CN103146683A - 一种提取哺乳动物和鸟类粪便dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从哺乳动物和鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。该方法包括如下步骤：1）前处理：若粪便成形，体积大于等于1×1×1cm3，且表面有粘液层，则以粘液层为待测样品；其余以粪便为待测样品；2）提取：将待测样品置于pH8.0的缓冲液中，混匀后于56-60℃保温8-12min；500g离心5-10min，取上清；除蛋白；进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；3）纯化：将待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含待纯化总DNA的胶块，加入溶胶液，于65-75℃溶胶，溶胶后样品加入硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。本发明对不同类型粪便进行不同预处理；通过梯度离心使粪渣和肠道脱落细胞有效分离；增加温浴，使脱落细胞更易从粪渣中析出，最大限度提高细胞含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。
背景技术
近二十年，研究者广泛采用野生动物的粪便、毛发、唾液、尿液、食物残渣、卵壳、遗骸、博物馆标本等非损伤性样本获得目标物种的遗传物质，解决了许多传统采样技术难以解决的问题，促进了野生动物分子遗传学的研究。比较而言，采集野生动物的粪便具有采样方便、采样量大、不损伤动物且不受时空限制的特点，成为研究者最为青睐的采样途径。动物粪便内携带肠道脱落细胞，可用于提取目标动物的DNA。粪便成分十分复杂，还含有细菌、真菌、寄生虫、病毒及食物DNA，研究者必须通过设计特异的引物获取目标动物的DNA。然而，在提取粪便内目标动物的DNA时，会将酶、胆盐、胆红素、腐殖质和色素等PCR抑制物一同提取出来，这些PCR抑制物严重干扰后续的PCR反应，使得实验成本增加，试验周期拉长，甚至实验失败。这是令研究者最感棘手的问题。因此，通过粪便DNA途径进行任何动物的遗传分析时，研究者必须选择合适的粪便DNA提取方法。
迄今，国内外研究者发展了多种粪便DNA提取方法，提取原理包括：（1）硫氰酸胍（GuSCN）-二氧化硅（SiO2）法；（2）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法；（3）酚-氯仿法。但是，各种提取方法的通用性不好，存在物种差异，甚至同一物种不同个体间也存在差异。再者，还发现提取方法和保存方法存在交互作用，也就是保存方法不同，提取效果也发生变化。这严重阻碍了非损伤性的粪便DNA样本运用于动物保护遗传学研究。
发明内容
本项发明旨在提供一种简便、低廉且通用有效的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。该方法可有效的克服粪便中PCR抑制物的干扰，提取的DNA浓度和纯度可以达到进一步研究的需要。
本发明所提供的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法，具体包括如下步骤：
（1）样品前处理：为如下A）或B）：
A）若待测粪便成形，则进行如下A1）或A2）
A1）若所述粪便体积大于等于1×1×1cm3，且所述粪便表面有明显粘液层，如普氏野马粪便，则取所述粘液层作为待测样品；
A2）若所述粪便体积小于1×1×1cm3，或所述粪便表面没有粘液层，如林麝粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；
在实际应用中，所述粪便表面没有粘液层包括粪便表面粘液层不明显的情况；
B）若待测粪便不成形，如鸟类粪便，具体如朱鹮粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；
（2）从步骤（1）所得待测样品中提取待纯化总DNA：为如下（a）-（d）：
（a）将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液（如TNE缓冲液或PBS缓冲液）中，漩涡震荡2min，混匀后于56-60℃（如60℃）温浴8-12min（如10min）（期间上下颠倒混匀1次），漩涡震荡2min，使样品溶液更加均质化，从而得到样品混合液；
所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液（TNE缓冲液或PBS缓冲液）的质量体积配比可为0.3g：1mL；
在本发明的一个实施例中，所述pH8.0的缓冲液具体为TNE缓冲液。
所述TNE缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：5mM Tris，16mM EDTA，100mMNaCl，pH8.0。
（b）将步骤（a）得到的样品混合液以500g离心5-10min（如5min），取上清液；
（c）除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液；
（d）对步骤（c）得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；
