CN104822357B - 旋转洗脱管 - Google Patents
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Abstract
提供了用于从微流控装置回收细胞的装置。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月18日提交的美国临时申请号61/702,730根据U.S.C.§119(e)的权益，其在此通过引用整体地结合于本文中，以用于所有的目的。
技术领域
提供了用于从微流控装置回收细胞的装置。
背景技术
用于移除被保留在微流控芯片中的细胞的方法已涉及使用针和注射器，以便例如利用流体冲洗芯片来逼出细胞或者抽出芯片中的细胞和残留的流体。这样的方法既效率不高、非定量，也不是无菌的。
发明内容
在一个方面，所提供的是端部开口的圆锥形管。在一些实施例中，端部开口的圆锥形管包括：
i）接头部，其中，接头部尺寸设计成用0.5 mL的PCR管的内部密封，其中，接头部包括窄的孔口；
ii）圆锥形部，其附接到接头部并与之流体连通，其中，圆锥形部的外周表面垂直地附接到具有圆筒形腔的凸缘，其中，所述PCR管的帽装配到凸缘中的圆筒形腔中；
iii）圆筒形部，其附接到圆锥形部并与之流体连通，并且具有与圆锥形部的轴线基本上共线的轴线，其中，圆筒形部包括宽的孔口以及与所述宽的孔口邻接的外表面上的螺纹以收容用于圆锥形管的帽，
其中，圆锥形管装配到设计成收容50 mL的圆锥形管的离心机转子桶中。在一些实施例中，圆锥形管还包括0.5 mL的PCR管，其中，圆锥形管的接头部尺寸设计成密封到所述0.5 mL的PCR管中。在一些实施例中，圆锥形管还包括帽，其旋拧到圆筒形部的与所述宽的孔口邻接的外表面上的螺纹上。在一些实施例中，圆锥形管还包括帽，其卡合到圆筒形部的与所述宽的孔口邻接的外表面上的螺纹上。在一些实施例中，圆锥形管包括高密度聚乙烯。在一些实施例中，圆锥形管通过模制过程生产。在一些实施例中，圆锥形管通过吹模过程生产。在一些实施例中，圆筒形部具有尺寸设计成与微流控芯片接合的内径。在一些实施例中，圆锥形管还包括管内的微流控芯片。在一些实施例中，圆锥形管是如图1、图2、图3、图4和/或图5中所描绘的圆锥形管。
在另一个方面，提供了从微流控芯片收集细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括：
a）将微流控芯片放置到如权利要求2至8中任一项所述的圆锥形管中，其中，微流控芯片的出口朝向接头部的窄的孔口放置；
b）对圆锥形管内的微流控芯片进行离心分离；以及
c）收集尺寸设计成密封到圆锥形管的0.5 mL的PCR管中的细胞。在一些实施例中，离心分离以大约300 x g或更小的速度进行，例如，大约200 x g或大约100 x g。在一些实施例中，离心分离在回转桶转子中进行。在一些实施例中，所述方法在无菌条件下执行。在一些实施例中，所述方法还包括用等渗流体再填充微流控芯片的步骤，以及重复步骤a）至c）。
附图说明
图1A-B提供了旋转洗脱的或端部开口的圆锥形管的（A）侧视图和（B）底视图（4）图示。
图2图示了具有到一侧的凸缘的旋转洗脱管的侧视图。
图3图示了旋转洗脱管的侧视图，其从顶部观察所述凸缘。
图4图示了移除了转接器帽的旋转洗脱管的侧视图。
图5图示了附接到0.5 mL的PCR管的旋转洗脱管的侧视图。
图6图示了附接到0.5 mL的PCR管并且在圆筒形部的内部空间中包含微流控芯片的旋转洗脱管。还示出了说明性的转接器帽。
图7图示了在圆筒形部的内部空间中包含微流控芯片的旋转洗脱。还示出了说明性的转接器帽。
图8图示了附接到0.5 mL的PCR管并且在圆筒形部的内部空间中包含微流控芯片的旋转洗脱管。还示出了说明性的转接器帽。
