CN114836549A - 一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用，涉及DNA分子标记技术领域。该蒙古野驴微卫星分子标记组合，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17‑24所示的Eqr3400、Eqr5948、Eqr732、Eqr166、Eqr1096、Eqr1226、Eqr652和Eqr821。该分子标记组合的扩增引物组合，包括如SEQ ID NO.1‑16所示的核苷酸序列。本发明开发了一组具有丰富多态性的蒙古野驴微卫星分子标记，并提供了一组蒙古野驴微卫星引物。本发明提供的蒙古野驴微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增，并且具有高度多态性。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分子标记技术领域，特别是涉及一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用。
背景技术
微卫星：微卫星(simple sequence repeat，SSR)指DNA简单串联重复序列，由核心序列与两侧的侧翼序列构成。核心序列为1-6个核苷酸重复单位，不同等位基因间的重复数和重复单元的差异使其具有长度多态性，核心序列两侧则由保守的侧翼序列组成，在物种间具有较高的同源性，因此可用于引物设计。与其他分子标记相比，微卫星具有数量多、稳定性好、多态性信息丰富，共显性和易于检测等优势。同时，以PCR技术为基础的微卫星分析，对模板DNA的要求较低，纳克量或部分断裂的DNA都能够有效分析，因此微卫星标记被越来越多的应用于濒危物种的遗传学研究，例如解释濒危物种的进化历史、种群遗传结构分析、辅助种群调查、亲缘关系鉴定和近缘物种及杂交个体鉴别等保护生物学重点工作。然而，虽然有研究发现微卫星DNA侧翼序列在近缘物种间具有一定的保守性，但对一些珍稀濒危物种，当缺乏相关近缘物种微卫星序列信息参考的情况下﹐则需要进行微卫星位点的筛选和特异引物的开发，并且濒危物种的遗传多样性普遍较低，因此开发多态性的微卫星位点显得更困难也更重要。
蒙古野驴：蒙古野驴(Mongolian WildAss or Khulan，Equus hemionushemionus)属奇蹄目(Perissodactyla)马科(Equidae)马属，是中国国家一级保护动物，主要分布于蒙古国南部和中国北部中蒙边境附近地区，一般以集群活动，为目前野生数量最大的亚种种群。新疆卡拉麦里保护区分布有中国最大的蒙古野驴种群，是保护中国蒙古野驴的最关键区域，经过30余年的保护与调查，该保护区内蒙古野驴的数量不断增长。然而，由于农业用地、过度放牧和经济开发，蒙古野驴的栖息地逐渐破碎和边缘化，导致蒙古野驴的生存仍然受到威胁，处于濒危状态。目前，国内对于蒙古野驴的研究主要集中于生态种群结构、行为机制以及栖息地等方面，对其分子遗传学的相关研究极少。了解物种的遗传背景能够帮助保护生物学家更全面地制定出科学合理的保护对策。因此，开发高效有力的分子标记，继而能够从分子遗传学角度对蒙古野驴进行保护，补足其遗传学研究的短板。
发明内容
本发明的目的是提供一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的蒙古野驴微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增，并且具有高度多态性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种蒙古野驴微卫星分子标记组合，包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO.17-24所示的Eqr3400、Eqr5948、Eqr732、Eqr166、Eqr1096、Eqr1226、Eqr652和Eqr821。
本发明还提供一种上述的分子标记组合的扩增引物组合，包括如SEQ ID NO.1-16所示的核苷酸序列。
本发明还提供上述的分子标记组合或扩增引物组合在蒙古野驴或蒙古野驴的近缘种群遗传结构和遗传多样性研究中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过高通量测序技术，使用生物信息学方法，筛选含有微卫星的DNA序列，设计特异性引物，对这些微卫星位点进行了多态性检测，开发了一组(8个)具有丰富多态性的蒙古野驴微卫星分子标记，并提供了一组蒙古野驴微卫星引物。本发明提供的蒙古野驴微卫星引物对能够对微卫星位点进行特异性扩增，并且具有高度多态性，可以应用于蒙古野驴及其近缘种遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系等研究领域，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Eqr3400位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图2为Eqr3400位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图3为Eqr3400位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图4为Eqr3400位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图5为Eqr5948位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图6为Eqr5948位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图7为Eqr5948位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图8为Eqr5948位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图9为Eqr732位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图10为Eqr732位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图11为Eqr732位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图12为Eqr732位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图13为Eqr166位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图14为Eqr166位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