（3）对步骤（2）得到的待纯化总DNA进行纯化：为如下（I）-（II）：
（I）将步骤（2）得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75℃（如70℃）溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为1mg：3μl；
（II）将步骤（I）得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。
在上述方法中，在步骤（2）（c）中，所述除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，具体可包括如下步骤：向步骤（2）（b）得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠（SDS），于54-58℃（如56℃）裂解1-1.5h（如1h）；
所述上清液、所述蛋白酶K和所述十二烷基磺酸钠的配比可为0.6mL：150μg：15mg。
在上述方法中，在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提采用的抽提液可为苯酚-氯仿-异戊醇和/或氯仿-异戊醇；所述苯酚-氯仿-异戊醇具体是由苯酚、氯仿和异戊醇按照体积比25：24：1的比例混合而成的混合液；所述氯仿-异戊醇具体是由氯仿和异戊醇按照体积比24：1的比例混合而成的混合液；所述DNA沉淀采用的沉淀液可为无水乙醇和/或乙酸钠水溶液。
具体的，在本发明的一个实施例中，在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提和DNA沉淀，具体包括如下步骤：
a1）向步骤（2）（c）得到的样品裂解液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，回收上清液；
a2）向步骤a1）的上清液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，回收上清液；
a3）向步骤a2）的上清液中加入等体积的所述氯仿-异戊醇，轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，回收上清液；
a4）向步骤a3）的上清液中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，以及1/10体积的乙酸钠水溶液，于-20℃放置20min，12000g离心10min，得到总DNA沉淀；
所述乙酸钠水溶液的pH为5.2，乙酸钠的浓度为3M；
a5）将步骤a4）得到的总DNA沉淀用70%乙醇洗涤一遍，干燥后得到所述待纯化总DNA。
在上述方法中，在步骤（3）（I）中，所述溶胶液具体是浓度为5M的碘化钠水溶液。
在上述方法中，在步骤（3）（II）中，所述DNA纯化，具体包括如下步骤：
b1）将步骤（I）得到的待过柱样品液加到所述硅胶膜DNA吸附柱中，12000g离心1min，向柱内加入500μl的70%（体积分数）乙醇，以12000g离心1min，重复加入500μl的70%（体积分数）乙醇，再以12000g离心1min；
b2）将柱子转移至1.5mL离心管中，开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入100μl60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，得到所述纯化后的总DNA样品。
在本发明的一个实施例中，所述硅胶膜DNA吸附柱具体为Epoch Life Science公司产品，其产品目录号为1920-050。所述TE缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0。
在上述方法中，在步骤（2）和步骤（3）之间还包括如下步骤：向步骤（2）得到的待纯化总DNA（干燥后的DNA沉淀）中加入100μL的所述TE缓冲液，并置于56℃溶解1-5min（如5min）。
本发明的再一个目的是提供一种从动物粪便中提取总DNA的方法。
本发明所提供的从动物粪便中提取总DNA的方法，具体包括上述从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法的步骤（1）和步骤（2）。
本发明的还一个目的是提供一种从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法。
本发明所提供的从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法，具体包括上述从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法的步骤（1）和步骤（3）。
在本发明中，以上所有的所述动物均可为哺乳动物或鸟类。