图9图示了使用旋转洗脱管从微流控芯片收集细胞的验证试验的结果。1000个细胞被一式三份地装载到微流控芯片中，并且使用旋转洗脱管旋出成颗粒。测量颗粒阈值周期（Ct），并在使用旋转洗脱管从微流控芯片将洗脱的细胞颗粒化到PCR管中和直接将细胞颗粒化（例如，未通过微流控芯片或旋转洗脱管处理）到PCR管中进行比较。基于PCR的检测是等同的，无论细胞从微流控芯片回收或直接颗粒化。
具体实施方式
1. 介绍
本申请部分地基于旋转洗脱装置的发展和发现，以高效地和定量地回收微流控芯片中保留的细胞。例如通过磁选分离从全血隔离的目标细胞被保留在微流控芯片中，反之非目标细胞则从芯片中被冲洗掉。捕捉微流控芯片中保留的目标细胞从该捕捉微流控芯片中被回收，并且被安置到用于后续分析的管或其它容器中。执行此操作的能力对目标细胞群的所有进一步分析而言是非常重要的。为了回收这些细胞，我们设计并开发了本文所描述的旋转洗脱装置，来以高效且定量的简单、无菌和方便的方式收集目标细胞。所述旋转洗脱装置通过低速离心作用（例如，大约300 x g或更低）工作。高速离心作用可能导致细胞在微流控芯片中的截留。
微流控芯片被放置在作为载体的装置中。所述装置被放置在离心机中，并且以大约300 rpm旋转持续大约30秒。捕捉微流控芯片中的细胞和溶液（大约200-250 μL）被旋出到附接到所述装置的底部的500 μL的收集管中，目标细胞被沉积或颗粒化到所述收集管中。然后完成捕捉微流控芯片的第二冲洗，并且第二冲洗的这种流体（大约200-250 μL）被进一步收集在500 μL的收集管中。
所述装置能够通过任何方式来构建，能够包括不粘合细胞、强度足以抵抗离心作用的力并且无菌且免于污染DNA、RNA和蛋白质的任何材料。
2. 旋转洗脱管的结构特征
一般而言，旋转洗脱管被设计成装配到收容50 mL的圆锥形管的回转桶转子的桶中。此外，旋转洗脱管尺寸设计成收容微流控芯片，所述微流控芯片已被用于分离循环肿瘤细胞、干细胞或其它类型的细胞。用于目前的圆锥形旋转洗脱管中的微流控芯片包括但不限于美国专利号7,807,454和8,263,387中描述的那些，上述美国专利在此通过引用整体地结合于本文中，以用于所有的目的。转到图1，旋转洗脱管包括主体部（1）以及帽部（3，侧视图）和（4，底视图）。所述主体包括接头部（7）、圆锥形部（5）、圆筒形部（1），并且具有圆筒形部的顶部处的宽的孔口以及穿过接头部（7）的窄的孔口。管主体的圆筒形部的附接到帽部（3）的部段的外表面具有螺纹，以允许帽例如通过旋拧或卡合来装配或密封到管主体。视情况，所述螺纹可以是斜的（diagonal）或形成螺旋形以通过旋拧（例如，图2-4）来提供所述帽的附接，或者是圆周的以通过卡合（例如，图5-8）来提供所述帽的附接。视情况，管的主体上的螺纹能够为槽或者突起的脊。在管具有突起的脊螺纹的实施例中，帽将具有槽螺纹，使得帽将装配或密封到管上。在管具有槽螺纹的实施例中，帽将具有突起的脊螺纹，使得帽将装配或密封到圆锥形管的帽部（3）上。与接头部（7）邻接的管的圆锥形部（5）的外表面具有从管垂直伸出的凸缘（6）。所述凸缘具有凸起的圆形或圆柱形的形状。接头部（7）具有一定的外径，使得它能够装配到标准的0.5 mL的PCR管中，并且形成不渗透液体的密封。所述凸缘中的圆柱形形状的凸表面具有一定的尺寸，以足够紧密地装配0.5 mL的PCR管的帽，使得在离心作用期间所述帽在所述凸缘中保持锚定。
在不同的实施例中，旋转洗脱管的主体具有大约4.0英寸至大约4.5英寸的竖直长度，例如，大约4.0英寸、大约4.1英寸、大约4.2英寸、大约4.3英寸、大约4.4英寸或大约4.5英寸。主体的接头部具有一定的长度和外表面直径，使得它能够紧密地装配到0.5 mL的PCR管中，并且形成不渗透液体的密封。在不同的实施例中，管主体的接头部（7）具有在大约0.2英寸至大约0.3英寸的范围中的长度，例如，大约0.20英寸、大约0.21英寸、大约0.22英寸、大约0.23英寸、大约0.24英寸、大约0.25英寸、大约0.26英寸、大约0.27英寸、大约0.28英寸、大约0.29英寸或大约0.30英寸，以及具有在大约0.2英寸至大约0.3英寸的范围中的外径，例如，大约0.20英寸、大约0.21英寸、大约0.22英寸、大约0.23英寸、大约0.24英寸、大约0.25英寸、大约0.26英寸、大约0.27英寸、大约0.28英寸、大约0.29英寸或大约0.30英寸。