CN113827740A - 一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，包括以下步骤：步骤一、初选佐剂对小鼠的免疫试验；步骤二、优化药物组合佐剂剂量筛选试验；步骤三、符合佐剂配方的筛选试验。本发明与现有技术相比的优点在于：本试验步骤清晰合理，选用的试剂贴合实际，试验标准、细节设计完整，筛选的复合疫苗佐剂经过初步的研究证实，能够增强ICR小鼠的免疫应答反应，具有一定的研究价值，适用性好，便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程，具体是指一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法。
背景技术
疫苗是目前人们在畜牧业生产实践中控制动物疾病最重要、最高效、最经济方便的有效措施之一。伴随着科技的发展，各种新型疫苗不断的应用到实际生产中，与传统疫苗相比其虽然具有安全、可靠的优点。疫苗佐剂(Vaccine Adjuvant)又称为佐剂或者抗原佐剂，是一种能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用且自身没有抗原特性的一类物质。它可以增强疫苗的免疫性能，提高受免机体的自我保护能力，并且会减少疫苗的用量，降低成本。本研究将远志总皂苷(Platycodon tenuifoliumsaponins，PTS)、桔梗总皂苷(Platycodon grandiflorumsaponins，PGS))、桔梗皂苷 D(Platycodin D，PD)以及一种多肽(Polypeptide，PP)作为研究材料，以鸡卵清白蛋白(OVA)作为模式抗原，然后通过试验筛选出一种佐剂效果强、安全性高的复合疫苗佐剂用于临床生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是新型免疫原性较弱，它不能在体内诱导强烈的免疫效应，只有依靠疫苗佐剂才能诱导其产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一、初选佐剂对小鼠的免疫试验，首先通过皮下注射的方式将OVA和单组份疫苗佐剂免疫小鼠，并选取经过大量临床试验证明佐剂效应良好的Quil A作为阳性对照组。免疫程序为：将ICR小鼠随机分成 10组，并设立空白对照组，每组8只并分组编号，以OVA作为抗原，各试验组分别注射相应的佐剂，此为首次免疫(第0d)，首免后第14d进行二次免疫，在首免后第28d取样检测。检测的指标包括以下几种：小鼠血清中IL-4、IFN-γ和IgG的分泌量；小鼠脾淋巴细胞增殖指数(SI)；小鼠的免疫器官脏器指数等，结果表明PTS、PGS以及二者分别与PP的组合佐剂的免疫效果较好，明显优于PD以及PD与PP 的组合佐剂，佐剂效果差异显著(0.01＜P＜0.05)或极显著(P＜0.01)，筛选后将符合标准的试剂组进行步骤二的再次筛选；
步骤二、优化药物组合佐剂剂量筛选试验，目的是研究组合佐剂的免疫效果有无剂量依赖性，具体分组为：将ICR小鼠分为8组，设立OVA组、PTS+PP低剂量组、PTS+PP中剂量组、PTS+PP高剂量组、 PGS+PP低剂量组、PGS+PP中剂量组、PGS+PP高剂量组以及Quil A组作为对照组，免疫程序和检测的指标同步骤一的试验，筛选后将符合标准的试剂组进行步骤三的最终筛选；
步骤三、复合佐剂配方的筛选试验，将ICR小鼠随机分为8组，分别为OVA组、OVA+ISCOM(Quil A)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组、PGS+PP组、OVA+ISCOM(PTS+PP)组、OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组、OVA+PTS+PP组，将步骤二筛选出的合适的剂量与卡波姆混合使用，用以检测其免疫指标的大小，结果表明，OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组的免疫效果强于OVA+ISCOM(PGS+PP)组和 OVA+ISCOM(PTS+PP)组，既提高了佐剂的安全性又提高了免疫效力。
本发明与现有技术相比的优点在于：本试验步骤清晰合理，选用的试剂贴合实际，试验标准、细节设计完整，筛选的复合疫苗佐剂经过初步的研究证实，能够增强ICR小鼠的免疫应答反应，具有一定的研究价值，适用性好，便于推广。
作为改进，步骤一的筛结果显示，优选的佐剂是PTS+PP的组合佐剂以及PGS+PP的组合佐剂。
作为改进，步骤二的结果显示，PGS+PP中、高剂量组与低剂量组的0.01＜P＜0.05表示差异显著，P ＜0.01表示差异极显著，中剂量组与高剂量组间相比较P＞0.05表示基本差异不显著，PTS+PP组的剂量试验与PGS+PP组的剂量试验基本相似。
作为改进，步骤一的检测指标包括以下几种：小鼠血清中IL-4、IFN-γ和IgG的分泌量；小鼠脾淋巴细胞增殖指数(SI)；小鼠的免疫器官脏器指数等，结果表明PTS、PGS以及二者分别与PP的组合佐剂的免疫效果较好，明显优于PD以及PD与PP的组合佐剂，即0.01＜P＜0.05表示佐剂效果差异显著，P ＜0.01表示佐剂效果差异极显著。
作为改进，步骤一的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果； 3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性 IgG含量测定结果。
作为改进，步骤二的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果； 3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性 IgG含量测定结果。
