CN108998449A - 一种提取灰树花总dna的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提取灰树花总DNA的试剂及其应用，从50 mg左右其菌丝体和子实体样品中，经过破碎裂解、DNA吸附、漂洗、洗脱等步骤，快速高效的提取总DNA。单个样品提取时间缩短至15 min，且所提取的DNA完整性好、纯度高，可直接用于PCR、Real‑Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验。且整个提取过程中不涉及氯仿、苯酚、β‑巯基乙醇等有毒试剂，保证了研究人员免于有毒试剂的伤害。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术分子生物学领域，具体涉及一种提取灰树花总DNA的试剂及其应用，该方法开发了一种适用于PCR、Real-Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验的快速灰树花等真菌的总DNA提取方法，可对灰树花等真菌的子实体、菌丝体及其他发酵产物等总DNA进行快速提取，提取产物可以用于分子生物学和遗传学的研究和分子鉴定。
背景技术
DNA是生命体中遗传信息的载体，包含了生物体的遗传性状。高质量、高纯度的总DNA是保证开展PCR扩增、限制性内切酶酶切、遗传图谱分析、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组学等分子生物学研究的首要条件。因此，高效、快速制备高纯度、完整性好的总DNA样品显得极为重要。
目前，传统制备食用菌总DNA的方法包括CTAB、SDS法和碱裂解法等，CTAB法和SDS法采用离子型表面活性剂用于裂解食用菌细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇等的多次抽提使蛋白质等沉淀于有机试剂中，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。在这种方法中存在反复离心、沉淀、等待的工序，操作繁琐且耗时长，其提取过程需要2-3 h；且药品中苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂具有毒性，对操作人员可能造成一定伤害；其次可能导致有机溶剂残留在总DNA样品中从而造成下游试验无法顺利进行；最后，传统DNA提取方法具有广谱性，能广泛针对食用菌、动物、微生物等总DNA提取，在提取过程中无物种针对性。以上这些因素都可能严重影响了样品质量、延长提取时间、影响准确率等。
碱裂解法直接利用强碱NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放总DNA，再经过TE缓冲液对碱溶液稀释中和，从而得到了DNA溶液直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取总DNA的方法。该方法得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含有大量色素、多糖和蛋白等物质，其含量和纯度都低不利于后续实验，且反应过程中强碱NaOH会打断DNA片段，导致该方法获得的DNA样品仅扩增上限为1000 bp左右的基因，而对于较长的基因片段而言，这种提取方法显然不适用。
灰树花是珍稀的药用真菌，因具有保肝、抗辐射、降血糖等效果显著逐渐成为我国大陆及台湾地区和国外研究的热点。随着现代生物技术的发展，开展灰树花分子生物学的研究是发展和弘扬灰树花文化的重要方向，但由于灰树花子实体和菌丝体中含有大量黏性的多糖类物质，在市面上仅QIAGEN公司和Omega BioTek公司的真菌试剂盒对灰树花子实体和菌丝体总DNA的提取在纯度和浓度上基本达到后续反应要求，但同时存在耗时多、步骤繁多、提取量少等缺点，因此针对以上不足并通过对现有提取技术的改进发明了本方法，具有安全、快速、简便、高效、经济等提点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取灰树花总DNA的试剂及其应用，通过多次优化实验流程和试剂配方，总结出一种安全、快速、简单、高效提取灰树花总DNA的方法。该方法利用硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA在不同盐离子浓度和pH条件下的结合程度不同从而达到提取、分离、纯化DNA的目的。本方法操作安全、快速、简单，15 min就能完成整个总DNA的制备过程，提取过程中原料用量少、无需酚、氯仿抽提，避免了有机溶剂对操作人员的污染；实验结果显示，总DNA完整性好，纯度高，适用于PCR、SSR、ISSR、qPCR等实验。从而解决了现有提取技术样品用量大、耗时长、试剂有毒、提取的DNA片段较短等缺点，以满足灰树花等珍贵材料分子生物学实验的需要。
具体操作步骤如下：
（1）向DNA吸附柱SC中加Balance Buffer 200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将2-50 mg样品研磨后加入Lysis Buffer 400 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入Wash Buffer 600 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min。
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的洗脱缓冲液EB（如需去除RNA，可在其中加入20 μg/ mL 的RNA酶，37℃孵育30min） 30-100µl，静置1-2 min；
（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
备注：提取的DNA可存放于4℃，如需长期保存，请放置于-20℃中保存。
以上快速提取食用菌总DNA的方法中，所述的试剂配方如下：