接头部（7）和与接头部（7）邻接的主体的圆锥形部（5）的外径足够窄，以允许凸缘（6）垂直地附接到所述管，使得PCR管的帽能够插入到所述凸缘中，并且具有所述凸缘的管能够装配在离心机桶的井中。管主体的圆锥形部（5）具有在大约1.0英寸至大约1.5英寸的范围中的竖直长度，例如，大约1.0英寸、大约1.05英寸、大约1.1英寸、大约1.15英寸、大约1.2英寸、大约1.25英寸、大约1.3英寸、大约1.35英寸、大约1.4英寸、大约1.45英寸、大约1.5英寸。在不同的实施例中，管的圆锥形部的外表面相对于管的圆筒形部的外表面的角度在大约30°至大约45°之间，例如，大约30°、大约35°、大约40°或大约45°。管主体的圆筒形部能够具有在大约2.2英寸至大约2.8英寸的范围中的竖直长度，例如，大约2.2英寸、大约2.3英寸、大约2.4英寸、大约2.5英寸、大约2.6英寸、大约2.7英寸或大约2.8英寸。管的圆筒形部的外径在大约1.10英寸至大约1.19英寸的范围中，例如，1.10英寸、1.12英寸、1.13英寸、1.14英寸、1.15英寸、1.16英寸、1.17英寸、1.18英寸或1.19英寸。在一个实施例中，管的主体的竖直长度为大约4.2英寸，接头部（7）具有大约0.25英寸的长度和外径，圆锥形部具有大约1.25英寸的竖直长度以及大约30°的外表面角度，并且圆筒形部具有大约2.5英寸的长度。
管的帽部（3）在其内表面上具有螺纹，使得帽能够旋拧到处于圆筒形部的顶部处的宽的孔口上。在不同的实施例中，帽具有大约1.00英寸至大约1.10英寸的竖直长度，例如，大约1.00英寸、大约1.01英寸、大约1.02英寸、大约1.03英寸、大约1.04英寸、大约1.05英寸、大约1.06英寸、大约1.07英寸、大约1.08英寸、大约1.09英寸或大约1.10英寸。与管主体的圆筒形部相比，帽的直径足够宽，使得帽能够紧密地旋拧到管主体上。
通常，主体的圆筒形部的内表面是光滑的和无特征的，例如，没有形貌特征。在一些实施例中，主体的圆筒形部的内表面包括引导件（例如，沿着管的圆筒形部的内表面的长度的突起的平行竖直脊），用于在管中收容一个或多个微流控芯片或滑动件。
在不同的实施例中，旋转洗脱管的壁的厚度在大约0.030英寸至大约0.10英寸的范围中，例如，0.030英寸、0.035英寸、0.040英寸、0.045英寸、0.050英寸、0.055英寸、0.060英寸、0.065英寸、0.070英寸、0.075英寸、0.080英寸、0.085英寸、0.090英寸或0.10英寸。在一个实施例中，流体储存器的壁的厚度为大约0.050。视情况，旋转洗脱管的壁的厚度能够是均匀的或变化的。旋转洗脱管一般由当与生物流体（例如，全血）接触时对悬浮于介质中的细胞是惰性的并且不会与之结合或溶解的材料制成。在不同的实施例中，流体储存器由一种或多种聚合物制成，例如，聚乙烯、聚丙烯和它们的混合物。在一些实施例中，流体储存器包括高密度聚乙烯（HDPE）。
在各种实施例中，旋转洗脱管能够使用吹模过程形成。当使用吹模过程形成时，吹制模包括圆筒形部（1）和帽部（3）之间的附加部（2）。此附加部是在生产过程期间使用的可移除件。此附加部还允许在圆筒形部（1）和帽部（3）之间的直径上的微小差异，所述差异允许帽旋拧到管的主体上。
3. 使用旋转洗脱管的方法
