JP5202732B2

JP5202732B2 - 核酸抽出装置

Info

Publication number: JP5202732B2
Application number: JP2011516118A
Authority: JP
Inventors: リム，グン−ベ; クウォン，ホ−テク; カーン，ジ−ミン; チュン，ジン−ファ
Original assignee: ポステックアカデミー−インダストリーファンデーション
Priority date: 2008-06-27
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: CN102137719A; EP2303458A4; CN102137719B; EP2303458B1; JP2011525805A; KR20100001826A; US20110300609A1; KR101005924B1; EP2303458A1; US8815572B2; WO2009157679A1

Description

本発明は、核酸抽出装置に関し、より詳細には、支持体としてヒドロゲル支持体を用いた核酸抽出装置に関する。

近年、ヒトゲノム研究の結果に基づいて遺伝子レベルで病気の原因を解析することにより、人の病気を治療または予防する目的で生体試料の操作および生化学的分析に対する要求が次第に高まっている。また、病気の診断以外にも、新薬の開発、ウイルスやバクテリア感染の有無の事前検査および法医学などの多様な分野において、生体試料や細胞を含む試料から核酸を抽出および分析する技術が求められている。

核酸の抽出時に、低純度の核酸は、サザンブロット法（ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）のようなハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応、酵素反応のような化学反応を抑制したり妨害し、核酸汚染物質は、被検核酸を分解し、核酸の定量に誤りをもたらす。このような汚染物質には、脂肪のような低分子物質、酵素阻害剤のみならず、蛋白質のような酵素、多糖体、およびポリヌクレオチドなどがある。

分子生物学方法の応用に適した高純度の核酸を得るために、前記問題を解決するための方法が種々開発されている。

細胞から核酸を抽出するための方法として、細胞を含む試料をＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ）やプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）で処理して可溶化した後、フェノールで蛋白質を変性除去して核酸を精製する方法がある。しかし、フェノール抽出法では、多くのステップを経なければならず、時間が長くかかる上に、核酸の抽出効率は作業者の熟練度に大きく左右される。

最近では、このような問題を減らすために、カラムを用いたキットが核酸の抽出における基本となっている。これは、核酸と特異的に結合するシリカやガラス繊維を用いた方法であり、細胞をカオトロピック試薬（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃｒｅａｇｅｎｔ）で処理して細胞を溶解し、水分子と核酸との構造的な相互作用の原理を利用して核酸分子を蛋白質およびその他の細胞内物質から精製する方法である。

ガラス繊維やシリカ膜は、細胞代謝物質との結合比率が低いため、相対的に高濃度の核酸を得ることができる。この方法は、フェノール法に比べて簡便ではあるが、ＰＣＲなどの酵素反応を強く阻害するカオトロピック試薬やエタノールを使用しているため、これらの物質を完全に除去しなければならず、このため、操作が複雑で、時間がかかるという欠点がある。

最近、フィルタを用いて核酸を直接精製する方法が開示されている（国際公開ＷＯ００／２１９７３号）。この方法では、試料をフィルタに通過させて細胞をフィルタに吸着させた後、フィルタに吸着した細胞を溶解し、フィルタでろ過させた後、フィルタに吸着した核酸を洗浄および溶出する。しかし、細胞をフィルタに吸着させた後、核酸を溶出させるためには、細胞の種類によってフィルタを選択しなければならないという問題がある。

そこで、本発明は、上記の問題を解決するためになされたものであって、その目的は、より安定的かつ容易に核酸を抽出可能な抽出装置を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明の一実施例による核酸抽出装置は、管状の、一側に開放された排出口を有するチューブと、前記チューブ内に設けられ、抽出対象物質を除く不純物をフィルタリングするヒドロゲル支持体とを備えることができる。

一側が詰まった管状の、前記チューブが挿入されて前記排出口に連通するハウジングをさらに備えることができる。また、前記ヒドロゲル支持体は、アガロースゲルからなり得、前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことができる。また、前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことができる。