作为改进，步骤三的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果； 3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性 IgG含量测定结果。
作为改进，步骤二的筛选结果为通过剂量试验得到初步证明，选用桔梗总皂苷+多肽以及远志总皂苷 +多肽的中剂量组进行下一步研究，做成新型的复合佐剂。
作为改进，步骤二的筛选结果是ISCOM(PGS+PP)佐剂组和ISCOM(PTS+PP)佐剂组分别加入卡波姆按比例混合后免疫小鼠的效果，优于不加卡波姆的佐剂。
附图说明
图1是初选佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠的脾脏指数示意图。
图2是初选佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠的胸腺指数示意图。
图3是初选佐剂对Con A诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图4是初选佐剂对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图5是初选佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IL-4含量示意图。
图6是初选佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IFN-γ含量示意图。
图7是初选佐剂对小鼠OVA特异性IgG的含量示意图。
图8是不同剂量佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠的脾脏指数示意图。
图9是不同剂量佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠的胸腺指数示意图。
图10是不同剂量佐剂对Con A诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图11是不同剂量佐剂对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图12是不同剂量佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IL-4含量示意图。
图13是不同剂量佐剂对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IFN-γ含量示意图。
图14是不同剂量佐剂对小鼠OVA特异性IgG的含量示意图。
图15是佐剂不同配方对小鼠免疫试验中各组小鼠的脾脏指数示意图。
图16是佐剂不同配方对小鼠免疫试验中各组小鼠的胸腺指数示意图。
图17是佐剂不同配方对Con A诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图18是佐剂不同配方对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用示意图。
图19是佐剂不同配方对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IL-4含量示意图。
图20是佐剂不同配方对小鼠免疫试验中各组小鼠血清IFN-γ含量示意图。
图21是佐剂不同配方对小鼠免疫试验中各组小鼠免疫球蛋白IgG含量示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
本发明在具体实施时，一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一、初选佐剂对小鼠的免疫试验，首先通过皮下注射的方式将OVA和单组份疫苗佐剂免疫小鼠，并选取经过大量临床试验证明佐剂效应良好的Quil A作为阳性对照组，免疫程序为：将ICR小鼠随机分成10组，并设立空白对照组，每组8只并分组编号，以OVA作为抗原，各试验组分别注射相应的佐剂，此为首次免疫(第0d)，首免后第14d进行二次免疫，在首免后第28d取样检测，筛选后将符合标准的试剂组进行步骤二的再次筛选；
步骤二、优化药物组合佐剂剂量筛选试验，目的是研究组合佐剂的免疫效果有无剂量依赖性，将ICR 小鼠分为8组，设立OVA组、PTS+PP低剂量组、PTS+PP中剂量组、PTS+PP高剂量组、PGS+PP低剂量组、 PGS+PP中剂量组、PGS+PP高剂量组以及Quil A组作为对照组，免疫程序和检测的指标同步骤一的试验筛选后将符合标准的试剂组进行步骤三的最终筛选；
步骤三、复合佐剂配方的筛选试验，将ICR小鼠随机分为8组，分别为OVA组、OVA+ISCOM(Quil A)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组、PGS+PP组、 OVA+ISCOM(PTS+PP)组、OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组、OVA+PTS+PP组，将步骤二筛选出的合适的剂量与卡波姆混合使用，用以检测其免疫指标的大小，结果表明，OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组的免疫效果强于OVA+ISCOM(PGS+PP)组和 OVA+ISCOM(PTS+PP)组，既提高了佐剂的安全性又提高了免疫效力。
所述步骤一的筛选结果显示，优选的佐剂是PTS+PP的组合佐剂以及PGS+PP的组合佐剂。
所述步骤二的结果显示，PGS+PP中、高剂量组与低剂量组的0.01＜P＜0.05表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，中剂量组与高剂量组间相比较P＞0.05表示基本差异不显著，PTS+PP组的剂量试验与 PGS+PP组的剂量试验基本相似。