一种快速提取灰树花总DNA试剂，其提取试剂包括Balance Buffer（平衡液）、LysisBuffer（裂解液）、Wash Buffer（DNA洗涤液）、Elution Buffer（DNA洗脱液）和DNA吸附柱。其中：
（1）Balance Buffer（平衡液，BB）包含以下成分：1.5wt.% Na2SiO3·9H2O；
（2）Lysis Buffer（裂解液，LB）包含以下成分：5.0M盐酸胍，30%v/v异丙醇和1wt.%PVPK30；
（3）Wash Buffer（洗涤液，WB）包含以下成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，80%v/v乙醇，pH 7.5；
（4）Elution Buffer（洗脱液，EB）包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。
所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
本发明的优点和有益效果为：
（1）在DNA分离纯化过程中，本发明使用了硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱，并通过使用本发明研发的平衡液对硅酸铝陶瓷纤维膜进行预处理，可明显增加硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA的结合率；
（2）通过优化裂解液和洗涤液的配方，一方面可以充分的去除蛋白、多糖等其他的杂质，另一方面由于不使用苯酚、氯仿等有机试剂，可避免有毒试剂对操作人员造成的毒害和残留试剂对下游试验的抑制作用；
（3）在DNA洗脱的步骤中，通过65℃预热Elution Buffer，来加快分子的热运动，使DNA分子更容易与硅胶柱分离，最大程度的保证DNA的洗脱效率。
本发明操作简单、快速、纯度高、完整度高，可直接用于PCR、Real-Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验的快速灰树花等真菌的总DNA提取方法，可对灰树花等真菌的子实体、菌丝体及其他发酵产物等总DNA进行快速提取，提取产物可以用于分子生物学和遗传学的研究和分子鉴定，能更好地满足分子生物学的需求。
附图说明
图1为灰树花子实体、菌丝体总DNA以及香菇、平菇、北虫草子实体总DNA的跑胶结果。图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNA Marker；1. 灰树花子实体总DNA；2. 灰树花菌丝体总DNA；3. 平菇子实体总DNA；4. 香菇子实体总DNA；5. 北虫草子实体总DNA。
图2为采用该方法提取的灰树花子实体、菌丝体、干样品DNA以及香菇、灵芝、金针菇总DNA为模板进行ITS序列扩增。图中样品依次为：M，北京全式金公司Trans 15K DNAMarker；1. 灰树花子实体ITS片段；2. 灰树花菌丝体ITS片段；3. 平菇干样品ITS片段；4.平菇子实体ITS片段；5. 香菇子实体ITS片段；6. 北虫草子实体ITS片段。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明进一步说明，只是为清楚地说明本发明所作的举例，不应理解为对本发明的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换仍处于本发明的保护范围之中。
实施例：选择灰树花子实体和菌丝的样品进行DNA提取和纯度检测，并进行ITS序列检测和分析。
实施例1、采用本方法提取灰树花菌丝体和子实体的总DNA
分别收集灰树花的菌丝体和子实体，具体步骤如下：
（1）向DNA吸附柱中加BB 200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附硅胶柱进行预处理；
（2）将2-100 mg样品经干冰研磨后加入LB 600 µL，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附硅胶柱中加入WB 600 µL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附硅胶柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入30-100 µL 65℃预热EB，静置2 min；
（6）12,000 rpm离心2 min，收集DNA洗脱液，保存备用。
其提取试剂包括Balance Buffer（平衡液）、Lysis Buffer（裂解液）、Wash Buffer（DNA洗涤液）、Elution Buffer（DNA洗脱液）和DNA吸附柱。其中：
（1）Balance Buffer（平衡液，BB）包含以下成分：1.5wt.% Na2SiO3·9H2O；
（2）Lysis Buffer（裂解液，LB）包含以下成分：5.0M盐酸胍，30%v/v异丙醇和1wt.%PVPK30；
（3）Wash Buffer（洗涤液，WB）包含以下成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，80%v/v乙醇，pH 7.5；
（4）Elution Buffer（洗脱液，EB）包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。
所提基因组DNA的浓度测定结果为菌丝体300ng/µl，子实体400ng/µl，
实施例2
分别收集灰树花子实体、菌丝体总DNA以及香菇、平菇、北虫草子实体总DNA，具体步骤如下：
（1）向DNA吸附柱中加BB 200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附硅胶柱进行预处理；
（2）将2-100 mg样品经干冰研磨后加入LB 600 µL，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附硅胶柱中加入WB 600 µL，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附硅胶柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入30-100 µL 65℃预热EB，静置2 min；