前記ヒドロゲル支持体は、上面に前記チューブの長手方向につながった注入溝が形成可能であり、前記注入溝は、前記ヒドロゲル支持体の中央に位置することができる。また、前記チューブの外周には、前記ヒドロゲル支持体と当接する複数の減圧孔が形成可能である。また、前記ヒドロゲル支持体は、前記チューブの内側面と密着可能であり、前記ヒドロゲル支持体は、回転体形状からなり得る。

また、核酸抽出装置は、細胞から核酸を抽出するためのものであって、細胞は、生体試料からなるか、あるいは動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得、さらに、細胞は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液（ｃｅｌｌａｓｐｉｒａｔｅ）、組織、および組織由来物質を含むヒト由来細胞からなり得る。

前記核酸抽出装置は、遠心分離機に設置され得、前記核酸は、ＤＮＡであり得る。また、前記核酸抽出装置は、ＤＮＡチップまたは遺伝子検査において核酸の抽出に適用可能であり、ポイントオブケア検査において核酸の抽出に適用可能である。

本発明の一実施例によれば、ヒドロゲル支持体をフィルタとして用いることにより、不純物なく、より容易に核酸を抽出することができる。

また、ヒドロゲル支持体としてアガロースゲルを用いることにより、純粋な核酸を得ることができる。

さらに、ヒドロゲル支持体に注入溝を形成することにより、核酸の回収効率が向上する。

なお、チューブに減圧孔を形成することにより、核酸の損傷を減らし、かつ、より容易に抽出することができる。

本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。本発明の核酸抽出装置を用いて分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）のゲノム核酸の電気泳動結果を示す写真である。本発明の核酸抽出装置を用いて分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノム核酸のＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）結果を示す写真である。本発明の第１実施例による核酸抽出装置を用いて抽出したヒトパピローマウイルス（ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａＶｉｒｕｓ）（以下、「ＨＰＶ」という。）細胞核酸のＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真である。本発明の第１実施例による核酸抽出装置を用いて抽出したＨＰＶ細胞核酸の核酸チップ検査結果を示す写真である。本発明の第２実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。本発明の第３実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。

以下、添付した図面を参照して、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、様々な異なる形態で実現可能であり、後述する実施例に限定されない。そして、図面において、本発明を明確に説明するために、説明において不要な部分は省略しており、明細書の全体にわたって同一または類似の構成要素については、同一の参照符号を付している。

図１は、本発明の第１実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。

図１に示すように、本発明の一実施例による核酸抽出装置は、外形をなすハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４の内部に設けられたヒドロゲル支持体１６と、チューブ１４を密閉する蓋１３とを備える。

ハウジング１２は、内部に空間を有する円筒状の管からなり、下部が詰まっている。そして、ハウジング１２の下端は、抽出された核酸または核酸が集められるように、下方に行くほど内径が小さくなる。

チューブ１４は、ハウジングの内部に嵌設されるが、内側に細胞抽出液を収容できるように空間が形成される。チューブ１４の下端には、核酸がハウジングへ移動可能に下向きに開放された排出口２４が形成される。排出口２４は、蛋白質などを除く核酸のみが排出できるように、他の部分よりも内径が小さくなるように形成される。

チューブ１４にはヒドロゲル支持体１６が設けられる。ヒドロゲル支持体１６は、チューブ１４の内部形状に対応する形状からなるが、略回転体形状の柱からなる。

本実施例において、ヒドロゲル支持体１６は、作製が容易であり、人体に無害なアガロースゲルからなる。本実施例では、アガロースゲルを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、多様なヒドロゲルが適用可能である。

ヒドロゲル支持体１６は、濃度が１．０％〜２．０％のアガロースを含み、体積は３００μｌ〜６００μｌとなり得る。

遠心分離方法を適用するにあたり、ヒドロゲル支持体１６において、アガロースの濃度が１．０％より小さければ、遠心分離過程でヒドロゲル支持体１６が壊れやすい問題があり、アガロースの濃度が２．０％より大きければ、空隙が小さいために核酸を適切に抽出できない問題が発生する。

圧力や電気的な方法を用いる場合、ヒドロゲル支持体１６は、０．５％〜５．０％のアガロースを含むことができる。圧力を用いて核酸を抽出する場合は、高い圧力でもヒドロゲル支持体１６が壊れてはならないことから、アガロースを５．０％以下として含むことが好ましい。アガロースを５．０％より多く含む場合は、気孔が小さくなり、核酸がヒドロゲル支持体１６を通過しない問題がある。