所述步骤一的检测指标包括以下几种：小鼠血清中IL-4、IFN-γ和IgG的分泌量；小鼠脾淋巴细胞增殖指数(SI)；小鼠的免疫器官脏器指数等，结果表明PTS、PGS以及二者分别与PP的组合佐剂的免疫效果较好，明显优于PD以及PD与PP的组合佐剂，即0.01＜P＜0.05表示佐剂效果差异显著，P＜0.01表示佐剂效果差异极显著。
所述步骤一的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对 ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
所述步骤二的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对 ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用； 5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
所述步骤三的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对 ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用； 5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
所述步骤二的筛选结果为通过剂量试验得到初步证明，选用桔梗总皂苷+多肽以及远志总皂苷+多肽的中剂量组进行下一步研究，做成新型的复合佐剂。
所述步骤二的筛选结果是ISCOM(PGS+PP)佐剂组和ISCOM(PTS+PP)佐剂组分别加入卡波姆按比例混合后免疫小鼠的效果，优于不加卡波姆的佐剂。
本发明的工作原理：本技术方案共包括三个试验：
一、试验一：初选佐剂对小鼠的免疫试验
将ICR小鼠随机分成10组，包括空白对照组、OVA组和试验组，每组8只，以鸡卵清白蛋白 (OVA)作为抗原，其余各组小鼠均皮下注射OVA，剂量为100μg/只，空白对照组皮下注射同等剂量的生理盐水，各试验组分别注射相应量的佐剂，此为首次免疫，首免后第14d进行二次免疫，首免后第28 d取样检测。具体试验设计见表1。
表1
实验结果：
1、小鼠脏器指数的测定结果：
（1） 小鼠脾脏指数的测定结果
不同种类的的佐剂对受免小鼠的脾脏指数结果见图1，由图可得出，与空白对照组和OVA组相比较，各佐剂组对小鼠脾脏生长的刺激作用表现为差异极显著(P＜0.01)，而且OVA组对小鼠脾脏的刺激作用与空白对照组相比较同样差异极显著(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽组对脾脏生长的刺激效果优于多肽组、桔梗总皂苷组、远志总皂苷组和桔梗皂苷D组(0.01＜P＜0.05)，与桔梗总皂苷+多肽组、桔梗皂苷D+多肽组和Quil A组差异不显著(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽组与其它组相比与远志总皂苷+多肽组类似；桔梗皂苷D+多肽组与桔梗皂苷D组和多肽组均差异不显著(P＞0.05)；Quil A组与远志总皂苷+多肽组、桔梗总皂苷+多肽组、桔梗皂苷D+多肽组均差异不显著(P＞0.05)，与其余佐剂试验组相比差异极显著 (P＜0.01)或差异显著(0.01＜P＜0.05)。
(2)小鼠胸腺指数的测定结果
从图2可以看出，不同类型的佐剂对受免小鼠的胸腺指数的影响有所不同，与空白对照组和OVA组相比，各佐剂组对胸腺的刺激指数差异极显著(P＜0.01)或差异显著(0.01＜P＜0.05)，此外，OVA组对胸腺的生长刺激作用与空白对照组相比有显著差异(0.01＜P＜0.05)；远志总皂苷+多肽组对胸腺指数的作用优于远志总皂苷组和桔梗皂苷D组(0.01＜P＜0.05)，与多肽组和桔梗总皂苷组相比无显著差异 (P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽组与远志总皂苷组和桔梗皂苷D组相比有显著差异(0.01＜P＜0.05)，与多肽组和桔梗总皂苷组相比，其对免疫器官胸腺的刺激作用无显著差异(P＞0.05)；远志总皂苷+多肽组和桔梗总皂苷+多肽组比Quil A组、桔梗皂苷D+多肽组的数稍微大一些，但差异不显著。
2、不同类型的佐剂对受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
(1)对Con A诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
结果见图3，由图可知，与空白对照组和OVA组相比，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用明显更强(P ＜0.01)，此外，OVA组对淋巴细胞的刺激作用比空白对照组更强，二者差异极显著(P＜0.01)；桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组以及Quil A组对ConA诱导的小鼠淋巴细胞的效果极优于桔梗皂苷D 组(P＜0.01)，也优于桔梗总皂苷和远志总皂苷的单组份佐剂(0.01＜P＜0.05)而且桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组这两组的SI的数值也大于Quil A组。总体来看，各佐剂试验组对脾淋巴细胞的刺激作用优选桔梗总皂苷+多肽组和远志总皂苷+多肽组。
(2)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
相关结果见图4，由图可知，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用效果明显好于空白组和OVA组(P＜ 0.01)；佐剂试验组中，桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组对淋巴细胞的增殖作用强于或更强于其它各佐剂试验组(P＜0.01或0.01＜P＜0.05)，而且各试验组中对脾淋巴细胞的刺激作用最差的是桔梗皂苷D组。综上，各佐剂试验组对脾淋巴细胞的刺激作用优选桔梗总皂苷+多肽组和远志总皂苷+多肽组。
