以下步骤：

S1:按成分配比，分别称取配制复合水溶性动物疫苗佐剂配方的各成分；

S2:取乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，用纯净水将其溶解配置成乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液；

S3:将所述的树突状细胞靶向诱导肽DCpep，桔梗皂苷D，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8和脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7添加到乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液中，组成复合水溶性动物疫苗佐剂；

S4:将复合水溶性动物疫苗佐和抗原，按质量比4：1-5：1进行混合均匀，制备疫苗。

具体的，所述抗原为水相抗原，其浓度可根据具体情况实际配置。

本发明实施例提供的一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法，具有以下有益效果：本发明与常规油佐剂相比，不仅能够刺激IgG、IgG1和IgG2a体液免疫应答，还能够促进T细胞增殖，提高细胞因子(IFN-γ、IL-6)水平，激发细胞免疫应答，同时避免了因油佐剂疫苗引起的注射部位肉芽肿等不良反应，有效提高动物疫苗免疫效果。

附图说明

图1为免疫仔猪外周血淋巴细胞刺激指数(SI)检测结果；

图2为免疫仔猪外周血中IL-6浓度检测结果；

图3为免疫仔猪外周血中IFN-γ浓度检测结果；

图4为免疫仔猪PCV2中和抗体检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明发明构思如下：

通过研究发现，树突状细胞靶向分子DCpep是树突状细胞靶向分子之一，由12个氨基酸(FYPSYHSTPQRP)组成，在诱导体液免疫和细胞免疫过程中发挥着重要作用，能特异性结合DC并促进递呈作用。

进一步研究发现，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白与卵白蛋白(OVA)混合配制的疫苗可诱导多种抗原特异性抗体亚类和效应分子(MIG，MCP-1，IP-10，MIP-1α，KC和IL-2)，以及抗原刺激后Th1和Th2型细胞因子水平升高，其有作为新型疫苗佐剂的潜力。

同时，某些氨基酸残基数小于50的小分子多肽具有增强机体免疫活性的能力，这类小分子多肽类佐剂具有安全性好、生物相容性佳、易合成、纯度高和制备成本低等优点。

因此，发明人尝试将树突状细胞靶向分子DCpep和脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白，以及配合筛选氨基酸残基数小于50的小分子多肽制备一种复合水溶性动物疫苗佐剂，用于提高动物疫苗的免疫效果。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1：实验方法

1.1：脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞和T细胞有效抗原表位分布预测和制备

利用DNAstar Lasergene v7.1软件对脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白亲水性、抗原指数、表面可能性及可塑性进行分析，预测了PorB蛋白的B淋巴细胞抗原表位分布和T淋巴细胞抗原表位分布，并利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统获得PorB蛋白，通过蛋白结构分析，确定其B细胞有效抗原肽为BP-8(GNVTPRVS)和T细胞有效抗原肽为TP-7(SKRTSAL)。

需要说的是，对于脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞有效抗原肽为BP-8和脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞有效抗原肽为TP-7，其制备方法可通化合合成，也可通过基因工程进行表达，本实施例中，主要通过昆虫细胞-杆状病毒进行表达制备。

1.2：仔猪的疫苗接种试验

取40只21日龄的健康仔猪，猪圆环病毒(PCV2)抗原、抗体双阴性，随机将其分成4个组，分别为A组、B组、C组和D组，其中，接种量如下：

A组：接种PCV2Cap蛋白疫苗(30μg/头份)

B组：接种PCV2Cap蛋白(30μg/头份)+复合水溶性动物疫苗佐剂(1.0mL/头份)

C组：接种PCV2Cap蛋白(30μg/头份)+Carbomer佐剂(1.0mL/头份)；

D组：接种PBS 1.0mL

按照上述分组进行复合水溶性佐剂、Carbomer佐剂与PCV2 Cap蛋白制备成亚单位疫苗后，进行仔猪免疫接种试验。

疫苗接种后第14d、28d和42d，各组分离血清，测PCV2病毒中和抗体；第21d各组按照第一次接种的剂量进行二免；第42d各组采血，测外周血T细胞增殖和外周血细胞因子(IFN-γ、IL-6)。

表1疫苗佐剂效果试验动物分组

1.3：血清中和抗体测定

进行血清中和试验检测PCV2中和抗体。血清样品先经56℃灭活30min后用PBS 2倍系列稀释血清样品，然后加到96孔细胞培养板中。向每个孔中添加滴度为2×10³TCID₅₀PCV2 QD株且体积为100μL的病毒悬液。在37℃下孵育1小时后，每个孔中均添加100μL PK-15细胞悬液。置37℃5％CO₂培养3天后，计算PCV2特异性中和抗体的滴度，并表示为当抑制PK-15细胞感染时最高稀释度的倒数。

1.4：外周血淋巴细胞增殖测定

用外周血淋巴细胞分离液从仔猪经肝素钠处理的抗凝血中分离出外周血单核细胞(PBMC)，洗涤后，将分离的淋巴细胞(调整浓度为4×10⁶细胞/ml)接种到96孔板中，加入100μl含10％FBS的RPMI 1640细胞培养液，并加入适量的刀豆蛋白A(PHA)(10μg/mL)，同时设不加PHA的阴性对照组。