また、電気的な方法を用いる場合は、気孔が相対的に大きいことが有利であるため、０．５％以上のアガロースを含むことが好ましい。ヒドロゲル支持体１６が０．５％より小さいアガロースを含む場合は、気孔が過度に大きくなる問題があり、ヒドロゲル支持体１６が圧力で壊れたり、異物がアガロースゲルカラムを通して離脱する問題が発生する。

ヒドロゲルは、水分を含有できる高分子材料であり、化学的・物理的な結合により分子が互いに連結され、３次元網状構造を有する。また、親水性官能基および毛細管現象と浸透圧により水分を含む。これにより、ヒドロゲルは、空気透過性と滲出液吸収性に優れているだけでなく、血液、体液、および生体組織に対して親和性を有する。

ヒドロゲル支持体１６は、親水性で、かつ、３次元網状構造を有するため、遠心分離過程で核酸フィルタとして作用する。つまり、遠心分離過程で細胞抽出液に含まれている核酸は、サイズが小さく、親水性であるため、ヒドロゲル支持体１６に形成された気孔を通過して排出口２４に排出できるのに対し、サイズが相対的に大きく、疎水性である蛋白質などの不純物は、ヒドロゲル支持体１６を通過せずにチューブ１４に残留するようになる。

以下、本実施例による核酸抽出装置を用いて核酸を抽出する過程をより詳細に説明する。

まず、細胞抽出液を調製する。ここで、細胞抽出液とは、細胞を破壊して得られる細胞の構成成分を含む混合物をいう。

細胞は、生体試料からなり得、動物試料、植物試料、または微生物試料からなり得る。さらに、細胞は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来細胞からなり得る。

細胞抽出液は、細胞の入った容器に溶解バッファ（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を添加して調製できる。溶解バッファは、商用化された製品など、多様な物質からなり得る。また、溶解バッファのほか、蛋白質加水分解酵素のプロテイナーゼＫや、リボＤＮＡ分解酵素のＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）をさらに添加してもよい。

次に、チューブ１４にヒドロゲル支持体１６を形成する。ここで、ヒドロゲル支持体１６は、２％のアガロースを含むアガロースゲルからなる。ただし、アガロースの濃度は、試料の粘性や濃度により多様な変化が可能である。

蒸溜水にアガロースを添加した後、混合液を加熱してアガロースを完全に溶解させる。以後、チューブ１４にアガロース水溶液を注入した後、常温で十分に放置し、カラム状のヒドロゲル支持体１６を形成する。

細胞抽出液をヒドロゲル支持体１６が形成されたチューブ１４に入れた後、遠心分離を行う。ここで、遠心分離は、マイクロ遠心分離機により、２０００ｒｐｍで、５分ずつ、３回行われる。

遠心分離過程において、ＤＮＡは、ヒドロゲル支持体１６を通過し、排出口２４を介してハウジング１２に排出され、蛋白質などの異物は、ヒドロゲルを通過せずに残留する。

本実施例では、遠心分離を用いて核酸を抽出することを例示しているが、本発明はこれに限定されない。したがって、ヒドロゲル支持体１６をフィルタとして用い、圧力や電気的な方法により核酸を抽出することもできる。

このように抽出された核酸は、遺伝子検査に使用可能であり、ＤＮＡチップ検査にも使用可能である。つまり、本実施例による核酸抽出装置は、遺伝子検査またはＤＮＡチップ検査において核酸の抽出に適用できるのである。

また、本実施例による核酸抽出装置は、ポイントオブケア検査（ｐｏｉｎｔｏｆｃａｒｅｔｅｓｔｉｎｇ）（一般的に、「ＰＯＣ検査」ともいう。）において核酸の抽出に適用可能である。ＰＯＣ検査とは、医師の診療現場や、患者の家庭で病気の診断を可能にする検査方式である。本実施例による核酸抽出装置は、簡単な構造で核酸を抽出できるため、携帯が容易で、これによって分離された核酸がＰＯＣ検査に容易に適用可能である。

