CN109897851A

CN109897851A - 小分子dna纯化试剂

Info

Publication number: CN109897851A
Application number: CN201910292151.1A
Authority: CN
Inventors: 邓文生; 彭飞霞; 吴自辉
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE; Wuhan University of Science and Technology WHUST
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-06-18

Abstract

本发明公开了一种小分子DNA纯化试剂，由试剂A和试剂B两种独立的试剂构成，其中，其中试剂A为饱和碘化钠水溶液(pH 6.0)，且其中含有0.5％质量浓度的Na₂SO₃，试剂B为DNA洗涤液，配方为20mM pH 7.2的Tris.HCl、50mM KCl、85％乙醇。本发明的DNA纯化试剂可同时替代PCR产物纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒中的试剂纯化DNA或从琼脂糖凝胶中抽提DNA,特别是对小分子DNA具有很好的纯化效果，具有很大应用价值和市场前景。

Description

小分子DNA纯化试剂

技术领域

本发明属于化学试剂领域，具体涉及一种小分子DNA纯化试剂。

背景技术

基因克隆是现代分子生物学中最频繁使用的技术手段之一，广泛应用于农业，医学，生物研究，生物制药等领域。基因克隆是将酶切后的目的基因(或DNA片段)与相同的酶酶切的载体在DNA连接酶的作用下进行连接，然后将重组DNA导入细菌宿主进行复制获得大量重组DNA的过程。这一过程包括一系列的DNA操作技术，其中的关键步骤之一是DNA的纯化,它对基因克隆效率起至关重要的作用。例如，利用聚合酶链式反应(PCR)获得的DNA需要纯化以及酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳后也需要纯化。目前，在研究中，常常利用商业试剂盒如PCR纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒对DNA进行纯化。

PCR纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒常用于分子生物学和基因工程研究领域并加快基因的克隆效率。这些试剂盒被设计和生产成一次性使用的商品，主要原因之一是因为试剂盒中的试剂配方不为用户所知。在现有的技术中，PCR产物纯化和DNA胶抽提是分别利用PCR纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒完成，现有的PCR试剂盒和DNA胶抽提试剂盒纯化小分子DNA效率很低，很难获得足够DNA满足基因克隆的要求，影响研究的效率，浪费时间和人力。PCR纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒包含各自的试剂，是两种不同的试剂盒，购买两种试剂盒不仅增加研究成本，也产生大量实验室垃圾，对环境造成负担。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种小分子DNA纯化试剂，解决现有的PCR纯化试剂盒和DNA胶抽提试剂盒对小分子DNA纯化效率低的问题。

本发明的技术方案为：小分子DNA纯化试剂，由试剂A和试剂B两种独立的试剂构成，其中，其中试剂A为饱和碘化钠水溶液(pH 6.0)，且其中含有0.5％质量浓度的Na₂SO₃，试剂B为DNA洗涤液，配方为20mM pH 7.2的Tris.HCl、50mM KCl、85％乙醇。

进一步地，试剂A的配置方法如下：

(1)在电子天平中称量210克NaI,将称量好的NaI置于500毫升烧杯中；

(2)取100毫升蒸馏水，在50℃水浴锅中加热，加入烧杯中溶解NaI,充分搅拌最大限度的溶解NaI，直至仍有少量NaI固体未还完全溶解，室温静置1小时；

(3)用浓盐酸调整溶液pH值至6.0，静置过夜，将上清转移至无菌试剂瓶中；

(4)加入0.5克亚硫酸钠(Na₂SO₃)固体至溶液中让其充分溶解，防止饱和NaI氧化变色；

(5)将溶液用0.45μM过滤器灭菌并保存在避光的容器中。

进一步地，试剂B的配置方法如下：

(1)按照常规方法配制1M Tris.HCl(pH 7.2)母液；

(2)在电子天平中称量0.373克KCl，置于250毫升试剂瓶中；

(3)向试剂瓶中加2毫升1M Tris.HCl(pH7.2)母液；

(4)向试剂瓶中加13.0毫升蒸馏水将KCl彻底溶解；

(5)用量筒量取85毫升无水乙醇，加入到试剂瓶中，与溶液彻底混匀，加盖密封。

本发明的小分子DNA纯化试剂可用于纯化PCR产物中小分子DNA，效果优于现有的商业化试剂盒。

本发明的小分子DNA纯化试剂可用于纯化琼脂糖凝胶中小分子DNA，效果优于现有的商业化试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