本发明与已报道的粪便DNA提取方法相比，本发明根据不同粪便类型，选择了不同的预处理方法（步骤（1））。通过梯度离心方法使粪便残渣和肠道脱落细胞得已有效分离（步骤（2）中的（b）），并增加了温浴（步骤（2）中的（a）），使脱落细胞更易从粪渣中析出，最大限度提高脱落细胞的含量。另外，本发明在提取到粪便DNA后，还增加了粪便DNA纯化过程（步骤（3）），是通过切胶-溶胶-硅胶膜胶回收实现的。实验证明本发明所提取和纯化的DNA片段长度大于23Kbp，浓度平均值大于9μg/ml，1.8≤OD260/280＜2.0，这表明本发明所得到的粪便DNA可以进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。再则，本发明整个提取和纯化过程，不需要高端精密的仪器，成本低廉，试验周期短，且操作简单，一般实验人员均可掌握。
本发明所提供的粪便DNA提取和纯化方法，具有良好的通用性，适用于哺乳动物和鸟类的粪便DNA提取，并已在普氏野马(Equus Przewalskii)、平原斑马（Equusquagga）、蒙古野驴(Equus hemionus)、白犀牛(Ceratotherium simum)、野骆驼(Camelusbactrianus)、赛加羚羊(Saiga tatarica)、长颈鹿(Giraffa camelopardalis)、麋鹿(Elaphurusdavidianus)、林麝(Moschus berezovskii)、原麝(Moschus moschiferus)、狼(Canis lupus)、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)、金丝猴(Rhinopithecus roxellanae)、朱鹮(Nipponianippon)、褐马鸡(Crossoptilon mantchuricum)、丹顶鹤(Grus japonensis)等哺乳动物和鸟类中得到验证。本发明方法一次可提取到大量的DNA，尤其适用于诸如采用多引物的微卫星标记的相关研究，无须多次提取DNA。在验证的本方法提取的粪便DNA还能用作核功能性DNA的扩增，如MHC基因家族相关基因的扩增。还能用于性别鉴定基因的模板，成功鉴定林麝和朱鹮的性别。作为扩增线粒体DNA的模板，效果尤其优越，如对线粒体控制区片段、12SrRNA的扩增。
附图说明
图1为从普氏野马粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1-4为普氏野马粪便DNA；泳道M为λDNA/HindIII Marker。
图2为以普氏野马粪便DNA为模板扩增微卫星琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-10依次为普氏野马个体1在微卫星位点VHL20，HTG4，HTG10，HMS3，ASB2，CA425，HMS6，HMS7，AHT4，AHT5上的PCR产物；泳道11-20依次为普氏野马个体2在微卫星位点VHL20，HTG4，HTG10，HMS3，ASB2，CA425，HMS6，HMS7，AHT4，AHT5上的PCR产物。
图3为以普氏野马粪便为研究对象，本发明方法和国产粪便DNA提取试剂盒在微卫星位点上的PCR成功率统计结果。其中，1表示以国产粪便DNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP328）提取的粪便DNA作为模板；2表示以本发明方法提取的粪便DNA作为模板。
图4为以普氏野马粪便DNA为模板扩增MHC基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-4为以3μl从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA原液为模板时的PCR产物；泳道5-8为以3μl从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA的2倍稀释液为模板时的PCR产物。
图5为以普氏野马粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-4为在马线粒体控制区的PCR产物，N为阴性对照。
图6为从林麝粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1-4为林麝粪便DNA；泳道M为λDNA/HindIIIMarker。
图7为以林麝粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-9为在林麝线粒体控制区的PCR产物。
图8为以林麝粪便DNA为模板扩增线粒体DNA的CYTB基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-5为在林麝线粒体CYTB基因的PCR产物。
图9为从朱鹮粪便中提取和纯化的DNA琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道1-4为朱鹮粪便DNA；泳道M为λDNA/HindIII Marker。
图10为以朱鹮粪便DNA为模板扩增线粒体DNA控制区琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000；泳道1-4为在朱鹮线粒体控制区的PCR产物，N为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
TNE缓冲液：5mM Tris，16mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0。
