CN109022538A - 一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，属于植物抗病性鉴定技术领域，包括以下步骤：培养基的制备：原料包括琼脂和固体营养颗粒，采用凝胶法制备培养基，所述固体营养颗粒为具有四层的球形颗粒；接种体的分离；接种体鉴定；接种体保存；接种体复壮；接种孢子制备；鉴定材料准备；对照品种选择；接种及接种后的管理；发病指数的调查；抗性评价。该方法操作简便、成本低廉，且运用的培养基培养西瓜炭疽病菌成功率高、周期短，本方法可用于选育和推广的西瓜品种进行炭疽病抗性鉴定，大大降低或避免炭疽病的危害，对抗病新品种的选育、推广及综合利用具有重要意义。

Description

一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法

技术领域

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，尤其涉及一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法。

背景技术

西瓜炭疽病由瓜类炭疽菌引起，是西瓜重要病害之一。自1867年意大利首次对瓜类炭疽病报道以来，该病已经在地中海、美国、中美洲、澳大利亚等众多国家和地区发生，每年全球西瓜产量因炭疽病的损失达10-15％。瓜类炭疽病菌的无性孢子世代常见，为半知菌门亚门黑盘孢目葫芦科刺盘孢(Colletotrichum orbiculare)。我国1899年就有西瓜炭疽病发生的报道，近年来，西瓜炭疽病在我国的山东、河南、上海、江苏、浙江等省市都有发生，使许多地区西瓜生产受到不同程度的影响。该病在西瓜瓜苗期到成株期都可发生，以幼苗期和果实成熟期为发病高峰期。西瓜幼苗发病时，子叶上出现圆形或半圆形褐色病斑，外围常有一黄褐色晕圈，病斑上长有黑色小点或淡红色粘状物，发展到幼茎基部变为黑褐色，且缢缩，甚至倒折，但病斑部位较立枯病高。成株期发病，在叶片上出现水浸状圆形淡黄色斑点，稍凹陷，后变褐色，边缘紫褐色，中间淡褐色，有同心轮纹，病斑扩大相互融合后易引起叶片穿孔干枯。在未成熟的果实上，初期病斑呈水浸状淡绿色圆斑，成熟果实上开始为突起病斑，后期扩大为褐色凹陷，并环状排列许多小黑点，潮湿时生出粉红色黏物，多呈畸形或变黑腐烂。

选育和利用抗病品种是防治病害最基本、最重要的措施。抗病育种从选育到利用都离不开抗性鉴定，抗性鉴定是抗病育种过程中的一项基础性工作。研究西瓜炭疽病的抗性，进而研发出一种快速、简便鉴定品种抗性的方法，也必将在生产实践中起到理论上的指导作用。

短期内繁殖足够的西瓜炭疽病菌孢子是进行西瓜炭疽病抗性鉴定的基础。通常瓜类炭疽病菌在普通培养基上只长菌丝不长孢子，为了得到一种短期获得西瓜炭疽病菌分生孢子的有效途径，要选择制备一种最适合西瓜炭疽病菌丝生长及产孢的培养基。西瓜感染炭疽病时，在感染对数期产孢快且孢子量大，所以炭疽病菌的孢子繁殖较其他的一般菌种培养基所需要的碳源和营养成分更为重要，故，西瓜炭疽病的培养基制备是在抗性鉴定中非常关键的一步。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，该方法操作简便，并且在炭疽病病原菌培养时，培养基内可长期提供稳定的碳源和营养成分，无需额外添加，减少了菌种被污染的可能性，提高西瓜炭疽病鉴定的成功率，本方法可用于选育和推广的西瓜品种进行炭疽病抗性鉴定，大大降低或避免炭疽病的危害，对抗病新品种的选育、推广及综合利用具有重要意义。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，包括以下步骤：

培养基的制备：取琼脂和固体营养颗粒采用凝胶法制备培养基，并将培养基制备成平面培养基和斜面培养基，所述固体营养颗粒为维生素、石蜡、葡萄糖、氨基酸、明胶、网状大豆蛋白纤维、蜂蜜制备的多层球形颗粒；

接种体的分离：剪取西瓜叶片的病键部，于浓度为75wt％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用0.1wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，插入平面培养基中，于黑暗环境中暗培养2-3d，出菌丝后转接到新的平面培养基上，得到接种体；

接种体鉴定：提取接种体的菌丝DNA进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，并进行DNA序列对比，得到西瓜炭疽病病原菌接种体；

接种体保存：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体进行分离纯化，然后转接到斜面培养基于26-28℃进行暗培养3-4d；

