CN108949749A - 一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉；细胞裂解：加入DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，混匀后在65℃水浴30min；DNA提取：加入0.33mL浓度为KAc，冰浴20min，后酚:氯仿:异戊醇抽提，离心，取上清液加入无水乙醇沉淀，低温静置30min，离心收集沉淀；纯化处理：加入RNaseA，在37℃处理30min，后25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，低温离心5min；取上清液加入无水乙醇沉淀，挑取沉淀，漂洗，风干，溶于TE缓冲液中，保存备用。采用本方法提取的丝状真菌DNA量提高2倍，浓度达到277ng/μL，片段长≥20000bps，无降解，纯度高。

Description

一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。
背景技术
真菌为低等真核生物，种类庞大而多样，近几年，随着高通量测序技术的提高，更多真菌完成了基因组测序。基因组学的深入分析促进了生物进化、系统发生学、药物靶基因、新基因和新编辑方式的发现及功能等研究。真菌基因组DNA的长度、浓度、纯度直接关系到真菌基因组的测序、组装和注释。在文库构建和高通量测序过程中，高质量和长片段的真菌基因组DNA能够减少拼接误差，更好的反映原始基因调控序列和基因结构，便于基因功能和表达调控模式注释。因此，简便快捷地提取高质量、长片段丝状真菌基因组DNA提取方案在高通量测序、基因工程领域尤为重要。
迄今，对于从真菌中提取染色体的方法已有许多研究，其中较为有效的方法是酶解法、氯化苄法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基磺酸钠(SDS)法等，后两种由于无需昂贵仪器和药品，应用更广泛。但是现有这4种常规真菌基因组DNA提取方法主要应用于真菌子实体DNA的提取，而非新鲜培养的菌丝体DNA的提取，且提取效率较低(时间长、产量低)、质量较低(片段长度短、存在蛋白残留及降解产物)。
由于真菌子实体组织结构紧密，细胞壁结构坚固，且多数实验样本为干燥或多年生子实体，其中色素、多糖等次生代谢产物丰富，如白僵菌子实体含有20种多糖，约占白僵菌总干质量3％-8％；这些不利因素给真菌基因组DNA的提取带来巨大困难，导致提取操作繁琐，时间较长，成本较高；提取产物的产量较低，降解严重，蛋白、色素等残留较多，纯度较低。
而组织材料新鲜是提取高质量真菌基因组DNA的关键，尤其是色素、多糖含量较高的真菌。新鲜培养的真菌菌丝体，多糖、色素等次生代谢产物含量较低，细胞分裂增殖活跃，DNA含量丰富，且真菌基因工程操作多数以菌丝体为操作对象。但新鲜真菌菌丝体含水率高，导致液氮研磨不充分；活性酶含量高，导致DNA易降解、操作过程中长链易于断裂；此外，现有的离体真菌DNA提取方法不适用于新鲜菌丝的DNA提取，且操作时间较长(≥10h)，尤其是裂解液裂解能力越强，提取率越高，但DNA片段短；反之亦然。因此还未有一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，解决了现有技术存在的问题。
本发明提供了一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：
S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；
S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃水浴30min；
S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5M KAc，冰浴20min，后加入1.5倍体积的比例为25:24:1苯酚:氯仿:异戊醇抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用75％乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液中；
S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mL RNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min，挑取沉淀，用75％乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在-20℃保存备用。
优选地，S101步骤中，离心滤去菌丝质量70-75％的水分。
优选地，DNA提取缓冲液包含0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，0.05mol/LEDTA，3％SDS，在快速提取长片段DNA的同时防止DNA降解。
优选地，TE缓冲液为10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)。
优选地，真菌为白僵菌或蛹虫草。
采用本发明所提供的一种快速提取长片段测序用丝状真菌DNA的方法，采用新鲜菌丝体70％-75％脱水，便于菌丝的液氮研磨破碎和裂解；采用一定配比蛋白酶K和3％SDS混合体系来裂解菌丝细胞并提取DNA，不仅提高裂解效率，节省实验时间3-4h，在影响新鲜菌丝体的DNA活性前提下保留DNA长片段的同时实现高提取率，另外采用RNaseA处理、酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次、低温高速离心、无水乙醇沉淀、75％乙醇漂洗既可以在温和条件下纯化DNA，20000bp及以上的长片段提取产量较传统方法提高1倍以上。