TE缓冲液：10mM Tris，1mM EDTA，pH=8.0。
溶胶液：终浓度为5M的NaI水溶液。
硅胶膜DNA吸附柱：Epoch Life Science公司产品，其产品目录号为1920-050
实施例1、普氏野马粪便DNA的提取及鉴定
一、普氏野马粪便DNA的提取
1）由于普氏野马粪便成形，体积大于1×1×1cm3，且粪便表面有粘液层，所以以其粘液层作为待测样品。用镊子从粪便表面刮取0.3g，转移至2mL离心管中，加入1mL TNE缓冲液，于漩涡震荡器上剧烈震荡2min。
2）置于60℃水浴中温浴10min，期间上下颠倒离心管混匀1次，使待测样品与TNE缓冲液混合更加均匀。
3）再于漩涡震荡器剧烈震荡2min，以500g离心5min（使粪渣沉降于离心管底部，使脱落细胞悬浮于上清液中，使两者有效分离），吸取0.6mL上清液转移至2.0mL离心管中。
4）向上述装有上清液的2mL离心管中，加入15μL蛋白酶K（10mg/mL）和150μL10%（10g/100ml）十二烷基磺酸钠（SDS），56℃水浴裂解1h，期间每隔20min摇匀1次。
5）向上述上裂解液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液（体积比为25:24:1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min。取上清液于2mL离心管中，然后再加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液，摇匀5min，以10000g离心5min。最后取上清液于2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（体积比为24：1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，取上清液。
6）将上述上清液转移至1.5mL离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，并加入上清液十分之一体积的乙酸钠水溶液（3M，pH5.2）。在-20℃冰箱中放置20min。
7）12000g离心10min，弃去上清液，收集离心管底部的DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤一遍，置于通风橱内风干乙醇。
8）向干燥后的DNA中加入100μL的TE缓冲液，置于56℃水浴溶解5min。
9）溶解后的DNA经过0.8%琼脂糖凝胶电泳，根据λDNA/HindIIIMarker，切下含有基因组DNA的胶块区域，加入胶块质量3倍体积的溶胶液（即所述胶块与所述溶胶液的配比为1mg：3μl），于70℃水浴溶胶。
10）胶块溶解完全的溶液转移至硅胶膜DNA吸附柱，12000g离心1min。向柱子内加入500μl的70%（体积分数）乙醇，以12000g离心1min。重复加入500μl的70%（体积分数）乙醇，再以12000g离心1min。
11）将柱子转移至1.5mL离心管中，并敞开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，最终获得纯化后的总DNA。
二、普氏野马粪便DNA的鉴定
1、紫外吸收
将步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA，利用分光光度仪进行紫外吸收测定，共测定4个平行样品，每个样品重复测定三次，结果取平均值。
结果如表1所示，可见步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA，其浓度平均值为17.69±2.1μg/ml，OD260/280为1.86±0.03，这说明步骤一提取并纯化后的总DNA纯度较高，基本上无蛋白和RNA，可进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。
表1从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA的紫外吸收分析结果
| 平行样品1 | 平行样品2 | 平行样品3 | 平行样品4 | 平均值 | |
| OD260/280 | 1.88 | 1.83 | 1.85 | 1.89 | 1.86 |
| 浓度（μg/ml） | 17.83 | 20.56 | 15.6 | 16.8 | 17.69 |
2、琼脂糖凝胶电泳
将步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。
结果如图1所示，从图中可以看出，步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA片段长度大于23Kbp，目的条带单一，无杂带，可见步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA质量较高，满足进一步研究的需要。
3、用作微卫星DNA多态性分析模板
10对马微卫星引物：VHL20，HTG4，HTG10，HMS3，HMS6，HMS7，ASB2，CA425，AHT4，AHT5（这10对引物是经国际动物遗传学会（ISAG）认定的用于马亲子鉴定的引物）。具体如表2所示。
表210对马微卫星引物及PCR反应条件