与商业试剂盒的试剂相比，我们发明的试剂能够更有效地从PCR产物中和琼脂糖凝胶中纯化小分子DNA。由于目前小分子RNA包括siRNA(小干扰RNA),shRNA(小发夹RNA),miRNA(微小RNA)等在生物领域被广泛研究，在研究这些小RNA在细胞中的功能之前，研究人员需要将编码这些RNA的小分子DNA克隆在表达载体上。然而，用现有试剂盒包括PCR产物纯化试剂盒和DNA抽提试剂盒纯化小分子DNA效果很差，很难获得足够量的DNA来满足基因克隆的要求，从而严重影响研究的进程。利用我们发明的试剂代替试剂盒中的试剂纯化小分子DNA能够获得足够量的产量，解决上述存在的问题，能加快研究的进程。另外，我们发明的两种试剂既可以用于PCR产物的纯化也能够从琼脂糖凝胶中抽提纯化DNA；而用商业试剂盒完成同样的工作则需要订购两种不同试剂盒，增加研究成本。由于PCR试剂盒和DNA胶抽提试剂盒使用的是同种硅柱，因此，使用我们的试剂只需要订购一种试剂盒就能完成，能节省研究支出。应用实例数据表明，我们的试剂可以与不同公司的试剂盒中的硅柱一起使用，具有很好的兼容性，可以订购便宜的试剂盒一起使用，也可以节省研究成本。另外，由于在市场上可以单独向生产硅柱的厂家订购硅柱，因此，我们实际上发明了一种可以同时用于PCR产物纯化和DNA胶抽提的双功能试剂盒，我们这款产品使用的试剂极为简单，特别是对小分子DNA的纯化具有很好的效果，具有很大应用价值和市场前景。

附图说明

图1.PCR纯化试剂盒与发明的试剂纯化PCR小分子DNA的效果比较分析；

图2.DNA胶抽提试剂盒与发明的试剂从琼脂糖中抽提小分子DNA的效果比较分析。

具体实施方式

2.2.1)两种溶液的试剂配方及配制方法

用于高效纯化小分子DNA的试剂包括饱和碘化钠溶液(NaI)和DNA洗涤液。

a)饱和碘化钠溶液配方和配制

配方：NaI,Na₂SO₃,H₂0.

配制方法：

(2)取100毫升蒸馏水，在50℃水浴锅中加热，加入烧杯中溶解NaI,充分搅拌最

大限度的溶解NaI，直至仍有少量NaI固体未还完全溶解，室温静置1小时；

(4)加入0.5克亚硫酸钠(Na₂SO₃)固体至溶液中让其充分溶解，防止饱和NaI氧

化变色；

(5)将溶液用0.45μM过滤器灭菌并保存在避光的容器中。

b)DNA洗涤液配方和配制

配方：20mM Tris.HCl(pH 7.2)，50mM KCl,85％乙醇。

配制方法(100mL)：

(1)按照常规方法配制1M Tris.HCl(pH 7.2)母液；

(2)在电子天平中称量0.373克KCl，置于250毫升试剂瓶中；

(3)向试剂瓶中加2毫升1M Tris.HCl(pH7.2)母液；

(4)向试剂瓶中加13.0毫升蒸馏水将KCl彻底溶解；

(5)用量筒量取85毫升无水乙醇，加入到试剂瓶中，与溶液彻底混匀，加盖密封

2.2.2)利用上述配制的两种溶液从PCR产物中高效纯化小分子DNA的方法

为了确定上述配制试剂从PCR产物中纯化小分子DNA的效果，利用Qiagen和Axygen和CWBIO PCR纯化试剂盒中提供的硅柱和上述两种配制的试剂对PCR产物进行纯化，获得的结果与商业试剂盒纯化DNA的效果进行比较。通过PCR扩增编码TFIIA shRNA的cDNA片段(约70bp),每个反应50微升。每个纯化柱用2管50微升PCR产物，共设置12个反应。商业试剂盒纯化DNA的方法根据各自的试剂盒提供的操作手册完成。而使用我们发明的试剂则按照以下操作步骤完成：