所述旋转洗脱管具有在高效、定量和无菌地收集保留在微流控芯片中的细胞中的使用。在不同的实施例中，一个、两个或三个包含流体和保留的细胞的微流控芯片被放置在旋转洗脱圆锥形管中，其中微流控芯片的流体出口朝向旋转洗脱管接头部的窄的孔口或出口定向。附接到0.5 mL的PCR管并且包含所述一个或多个微流控芯片的旋转洗脱管被放置在收容50 mL的圆锥形管的离心机转子桶中。在不同的实施例中，离心机具有回转桶转子。离心机以相对较低的离心速度运行较短的时间段，离心速度例如大约300 x g或更低，例如，大约200 x g或大约100 x g，运行的时间段例如，大约5分钟或更短，例如，大约4分钟、大约3分钟、大约2分钟或大约1分钟。离心力使微流控芯片中保留的流体和细胞从微流控芯片中流出，通过旋转洗脱管的接头部的窄的孔口，并且流到附接到旋转洗脱管的0.5 mL的PCR管中。可选地，微流控芯片能够从旋转洗脱管移除，用等渗溶液（例如，细胞培养基、磷酸盐缓冲盐水）再填充，并且再次离心分离一次或多次，以移除在第一次离心过程之后仍然残留在微流控芯片中的任何细胞。附接到旋转洗脱管的0.5 mL的PCR管能够收容微流控芯片的两倍容积的容积。
示例
提供以下示例来说明而非限制所要求的发明。
示例1
旋转洗脱循环肿瘤细胞（CTC）流动池采集
此规程描述了用于在液体活检规程系统上进行处理之后从Cynvenio CTC流动池回收捕获的细胞的程序。
材料
1. 洗脱缓冲液（可选地，w/ .5％氚核）
2. 70%乙醇
设备
1. Corning 3750 Thermowell Gold PCR管，0.5 mL，Flatcap（Fisher Cat # 07-200-396）
2. Cynvenio旋转洗脱CTC回收管
3. Branson 1510超声水浴器
4. IEC CENTRA CL3R台式离心机
5. 组织培养培养皿
6. Tygon R-3603 （1/16英寸. I.D.，1/8英寸. O.D.，壁厚度：1/32英寸.）, 7-10mm长度（VWR Cat# 63010-232，Fisher cat #：14-168，-111）
7. p1000 Pipetteman移液器
规程
1.1. 确保CTC流动池和内容物的全部计数和拍摄已完成。
1.2. 将所述PCR管应用于旋转洗脱回收管的基部。
1.3. 将帽卡合到旋转洗脱回收管。
1.4. 适当地标记PCR管的盖和侧面。
1.5. 将数滴70％乙醇放置到培养皿的基部上。
1.6. 将CTC流动池面朝上地放置在乙醇液滴的顶部上。
1.7. 将培养皿保持在Branson超声水浴器的表面上，并且接合超声仪持续15秒至20秒，以逐出截留的材料，所述截留的材料包括截留的细胞和可能的较小磁性微粒。
1.8. 从旋转洗脱管移除帽，并且将CTC流动池废料端口首先插入到管中。
1.9. 重新盖上帽，并在回转桶转子中以伴随快速的加速/减速的100 x g进行离心分离持续1分钟。
1.10. 从旋转洗脱回收管移除CTC流动池。
1.11. 将一件7-10 mm的tygon管道放置在p1000的末端上，并且将275 μL洗脱缓冲液引入到平坦表面上的废料端口中。
1.12. 将数滴（~50 μL）70％乙醇放置到培养皿的基部上。
1.13. 将CTC流动池面朝上地放置在乙醇液滴的顶部上。
1.14. 将培养皿保持在Branson超声水浴器的表面上，并且接合超声仪持续15秒至20秒，以逐出截留的材料，所述截留的材料包括截留的细胞和可能的较小磁性微粒。
1.15. 从旋转洗脱管移除帽，并且将CTC流动池废料端口首先插入到管中。
1.16. 重新盖上帽，并在回转桶转子中以伴随快速的加速/减速的100 x g进行离心分离持续1分钟。
1.17. 回收PCR管，并更换PCR管上的平坦顶帽。
1.18. 以5000 x g，RT持续10分钟使回转桶离心机中的细胞颗粒化。
1.19. 利用p200的末端倒出上清液，从而在细胞颗粒上留下不超过5 μL的缓冲液。
1.20. 以-20℃冷冻颗粒，直到使用染色体组DNA回收规程来处理颗粒。
1.21. 适当地处置CTC流动池和旋转洗脱管。
应当理解的是，本文描述的示例和实施例仅用于说明性的目的，并且根据其的各种修改或改变将给予本领域技术人员建议并且将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用整体地结合于本文中，以用于所有的目的。
Claims (14)
