CN107312815A - 一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法 - Google Patents

一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法 Download PDF

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CN107312815A CN201710506212.0A CN201710506212A CN107312815A CN 107312815 A CN107312815 A CN 107312815A CN 201710506212 A CN201710506212 A CN 201710506212A CN 107312815 A CN107312815 A CN 107312815A
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Abstract

本发明提供一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，包括：培养基制备；接种体分离；接种体鉴定；接种体保存；接种体复壮；接种孢子制备；鉴定设计；鉴定材料准备；对照品种选择；接种以及接种后管理；病情调查；抗病性评价；与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：通过人工接种方法，将植物病原菌直接接种到寄主植株或器官上，使其发病，并依据相关的抗性评价标准，来区分品种的抗病性。

Description

一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法
技术领域
本发明是一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，属于辣椒炭疽病室内抗性鉴定技术领域。
背景技术
辣椒炭疽病一般由5种病原菌引起，即红色炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides＝Gloeosporium piperatum)，黑色炭疽病菌 (C.coccodes＝C.nigrum)、黑点炭疽病菌(C.capsici)、尖孢炭疽菌(C.acutatu)和黑线炭疽菌(C.dematium)，在湖南省以红色炭疽菌危害为主。辣椒炭疽病主要危害叶片和果实。初侵染时呈水浸状黄褐色圆斑，进而发展为中央灰褐色，有同心轮纹，上生小黑点的圆型或不规则型病斑，干燥时呈现膜状且易破裂。病菌侵染叶片时，初期病斑呈褪绿呈水渍状，慢慢扩大，病斑中间灰白色，周围褐色。在果实上，病斑表面初生为水渍状，逐渐扩展为褐色凹陷，圆形或不规则形状，病斑上生有黑点，为病原菌分生孢子，受害的辣椒茎病部呈不规则或梭形病斑，纵裂凹陷。在我国辣椒种植区，辣椒炭疽病是一种常发真菌性病害，辣椒染病后可引起(30-85)％产量损失。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的问题,本发明使用方便，便于操作，设计巧妙，提高了市场竞争力。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，包括：
培养基制备；
接种体分离；
接种体鉴定；
接种体保存；
接种体复壮；
接种孢子制备；
鉴定设计；
鉴定材料准备；
对照品种选择；
接种以及接种后管理；
病情调查；
抗病性评价。
进一步地，所述培养基制备包括制备水琼脂培养基以及制备马铃薯培养基：在制备水琼脂培养基中，以1L培养基为列：用5个250ml三角瓶每个装入200ml纯净水和4g琼脂粉然后加热至121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，在制备马铃薯培养基中，以1L为列：称取马铃薯200g，切成细条或片状，放入锅中蒸煮当马铃薯煮至熟而不烂时，在1L量筒上用纱布过滤马铃薯残渣，定容至1L，用5个250ml三角瓶每个分别加入200ml滤液、4g葡萄糖、和4g琼脂粉然后121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。
进一步地，接种体分离的具体步骤为：从田间采集刚开始发病的辣椒炭疽病病果，在超净工作台上，用手术刀取0.5cm×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸钠中浸泡2min，用灭菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干病健块的水分，插入倒的水琼脂平板上，放置28℃人工气候箱中黑暗培养2d，待长出菌丝后再转接在PDA平板上，获得分离物。
进一步地，接种体鉴定的具体步骤为：将培养7d后的分离物在显微镜下进行菌丝、孢子形态观察，如符合辣椒炭疽病病原菌的形态特征，用CTAB法提取分离物菌丝DNA，经过对获得的DNA进行电泳分析，分离物的DNA提取成功将分离物的DNA进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂凝胶电泳检测，将得到的rDNA ITS序列提交至GenBank,BLAST进行对比，如与辣椒炭疽病病原物的 ITS序列具有99％的相似，即可确定是辣椒炭疽病病原菌。