3、小鼠血清中细胞因子含量的测定结果
(1)小鼠血清中IL-4含量测定结果
小鼠血清IL-4的测定结果见图5，从图来看，各佐剂实验组IL-4含量水平显著高于OVA组与空白对照组(P＜0.01)，且各实验组IL-4的含量最少的是桔梗皂苷D组，就桔梗总皂苷组、远志总皂苷组和桔梗皂苷D组三组相比较而言就桔梗总皂苷组、远志总皂苷组的IL-4含量极显著于桔梗皂苷D组(P＜ 0.01)；且桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组刺激免疫系统分泌IL-4的作用强于或明显强于其它实验组(P＜0.01或0.01＜P＜0.05)，且桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组和桔梗皂苷D+多肽组的效果与对照组Quil A组相当(P＞0.05)。综上，各佐剂试验组IL-4含量优选桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组和桔梗皂苷D+多肽组。
(2)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果
小鼠血清中IFN-γ的测定结果如图6，由结果分析得知，各佐剂试验组IFN-γ的含量比空白对照组和OVA组的含量要大得多，差异极显著(P＜0.01)；桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组和桔梗皂苷D+多肽组的效果与对照组Quil A组差异不显著(P＞0.05)，且与桔梗总皂苷、远志总皂苷、桔梗皂苷 D以及多肽组相比均为差异极显著(P＜0.01)；单组份间桔梗总皂苷组、远志总皂苷组与桔梗皂苷D组间差异极显著，桔梗总皂苷组与远志总皂苷组间差异不显著(P＞0.05)。综上可知，各佐剂试验组IFN-γ含量优选桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组和桔梗皂苷D+多肽组。
4、小鼠OVA特异性IgG含量测定结果
小鼠血清中免疫球蛋白IgG含量测定结果见图7。从总体上看，各佐剂实验组与空白对照组和OVA组相之前差异极显著(P＜0.01)；而且Quil A组IgG的含量与各佐剂试验组、空白组或OVA组间差异显著 (0.01＜P＜0.05)或差异极显著(P＜0.01)；
而且桔梗总皂苷+多肽组、远志总皂苷+多肽组与桔梗皂苷D+多肽组差异显著(0.01＜P＜0.05)，和其它单组份佐剂组相比较差异显著(0.01＜P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。综合来看，刺激机体产生 IgG增多的优选桔梗总皂苷+多肽组和远志总皂苷+多肽组。
5、总结
本研究对初选的疫苗佐剂的免疫效果进行了评价，以期从中筛选出免疫促进效力强的佐剂进行下一步的试验。从上述几个指标的测试结果可以得知，各个初选的疫苗佐剂对机体的免疫系统都具有促进作用，桔梗皂苷D的佐剂性能稍弱，桔梗总皂苷+多肽组和远志总皂苷+多肽组比其它单组份或配伍组更能显著刺激机体的免疫器官的生长和细胞因子的分泌。因此选择桔梗总皂苷+多肽组和远志总皂苷+多肽组进行下一步试验研究。
二、试验二：优化药物组合佐剂剂量筛选试验
将ICR小鼠随机分成8组，每组8只，分组编号，鸡卵清白蛋白(OVA)作为抗原，皮下注射50μg/ 只，各个试验组分别注射相应的佐剂，此为首次免疫(第0d)，二免在首免后第14d进行，首免后第 28d取样检测。具体试验设计见表2。
表2
试验结果：
1、小鼠脏器指数的测定结果
(1)小鼠脾脏指数的测定结果
各组佐剂对受免小鼠的脾脏指数见图8，由图可知，与OVA组相比，各佐剂组刺激脾脏生长的作用差异极显著(P＜0.01)或差异显著(0.01＜P＜0.05)；远志总皂苷+多肽中剂量组对小鼠脾脏的刺激作用与高剂量组间无显著差异性(P＞0.05)，与低剂量组相比有极显著的差异性(P＜0.01)；桔梗总皂苷+ 多肽中剂量组的脾脏指数与高剂量组间差异不显著(P＞0.05)，与低剂量组差异极显著(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中、高剂量组，桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与Quil A组均差异不显著(P＞0.05)。
(2)小鼠胸腺指数的测定结果
各组佐剂对受免小鼠的胸腺指数见图9，由图可知，与OVA组相比，各佐剂组刺激脾脏生长的作用差异极显著(P＜0.01)或差异显著(0.01＜P＜0.05)；远志总皂苷+多肽中剂量组与高剂量组的胸腺指数无显著差异(P＞0.05)，与低剂量组相比差异极显著(P＜0.01)，高剂量组和低剂量组对胸腺的刺激作用差异显著(0.01＜P＜0.05)；桔梗总皂苷+多肽中剂量组与高剂量组差异不显著(P＞0.05)，与低剂量组差异极显著(P＜0.01)高剂量组与低剂量组差异极显著(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中、高剂量组，桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组的胸腺指数稍大于Quil A组，但均差异不显著(P＞0.05)。
2、不同类型的佐剂对受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
(1)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