1.一种端部开口的圆锥形管，包括：
i）接头部（7），其中，所述接头部（7）尺寸设计成用0.5mL PCR管的内部密封，其中所述接头部（7）具有在0.2英寸至0.3英寸的范围中的长度，在0.2英寸至0.3英寸的范围中的外径，其中，所述接头部（7）包括窄的孔口；
ii）圆锥形部（5），其附接到所述接头部（7）并与所述接头部（7）流体连通，其中，所述圆锥形部（5）具有在1.0英寸至1.5英寸的范围中的竖直长度，并且所述圆锥形管的圆锥形部（5）的外表面相对于所述圆锥形管的圆筒形部（1）的外表面的角度在30°至45°之间，其中所述圆锥形部（5）的外周表面垂直地附接到具有圆筒形腔的凸缘（6），其中，所述PCR管的帽装配到所述凸缘中的圆筒形腔中；
iii）圆筒形部（1），其附接到所述圆锥形部（5）并与所述圆锥形部（5）流体连通，并且具有与所述圆锥形部（5）的轴线共线的轴线，其中，所述圆筒形部（1）包括宽的孔口以及与所述宽的孔口邻接的外表面上的螺纹以收容用于所述圆锥形管的帽；其中，所述圆筒形部（1）具有内径、在2.2英寸至2.8英寸的范围中的竖直长度、和在1.10英寸至1.19英寸的范围中的外径以收容一个或多个微流控芯片或一个或多个滑动件；以及
其中所述圆锥形管装配到设计成收容50 mL的圆锥形管的离心机转子桶中。
2.如权利要求1所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆筒形部的内表面包括突起的平行竖直脊以便在所述圆锥形管中收容一个或多个微流控芯片或一个或多个滑动件。
3.如权利要求1所述的圆锥形管，其特征在于，还包括0.5 mL的PCR管，其中，所述圆锥形管的接头部（7）密封到所述0.5 mL的PCR管中，其中所述PCR管的盖能够插入到所述凸缘的圆筒形腔中。
4.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，还包括旋拧到与所述宽的孔口邻接的所述圆筒形部（1）的外表面上的螺纹上的帽。
5.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆锥形管包括高密度聚乙烯。
6.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆锥形管通过模制过程生产。
7.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆锥形管通过吹模过程生产。
8.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆筒形部（1）具有收容一个、两个或三个微流控芯片的内径。
9.如权利要求1至3中任一项所述的圆锥形管，其特征在于，所述圆锥形管还包括在所述圆锥形管内的微流控芯片。
10.一种从微流控芯片收集细胞的方法，包括：
a）将所述微流控芯片放置到如权利要求2至9中任一项所述的圆锥形管中，其中，所述微流控芯片的出口朝向所述接头部（7）的窄的孔口放置；
b）对所述圆锥形管内的微流控芯片进行离心分离；以及
c）收集尺寸设计成密封到所述圆锥形管的0.5 mL的PCR管中的细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述离心分离以300 x g或更小的速度进行。
12.如权利要求10至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述离心分离在回转桶转子中进行。
13.如权利要求10至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在无菌条件下执行。
14.如权利要求10至11中任一项所述的方法，其特征在于，还包括用等渗流体再填充所述微流控芯片的步骤，以及重复步骤a）至步骤c）。
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