（6）12,000 rpm离心2 min，收集DNA洗脱液，保存备用。
其提取试剂包括Balance Buffer（平衡液）、Lysis Buffer（裂解液）、Wash Buffer（DNA洗涤液）、Elution Buffer（DNA洗脱液）和DNA吸附柱。其中：
（1）Balance Buffer（平衡液，BB）包含以下成分：1.5wt.% Na2SiO3·9H2O；
（2）Lysis Buffer（裂解液，LB）包含以下成分：5.0M盐酸胍，30%v/v异丙醇和1wt.%PVPK30；
（3）Wash Buffer（洗涤液，WB）包含以下成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，80%v/v乙醇，pH 7.5；
（4）Elution Buffer（洗脱液，EB）包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。
取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，结果表明，以本发明的方法提取上述五种样品，均能得到电泳可见的基因组。
实施例3、灰树花ITS序列PCR扩增
采用食用菌ITS片段通用引物ITS-4/5，对灰树花子实体、菌丝体、干样品DNA以及香菇、灵芝、金针菇总DNA等基因组进行PCR检测。
引物序列为：
ITS-4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’
ITS-5: 5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3’
PCR扩增所用试剂购自北京全式金生物科技有限公司，反应的体系为：
PCR反应的条件为：94℃ 7min → [94℃ 30s → 56℃ 30s → 72℃ 30s] ×34cicles → 72℃ 10min → 4℃。
琼脂糖凝胶电泳分析
总DNA和PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样缓冲液为10×LoadingBuffer，电泳缓冲液为1×TAE，分子量标准Marker为Trans 15 K，EB染色，紫外凝胶成像仪在312nm下观察并拍照。
结果表明，以本发明的方法灰树花样品得到电泳可见的明亮完整的基因组DNA条带，其他三种食用菌样品也得到明亮完整的条带，用通用引物ITS扩增灰树花总DNA和其他三种食用菌样品的总DNA，所有样品都能获得大小在600 bp左右的目的条带且亮度差异不大（图2），具有广泛的适用性。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种提取灰树花总DNA的试剂及其应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
Claims (4)
1.一种提取灰树花总DNA的试剂，其特征在于：其试剂包括平衡液、裂解液、洗涤液、洗脱液，其中：
（1）平衡液包含以下成分：1.5% Na2SiO3·9H2O；
（2）裂解液包含以下成分：5.0M盐酸胍，30%异丙醇和1%PVP K30；
（3）洗涤液包含以下成分：20 mM NaCl，20 mM Tris-HCl，80%乙醇，pH 7.5；
（4）洗脱液包含以下成分：10 mM Tris-HCl，pH 8.5。
2.一种基于权利要求1所述试剂的提取灰树花总DNA的方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）向DNA吸附柱中加平衡液200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；
（2）将50 mg样品研磨后加入裂解液 400 µl，混匀，室温 10,000 rpm，离心30 s；
（3）将上清转移到处理过的DNA吸附柱，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液；
（4）向DNA吸附柱中加入洗涤液 600 µl，室温10,000 rpm离心1 min，弃废液后将DNA吸附柱套回废液收集管，室温10,000 rpm离心1 min；
（5）将DNA吸附柱移到新的1.5 mL EP管中，开盖放置1-2 min去除乙醇残留，加入65℃预热的洗脱液30-100µl，静置1-2 min；当去除RNA，在洗脱液中加入20 μg/ mL 的RNA酶，37℃孵育30 min；
（6）12,000 rpm离心2 min，洗脱DNA，保存备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA吸附柱为硅酸铝陶瓷纤维膜DNA吸附柱。
4.根据权利要求1所述的试剂在提取灰树花DNA中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981129A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-01-28 | 上海市农业科学院 | 一种用于鉴定灰树花菌种单核体交配型的InDel引物组合及鉴定方法 |
-
2018
- 2018-09-20 CN CN201811118574.3A patent/CN108998449A/zh not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981129A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-01-28 | 上海市农业科学院 | 一种用于鉴定灰树花菌种单核体交配型的InDel引物组合及鉴定方法 |
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