ハウジング１２で回収したＤＮＡの電気泳動結果を図２に示している。

図２は、本発明の核酸抽出装置を用いて分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡの電気泳動結果を示す写真である。図２において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１およびレーン２は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡの電気泳動結果である。

図３は、本発明の核酸抽出装置を用いて分離したＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡの純度を確認するために、ＰＣＲ結果を示す写真である。

図３において、レーンＭは、標準ＤＮＡマーカーであり、レーン１は、本発明の方法で得られたＭＣ３Ｔ３骨芽細胞のゲノムＤＮＡにおいてＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を増幅した後の電気泳動結果を示す。レーン２および３は、商用化されたゲノムＤＮＡ抽出装置を用いて骨芽細胞のゲノムＤＮＡを抽出した後、Ｇ３ＰＤＨを増幅した後の電気泳動結果を示す。

本実施例では、核酸としてＤＮＡを適用することを例示しているが、本発明は、これに限定されるものではなく、ＲＮＡなど、多様な種類の核酸の分離に適用可能である。

臨床検体からアガロースゲル支持体を用いてＤＮＡを抽出する可能性および適正なゲル濃度を測定するための実験を行った。

結果物に混在し得るＰＣＲ反応抑制剤の影響を最大限に排除するために、ＤＮＡを用いた検査のうち、ハイブリダイゼーション過程を含む検査を選択した。

ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）ＤＮＡチップ検査が行われた頸部スワブ（ｃｅｒｖｉｃａｌｓｗａｂ）検体から選別し、アガロースゲル支持体を用いた核酸抽出装置を用いてＤＮＡの抽出を行い、結果物に対してＨＰＶＤＮＡチップ検査を行った。敏感度を推定するために、通常のＰＣＲ検査後、電気泳動結果の読み取りを併行した。検体は、ＨＰＶ−５８であって、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＨＰＶ検査用検体４００μｌ、溶解バッファ２００μｌを、アガロースゲル支持体が挿入されたチューブに入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、５分ずつ、３回遠心分離を行った。アガロースゲル支持体は、体積が０．３ｍｌの支持体と、体積が０．６ｍｌの支持体の２種を使用した。

通常のＰＣＲ検査後、その結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのヒドロゲル支持体とも、２％のアグロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌの支持体において１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌの支持体においては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。

本実験の結果によれば、２％のアガロースゲルを用いた場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌの支持体とも、ＨＰＶタイプ情報を得るための通常のＰＣＲ検査とＤＮＡチップ検査が可能であることがわかった。

下記の表１は、各レーンの実験条件を示す。

図４は、ＰＣＲ検査後における電気泳動結果を示す写真であり、図５は、ＤＮＡチップ検査結果を示す写真である。

図４および図５に示すように、通常のＰＣＲ検査後の結果を電気泳動で読み取る場合、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのヒドロゲル支持体とも、２％のアガロースゲル濃度でのみ結果を読み取ることができた。一方、ＤＮＡコピー数が低くても結果が得られるＤＮＡチップ検査では、０．３ｍｌの支持体において１％、１．５％、２％のアガロースゲル濃度で、０．６ｍｌの支持体においては２％の濃度で正確なＨＰＶタイプ結果を得ることができた。

本実施例による核酸抽出装置の核酸の抽出効率を判定するために、従来の核酸抽出方法と比較する実験を行った。

核酸の抽出状態で保管されていた臨床検体の核酸抽出物に対し、従来の核酸抽出装置と本実施例による核酸抽出装置とを用いてそれぞれ核酸の抽出を行った後、核酸の濃度を測定して回収率を比較した。

検体としてはＨＰＶ−１８を使用し、プロテイナーゼＫ２０μｌ、ＤＮＡ抽出検体２００μｌ、溶解バッファ２００μｌを入れ、２０００ｒｐｍ／２００ｒｃｆで、１５分間、遠心分離を行った。２．０％のアガロースゲル濃度で、０．３ｍｌおよび０．６ｍｌの体積を有するヒドロゲル支持体で実験を行った。検査に用いられたＤＮＡ抽出物のＤＮＡ酸濃度６５μｇ／ｍｌを基準とする従来の核酸抽出方法では、１４μｇ／ｍｌ、約２１．５％の回収率を示し、２％のアガロースゲルで０．３ｍｌおよび０．６ｍｌのヒドロゲル支持体では、それぞれ１９μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ、約２９．２％および１５．４％の回収率を示している。したがって、本実施例による核酸抽出装置の効率は、従来の核酸抽出装置に比べて臨床適用可能な範囲に属していることがわかる。このように、本実施例による核酸抽出装置は、生体試料のＤＮＡを抽出するのに特に有利である。