在37℃5％CO₂培养箱中培养72h后，向每个孔中添加20μL MTS(在PBS中为5mg/mL)。在37℃下孵育4h后，根据下列公式计算刺激指数(SI)：SI＝(免疫组的OD值–空白对照的OD值)/(阴性对照组的OD值–空白对照的OD值)。

1.5：外周血细胞因子检测

为充分掌握各疫苗佐剂疫苗接种组诱发仔猪体内产生细胞免疫类型，以Th1及Th2型细胞因子为靶点，比较仔猪免疫后Th1型细胞因子(IFN-γ)、Th2型(IL-6)细胞因子的分泌量。按照试剂盒说明书的操作步骤测定各组样本中IFN-γ和IL-6的OD值，通过标准曲线确定不同细胞因子的浓度。

1.6：统计分析

所有数据均表示为平均值±标准偏差(SD)。t检验用于比较两组之间的均值。使用Oneway ANOVA和Tukey检验进行多次比较。统计学显著性设定为p<0.05，极显著设定为p＜0.01。

2结果与分析

2.1：对细胞免疫反应的影响

为了进一步研究各组疫苗对细胞免疫反应的影响，本研究测定了接种仔猪第42d外周血淋巴细胞的增殖指数(SI)(见图1)。在42d时，各疫苗接种组和PBS组之间的SI差异显着。另外，B组接种组显示出比其他组显着性更高的SI。

本研究同时使用ELISA试剂盒检测各免疫组外周血中IL-和IFN-γ细胞因子的含量，它们分别与Th2偏向和Th1细胞应答有关，结果显示(见图2和图3)。42d时，与D组相比，所有疫苗疫苗接种组的IL-6和IFN-γ分泌均增加；B组接种组、C组接种组的IL-6和IFN-γ浓度显着高于PCV2 Cap蛋白疫苗接种组，并且，B组接种组的IL-6和IFN-γ浓度最高。

总之，这些数据表明PCV2 Cap蛋白和复合水溶性动物疫苗佐剂联合免疫显著促进了细胞免疫应答。

2.2：IgG Fc融合蛋白对血清中和抗体滴度的影响

中和抗体对于评估疫苗佐剂的免疫效果至关重要，因此，本研究进一步分析了各组疫苗佐剂接种组诱导仔猪产生PCV2中和抗体水平的情况(见图4)。在整个试验期内，D组中未检测到针对PCV2 QD株的中和活性；相反，所有接种疫苗组在14d、28d和42d时均显示PCV2 QD株的特异性中和抗体反应。在28d和42d时B组接种组和C组接种组的抗体效价显着高于A组接种组，且B组接种组的抗体效价最高。

上述结果表明PCV2 Cap蛋白+复合水溶性动物疫苗佐剂具有良好的免疫原性并有效地提高了抗体的效价。

需要强调的是，上述使用本发明作为复合水溶性动物疫苗佐剂的各实验中，均没有出现因注射本发明而导致仔猪在注射部位出现肉芽肿等不良反应。

本发明实施例提供的一种复合水溶性动物疫苗佐剂和疫苗以及疫苗的制备方法，其作用机制如下：树突状细胞靶向分子DCpep作为疫苗佐剂的主要作用是，能特异性结合DC并促进将抗原物质递呈给B细胞和T细胞；脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞有效抗原肽为BP-8(GNVTPRVS)，T细胞有效抗原肽为TP-7(SKRTSAL)能特异性的诱导B细胞和T细胞的活化，增强对DC递呈的抗原物质的反应性。因此，上述佐剂成分起到免疫协同作用，提高抗原物质的免疫刺激作用，进而增强体液免疫和细胞免疫。

同时，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白全长为331个氨基酸，人工合成和重组表达的成本较高，本研究创造性通过蛋白结构预测和验证，筛选获得其B淋巴细胞抗原表位八肽和T淋巴细胞抗原表位七肽，可通过人工合成等比较经济的方面获得高纯度的多肽分子，与DCpep十二肽共同制备免疫佐剂，目前未见相同报道。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种复合水溶性动物疫苗佐剂，其特征在于，包括：乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，树突状细胞靶向诱导肽DCpep，桔梗皂苷D，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8和T细胞抗原肽TP-7。

2.根据权利要求1所述的复合水溶性动物疫苗佐剂，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8氨基酸序列为：GNVTPRVS；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7氨基酸序列为：SKRTSAL。

3.根据权利要求2所述的复合水溶性动物疫苗佐剂，其特征在于，所述复合水溶性动物疫苗佐剂各成份的质量配比满足以下条件：总质量份按100份计，所述乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA为1.0-2.5份；所述树突状细胞靶向诱导肽DCpep为0.05-0.1份；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8为0.08-0.16份；所述脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7为0.08-0.16份。

4.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的复合水溶性动物疫苗佐剂和抗原。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述复合水溶性动物疫苗佐剂和抗原的质量比为4：1-5：1。

6.一种权利要求5所述的疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:按成分配比，分别称取配制复合水溶性动物疫苗佐剂配方的各成分；

S2:取乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，用纯净水将其溶解配置成乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液；

S3:将所述的树突状细胞靶向诱导肽DCpep，桔梗皂苷D，脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的B细胞抗原肽BP-8和脑膜炎奈瑟氏球菌PorB蛋白的T细胞抗原肽TP-7添加到乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶液中，组成复合水溶性动物疫苗佐剂；

S4:将复合水溶性动物疫苗佐和抗原，按质量比4：1-5：1进行混合均匀，制备疫苗。

Images