取3μl按步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA作为模板，用表2中的10对马微卫星引物分别进行PCR扩增，上下游引物用量均为0.4μl（浓度为10μmol/L），反应体系为25μl。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
结果如图2所示，在相应的微卫星片段范围内，均得到清晰的目的条带。这一结果表明采用本发明方法提取的粪便DNA可以作为扩增核DNA微卫星标记的模板，能够用于濒危物种保护遗传学非损伤研究。
另外，本发明的发明人还采用国产粪便DNA提取试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP328）提取普氏野马粪便DNA，具体操作参见试剂盒说明书。将利用该试剂盒提取的普氏野马粪便DNA作为微卫星DNA多态性分析模板，采用上述10对引物分别进行PCR扩增，模板用量及PCR反应体系均同上所述。实验重复3次。分别统计本发明方法和国产粪便DNA提取试剂盒在微卫星位点上的PCR成功率。利用相应引物对扩增得到对应大小的目的条带，即视为PCR扩增成功，否则视为PCR扩增失败。
本发明方法和国产粪便DNA提取试剂盒在微卫星位点上的PCR成功率统计结果如图3所示，1表示试剂盒，2表示本发明方法，所得PCR成功率分别为0.528±0.052和0.444±0.036，两者具有显著差异（P<0.01），且本发明方法的PCR成功率更高一些。
4、用作MHC基因扩增模板
取3μl按步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA作为模板，用引物ELA-DQA*exon2（上游引物：5′-CTGATCACTTTGCCTCCTATG-3′；下游引物：5′-TGGTAGCAGCAGTAGTGTTG-3′）PCR扩增MHC基因（目的条带大小约为250bp），上下游引物用量均为0.2μl（浓度为10μmol/L），反应体系为25μl。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
结果如图4所示，在250bp附近扩增出目的条带，条带清晰且单一。这一结果表明采用本发明方法提取的粪便DNA可以作为扩增核功能基因的模板，为进一步研究濒危动物MHC奠定了基础。
5、用作线粒体DNA控制区的扩增模板
取3μl按步骤一从普氏野马粪便中提取并纯化得到的总DNA作为模板，用引物EPR2-F和EPR2-R PCR扩增线粒体DNA控制区（目的条带大小约为500bp），上下游引物用量均为0.2μl（浓度为10μmol/L），反应体系为50μl。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。同时设置以水代替PCR模板的阴性对照。
EPR2-F：5′-CGCACATTACCCTGGTCTTG-3′；
EPR2-R：5′-GAACCAGATGCCAGGTATAG-3′。
结果如图5所示，在500bp附近扩增出相应的目的条带，含量和纯度可满足PCR产物直接测序的要求。这一结果表明采用本发明方法提取的动物粪便DNA可用于濒危物种线粒体基因的扩增模板，为研究遗传多样性及母系遗传提供充足样本。
综合步骤1-5的鉴定结果，可见采用本发明方法提取动物粪便DNA，模板量较大，能够同时用于线粒体基因和核基因扩增的模板，更为重要的是，PCR抑制物得到有效去除，PCR成功率较高，有效解决了粪便DNA量少质次的问题。
实施例2、林麝粪便DNA的提取及鉴定
一、林麝粪便DNA的提取
1）由于林麝粪便成形，但体积小于1×1×1cm3，且粪便表面无粘液层，所以取0.3g粪便，于液氮中迅速研磨成粉状，以其为待测样品，转移至2mL离心管中，加入1mL的TNE缓冲液，于漩涡震荡器上剧烈震荡2min。
2）置于60℃水浴中温浴10min，期间上下颠倒离心管混匀1次，使待测样品与TNE缓冲液混合更加均匀。
3）再于漩涡震荡器剧烈震荡2min，以500g离心5min（使粪渣沉降于离心管底部，使脱落细胞悬浮于上清液中，使两者有效分离），吸取0.6mL上清液转移至2.0mL离心管中。
4）向上述装有上清液的2mL离心管中，加入15μL蛋白酶K（10mg/mL）和150μL10%（10g/100ml）十二烷基磺酸钠（SDS），56℃水浴裂解1h，期间每隔20min摇匀1次。
5）向上述上裂解液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液（体积比为25:24:1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min。取上清液于2mL离心管中，然后再加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液，摇匀5min，以10000g离心5min。最后取上清液于2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（体积比为24：1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，取上清液。
6）将上述上清液转移至1.5mL离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，并加入上清液十分之一体积的乙酸钠水溶液（3M，pH5.2）。在-20℃冰箱中放置20min。