进一步地，用CTAB法提取分离物菌丝DNA的具体步骤为：将培养(5～7)d 的分离物，用干净灭菌手术刀刮菌丝与一干净灭菌的1.5mL离心管中，加500μl TE缓冲液混匀，加入10％SDS溶液30μl和10mg/ml蛋白酶K(PK)3μl混匀， 37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μl Nacl(5M)混匀。加入80μl CTAB/Nacl混匀，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀， 12000r/min离心15min。取上清至新1.5mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)混匀，12000r/min离心15min。取上清至新1.5mL 离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min。取上清至新1.5mL离心管，加入2/3体积异丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min 离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口，沉淀用70％冷乙醇洗涤(轻轻来回倒置离心管)12000r/min离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口， 55℃干燥15min。加入20～50μl TE缓冲液溶解DNA沉淀，用1％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和DNA，将混有上样缓冲液的DNA加至样品孔中，用DNA Maker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否提取出DNA电泳带，拍摄并记录实验结果，经过对实验结果的观察，分离物DNA提取成功，剩下的DNA在-20℃保存。
进一步地，接种体保存的具体步骤为：将鉴定为辣椒炭疽病的病原菌，进行3次单孢分离纯化后，转接于含PDA斜面培养基的5cm冷冻离心管上，于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，在斜面上加倒入一层1cm厚灭菌矿物油后置4℃或室温保存。
进一步地，接种体复壮的具体步骤为：接种前需要进行病原物接种体的复壮，复壮方法为：将接种体培养在PDA培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.51cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病品种辣椒果实上，放入温度为28℃、湿度为90％的人工气候箱中光照和黑暗交替12/12h进行培养，等果实发病后进行病原菌分离。
进一步地，接种孢子制备的具体步骤为：将复壮分离后获得的分离物转接培养在PDA培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养7d，待菌丝长满平板后，将平板放入28℃的人工气候箱中光照和黑暗交替进行产孢，待产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌的擦镜纸过滤菌丝，制成浓度为1 ×105个/mL分生孢子的悬浮液供接种用。
进一步地，鉴定设计的具体步骤为：鉴定材料选择青果或红色成熟果，每个品种或资源材料设3-4次重复，每个重复不少于6个果，每次重复一半接种用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液1μl、一半接种的无菌水1μl。
进一步地，鉴定材料准备的具体步骤为：选取形状和成熟度一致、无病无虫危害的健康果实，将果实用清水洗净，晾干或在超净工作台上吹干，放入75％的酒精中浸泡2min，用1％次氯酸钠溶液中浸泡2min，用无菌水洗3次，然后在超净工作台中晾干。
进一步地，对照品种选择的具体步骤为：以亚蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品种PBC602和中国农业科学院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品种茄门厚皮辣椒分别作为室内抗病性鉴定的阳性和阴性对照品种，以各鉴定材料与对照相比的相对抗性来判定各鉴定材料的相对抗性。
进一步地，接种以及接种后管理的具体步骤为：在每个果实的中央部用微量注射器细刺破表皮后注入1μL用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液(1 ×105个/mL)，当全部接种完毕后，放入鉴定室内28℃黑暗保湿24h，以后每天光照12h，相对湿度为(80～100)％，温度控制在28℃。
进一步地，病情调查的具体步骤为：接种后(5～7)d进行病情调查，逐一观察果实每一接种处的病斑扩展情形，逐个果实观察发病情况，记载各病级病果数，并将发病结果记入。
进一步地，抗病性评价的具体步骤为：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3～4次重复病情指数平均数与对照病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在辣椒炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数>30，参鉴品种的空白对照的病情指数为0，即参鉴品种空白对照果实不发病，该抗性鉴定结果有效。
本发明的有益效果：本发明的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，通过自然诱发或人工接种等方法，将病原物直接或间接接种到寄主植株或器官上，使其发病，并依据相关的抗性评价标准，来区分品种的抗病性。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本发明提供一种技术方案：一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，包括：
培养基制备；
接种体分离；
接种体鉴定；
接种体保存；
接种体复壮；
接种孢子制备；
鉴定设计；
鉴定材料准备；
对照品种选择；
接种以及接种后管理；
病情调查；
抗病性评价。