接种体复壮：将保存的接种体在平面培养基上于26-28℃进行暗培养3-4d，将培养的菌丝接种于病感西瓜叶上，于温度为26-28℃、相对湿度为85-90％进行昼夜培养，待叶片发病后将接种体分离，得到分离物；

接种孢子制备：将分离物转接于平面培养基上，于26-28℃培养箱进行暗培养7-8d，待菌丝长满平面培养基后，洗下孢子，制备成悬浮液；

鉴定材料准备：选取西瓜幼苗的成熟叶，放入75wt％乙醇中浸泡1min，1wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，将1/2的成熟叶接种悬浮液，1/2的成熟叶接种无菌水；

对照品种选择：选取中抗品种、高抗品种作为各抗性等级的对照品种，以各鉴定材料与对照品种相比的相对抗性判定鉴定材料的相对抗性；

接种及接种后的管理：每片成熟叶接种后，将平面培养基置于温度26-28℃、相对湿度80％条件下的人工气候箱内培养；

发病指数的调查：接种7-8d后进行病情调查，观察每片成熟叶接种处的病斑发生情况，记载各个病级叶片数；

抗性评价：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较。

进一步，所述接种体的分离步骤的具体操作为：采集发病初期的西瓜叶片，剪取0.5cm×0.5cm的病键部，置于灭菌的培养皿中，于浓度75wt％乙醇溶液中浸泡30s，取出用0.1wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，用无菌水清洗2次后，用灭菌滤纸吸干水分，插入平面培养基上，于28℃培养箱暗培养2d，待长出菌丝后转接到新的平面培养基，获得接种体。

进一步，所述接种体保存步骤的具体操作为：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体，进行3次单孢分离纯化,再转接到含6cm斜面培养基的冷冻离心管中，并于28℃的条件下暗培养3d，在斜面培养基上倒入1cm厚的灭菌矿物油，置于4℃保存。

进一步，所述接种体复壮步骤的具体操作为：将保存的接种体在平面培养基上于28℃的条件下暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.6cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病西瓜品种早佳8424的15日龄叶片上，放入28℃、相对湿度90％的人工气候箱中昼夜各12h进行培养，等叶片发病后进行接种体分离，得到分离物。

进一步，所述接种孢子制备步骤的具体操作为：将接种体复壮分离后获得的分离物转接到平面培养基上，于28℃的条件下暗培养8d，待菌丝长满平面培养基产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌纸过滤菌丝，制成1×10⁶个/ml分生孢子的悬浮液供接种使用。

进一步，所述鉴定材料准备步骤的具体操作为：选择生长点以下第2片成熟叶，每品种或资源材料设3次重复，每次重复不少于4片成熟叶，每次重复1/2成熟叶用无菌水配置的病原菌分生孢子悬浮液2ul接种，另外的1/2成熟叶接种2ul的无菌水；

所述成熟叶为生长一致，无病虫危害的西瓜幼苗15日龄的完全展开真叶，将成熟叶用清水冲洗干净，晾干，放入75wt％乙醇中浸泡1min，1wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台中晾干。

进一步，所述接种及接种后管理步骤的具体操作为：在每片成熟叶的中间部位用微量注射器刺破表皮后注入2ul的分生孢子悬浮液，接种后，放入铺有无菌水湿润滤纸的平面培养基中，并将平面培养基置于28℃、相对湿度为90％的人工气候箱黑暗保湿24h，以后每天光照12h。

进一步，所述发病指数的调查的具体操作为：接种7d后进行病情调查，观察每片成熟叶接种处的病斑发生情况，记载各病级叶片数。

进一步，所述抗性评价步骤的具体操作为：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对照品种病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在西瓜炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种或资源材料应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数＞30，参鉴品种或资源材料的空白对照的病情指数为0，该抗性鉴定结果有效。

进一步，所述培养基的制备方法为：

将维生素、石蜡、葡萄糖、氨基酸混合加入无菌去离子水中，得到悬浮液，随后加入淀粉搅拌成糊状物，将糊状物涂抹至粒径为2mm球形模具上，制备成为球形颗粒，待球形颗粒表面风干后取出，置于40-45℃的干燥箱内干燥，得到内层营养颗粒；

将内层营养颗粒置于明胶与葡萄糖的凝胶状混合物中，于30-35℃的温度下以200-400r/min搅拌1h，静置消泡2h后，于-1-2℃凝固，自然风干得到双层营养颗粒，所述双层营养颗粒粒径为2.5mm；