7）12000g离心10min，弃去上清液，收集离心管底部的DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤一遍，置于通风橱内风干乙醇。
8）向干燥后的DNA中加入100μL的TE缓冲液，置于56℃水浴溶解5min。
9）溶解后的DNA经过0.8%琼脂糖凝胶电泳，根据λDNA/HindIII Marker，切下含有基因组DNA的胶块区域，加入胶块质量3倍体积的溶胶液（即所述胶块与所述溶胶液的配比为1mg：3μl），于70℃水浴溶胶。
10）胶块溶解完全的溶液转移至硅胶膜DNA吸附柱，12000g离心1min。向柱子内加入500μl的70%（体积分数）乙醇，以12000g离心1min。重复加入500μl的70%（体积分数）乙醇，再以12000g离心1min。
11）将柱子转移至1.5mL离心管中，并敞开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，最终获得纯化后的总DNA。
二、林麝粪便DNA的鉴定
1、紫外吸收
将步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA，利用分光光度仪进行紫外吸收测定，共测定4个平行样品，每个样品重复测定三次，结果取平均值。
结果如表3所示，可见步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA，其浓度平均值为19.45±2.84μg/ml，OD260/280为1.83±0.12，这说明步骤一提取并纯化后的总DNA纯度较高，基本上无蛋白和RNA，可进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。
表3从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA的紫外吸收分析结果
| 平行样品1 | 平行样品2 | 平行样品3 | 平行样品4 | 平均值 | |
| OD260/280 | 1.81 | 1.95 | 1.89 | 1.68 | 1.83 |
| 浓度（μg/ml） | 20.6 | 15.8 | 22.5 | 18.9 | 19.45 |
2、琼脂糖凝胶电泳
将步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。
结果如图6所示，从图中可以看出，步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA片段长度大于23Kbp，目的条带单一，无杂带，可见步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA质量较高，满足进一步研究的需要。
3、用作线粒体DNA控制区和CYTB基因的扩增模板
取3μl按步骤一从林麝粪便中提取并纯化得到的总DNA作为模板，用设计的引物mdloop2-F和mdloop2-R PCR扩增线粒体DNA控制区（目的条带大小约为800bp），上下游引物用量均为0.4μl（浓度为10μmol/L），反应体系为50μl，退火温度为56.6℃。另外，用设计的引物cytb-F和cytb-R扩增线粒体DNA的CYTB基因（目的条带大小约为1200bp），上下游引物用量均为0.4μl（浓度为10μmol/L），反应体系为50μl，退火温度为57℃。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
mdloop2-F：5′-CCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAA-3′；
mdloop2-R：5′-TCGTGCCTACCATTATGGTGATG-3′。
cytb-F：5′-GCATGGAATCTAACCATGA-3′；
cytb-R：5′-GTCTTAGGGAGGTTAGTTGTTC-3′。
线粒体DNA控制区的扩增结果如图7所示，在800bp附近出现清晰、单一的目的条带，可以将PCR产物直接测序；线粒体CYTB基因的扩增结果如图8所示，在1200bp附近出现清晰、单一的目的条带，可以将PCR产物直接测序。以上结果表明采用本发明方法提取的动物粪便DNA可用于濒危物种线粒体基因的扩增模板，为研究遗传多样性及母系遗传提供充足样本。
综合步骤1-3的鉴定结果，可见通过本发明方法对粪便进行前处理以及后续的抽提、纯化步骤，可获得量大质优的粪便DNA模板，满足濒危动物非损伤研究的需求。
实施例3、朱鹮粪便DNA的提取及鉴定
一、朱鹮粪便DNA的提取
1）由于朱鹮粪便不成形，所以取0.3g粪便，于液氮中迅速研磨成粉状，以其为待测样品，转移至2mL离心管中，加入1mL TNE缓冲液，于漩涡震荡器上剧烈震荡2min。
2）置于60℃水浴中温浴10min，期间上下颠倒离心管混匀1次，使待测样品与TNE缓冲液混合更加均匀。
3）再于漩涡震荡器剧烈震荡2min，以500g离心5min（使粪渣沉降于离心管底部，使脱落细胞悬浮于上清液中，使两者有效分离），吸取0.6mL上清液转移至2.0mL离心管中。