図６は、本発明の第２実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。

図６に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲル支持体１７と、チューブ１４を密閉する蓋１９とを備える。

本実施例によるヒドロゲル支持体１７の内側には注入溝１８が形成されている。注入溝１８は、ヒドロゲル支持体１７の中央に形成され、円筒状となり得る。この注入溝１８は、細胞抽出液を収容可能であり、排出口２４と細胞抽出液との距離を減少させ、核酸の回収効率を向上させる。ヒドロゲル支持体１７には複数の微細な気孔が形成されるが、これらの気孔を介して遠心分離過程で核酸が排出口２４に排出される。したがって、細胞抽出液と排出口２４との距離が減少すると、核酸がより容易にヒドロゲル支持体１７を通過できるため、核酸の回収効率が向上する。

図７は、本発明の第３実施例による核酸抽出装置を示す断面図である。

図７に示すように、本実施例による核酸抽出装置は、円筒状のハウジング１２と、ハウジング１２の内部に嵌設されたチューブ１４と、チューブ１４に設けられたヒドロゲル支持体１７と、チューブを密閉する蓋１９とを備える。

ヒドロゲル支持体１７が位置するチューブ１４の外周には複数の減圧孔１５が形成されるが、減圧孔１５は、遠心力によって発生する圧力を減少させる役割を果たす。また、ヒドロゲル支持体１７には注入溝１８が形成され、減圧孔１５は注入溝の横側に形成される。これにより、注入溝１８に位置する核酸が減圧孔１５を介してハウジング１２に排出できるため、核酸の回収効率がさらに向上する。

以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、特許請求の範囲と発明の詳細な説明および添付した図面の範囲内で多様な変形が実施可能であり、これもまた、本発明の範囲に属するのはいうまでもない。

１２：ハウジング
１３、１９：蓋
１４：チューブ
１５：減圧孔
１６、１７：ヒドロゲル支持体
１８：注入溝
２４：排出口

Claims

管状の、一側に開放された排出口を有するチューブと、
前記チューブ内に設けられ、抽出対象物質を除く不純物をフィルタリングするヒドロゲル支持体と、
一側が詰まった管状の、前記チューブが挿入されて前記排出口に連通するハウジングと
を備え、
前記ヒドロゲル支持体は、上面に前記チューブの長手方向につながった注入溝が形成され、
前記チューブの外周には、前記ヒドロゲル支持体と当接する複数の減圧孔が形成されていることを特徴とする核酸抽出装置であって、
当該核酸抽出装置は、遠心分離機に適用されることを特徴とする核酸抽出装置。
前記ヒドロゲル支持体は、アガロースゲルからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記アガロースゲルは、１％〜２％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出装置。
前記アガロースゲルは、０．５％〜５％のアガロースを含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出装置。
前記注入溝は、前記ヒドロゲル支持体の中央に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記ヒドロゲル支持体は、前記チューブの内側面と密着していることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記ヒドロゲル支持体は、回転体形状からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
細胞から核酸を抽出するための核酸抽出装置に関するものであって、
前記細胞は、生体試料であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
細胞から核酸を抽出するための核酸抽出装置に関するものであって、
前記細胞は、動物試料、植物試料、または微生物試料からなる群より選択されるいずれか一つからなることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
細胞から核酸を抽出するための核酸抽出装置に関するものであって、
前記細胞は、血液、血清、血漿、骨髄、尿、糞便、痰、細胞穿刺液、組織、および組織由来物質を含むヒト由来細胞であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
前記核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
ＤＮＡチップ検査において核酸の抽出に適用されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
遺伝子検査において核酸の抽出に適用されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。
ポイントオブケア検査において核酸の抽出に適用されることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出装置。