CN108642050A - Pcr纯化试剂及使用该试剂纯化pcr产物的方法 - Google Patents

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王娟
赵沙沙
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Wuhan University of Science and Technology WHUST
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

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Abstract

本发明公开了一种PCR纯化试剂及使用该试剂纯化PCR产物的方法，PCR纯化试剂，包括DNA结合液和洗涤液，所述DNA结合液的配方为：3mol/L氯化钠、体积浓度为30％的乙醇；洗涤液的配方为：10mmol/L Tris.HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、体积浓度80％乙醇，Tris.HCl的pH值为8.0。本发明的PCR纯化试剂可以成功用于DNA的纯化而不影响DNA纯化的产量。本发明的PCR纯化试剂与再生硅柱一起使用，可以减少一次性商业试剂盒的使用数量，减少实验室垃圾的产生，保护环境，节约社会资源和使用费用。

Description

PCR纯化试剂及使用该试剂纯化PCR产物的方法
技术领域
本发明属于生物试剂领域，具体涉及一种PCR纯化试剂及使用该试剂纯化PCR产物的方法。
背景技术
基因克隆是二十世纪最伟大的发明之一，广泛应用于许多研究领域包括生物，医学，农业，生物制药等。基因克隆是利用具有复制能力的载体或质粒将获得的目的基因或DNA(脱氧核糖核酸)片段与载体在体外进行连接形成重组载体并将之转化宿主细菌进行复制，通过菌体培养、繁殖和提取质粒等步骤获得大量重组DNA的过程。基因克隆包含一系列实验步骤，包括目的基因的扩增与纯化，限制性酶酶切反应与琼脂糖凝胶电泳，DNA胶抽提与连接反应，细菌的转化、培养和质粒提取等步骤。目前，研究者通常采用两种主要的方法完成基因克隆，即采用纯手工方法或者采用商业试剂盒与手工相结合的方法。纯手工方法费时费力，实验进展慢；而采用商业试剂盒与手工结合的方法，可加速实验的进程。在基因克隆过程中PCR(Polymerase Chain Reaction-聚合酶链式反应)纯化试剂盒常用于PCR产物纯化。经PCR纯化的DNA不仅纯度高，而且增加随后的酶切反应的效率，因此，使用PCR试剂盒具有省时、省力，加快基因克隆等效果。由于PCR纯化试剂盒是全球绝大多数实验室常使用的试剂盒，每年消耗的PCR试剂盒数量很大，而且PCR纯化试剂盒被设计和制备成一次性使用；因此，使用试剂盒，一方面，不仅产生大量实验室垃圾，造成环境污染；另一方面，也对实验室产生沉重经济负担。因此，本发明的目的是通过使用可持续的实验室自配的PCR产物纯化试剂从而减少研究中PCR试剂盒的使用量，减少实验室垃圾，为保护环境，节约资源和资金提供方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种PCR纯化试剂，解决现有的PCR纯化试剂盒一次性使用造成环境和浪费的问题。
本发明的技术方案为：PCR纯化试剂，包括DNA结合液和洗涤液，所述DNA结合液的配方为：3mol/L氯化钠、体积浓度为30％的乙醇；洗涤液的配方为：10mmol/L Tris.HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、体积浓度80％乙醇，Tris.HCl的pH值为8.0
本发明还公开了一种PCR产物纯化试剂与硅柱一起使用、纯化DNA的方法，包括以下步骤
(1)将PCR产物转移至无菌离心管中，向离心管加入5倍体积的上述所述的DNA结合液并用移液枪将PCR产物与DNA结合液彻底匀；
(2)将PCR产物混合液转移至PCR产物纯化用的硅柱中，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；
(3)向硅柱中加入上述所述的洗涤液，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；将硅柱重置于离心机中，以相同的速度离心1分钟，去除硅柱中的残留液；
(4)将硅柱转移至无菌离心管中，向硅柱中加入去离子蒸馏水，将硅柱与离心管转移至离心机中以12000rpm速度离心1分钟；
(5)将洗脱的DNA进行定量和琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步地，为了达到本发明节约材料的目的，硅柱为再生硅柱。
进一步地，再生硅柱采用专利申请号：201710437190.7中权利要求2的方法制备，即：
(1)取使用后的一次性硅柱置于收集管中，加0.75mL蒸馏水，进行离心分离并弃去废液；
(2)加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，静置3分钟进行离心分离并弃去废液；重复该步骤五次；
(3)用0.75mL蒸馏水清洗硅柱，进行离心分离并弃去废液；
(4)将硅柱移至无菌离心管中，再次离心分离，除尽硅柱中残留水分，即得到再生硅柱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的PCR纯化试剂可以成功用于DNA的纯化而不影响DNA纯化的产量。本发明的PCR纯化试剂与再生硅柱一起使用，可以减少一次性商业试剂盒的使用数量，减少实验室垃圾的产生，保护环境，节约社会资源和研究经费。
附图说明
图1为使用本发明的PCR纯化试剂纯化PCR产物与商业试剂盒的对比图。
具体实施方式
实施例1DNA结合液的制备
DNA结合液包含3M氯化钠(NaCl)和30％(v/v)乙醇。
下面以50毫升DNA结合液为例，配制方法如下：
(1)在电子天平中称量8.775克NaCl,将称量好的NaCl置于50毫升无菌离心管中；
(2)向离心管中加35毫升蒸馏水，在50℃水浴锅中加热溶解NaCl；
(3)量取15毫升无水乙醇并置于50毫升无菌离心管中；
(4)用5毫升移液枪吸取无水乙醇加入到35毫升NaCl溶液中，加离心管盖并旋紧离心管，颠倒离心管数次，使NaCl溶液和乙醇彻底混匀；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)换成1毫升移液枪，吸取无水乙醇，继续加入到离心管中的NaCl和乙醇混合液中，每加一次乙醇都要将离心管加盖密封并彻底混匀，直到加完所有无水乙醇为止。
实施例2洗涤液的配置
洗涤液包含10mM Tris.HCl(pH 8.0),100mM NaCl,1mM EDTA,80％(v/v)乙醇。
下面以100毫升洗涤液为例，配制方法如下：
(1)按照常规方法配制1M Tris.HCl(pH 8.0)母液以及0.5M EDTA母液；
(2)在电子天平中称量0.585克NaCl，置于250毫升试剂瓶中；
(3)向试剂瓶中加1毫升1M Tris.HCl(pH8.0)母液以及200微升0.5M EDTA母液；
(4)向试剂瓶中加18.5毫升蒸馏水将NaCl彻底溶解；
(5)用量筒量取80毫升无水乙醇，加入到试剂瓶中，与溶液彻底混匀，加盖密封。
实验例
为了确定本发明的试剂在DNA纯化中效果，利用Qiagen和Axygen PCR纯化试剂盒中的再生柱和本发明的试剂对PCR产物(LIF DNA,约600bp)进行纯化。再生硅柱的制备方法参照专利申请号：201710437190.7，发明名称为：硅柱快速再生方法。同时与Qiagen和AxygenPCR纯化试剂盒原装硅柱和试剂的纯化效果进行比较。
利用本发明的试剂和再生硅柱完成PCR产物纯化方法如下：
(1)按照PCR常规方法扩增合成50微升PCR产物；
(2)将PCR产物转移至1.5毫升无菌离心管中，向离心管加入5倍体积本发明的DNA结合液并用移液枪将PCR产物与本发明的DNA结合液彻底匀；
(3)将PCR产物混合液转移至PCR产物纯化用的再生硅柱中，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；
(4)向再生硅柱中加700微升本发明的洗涤液，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；将再生硅柱和收集管重置于离心机中，以相同的速度离心1分钟，除尽再生硅柱中的残留液；
(5)将结合DNA的再生硅柱转移至1.5毫升无菌离心管中，向再生硅柱中加入35微升去离子蒸馏水，将再生硅柱与离心管转移至离心机中以12000rpm速度离心1分钟；
(6)将洗脱的DNA进行定量和琼脂糖凝胶电泳检测。
Qiagen和AxygenPCR纯化试剂盒原装硅柱和试剂纯化方法则根据各自提供的实验手册完成。
如图1所示，利用再生柱和本发明的试剂对PCR产物的纯化效果与原装试剂盒的纯化效果没有显著差异；说明用于PCR产物纯化的本发明的试剂可以与再生柱一起使用而不显著影响DNA纯化的产量，证明本发明的试剂是具有很好的DNA纯化功能。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (4)

