CN109022419A - 一种片段化dna的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种片段化DNA的制备方法，其制备方法步骤为：A、复苏并扩增细胞系；B、细胞系核小体酶切；C、片段化DNA的纯化和回收；D、对片段化DNA进行分段大小分析。本发明的目的在于制备接近人天然的cfDNA的片段化DNA，为cfDNA标准品、质控品和参考品提供稳定可靠的原料来源。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技领域，具体涉及一种片段化DNA的制备方法。
背景技术
癌症患者的基因分子层面的信息给新药开发和治疗方法带来了一场新的革命。目前组织样本检测是基因分子检测的金标准，但其存在两点不足：1.取样方式为风险性入侵式取样，有许多癌种和患者无法满足该要求。2.由于异质性的原因，取得的组织样本可能不能完整地代表肿瘤信息。检测血液中游离DNA(Cel l-free DNA，cfDNA)的信息能很好的弥补上述的缺点。cfDNA是人体组织排放到血液里的DNA片段，不管是正常人还是病人都会发生，能够作为癌症早筛，癌症治疗，治疗后的分子标记物。
随着cfDNA在临床中的广泛应用，样本的前、不同的检测和分析方法以及不同实验室的检测能力都需要通过标准品、质控品或参考品来衡量和评估，人体内的cfDNA含量少，且无法保证稳定可靠的来源，所以通过获取人体内的cfDNA作为制备标准品、质控品和参考品的原材料不可行，本发明通过酶切细胞系获得片段化DNA的方法，模拟人体内cfDNA的产生，为cfDNA标准品、质控品和参考品的制备提供稳定可靠的原料来源。
目前制备cfDNA标准品、质控品和参考品的所用的片段化DNA主要通过2种途径获得：1、通过人工合成质粒方法获得，缺点：人工合成的质粒不能模拟天然cfDNA正常生物学状态下的序列复杂度2、通过超声打断细胞系的基因组DNA获得片段化DNA，缺点：在人体内不存在机械力打断DNA这一过程，超声打断获得的DNA片段与人天然cfDNA片段大小和DNA分子末端差异大，不能准确评估cfDNA检测方法或实验室的检测能力。
发明内容
本发明的目的在于制备接近人天然的cfDNA的片段化DNA，为cfDNA标准品、质控品和参考品提供稳定可靠的原料来源。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
1、复苏并扩增细胞系；
2、细胞系核小体酶切；
3、片段化DNA的纯化和回收；
4、对片段化DNA进行分段大小分析。
通过上述技术方案与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、具备与天然cfDNA相近的片段大小分布；
2、具备正常生物学状态下的序列复杂度；
3、具备与天然cfDNA相似的分子末端链接效率；
4、得率高，稳定性高，保存简单，有效期长；
5、本发明方法获得的片段化DNA性能稳定，可重复性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明一种片段化DNA的制备方法实施例或现有技术中的技术方案，下面将对一种片段化DNA的制备方法实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明一种片段化DNA的制备方法的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为人天然cfDNA片段大小分布(bp)；
图2为细胞系核小体酶切获得的片段化DNA大小分布(bp)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明一种片段化DNA的制备方法实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一种片段化DNA的制备方法一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明一种片段化DNA的制备方法中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明一种片段化DNA的制备方法保护的范围。
下面结合实施例和具体实施方式对本发明一种片段化DNA的制备方法作进一步详细的说明。
名词解释
Hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸
PMSF：苯甲基磺酰氟
IGEPAL：酞菁氧钒
EDTA：乙二胺四乙酸
RNaseA：核糖核酸酶A
SDS:十二烷基硫酸钠
Proteinase K:蛋白酶K
Tris-HCL缓冲液：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲液
一种片段化DNA的制备方法步骤如下：
1、细胞复苏与扩增：
1.1从液氮罐中取出需要复苏的细胞，立即放入37℃水浴锅中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管；
1.2待冻存管中细胞悬液融化后，移入离心机内，100g。。。。800g离心1min。。。。。5min；
1.3离心完毕后，弃上清，加入0.5ml，1ml 1.5ml。。。5ml培养基，轻轻混匀，移入培养瓶，并补至1ml，。。。。。。10ml培养液，转移至37℃，5％CO2培养箱中培养；
1.4当细胞密度达到0.5×10^6/ml,1×10^6/ml。。。。。。。5×10^6/ml时，收集细胞并补加培养液，使细胞密度维持在0.5×10^6/ml,1×10^6/ml。。。。。。。5×10^6/ml；
1.5当细胞量达到1×10^6,1×10^7，。。。。。。。1×10^9时，收集细胞；
2试剂配置：
2.1 Hepes溶液配制
称量1g。。。。10g Hepes溶于2,ml，4ml，20mL超纯水或纯化水中；使用饱和氢氧化钠溶液将Hepes溶液PH值调节到8后定容至10ml，20ml，。。。。。。100ml；
2.2 BufferA配制
取1ml，。。。。。。。。10ml纯化水或超纯水，加入1μL，。。。。。10μL Hepes溶液，2μL，4μL。。。。。20μL的1摩尔/L的氯化镁溶液，10μL，。。。。。100μL 1摩尔/L的氯化钾溶液，1μL，。。。。。10μL 1摩尔/L的DTT溶液，10μL，。。。。。100μL 0.1摩尔/L的PMSF溶液，定容至2ml，。。。。。。。。20ml；
2.3 SDS溶液的配制