相关测定结果如图10所示，与OVA组相比，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用极显著(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中剂量组和高剂量组与低剂量组相比，其对ConA诱导的脾淋巴细胞的刺激作用更强(P＜ 0.01)，而且高、中剂量组间虽然对淋巴细胞的刺激作用有轻微的差异，但两者差异不显著(P＞ 0.05)；桔梗总皂苷+多肽的低、中、高剂量组对ConA诱导的脾淋巴细胞的刺激作用与远志总皂苷+多肽的低、中、高剂量组的刺激作用相似，这说明就ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，桔梗总皂苷和远志总皂苷与多肽的复合佐剂中、高剂量组无显著差异性(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与远志总皂苷中、高剂量组四组间无明显差异。
(2)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
相关测定结果如图11所示，由图可知，与OVA组相比，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用差异显著 (0.01＜P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中剂量组和高剂量组与低剂量组相比，其对OVA诱导的脾淋巴细胞的刺激作用分别为差异极显著(P＜0.01)和差异显著(0.01＜P＜0.05)，而且中剂量组对淋巴细胞的刺激作用稍微强于高剂量组，但两者差异不显著(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽的中、高剂量组与低剂量组间差异显著(0.01＜P＜0.05)。从图中可得知，桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与远志总皂苷中、高剂量组四组间无明显差异。
3、小鼠血清中细胞因子含量的测定结果
(1)小鼠血清中IL-4含量测定结果
小鼠血清细胞因子IL-4的测定结果见图12，从图来看，各佐剂实验组IL-4含量水平显著高于OVA 组(P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中剂量组、高剂量组的IL-4的含量与低剂量组间有显著性差异(P＜ 0.01)，高剂量组刺激机体分泌IL-4的作用稍微强于中剂量组，但二者无显著性差异(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与低剂量组间差异极显著(P＜0.01)或显著(0.01＜P＜0.05)，高剂量组刺激机体分泌IL-4的作用稍微强于中剂量组，但二者无显著性差异(P＞0.05)；而且桔梗总皂苷+多肽的中剂量组、高剂量组和远志总皂苷+多肽的中剂量组、高剂量组与Quil A组同样无显著性差异(P＞ 0.05)；从图中还能看出，桔梗总皂苷+多肽的复合佐剂诱导IL-4的分泌作用稍微强于远志总皂苷+多肽的复合佐剂。
(2)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果
小鼠血清中IFN-γ的测定结果如图13，由结果分析得知，各实验组IFN-γ的含量显著高于OVA组 (P＜0.01)；远志总皂苷+多肽中、高剂量组的IFN-γ的IFN-γ的含量与低剂量组间差异非常显著(P＜ 0.01)，高剂量组刺激机体分泌IFN-γ的作用稍微强于中剂量组，但二者差异不显著(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与低剂量组间IFN-γ的含量差异有极显著性(P＜0.01)，高剂量组刺激机体分泌IFN-γ的作用稍微强于中剂量组，但二者无显著性差异(P＞0.05)；而且桔梗总皂苷+多肽高剂量组与远志总皂苷+多肽高剂量组IFN-γ的量有显著性差异(0.01＜P＜0.05)。
4、小鼠OVA特异性IgG含量测定结果
小鼠血清中IgG含量测定结果见图14，从总体上看，各实验组IgG的含量显著高于OVA组(P＜ 0.01)；远志总皂苷+多肽中剂量组、高剂量组与低剂量组间IgG的含量差异极显著(P＜0.01)，中剂量组刺激机体分泌IgG的作用稍微强于高剂量组，但二者无显著性差异(P＞0.05)；桔梗总皂苷+多肽中剂量组、高剂量组与低剂量组间差异极显著(P＜0.01)或显著(0.01＜P＜0.05)，中剂量组刺激机体分泌IgG的作用稍微强于高剂量组，但二者之间无显著性差异(P＞0.05)；需要特别指出的是远志总皂苷 +多肽中剂量组和桔梗总皂苷+高剂量组相比刺激机体产生IgG的能力要强，二者差异显著(0.01＜P＜ 0.05)。
5、总结
1、桔梗总皂苷+多肽中、高剂量组与低剂量组相比较，对机体的免疫调节作用表现出差异显著性(0.01＜P＜0.05)或极显著性(P＜0.01)，中剂量组、高剂量组之间差异不显著(P＞0.05)。
2、远志总皂苷+多肽中剂量组、高剂量组与低剂量组相比较，对机体的免疫调节作用表现出差异显著性(0.01＜P＜0.05)或极显著性(P＜0.01)，中剂量组、高剂量组之间差异不显著(P＞0.05)。
通过本试验研究结果证明，运用中剂量组进行下一步研究。
三、试验三：复合疫苗佐剂的配方研究
佐剂的选择对疫苗的免疫效果具有重要的作用。不同的佐剂对机体免疫系统的诱导作用也各有不同。本试验将试验二筛选出的合适的剂量与卡波姆混合使用，用以检测其免疫指标的大小。卡波姆 (Carbomer)是丙烯酸与烯丙基蔗糖交联的高分子聚合物。卡波姆的性状为白色，易溶于水和乙醇等。在药剂中主要用作缓释剂、助悬剂、增稠剂等。卡波姆已经被广泛用于医药工业、日化工业等。
将ICR小鼠随机分成8组，每组8只，分组编号，以鸡卵清白蛋白(OVA)作为抗原，皮下注射 50μg/只，各试验组分别注射相应的佐剂，这是首次免疫(第0d)，第二次免疫在首免后第14d进行，首免后第28d取样检测。具体试验设计见表3。
表3