本发明方法快速制备的20000bp及以上的长片段DNA可直接用于文库构建和高通量测序，减少拼接误差，更好的反映原始基因调控序列和基因结构，便于基因功能和表达调控模式注释。
附图说明
图1为实施例一的白僵菌菌丝示意图；
图2为实施例一的S101步骤中液氮研磨成细粉状的示意图；
图3为实施例一的S102步骤中细胞裂解液的示意图；
图4为实施例一的S103步骤中加入无水乙醇后出沉淀物的示意图；
图5为实施例一的S104步骤中加入无水乙醇后出絮状沉淀物的示意图；
图6为实施例一和实施例二所提取DNA溶液的电泳检测结果，DNA片段大小基本为20000bps，M为λ/HindIII DNA Marker，T1为本发明方法(实施例一和实施例二)提取获得的DNA溶液，T2为现有方法(对比例3和对比例4)获得的溶液；
图7为实施例一所提取DNA溶液的分光光度计检测结果，其中A260/280＝1.78，A260/230＝2.32，浓度为277ng/μL；
图8为实施例二所提取DNA溶液的分光光度计检测结果，其中A260/280＝1.80，A260/230＝3.11，浓度为122ng/μL。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中的菌株是由中国热带农业科学院环境与植物研究所提供，使用现有方法可自主培养，蛋白酶K等药品试剂购自于试剂公司。
实施例一：一种从新鲜白僵菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：
S101菌体准备：取7.5cm平板上，培养4d的白僵菌菌丝(如图1)，放入离心管中在12000rpm下离心2min，去除75％的水分，后称取菌丝0.25g，在液氮中迅速研磨成粉(如图2)；
S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液(DNA提取缓冲液：0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，质量浓度为3％的SDS)，加入60μL蛋白酶K(20mg/mL)，(如图3)快速振荡混匀，在65℃水浴30min，期间混匀3次；
S103DNA提取：加入0.33mL 5mol/L KAc，冰浴20min，后加入1.5倍体积的苯酚(0.1M Tris饱和酚，pH>7.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，此时有白色絮状、片状、颗粒状等沉淀出现(如图4)，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/LEDTA(pH 8.0))中；
S104纯化处理：加入20μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理30min，后用800μL的酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和800μL的氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min，此时出现白色絮状沉淀(如图5)，挑取沉淀，用75％乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在-20℃保存备用。
实施例二：一种从新鲜培养蛹虫草菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，包括以下步骤：
S101菌体准备：取液态摇床培养4d的蛹虫草菌丝，放入离心管中在12000rpm下离心2min，去除70％的水分，后称取菌丝0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；
S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液(DNA提取缓冲液：0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，质量浓度为3％的SDS)，加入60μL蛋白酶K(20mg/mL)，快速振荡混匀，在65℃水浴30min，期间混匀3次；
S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5mol/L KAc，冰浴20min；加入1.5倍体积的苯酚(0.1mol/L Tris饱和酚，pH>7.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，此时有白色絮状、片状、颗粒状等沉淀出现，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度75％乙醇漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液中；
S104纯化处理：加入20μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理30min，后分别用800μL的酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和800μL的氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min，此时出现白色絮状沉淀，挑取沉淀，用75％乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在-20℃保存备用。
对比例一：对比例一和实施例一的区别在于，S102细胞裂解步骤中，DNA提取缓冲液中SDS质量浓度为1％，加入20μL蛋白酶K(20mg/ml)，在65℃水浴45min。
对比例二：对比例一和实施例一的区别在于，S102细胞裂解步骤中，DNA提取缓冲液中SDS质量浓度为5％，加入100μl蛋白酶K(20mg/ml)。