将双层营养颗粒外部包裹网状大豆蛋白纤维，于20-25℃的烘箱内干燥，得到三层营养颗粒，所述三层营养颗粒粒径为2.7mm；

将蜂蜜以1200-1400r/min搅拌5-10min后，加入第三层营养颗粒，以300-400r/min搅拌2h，取出，于20-25℃的烘箱内烘干，得到固体营养颗粒，所述固体营养颗粒粒径为3mm；

将固体营养颗粒加入半凝固态的琼脂中，进行1-2min的紫外线灭菌，凝胶完全冷却后得到培养基备用。

炭疽病的菌种培养中需要不断的添加葡萄糖或淀粉、氨基酸、碳源、维生素等营养物质以供菌种生长，菌种的生长曲线为迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期，对数期的营养物质需求量最大，所以制备固体营养颗粒，按照每期的需求量每层加入不同的营养物质，以便在不额外提供营养物质的情况下，保证菌落生长所需的碳源和营养，避免加入新培养基过程中带来的外源污染，影响培养效果，以提高西瓜炭疽病的抗性鉴定的成功率。最外层为包含维生素、矿物质和氨基酸、葡萄糖等多种营养物质的蜂蜜，在迟缓期的时候给菌种提供营养物质，待进入对数增长期前期阶段时，外层蜂蜜已经被基本消耗完全，裸露出三层营养颗粒，网状大豆蛋白纤维是为了防止病菌快速增长时营养颗粒的崩解,且还可以提供蛋白质，同时双层营养颗粒从网状大豆蛋白纤维空隙中裸露，由于菌落快速增长培养基温度变高，且培养基置于28℃左右的潮湿环境下，明胶逐渐溶解，葡萄糖露出，葡萄糖与明胶继续为菌落提供营养物质，当双层营养颗粒被逐渐消耗时，内层营养颗粒出现，大量的营养物质裸露出，此时，菌落因生长规律和充足的营养达到对数期的最大增长值，确保得到数量较多的菌种。

本发明提供的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，有益效果如下：

一、采用制备的缓释培养基培养接种体和病原菌，固体营养颗粒为孢子大量繁殖的期间一直稳定提供所需要的全部营养和碳源，无需外加营养液和碳源，减少了工作量，同时也减少了菌种被污染的可能性，提高培养西瓜炭疽病的成功率，从而进一步增加了西瓜炭疽病的抗性室内鉴定的成功率和可靠性，对抗病新品种的选育、推广起到了积极的作用。

二、本发明在室内通过人工接种进行鉴定，将病原菌直接接种到寄主植株或器官上，使其发病，所需西瓜植株少，操作简单、易掌握，鉴定成本较低，并依据相关的抗性评价标准，来区分品种的抗病性的筛选和抗性评价，对抗病新品种的选育、推广及综合利用具有重要意义。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例1：西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法:

采用病感品种早佳8424作为鉴定材料，以中抗品种Congo、高抗品种CharlestonGray作为对照品种；

西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，包括以下步骤：

培养基的制备：将0.5g维生素、0.2g石蜡、1g葡萄糖、0.07g氨基酸混合加入无菌去离子水中，制备成为悬浮液，随后在悬浮液中加入10g淀粉，制备成为糊状物，将糊状物涂抹至粒径为2mm球形模具上，制备成为球形颗粒，待球形颗粒表面风干后取出，置于40℃的干燥箱内干燥，得到内层营养颗粒；将内层营养颗粒置于5g明胶与2g葡萄糖的凝胶状混合物中，于35℃的温度下以200r/min搅拌1h，静置消泡2h后，于-1℃凝固，自然风干得到双层营养颗粒，双层营养颗粒粒径为2.5mm；将双层营养颗粒外部包裹1g网状大豆蛋白纤维，于25℃的烘箱内完全干燥，得到三层营养颗粒，三层营养颗粒粒径为2.7mm；将10g蜂蜜以1200r/min搅拌10min直至蜂蜜出现较多气泡后，加入三层营养颗粒，以400r/min搅拌2h，取出，于25℃的烘箱内烘干，得到固体营养颗粒，固体营养颗粒粒径为3mm；将20g琼脂煮沸溶解用无菌水定容至1L，分装于三角瓶中，待琼脂呈现半凝固状态时，加入固体营养颗粒，进行1min的紫外线灭菌，凝胶完全冷却后得到培养基备用，培养基可以制备成平面或斜面。

接种体的分离：采集发病初期的西瓜叶片，在超净工作台上，剪取0.5cm×0.5cm的病键部，置于灭菌的培养皿中，先用75wt％乙醇溶液消毒30s，取出再用0.1wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，用无菌水清洗2次后，用灭菌滤纸吸干水分，插入平面培养基上，于28℃培养箱暗培养2d，待长出菌丝后转接到新的平面培养基，获得接种体；