图15为Eqr166位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图16为Eqr166位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图17为Eqr1096位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图18为Eqr1096位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图19为Eqr1096位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图20为Eqr1096位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图21为Eqr1226位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图22为Eqr1226位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图23为Eqr1226位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图24为Eqr1226位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图25为Eqr652位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图26为Eqr652位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图27为Eqr652位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图28为Eqr652位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图；
图29为Eqr821位点引物扩增蒙古野驴样本S1-S20的DNA的SSR分型图；
图30为Eqr821位点引物扩增蒙古野驴样本S21-S40的DNA的SSR分型图；
图31为Eqr821位点引物扩增蒙古野驴样本S41-S60的DNA的SSR分型图；
图32为Eqr821位点引物扩增蒙古野驴样本S61-S80的DNA的SSR分型图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1蒙古野驴多态性微卫星分子标记的制备
1.血液基因组DNA的提取
利用(Qiagen)DNeasy Blood&Tissue Kit(50)试剂盒，提取蒙古野驴的血液基因组总DNA。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的基因组总DNA进行定量、定性检测。将合格的蒙古野驴血液基因组DNA进行IlluminaPE150测序。经过测序比对、筛选过滤、质量评估和组装后，得到71571.96Mb的有效数据量(Clean Base)，有效率(Effective Rate)为99.63％，碱基错误率为0.03％，Q20为97.19％，Q30为92.38％，GC含量为42.81％。表明样本的数据量足够，测序质量较高(Q20≥95％、Q30≥90％)，GC分布正常，建库测序成功。根据聚类结果进行局部组装，得到最后的组装序列，并对150bp以下的拼接序列(contig)进行过滤，组装结果总长度为3326.93Mb，平均长度为363bp，组装结果的GC含量为42.64％，和初始测序数据(reads)的GC含量一致性较高，说明组装结果能够代表部分基因组。
2.微卫星位点的提取及引物设计
使用SSR search软件检测组装的拼接序列(contig)中的微卫星位点，并过滤去掉距离过近的简单重复序列。筛选蒙古野驴基因组上的微卫星序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序需满足如下要求：对于二碱基的基序、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；SSR序列的最小长度为12；两个SSR的最小距离为12bp。由此鉴定蒙古野驴基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。最终得到的SSR数目为181936个，其中能够成功设计引物的SSR数目为170888个。得到的微卫星重复片段中，包括二碱基重复序列73813条，三碱基重复序列73989条，四碱基重复序列29614条，五碱基重复系列3788条，六碱基重复序列732条。在SSR位点两侧，利用Primer 3.0软件进行引物设计，最终得到引物序列170888对。
3.多态性微卫星引物的筛选
1)粪样DNA的提取：利用QIAamp Fast DNA Stool MinKit(德国)粪便专用提取试剂盒提取粪便中的基因组DNA。共提取80份DNA样品，将收集到的DNA溶液分成两等份，标注编号信息，将母液放入-80℃低温备存，子液-20℃保存以进行后续分子实验，构建蒙古野驴DNA模板库。
2)在设计的微卫星引物中随机选取40对SSR引物进行合成，并在单侧引物5’端进行荧光标记(FAM-蓝色)，在蒙古野驴DNA模板库(含80份蒙古野驴的粪便DNA，1％琼脂糖电泳检测DNA质量)中选取质量较好的模板进行引物扩增特异性检测和多态性初筛。
2)PCR扩增使用天根生化科技(北京)有限公司生产的2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒，扩增体系及反应程序为:
25μL反应体系：模板DNA 1μL，10μM的正反引物各1μL，2×EasyTaqRPCR SuperMix12.5μL，Nuclease-free Water 9.5μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性2-5min，94℃变性30s，50℃-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃修复延伸5-10min。
3)PCR反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：120V，30min。电泳结束后琼脂糖曝光检测，根据曝光结果筛选出清晰条带，并根据条带的清晰度确定每对引物的最佳退火温度。
4)PCR扩增后的目的产物进行微卫星标记等位基因的毛细管电泳分型(上海捷瑞生物工程有限公司)，电泳原始数据结果(.FSA)使用GeneMarker v2.2.0(SoftGeneticsLLC.，USA)进行手动验证和确认SSR扩增波段，最后判读条带。最终得到8个稳定的微卫星位点，标记为Eqr3400、Eqr5948、Eqr732、Eqr166、Eqr1096、Eqr1226、Eqr652和Eqr821，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17-24所示；8个微卫星位点及对应引物序列如表1所示。