4）向上述装有上清液的2mL离心管中，加入15μL蛋白酶K（10mg/mL）和150μL10%（10g/100ml）十二烷基磺酸钠（SDS），56℃水浴裂解1h，期间每隔20min摇匀1次。
5）向上述裂解液中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提液（体积比为25:24:1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min。取上清液于2mL离心管中，然后再加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液，摇匀5min，以10000g离心5min。最后取上清液于2mL离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（体积比为24：1），轻轻摇匀5min，以10000g离心5min，取上清液。
6）将上述上清液转移至1.5mL离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，并加入上清液十分之一体积的乙酸钠水溶液（3M，pH5.2）。在-20℃冰箱中放置20min。
7）12000g离心10min，弃去上清液，收集离心管底部的DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤一遍，置于通风橱内风干乙醇。
8）向干燥后的DNA中加入100μL的TE缓冲液，置于56℃水浴溶解5min。
9）溶解后的DNA经过0.8%琼脂糖凝胶电泳，根据λDNA/HindⅢMarker，切下含有基因组DNA的胶块区域，加入胶块质量3倍体积的溶胶液（即所述胶块与所述溶胶液的配比为1mg：3μl），于70℃水浴溶胶。
10）胶块溶解完全的溶液转移至硅胶膜DNA吸附柱，12000g离心1min。向柱子内加入500μl的70%（体积分数）乙醇，以12000g离心1min。重复加入500μl的70%（体积分数）乙醇，再以12000g离心1min。
11）将柱子转移至1.5mL离心管中，并敞开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，最终获得纯化后的总DNA。
二、朱鹮粪便DNA的鉴定
1、紫外吸收
将步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA，利用分光光度仪进行紫外吸收测定，共测定4个平行样品，每个样品重复测定三次，结果取平均值。
结果如表4所示，可见步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA，其浓度平均值为9.83±1.86μg/ml，OD260/280为1.82±0.06，这说明步骤一提取并纯化后的总DNA纯度较高，基本上无蛋白和RNA，可进行PCR扩增，满足进一步研究的需要。
表4从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA的紫外吸收分析结果
| 平行样品1 | 平行样品2 | 平行样品3 | 平行样品4 | 平均值 | |
| OD260/280 | 1.90 | 1.81 | 1.75 | 1.85 | 1.82 |
| 浓度（μg/ml） | 10.2 | 9.3 | 12.1 | 7.6 | 9.83 |
2、琼脂糖凝胶电泳
将步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。
结果如图9所示，从图中可以看出，步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA片段长度大于23Kbp，目的条带单一，无杂带，可见步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA质量较高，满足进一步研究的需要。
3、用作线粒体DNA控制区的扩增模板
取3μl按步骤一从朱鹮粪便中提取并纯化得到的总DNA作为模板，用引物CIDL-F和CIDH-R扩增线粒体DNA控制区（目的条带大小约为681bp），上下游引物用量均为0.4μl（浓度为10μmol/L），反应体系为50μl，退火温度为58℃。所得PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。同时设置以水代替PCR模板的阴性对照。
CIDL-F：5′-CTTGGTTAATCCCTTCTTCT-3′；
CIDH-R：5′-GGTTGTAAGCTACAAGGACT-3′。
结果如图10所示，在750bp以下出现清晰、单一的目的条带，可以将PCR产物直接测序。这一结果表明采用本发明方法提取的动物粪便DNA可用于濒危物种线粒体基因的扩增模板，为研究遗传多样性及母系遗传提供充足样本。
综合步骤1-3的鉴定结果，可见通过本发明方法对粪便进行前处理以及后续的抽提、纯化步骤，可从鸟类粪便中获得量大质优的粪便DNA模板，满足野生鸟类非损伤研究的需求。
Claims (9)
1.一种从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法，包括如下步骤：
（1）样品前处理：为如下A）或B）：
A）若待测粪便成形，则进行如下A1）或A2）：
A1）若所述粪便体积大于等于1×1×1cm3，且所述粪便表面有粘液层，则取所述粘液层作为待测样品；