试验结果：
1、小鼠脏器指数的测定结果
(1)小鼠脾脏指数的测定结果
小鼠脾脏指数的测定结果如图15，从结果可知，各佐剂实验组的脾脏指数和OVA组差异极显著(P＜ 0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异显著(0.01＜P＜0.05)，与ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组差异同样显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，其刺激脾脏生长的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异显著(0.01 ＜P＜0.05)，与ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异同样显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，其刺激脾脏生长的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；而且 ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组、ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比具有差异显著性(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞0.05)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，其刺激脾脏生长的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组、ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比具有差异显著性(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(QuilA) 组相比差异不显著(P＞0.05)。
(2)小鼠胸腺指数的测定结果
小鼠胸腺指数的测定结果如图16，从结果可知，各佐剂实验组的胸腺指数和OVA组差异极显著(P＜ 0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异不显著(P＞0.05)，与ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组差异同样不显著(P＞0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，其刺激胸腺生长的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异不显著(P＞ 0.05)，与ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组和远志总皂苷+多肽组相比，其刺激胸腺生长的能力具有差异显著性(0.01＜P＜0.05)；而且ISCOM(PTS+PP) +卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比具有差异显著性(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(QuilA)组相比差异不显著(P＞0.05)。
2、不同类型的佐剂对受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
(1)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
图20显示了各组佐剂对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用，由图17可知，与OVA组相比，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用极显著(P＜0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异极显著 (P＜0.01)，与ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组差异同样极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组桔梗总皂苷+多肽组相比，其诱导淋巴细胞增殖的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP) 与远志总皂苷+多肽组差异极显著(P＜0.01)，与ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异极显著(P＜ 0.01)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与远志总皂苷+多肽组相比，其诱导淋巴细胞增殖的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异极显著(P ＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比具有差异极显著性(P＜ 0.01)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞0.05)。
(2)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用