称量1g，。。。。。。10gSDS溶于10ml。。。。。。。。。100ml纯化水或超纯水中，等待充分溶解后定容至20ml。。。。。200ml；
2.4IGEPAL的配制
量取1ml。。。。。10ml IGEPAL溶于1ml。。。。。。10ml水中，充分混匀；
2.5 RNase A的配制
量取10μL，20μL….100μL100mg/ml的RNase A，0.1μL,0.2μL。。。。。1μL的Tris-HCl缓冲液，溶于10μL,……..100μL的纯化水或超纯水中，充分混匀；
3细胞系核小体酶切：
3.1.细胞2*10^6………………..2*10^9个细胞置于冰上融化；
3.2.加0.1ml,0.5ml,……………10ml Buffer A，震荡10s，15s。。。。30s，冰孵1min。。。。。。。10min；
3.3.加1μL。。。。。。。。。10μL IGEPAL溶液，震荡10s，15s。。。。30s，冰孵1min，。。。。。。。。10min；4℃，3000rpm，1min，。。。。。。。。10min离心，弃上清；
3.4.加0.1ml,0.5ml,……………10ml Tris-HCl缓冲液清洗，震荡混匀，4℃，3000rpm，1min，。。。。。。。。10min离心，弃上清；
3.5.加0.1ml,0.5ml,……………10ml Tris-HCl缓冲液重悬，并转移至PCR管中；
3.6.加10μL。。。。。。100μL微球菌核酸酶，震荡混匀，35℃。。。。。45℃孵育5min.。。50min；
3.7.加1μL.。。。10μL EDTA，震荡混匀；加1μL.。。。10μL RNaseA溶液，震荡混匀，35℃。。。。。45℃孵育5min.。。50min；
3.8.加1μL.。。。10μL SDS溶液，震荡混匀；1μL.。。。10μL Proteinase K，震荡混匀，40℃.。。。。60℃孵育5min.。。。。。。。50min；
4片段化DNA的纯化和回收：
4.1将DNA纯化磁珠室温平衡30min；
4.2将酶切后样本转移至合适的离心管中，每1mL.。。。。10ml样本加1mL.。。。。10ml10mM Tris-HCL冲液，震荡混匀，瞬离；
4.3每2mL。。。。。20ml样本加1mL.。。。。10ml纯化磁珠，震荡混匀，瞬离，室温静置10min.。。。。。。60min；
4.4将样本管转移至磁力架上，静置10min。。。。60min，上清澄清后，每1mL.。。。。10ml反应体系缓慢转移2mL。。。。。20ml上清至新的离心管中，不要碰到磁珠，弃磁珠；
4.5每2mL。。。。。20ml上清加1mL.。。。。10ml纯化磁珠至上清中，振荡混匀，瞬离，室温静置10min。。。。60min；
4.6将样本管转移至磁力架上，静置10min。。。。60min，弃上清；
4.7每2mL。。。。。20ml反应体系回收得到的磁珠加入1mL.。。。。10ml 80％乙醇清洗，将样本管转移至磁力架上静置10min。。。。60min，上清变澄清后，弃上清，再重复上述步骤一次；
4.8每2mL。。。。。20ml反应体系回收得到的磁珠加0.5mL。。。。。5ml 10mM Tris-HCL缓冲液洗脱，震荡混匀，瞬离，室温静置10min.。。。。。。60min；
4.9将样本管放在磁力架上，静置10min.。。。。。。60min，转移洗脱液至新的合适的容器中；
4.10将片段化DNA置于-20℃一下保存；
5对片段化DNA进行分段大小分析：
使用安捷伦2100Bioanalyzer生物分析仪对纯化获得的DNA片段大小进行分析(具体操作方法参考安捷伦2100Bioanalyzer生物分析仪操作说明)，DNA片段大小分布满足144bp-176bp≥92％。
通过上述技术方案与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、具备与天然cfDNA相近的片段大小分布；
2、具备正常生物学状态下的序列复杂度；
3、具备与天然cfDNA相似的分子末端链接效率；
4、得率高，稳定性高，保存简单，有效期长；
5、本发明方法获得的片段化DNA性能稳定，可重复性高。
以上所述的仅是本发明一种片段化DNA的制备方法的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明一种片段化DNA的制备方法创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明一种片段化DNA的制备方法的保护范围。
Claims (1)
1.一种片段化DNA的制备方法，其特征在于,
其制备方法步骤为：
A、复苏并扩增细胞系；
B、细胞系核小体酶切；
C、片段化DNA的纯化和回收；
D、对片段化DNA进行分段大小分析。
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| CN201810955500.9A CN109022419A (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种片段化dna的制备方法 |
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| CN (1) | CN109022419A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110699757A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-01-17 | 河北农业大学 | 低起始量细胞样本的核小体dna测序文库的构建方法和应用 |
| CN113862258A (zh) * | 2021-11-02 | 2021-12-31 | 苏州水木济衡生物技术有限公司 | 一种高收率dna片段及其制备方法 |
| CN113930512A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-01-14 | 苏州水木济衡生物技术有限公司 | 一种模拟血浆循环肿瘤游离dna标准品及其制备方法与应用 |
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2018
- 2018-08-21 CN CN201810955500.9A patent/CN109022419A/zh not_active Withdrawn
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