培养基制备包括制备水琼脂培养基以及制备马铃薯培养基：在制备水琼脂培养基中，以1L为列：称取琼脂15～20g，用自来水定容到1000mL，煮沸后用量筒盛或烧杯盛培养基，然后分装在三角瓶中121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，在制备马铃薯培养基中，以1L为列：称取马铃薯200g，切成细条或片状，放入锅中蒸煮0.5h左右，当马铃薯煮至熟而不烂时，在烧杯或量筒上用纱布过滤马铃薯残渣，把收集的滤液放入洗干净的锅中，加入葡萄糖20g，琼脂(15～20)g煮沸后用量筒盛或烧杯盛培养基，用自来水定容到1000mL，然后分装在三角瓶中121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。
接种体分离的具体步骤为：从田间采集新鲜的辣椒炭疽病果，取0.5cm ×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸钠中浸泡 2min，用灭菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干病健块的水分，用灭菌镊子夹着病健部插入倒的水琼脂平板上，放置28℃人工气候箱中黑暗培养2d，待长出菌丝后再转接在PDA平板上，获得分离物。
接种体鉴定的具体步骤为：将培养7d后的分离物进行肉眼观察，菌落形态刚开始为橙红色，后变为褐色或深灰色，圆形，边缘整齐，菌落轮纹的分界线明显，菌丝呈白色，湿度大的情况下，菌落表面溢出淡红色孢子堆，在电子显微镜下观察其分生孢子盘无刚毛，分生孢子椭圆形，无色，单胞，大小为13.5μm×4.2μm，符合红色炭疽菌的形态特征，用CTAB法提取分离物菌丝DNA，经过对获得的DNA进行电泳分析，分离物的DNA提取成功将分离物的DNA进行PCR扩增，定性PCR扩增检测结果如表1，表2。
表1检测辣椒炭疽病的PCR引物
表2检测辣椒炭疽菌的PCR反应体系
组成 加样体积
10×PCR buffer 5μl
dNTP(10mmol/μl) 1μl
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl
引物TIS4(25μmol/μl) 2μl
引物TIS5(25μmol/μl) 2μl
模板DNA(100/μl) 1μl
双蒸水 38μl
总体积 50μl
95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环；最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。
扩增产物用1％琼脂凝胶电泳检测，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物，将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中，用DNA Maker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录实验结果。实验结果可以看出5个分离物的ITS片段均在(500～750)bp之间的一条特异性扩增条带(583bp)，与预期目的片段长度基本一致。
扩增产物用1％琼脂凝胶电泳检测，获得了1条550bp左右的清晰条带，经测序后得到的rDNA ITS序列提交至GenBank,BLAST结果表明与红色炭疽菌的ITS序列99％相同。
用CTAB法提取分离物菌丝DNA的具体步骤为：将培养(5～7)d的分离物，用干净灭菌手术刀刮菌丝与一干净灭菌的1.5mL离心管中，加500μl TE缓冲液混匀，加入10％SDS溶液30μl和10mg/ml蛋白酶K(PK)3μl混匀，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h。加入100μl Nacl(5M)混匀。加入80μl CTAB/Nacl 混匀，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min 离心15min。取上清至新1.5mL离心管。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液 (25:24:1)混匀，12000r/min离心15min。取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min。取上清至新1.5mL 离心管，加入2/3体积异丙醇，放入-20℃冰箱1h。12000r/min离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口，沉淀用70％冷乙醇洗涤(轻轻来回倒置离心管)12000r/min离心10min。去上清，用吸水纸吸干离心管口，55℃干燥15min。加入20～50μl TE缓冲液溶解DNA沉淀，用1％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和DNA，将混有上样缓冲液的DNA加至样品孔中，用DNA Maker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否提取出DNA电泳带，拍摄并记录实验结果，经过对实验结果的观察，分离物 DNA提取成功，剩下的DNA在-20℃保存。
接种体保存的具体步骤为：将鉴定为辣椒炭疽病的病原菌，进行3次单孢分离纯化后，转接于含PDA斜面培养基的5cm冷冻离心管上，于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，在斜面上加一层灭菌矿物油后置4℃或室温保存。
接种体复壮的具体步骤为：接种前需要进行病原物接种体的复壮，复壮方法为：将接种体培养在PDA培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.5cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病品种辣椒果实上，放入温度为28℃、湿度为90％的人工气候箱中光照和黑暗交替12/12h 进行培养，等果实发病后进行病原菌分离。