1.PCR纯化试剂，其特征在于，它包括DNA结合液和洗涤液，所述DNA结合液的配方为：3mol/L氯化钠、体积浓度为30％乙醇；所述洗涤液的配方为：10mmol/L Tris.HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、体积浓度80％乙醇，Tris.HCl的pH值为8.0。
2.PCR产物纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将PCR产物转移至无菌离心管中，向离心管加入5倍体积的权利要求1所述的DNA结合液并用移液枪将PCR产物与DNA结合液彻底匀；
(2)将PCR产物混合液转移至PCR产物纯化用的硅柱中，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；
(3)向硅柱中加权利要求1所述的洗涤液，置于离心机中以12000rpm速度离心1分钟，弃收集管中废液；将硅柱重置于离心机中，以相同的速度离心1分钟，去除硅柱中的残留液；
(4)将硅柱转移至无菌离心管中，向硅柱中加入去离子蒸馏水，将硅柱与离心管转移至离心机中以12000rpm速度离心1分钟；
(5)将洗脱的DNA进行定量和琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述的PCR产物纯化的方法，其特征在于，硅柱为再生硅柱。
4.根据权利要求3所述的PCR产物纯化的方法，其特征在于，再生硅柱通过以下方法制备：
(1)取使用后的一次性硅柱置于收集管中，加0.75mL蒸馏水，进行离心分离并弃去废液；
(2)加入1mol/L磷酸溶液0.5mL，静置3分钟进行离心分离并弃去废液；重复该步骤五次；
(3)用0.75mL蒸馏水清洗硅柱，进行离心分离并弃去废液；
(4)将硅柱移至无菌离心管中，再次离心分离，除尽硅柱中残留水分，即得到再生硅柱。
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