微卫星及侧翼序列如下：
表1 8个微卫星位点及对应引物序列
实施例2蒙古野驴微卫星分子标记的多态性鉴定及群体遗传多样性分析
1.对实施例1中筛选获得的8个微卫星位点对应的8对引物进行荧光引物合成，即在单侧引物5’端进行荧光标记(FAM-蓝色)；以实施例1中构建的蒙古野驴DNA模板库中的80份蒙古野驴的粪便DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系和反应条件同实施例1，扩增产物在ABI 3730XL测序仪(上海捷瑞生物工程有限公司)上进行毛细管荧光电泳检测，并根据电泳结果统计等位基因等数据。
使用GeneMarker v2.2.0(SoftGenetics LLC.，USA)软件对采集的数据进行荧光颜色分离，与分型标准物GeneScan LIZI 600分子内标确定各基因座的基因分型数据，80份蒙古野驴的粪便DNA的SSR分型图见图1-32，其中图1-4是Eqr3400位点的SSR分型图；图5-8是Eqr5948位点的SSR分型图；图9-12是Eqr732位点的SSR分型图；
图13-16是Eqr166位点的SSR分型图；图17-20是Eqr1096位点的SSR分型图；图21-24是Eqr1226位点的SSR分型图；图25-28是Eqr652位点的SSR分型图；图29-32是Eqr821位点的SSR分型图。使用GenAlex插件及CERVUS 3.0.7软件进行遗传指标测定，以此进一步评估微卫星位点的多态性。蒙古野驴微卫星位点遗传多样性信息结果(表2)显示如下。
表2蒙古野驴微卫星位点遗传多样性检测信息
如表2显示，本发明利用8个微卫星位点对应的8对引物对80个蒙古野驴样本进行扩增，其遗传多样性分析结果表明各位点等位基因数(K)在9～16，平均多态信息含量(PIC)为0.723，属于高度多态信息位点(PIC>0.5)；平均观测杂合度(Ho)为0.33，平均期望杂合度(He)为0.751，Ho<He，说明基因杂合度水平较低；无效等位基因频率F(Null)较高，说明该群体遗传多样性较差。由此可见，本发明的8个微卫星分子标记多态性较高，可望用于蒙古野驴遗传多样性、种群遗传结构、谱系地理、进化与亲缘关系等研究，具有良好的应用前景。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院新疆生态与地理研究所
<120> 一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctgggattt gctttacaac act 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaatagaa taatgagccc gtg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catagtttaa gctgggtcag tgc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatgtgaca aagcatgagt aaa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaagtaaaa tggcaaatgc aaa 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttgtttct ttatccagcc tga 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taacttgcgt gaatttgtct gtg 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgtgtttg aagtttgtag gaatg 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tactcagacc agttttagct gcc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatttaaacc agggtcaggt ctc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtgtatatg tgtgtgcgtg tgt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgctttgct tcagtcactc tat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcttgatgt atcaactatt ttgct 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgtaagtgaa accactgagg aac 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acttcagtct ctgctgttgc tct 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagggattac gttttcttgc ttt 23
<210> 17
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tatgattaga ttttttaaaa gtccttgtct gctagagaca caaatttatg ggcaaattaa 60
atgttgtctg ggatttgctt tacaacacta aaagaaaagc gtgtgtgtgt gttgggggag 120
atgacacaac agtggctgtg agctggtaac tgttgacgct gggatgacac acgggctcat 180
tattctattg tctccacttt tttgtaggtt tg 212
<210> 18
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggttcctacc atctgttgct ccactgtccc ttaggttgtt atcctcactt gcatagttta 60
agctgggtca gtgctacatc ttcatttcaa aaacatgagg gagagagaga gaaatcccag 120
acaagtagat ttgttttcaa ggagacaact cagaagttgc atgtgtcact tttactcatg 180
ctttgtcaca tgggcatacc ttagctgcac ag 212
<210> 19