1)将两管50微升PCR产物合并在1.5mL的离心管中，加入500微升饱和碘化钠溶液并彻底混合；

2)分别从每个试剂盒中取1新鲜硅柱(带收集管)，将上述1)中的混合液加入至硅柱中，在12000rpm速度下离心1分钟；

3)弃收集管中的滤液，放回硅柱，加500微升DNA洗涤液，离心清洗1分钟。

4)弃收集管中的滤液，放回硅柱，不加任何液体离心1分钟去除硅柱中的残夜。

5)用1.5mL无菌离心管置换废液收集管，加入50微升双蒸水于硅柱膜的中央，12000rpm离心1分钟洗脱DNA。

最后，将上述获得的DNA与商业试剂盒获得的DNA一起分析，各取5微升DNA,用1.5％琼脂糖凝胶电泳并成像。结果表明，用我们发明的试剂纯化获得的DNA明显多于用商业试剂盒获得的DNA(图1)，因此，与试剂盒相比，我们发明的试剂更能高效地纯化PCR小分子DNA。

2.2.3)利用上述配制的两种溶液从琼脂糖凝胶中高效纯化小分子DNA的方法

为了确定上述配制试剂从琼脂糖凝胶中纯化小分子DNA的效果，利用Qiagen和Axygen和CWBIO胶抽提试剂盒中提供的硅柱和上述配制的两种试剂对琼脂糖凝胶中的小分子DNA进行抽提、纯化，获得的结果与用这些商业试剂盒抽提纯化DNA的效果进行比较。取5微克上述2.2.2)中纯化的小分子DNA片段(约70bp)并载于1.5％琼脂糖凝胶中电泳10分钟，在紫外灯下，用手术刀片切出含目的DNA的凝胶置于1.5mL离心管，在电子天平中称量其重量。商业试剂盒抽提DNA的方法根据各自的试剂盒提供的操作手册完成。而使用我们发明的试剂抽提DNA则按照以下操作步骤完成：

(1)向离心管中加入胶块重量的三倍体积的饱和碘化钠溶液(按100毫克胶加100微升胶溶解液比例计算)，在42℃水浴锅中加热将胶溶解；

(2)待胶完全溶解后，冷却至室温，往离心管中加胶重量的1倍体积的异丙醇彻底混合。

(3)将离心管中的胶混合液移至硅柱中(注:带收集管)，置于离心机中，以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；

(4)向再生柱中加600毫升DNA洗涤液，以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液。将硅柱放回收集管，不加任何液体，以相同速度再次离心1分钟以除尽硅柱中残留液；

(5)将硅柱置于1.5毫升无菌离心管中，向硅柱中加30微升去离子蒸馏水，放置室温1分钟后，以12000rpm速度离心1分钟将硅柱中DNA洗脱；

最后，将上述方法获得的DNA与商业试剂盒获得的DNA一起分析，各取5微升DNA,用1.5％琼脂糖凝胶完成电泳并成像。结果表明，用我们发明的试剂从琼脂糖抽提获得的DNA明显多于用商业试剂盒获得的DNA(图2)。因此，与试剂盒相比，我们发明的试剂更能高效地从琼脂糖中抽提获得小分子DNA。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.小分子DNA纯化试剂，其特征在于，由试剂A和试剂B两种独立的试剂构成，其中，其中试剂A为饱和碘化钠水溶液，pH6.0，且其中含有0.5％质量浓度的Na₂SO₃，试剂B为DNA洗涤液，配方为20mM pH7.2的Tris.HCl、50mM KCl、85％乙醇。

2.根据权利要求1所述的小分子DNA纯化试剂，其特征在于，试剂A的配置方法如下：

(4)加入0.5克亚硫酸钠固体至溶液中让其充分溶解；

(5)将溶液用0.45μm过滤器灭菌并保存在避光的容器中。

3.根据权利要求1所述的小分子DNA纯化试剂，其特征在于，试剂B的配置方法如下：

(1)配制1M Tris.HCl pH7.2母液；

(2)在电子天平中称量0.373克KCl，置于250毫升试剂瓶中；

(3)向试剂瓶中加2毫升步骤(1)配制的母液；

(4)向试剂瓶中加13.0毫升蒸馏水将KCl彻底溶解；

4.根据权利要求1-3任一项所述的小分子DNA纯化试剂用于从PCR产物中纯化小分子DNA的用途。

5.根据权利要求1-3任一项所述的小分子DNA纯化试剂用于从琼脂糖凝胶中纯化小分子DNA的用途。