接种孢子制备的具体步骤为：将复壮分离后获得的分离物转接培养在PDA 培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养7d，待菌丝长满平板后，将平板放入28℃的人工气候箱中光照和黑暗交替进行产孢，待产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌的擦镜纸过滤菌丝，制成浓度为1×105个/mL分生孢子的悬浮液供接种用。
鉴定设计的具体步骤为：鉴定材料选择红色成熟果，每个品种或资源材料设3次重复，每次重复一半接种用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液1μl、一半接种的无菌水1μl，每次重复不少于6个果。
鉴定材料准备的具体步骤为：选取形状和成熟度一致、无病无虫危害的健康果实，将果实用清水洗净，晾干或在超净工作台上吹干，放入75％的酒精中浸泡2min，用1％次氯酸钠溶液中浸泡2min，用无菌水洗3次，然后在超净工作台中晾干。
对照品种选择的具体步骤为：以亚蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品种 PBC602和中国农业科学院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品种茄门厚皮辣椒分别作为室内抗病性鉴定的阳性和阴性对照品种，以各鉴定材料与对照相比的相对抗性来判定各鉴定材料的相对抗性。
接种以及接种后管理的具体步骤为：在每个果实的中央部用微量注射器细刺破表皮后注入1μL用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液(1×105个 /mL)，当全部接种完毕后，放入鉴定室内28℃黑暗保湿24h，以后每天光照 12h，相对湿度为(80～100)％，温度控制在28℃。
病情调查的具体步骤为：接种后(5～7)d进行病情调查，逐一观察果实每一接种处的病斑扩展情形，逐个果实观察发病情况，记载各病级病果数，并将发病结果记入。
抗病性评价的具体步骤为：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对照病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在辣椒炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数>30，参鉴品种的空白对照的病情指数为0，即参鉴品种空白对照果实不发病，该抗性鉴定结果有效。
作为本发明的一个实施例：本发明的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，通过自然诱发或人工接种等方法，将病原物直接或间接接种到寄主植株或器官上，使其发病，并依据相关的抗性评价标准，来区分品种的抗病性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (14)

1.一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：包括：
培养基制备；
接种体分离；
接种体鉴定；
接种体保存；
接种体复壮；
接种孢子制备；
鉴定设计；
鉴定材料准备；
对照品种选择；
接种以及接种后管理；
病情调查；
抗病性评价。
2.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：所述培养基制备包括制备水琼脂培养基以及制备马铃薯培养基：在制备水琼脂培养基中，以1L培养基为列：用5个250ml三角瓶每个装入200ml纯净水和4g琼脂粉然后加热至121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，在制备马铃薯培养基中，以1L为列：称取马铃薯200g，切成细条或片状，放入锅中蒸煮当马铃薯煮至熟而不烂时，在1L量筒上用纱布过滤马铃薯残渣，定容至1L，用5个250ml三角瓶每个分别加入200ml滤液、4g葡萄糖、和4g琼脂粉然后121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。
3.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体分离的具体步骤为：从田间采集刚开始发病的辣椒炭疽病病果，在超净工作台上，用手术刀取0.5cm×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸钠中浸泡2min，用灭菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干病健块的水分，插入倒的水琼脂平板上，放置28℃人工气候箱中黑暗培养2d，待长出菌丝后再转接在PDA平板上，获得分离物。
4.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体鉴定的具体步骤为：将培养7d后的分离物在显微镜下进行菌丝、孢子形态观察，如符合辣椒炭疽病病原菌的形态特征，用CTAB法提取分离物菌丝DNA，经过对获得的DNA进行电泳分析，分离物的DNA提取成功将分离物的DNA进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂凝胶电泳检测，将得到的rDNA ITS序列提交至GenBank,BLAST进行对比，如与辣椒炭疽病病原物的ITS序列具有99％的相似，即可确定是辣椒炭疽病病原菌。