图18反映了各组佐剂对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用，与OVA组相比，各佐剂组对淋巴细胞的刺激作用极显著(P＜0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异极显著(P＜ 0.01)，与ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组差异显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，其诱导淋巴细胞增值的能力具有极显著性差异(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异显著(0.01＜P＜0.05)，与ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与远志总皂苷+多肽组相比，其诱导淋巴细胞增殖的能力具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P ＞0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异显著(0.01＜P＜ 0.05)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞ 0.05)。
3、小鼠血清中细胞因子含量测定结果
(1)小鼠血清中IL-4含量测定结果
小鼠血清细胞因子IL-4的测定结果见图19，从图来看，各佐剂实验组IL-4含量水平显著高于OVA 组(P＜0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异极显著(P＜0.01)，与ISCOM(PGS+PP)+ 卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异极显著(P＜0.01)，与 ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与远志总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比，其诱导机体分泌IL-4的能力差异不显著(P＞0.05)，ISCOM(PTS+PP)组、ISCOM(PGS+PP)组与对照组 ISCOM(Quil A)组相比差异极显著(P＜0.01)。
(2)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果
小鼠血清细胞因子IFN-γ的测定结果见图20，从图来看，各佐剂实验组IFN-γ含量水平显著高于 OVA组(P＜0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异极显著(P＜0.01)，与 ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异极显著(P＜ 0.01)，与ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与远志总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与对照组 ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A) 组相比，其诱导机体分泌IFN-γ的能力有极显著性差异(P＜0.01)，ISCOM(PTS+PP)组与对照组 ISCOM(Quil A)组相比差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异显著(0.01＜P＜0.05)；ISCOM(PGS+PP)组诱导机体产生IFN-γ的能力与ISCOM(PTS+PP)组相比差异极显著(P＜0.01)。
4、小鼠血清中IgG含量测定结果
小鼠血清中免疫球蛋白IgG的测定结果见图21，从图来看，各佐剂实验组IgG含量水平显著高于OVA 组(P＜0.01)；ISCOM(PGS+PP)与桔梗总皂苷+多肽组差异不显著(P＞0.05)，与ISCOM(PGS+PP)+ 卡波姆组差异极显著(P＜0.01)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和桔梗总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；ISCOM(PTS+PP)与远志总皂苷+多肽组差异极显著(P＜0.01)，与 ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组差异显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PTS+PT)+卡波姆组与远志总皂苷+多肽组相比，具有差异极显著性(P＜0.01)；而且ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A) 组相比差异显著(0.01＜P＜0.05)，ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组与对照组ISCOM(Quil A)组相比，其诱导机体分泌IgG的能力无显著性差异(P＞0.05)，ISCOM(PTS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞0.05)，ISCOM(PGS+PP)组与对照组ISCOM(Quil A)组相比差异不显著(P＞ 0.05)；ISCOM(PGS+PP)组诱导机体产生IgG的能力与ISCOM(PTS+PP)组相比差异显著(0.01＜P＜ 0.05)。
5、小结
1、用桔梗总皂苷+多肽和远志总皂苷+多肽制备的新型免疫刺激复合物佐剂，其对机体的免疫调节作用优于桔梗总皂苷+多肽和远志总皂苷+多肽的复合佐剂。
2、卡波姆+ISCOM(PTS+PP)佐剂组和卡波姆+ISCOM(PGS+PP)佐剂组免疫效果基本优于 ISCOM(PTS+PP)佐剂组和ISCOM(PGS+PP)佐剂组，这可能与卡波姆的性质有关。