对比例三：参照现有的SDS方法：取白僵菌新鲜菌体0.25g，液氮研磨，加入2mL SDS提取缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，质量浓度为1％SDS)，65℃水浴1.5h；13000r/min离心5min；取上清转到离心管中，加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)；摇匀，离心5min，取上清，加等体积的氯仿/异戊醇；摇匀，离心3min，取上清，加入2倍体积的无水乙醇和2mol/L NaCl，-20℃沉淀过夜；12 000r/min离心20min，去上清，酒精冲洗，真空干燥；加500μL TE，加2μL的RNA酶，37℃水浴1h；加入800μL氯仿/异戊醇(24:1)，12000r/min离心10min，重复2次，自然风干，溶于500μL TE缓冲液中，在-20℃保存备用。对比例三和实施例一的区别在于，新鲜菌体未经脱水处理，SDS提取缓冲液的浓度不同，未加蛋白酶和醋酸钾处理，纯化处理不同。
对比例四：对比例四和对比例三的区别在于：使用蛹虫草菌体替代白僵菌菌体。
对于实验提取DNA溶液进行测试：
对实施例一和实施例二提取前后的DNA溶液、对比例三和对比例四提取的DNA溶液的电泳检测结果如图6，DNA片段大小基本为20000bp，M为λ/HindIII DNA Marker，T1为本发明方法提取获得的DNA溶液，T2为现有方法(对比例3和对比例4)获得的DNA溶液；实施例一和二所获得DNA溶液的分光光度计检测结果截图分别如图7和图8。
分别对实施例一至三，对比例一至四提取的DNA溶液进行电泳检测和分光光度计检测结果汇总如表1。
表1实施例一至三，对比例一至四提取的DNA溶液进行电泳检测和分光光度计检测结果
从表1结果可知，本发明改进方法从新鲜培养真菌菌丝体提取的DNA溶液，基因组DNA提取量提高了2倍以上，浓度达到277ng/μL，A260/280＝1.8，纯度接近或等于绝对纯度，证明没有蛋白、酚类物质污染；A260/230>2.0，在2.5左右，说明样品中基本没有碳水化合物、多肽、苯酚等污染物残留；DNA片段大小基本为20000bp的长片段，没有降解，利于三通测序。
综上所述，采用本发明所提供的一种快速提取丝状真菌菌丝体长片段DNA的方法，采用新鲜菌丝体70％-75％脱水，便于菌丝的液氮研磨破碎和细胞裂解；采用一定配比的蛋白酶K和3％SDS混合体系来裂解菌丝细胞，不仅提高裂解效率，而且节省实验时间3-4h，不影响新鲜菌丝体的DNA活性，无降解，较大程度的保留DNA长片段的同时具有高提取率和纯度，采用RNaseA处理、酚(pH 8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次、低温高速离心、无水乙醇沉淀、75％乙醇漂洗既可以在温和条件下纯化DNA，20000bp及以上的长片段提取产量较传统方法提高1倍以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S101菌体准备：取新鲜培养的真菌菌丝体，快速离心滤去水分后称取菌丝体0.25g，在液氮中迅速研磨成粉；
S102细胞裂解：加入1mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，加入60μL浓度为20mg/mL蛋白酶K，快速振荡混匀，在65℃下水浴30min；
S103DNA提取：加入0.33mL浓度为5mol/L KAc，冰浴20min，后加入0.5mL体积比例为25:24:1的苯酚:氯仿:异戊醇溶液抽提1次，在12000rpm下离心5min，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，低温静置30min，在5000rpm下离心收集沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗若干次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μL TE缓冲液中；
S104纯化处理：加入20μL浓度为10mg/mL RNaseA，在37℃处理30min，后用800μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇和800μL体积比为24:1的氯仿:异戊醇各抽提1次，在4℃，10000rpm下离心5min；取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，在-20℃沉淀30min，挑取沉淀，用质量浓度为75％的乙醇漂洗，风干，溶于500μL TE缓冲液中，在-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于，所述S101步骤中，离心滤去菌丝70-75％水分。
3.根据权利要求1所述的一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于，所述DNA提取缓冲液包含0.1mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA和3％SDS。
4.根据权利要求1所述的一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于，所述TE缓冲液为10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA，TE缓冲液pH＝8.0。
5.根据权利要求1所述的一种从新鲜真菌菌丝体中快速提取长片段DNA的方法，其特征在于，所述真菌为白僵菌或蛹虫草。
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