5.根据权利要求4所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：用CTAB法提取分离物菌丝DNA的具体步骤为：将培养5～7d的分离物，用灭菌手术刀刮菌丝于一干净灭菌的1.5mL离心管中，加500μl TE缓冲液混匀，加入10％SDS溶液30μl和10mg/ml蛋白酶K(PK)3μl混匀，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h，加入100μl Nacl(5M)混匀，加入80μl CTAB/Nacl混匀，65℃水浴10min，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心15min，取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)混匀，12000r/min离心15min，取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min，取上清至新1.5mL离心管，加入2/3体积异丙醇，放入-20℃冰箱1h，12000r/min离心10min，去上清，用吸水纸吸干离心管口，沉淀用70％冷乙醇洗涤12000r/min离心10min，去上清，用吸水纸吸干离心管口，55℃干燥15min，加入20～50μl TE缓冲液溶解DNA沉淀，用1％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和DNA，将混有上样缓冲液的DNA加至样品孔中，用DNA Maker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否提取出DNA电泳带，拍摄并记录实验结果，经过对实验结果的观察，分离物DNA提取成功，剩下的DNA在-20℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体保存的具体步骤为：将鉴定为辣椒炭疽病的病原菌，进行3次单孢分离纯化后，转接于含PDA斜面培养基的5cm冷冻离心管上，于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，在斜面上加倒入一层1cm厚灭菌矿物油后置4℃或室温保存。
7.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体复壮的具体步骤为：接种前需要进行病原物接种体的复壮，复壮方法为：将接种体培养在PDA培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.51cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病品种辣椒果实上，放入温度为28℃、湿度为90％的人工气候箱中光照和黑暗交替12/12h进行培养，等果实发病后进行病原菌分离。
8.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种孢子制备的具体步骤为：将复壮分离后获得的分离物转接培养在PDA培养基上、于28℃人工气候箱中黑暗培养7d，待菌丝长满平板后，将平板放入28℃的人工气候箱中光照和黑暗交替进行产孢，待产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌的擦镜纸过滤菌丝，制成浓度为1×105个/mL分生孢子的悬浮液供接种用。
9.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：鉴定设计的具体步骤为：鉴定材料选择青果或红色成熟果，每个品种或资源材料设3-4次重复，每个重复不少于6个果，每次重复一半接种用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液1μl、一半接种的无菌水1μl。
10.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：鉴定材料准备的具体步骤为：选取形状和成熟度一致、无病无虫危害的健康果实，将果实用清水洗净，晾干或在超净工作台上吹干，放入75％的酒精中浸泡2min，用1％次氯酸钠溶液中浸泡2min，用无菌水洗3次，然后在超净工作台中晾干。
11.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：对照品种选择的具体步骤为：以亚蔬中心提供的抗辣椒炭疽病品种PBC602和中国农业科学院蔬菜花卉所提供的感辣椒炭疽病品种茄门厚皮辣椒分别作为室内抗病性鉴定的阳性和阴性对照品种，以各鉴定材料与对照相比的相对抗性来判定各鉴定材料的相对抗性。
12.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种以及接种后管理的具体步骤为：在每个果实的中央部用微量注射器细刺破表皮后注入1μL用无菌水配制的病原菌分生孢子悬浮液(1×105个/mL)，当全部接种完毕后，放入鉴定室内28℃黑暗保湿24h，以后每天光照12h，相对湿度为(80～100)％，温度控制在28℃。
13.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：病情调查的具体步骤为：接种后(5～7)d进行病情调查，逐一观察果实每一接种处的病斑扩展情形，逐个果实观察发病情况，记载各病级病果数，并将发病结果记入。
14.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：抗病性评价的具体步骤为：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3～4次重复病情指数平均数与对照病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在辣椒炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数>30，参鉴品种的空白对照的病情指数为0，即参鉴品种空白对照果实不发病，该抗性鉴定结果有效。
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