综上：
1、本试验通过小鼠免疫试验，筛选出桔梗总皂苷+多肽组以及远志总皂苷+多肽组为初选佐剂。
2、通过剂量试验初步证明，选用桔梗总皂苷+多肽以及远志总皂苷+多肽的中剂量组进行下一步研究，做成新型的复合佐剂。
3、通过试验三可得知，ISCOM(PGS+PP)佐剂组和ISCOM(PTS+PP)佐剂组分别加入卡波姆按比例混合后免疫小鼠的效果，优于不加卡波姆的佐剂。
名词解释：
OVA：鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)也称鸡卵清白蛋白，由386aa组成，分子量约45kD。
PTS：甲苯磺酸，广泛用于合成医药、农药、聚合反应的稳定剂及有机合成(酯类等)的催化剂。
PP：聚丙烯，是丙烯通过加聚反应而成的聚合物。
PGS：为无色混浊液，呈弱酸性(pH6.5)，富含蛋白水解酶，纤维蛋白溶酶，有液化精液的作用；还含高浓度的锌、柠檬酸和酸性磷酸酶，后二者是检测前列腺功能和法医鉴定精液的敏感指标。
ISCOM：免疫刺激复合物。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、初选佐剂对小鼠的免疫试验，首先通过皮下注射的方式将OVA和单组份疫苗佐剂免疫小鼠，并选取经过大量临床试验证明佐剂效应良好的QuilA作为阳性对照组，免疫程序为：将ICR小鼠随机分成10组，并设立空白对照组，每组8只并分组编号，以OVA作为抗原，各试验组分别注射相应的佐剂，此为首次免疫(第0d)，首免后第14d进行二次免疫，在首免后第28d取样检测，筛选后将符合标准的试剂组进行步骤二的再次筛选；
步骤二、优化药物组合佐剂剂量筛选试验，目的是研究组合佐剂的免疫效果有无剂量依赖性，将ICR小鼠分为8组，设立OVA组、PTS+PP低剂量组、PTS+PP中剂量组、PTS+PP高剂量组、PGS+PP低剂量组、PGS+PP中剂量组、PGS+PP高剂量组以及QuilA组作为对照组，免疫程序和检测的指标同步骤一的试验筛选后将符合标准的试剂组进行步骤三的最终筛选；
步骤三、复合佐剂配方的筛选试验，将ICR小鼠随机分为8组，分别为OVA组、OVA+ISCOM(Quil A)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)组、OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组、PGS+PP组、OVA+ISCOM(PTS+PP)组、OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组、OVA+PTS+PP组，将步骤二筛选出的合适的剂量与卡波姆混合使用，用以检测其免疫指标的大小，结果表明，OVA+ISCOM(PGS+PP)+卡波姆组和OVA+ISCOM(PTS+PP)+卡波姆组的免疫效果强于OVA+ISCOM(PGS+PP)组和OVA+ISCOM(PTS+PP)组，既提高了佐剂的安全性又提高了免疫效力。
2.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤一的筛选结果显示，优选的佐剂是PTS+PP的组合佐剂以及PGS+PP的组合佐剂。
3.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤二的结果显示，PGS+PP中、高剂量组与低剂量组的0.01＜P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，中剂量组与高剂量组间相比较P＞0.05表示基本差异不显著，PTS+PP组的剂量试验与PGS+PP组的剂量试验基本相似。
4.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤一的检测指标包括以下几种：小鼠血清中IL-4、IFN-γ和IgG的分泌量；小鼠脾淋巴细胞增殖指数(SI)；小鼠的免疫器官脏器指数等，结果表明PTS、PGS以及二者分别与PP的组合佐剂的免疫效果较好，明显优于PD以及PD与PP的组合佐剂，即0.01＜P＜0.05表示佐剂效果差异显著，P＜0.01表示佐剂效果差异极显著。
5.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤一的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
6.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤二的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
7.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤三的实验结果包括：1)小鼠脾脏指数的测定结果；2)小鼠胸腺指数的测定结果；3)对ConA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用结果；4)对OVA诱导的受免小鼠脾淋巴细胞的刺激作用；5)小鼠血清中IL-4含量测定结果；6)小鼠血清中IFN-γ含量测定结果；7)小鼠OVA特异性IgG含量测定结果。
8.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤二的筛选结果为通过剂量试验得到初步证明，选用桔梗总皂苷+多肽以及远志总皂苷+多肽的中剂量组进行下一步研究，做成新型的复合佐剂。
9.根据权利要求1所述的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于：所述步骤二的筛选结果是ISCOM(PGS+PP)佐剂组和ISCOM(PTS+PP)佐剂组分别加入卡波姆按比例混合后免疫小鼠的效果，优于不加卡波姆的佐剂。
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