A2）若所述粪便体积小于1×1×1cm3，或所述粪便表面没有粘液层，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；
B）若待测粪便不成形，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；
（2）从步骤（1）所得待测样品中提取待纯化总DNA：为如下（a）-（d）：
（a）将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液中，混匀后于56-60℃保温8-12min，得到样品混合液；
所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液的配比为0.3g：1mL；
（b）将步骤（a）得到的样品混合液以500g离心5-10min，取上清液；
（c）除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液；
（d）对步骤（c）得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；
（3）对步骤（2）得到的待纯化总DNA进行纯化：为如下（I）-（II）：
（I）将步骤（2）得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75℃溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为1mg：3μl；
（II）将步骤（I）得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（c）中，所述除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，包括如下步骤：向步骤（2）（b）得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，于54-58℃裂解1-1.5h；
所述上清液、所述蛋白酶K和所述十二烷基磺酸钠的配比为0.6mL：150μg：15mg。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提采用的抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇和/或氯仿-异戊醇；所述苯酚-氯仿-异戊醇是由苯酚、氯仿和异戊醇按照体积比25：24：1的比例混合而成的混合液；所述氯仿-异戊醇是由氯仿和异戊醇按照体积比24：1的比例混合而成的混合液；所述DNA沉淀采用的沉淀液为无水乙醇和/或乙酸钠水溶液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提和DNA沉淀，包括如下步骤：
a1）向步骤（2）（c）得到的样品裂解液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；
a2）向步骤a1）的上清液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；
a3）向步骤a2）的上清液中加入等体积的所述氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；
a4）向步骤a3）的上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，以及1/10体积的乙酸钠水溶液，于-20℃放置20min，12000g离心10min，得到总DNA沉淀；
所述乙酸钠水溶液的pH为5.2，乙酸钠的浓度为3M；
a5）将步骤a4）得到的总DNA沉淀用70%乙醇洗涤一遍，干燥后得到所述待纯化总DNA。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（3）（I）中，所述溶胶液是浓度为5M的碘化钠水溶液。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（3）（II）中，所述DNA纯化，包括如下步骤：
b1）将步骤（I）得到的待过柱样品液加到所述硅胶膜DNA吸附柱中，12000g离心1min，向柱内加入500μl的70%乙醇，以12000g离心1min，重复加入500μl的70%乙醇，再以12000g离心1min；
b2）将柱子转移至1.5mL离心管中，开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入100μl60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，得到所述纯化后的总DNA样品。
7.一种从动物粪便中提取总DNA的方法，其特征在于：所述方法包括权利要求1-6任一中的步骤（1）和步骤（2）。
8.一种从动物粪便中提取总DNA的样品前处理方法和提取后DNA纯化方法，其特征在于：所述方法包括权利要求1-6任一中的步骤（1）和步骤（3）。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述动物为哺乳动物或鸟类。
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