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaataaagc agtaaaggag gactagagaa acaaacaaaa aatacatgag atgtatggaa 60
aaccaaaaag taaaatggca aatgcaaatc aaactatatc aataataata atgtgtgaat 120
ggattaagca atccaataaa aaagcagaga ttgtcaggct ggataaagaa acaagataca 180
aatatatgct tcctacagga gacacacttt ag 212
<210> 20
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gttgttcatt gtaaataaat ctagaagata ccttactgag ttgtgtttat ttggccttgc 60
ataacttgcg tgaatttgtc tgtgacagat aatgaaaaaa atatatatat atgaccaaag 120
tgagacacta actttctttt tcttttttct tttttacata gtgataatca tgatctcttc 180
tcattaacat tcctacaaac ttcaaacaca ca 212
<210> 21
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atttggctaa ttacattttt aggaatgtac tcagaccagt tttagctgcc tggcgttact 60
tttaatagaa gctgttgctt accttttctc tcatttattt tctctctctc tcctgctttc 120
agagttatct tactgatttg gagacctgac cctggtttaa attagtgtgt ctgtaacact 180
cctgtgaatc acgtgcaata ttttaatggt ta 212
<210> 22
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cagagtgtgg gtgtgtgtat atgtgtgtgc gtgtgtgcaa ttatatacac tatttaggaa 60
agtttattga tagaagagat ggtacaagag aaaacaaaga agagagagag agaaacagaa 120
agaaacagag atagagtgac tgaagcaaag cgacagaggc tgcgggctgt ggggagacag 180
agagcgagcg agctggcagt tccccttatc ag 212
<210> 23
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acctaaaaat atatccaaca catgcttgat gtatcaacta ttttgctaca taacaaatta 60
ccaatactta ccaacaaata cttagtggtt taaaacattg tattattatt attacaattt 120
ttggggtgta gttggcagtt cctcagtggt ttcacttacg cttcctcctg tgcttgcact 180
aaggtggaag ctcacctgag ctggatgttc cg 212
<210> 24
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccaacagaag aacaagtgtg cccctttctg gatgcaaata ctattcactt cagtctctgc 60
tgttgctctc aggaccctgc cttcagtaaa aatgtatgag acacacacac acaaaagcaa 120
gaaaacgtaa tccctcacta tgagatagag taatcaatgg aaccagacac agagacagcc 180
cagatattgg cactatcaga gaaggacttc aa 212
Claims (3)
1.一种蒙古野驴微卫星分子标记组合，其特征在于，包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO.17-24所示的Eqr3400、Eqr5948、Eqr732、Eqr166、Eqr1096、Eqr1226、Eqr652和Eqr821。
2.一种如权利要求1所述的分子标记组合的扩增引物组合，其特征在于，包括如SEQ IDNO.1-16所示的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的扩增引物组合在蒙古野驴或蒙古野驴的近缘种群遗传结构和遗传多样性研究中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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| CN202210716823.9A CN114836549B (zh) | 2022-06-23 | 2022-06-23 | 一种蒙古野驴微卫星分子标记组合及其引物和应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN114836549B CN114836549B (zh) | 2024-05-10 |
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ID=82575056
Family Applications (1)
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Citations (3)
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| CN112481406A (zh) * | 2020-12-04 | 2021-03-12 | 新疆农业科学院园艺作物研究所 | 一种基于ssr标记的木纳格葡萄种质资源亲缘鉴定方法 |
| CN113994010A (zh) * | 2019-05-31 | 2022-01-28 | 马斯公司 | 预测马体重减轻倾向的方法 |
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2022
- 2022-06-23 CN CN202210716823.9A patent/CN114836549B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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