接种体鉴定：当肉眼观察到菌落形态为橙红色后变为深灰色，且边缘整齐时，用显微镜观察，符合炭疽病菌的形态特征时，提取接种体的菌丝DNA进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，分析后进行DNA序列对比，得到西瓜炭疽病病原菌；

接种体保存：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体，进行3次单孢分离纯化，再转接到含6cm斜面培养基的冷冻离心管中，并于28℃的条件下暗培养3d，在斜面培养基上倒入1cm厚的灭菌矿物油，置于4℃保存；

接种体复壮：将保存的接种体转移培养在平面培养基上，于28℃的条件下暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.6cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病西瓜品种早佳8424的15日龄叶片上，放入温度为28℃、相对湿度90％的人工气候箱中昼夜各12h进行培养，等叶片发病后进行接种体分离，得到分离物；

接种孢子制备：将接种体复壮分离后获得的分离物转接到平面培养基上，于28℃的条件下暗培养8d，待菌丝长满平面培养基产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌纸过滤菌丝，制成1×10⁶个/ml分生孢子的悬浮液供接种使用；

鉴定材料准备：摘取早佳8424生长点以下第2片成熟叶10片，成熟叶为生长一致，无病虫危害的西瓜幼苗15日龄的完全展开真叶，将成熟叶用清水冲洗干净，晾干，放入75wt％乙醇中浸泡1min，1wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台中晾干，每次品种设3次重复，每次重复1/2(5片叶)成熟叶用无菌水配置的病原菌分生孢子悬浮液2ul接种，另外的1/2(5片叶)成熟叶接种2ul的无菌水；

对照品种选择：选取中抗品种Congo、高抗品种Charleston Gray作为各抗性等级的对照品种，以各鉴定材料与对照品种相比的相对抗性判定鉴定材料的相对抗性；

接种及接种后的管理：在每片成熟叶的中间部位用微量注射器刺破表皮后注入2ul的分生孢子悬浮液，接种后，放入铺有无菌水湿润滤纸的平面培养基中，并将平面培养基置于温度为28℃、相对湿度保持80％的人工气候箱黑暗保湿24h，以后每天光照12h；

发病指数的调查：接种后7d进行病情调查，观察每片叶子接种处的病斑发生情况，记载各病级叶片数，

将西瓜幼苗对炭疽病的抗性分为0，1，3，5，7，9共六级。

0级：无病斑；

1级：轻微侵染，仅子叶上有少数小病斑(1～5个)；

3级：中度侵染，真叶发病，少数病斑(6～10个)；

5级：严重侵染，病斑较多(11～20个)；

7级：侵染非常严重，坏死斑扩大；

9级：发病严重，植株死亡；

病情指数(DI)计算公式如下：

其抗性分级标准为：0＝免疫；11以下＝高抗；12～33＝抗病；34～55＝中度抗病；56～77＝感病；78以上＝高感；

抗性评价：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对照品种病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在西瓜炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种或资源材料应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数＞30，参鉴品种或资源材料的空白对照的病情指数为0，该抗性鉴定结果有效。

本实施例早佳8424的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表1所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(5×10+7×3+9×2)/(9×15)×100＝65.9

表1：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

本实施例的Congo的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表2所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(3×10+5×4+7×1)/(7×15)×100＝54.3

表2：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

本实施例早Charleston Gray的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表3所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(0×12+1×2+3×1)/(3×15)×100＝11.1

表3：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

从以上数据可以看出，表1早佳8424品种DI平均值为65.9鉴定为感病品种，表2Congo品种的DI平均值为51.1鉴定为中度抗病品种，表3Charleston Gray品种的DI平均值为9.6鉴定为高抗病品种。

实施例2：西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法:

采用病感品种早佳8424作为鉴定材料，以中抗品种Congo、高抗品种CharlestonGray作为对照品种；

西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，包括以下步骤：

培养基的制备：将0.6g维生素、0.3g石蜡、2g葡萄糖、0.1g氨基酸混合加入无菌去离子水中，制备成为悬浮液，随后在悬浮液中加入14g淀粉，制备成为糊状物，将糊状物涂抹至粒径为2mm球形模具上，制备成为球形颗粒，待球形颗粒表面风干后取出，置于45℃的干燥箱内干燥，得到内层营养颗粒；将内层营养颗粒置于5g明胶与2g葡萄糖的凝胶状混合物中，于30℃的温度下以400r/min搅拌1h，静置消泡2h后，于2℃凝固，自然风干得到双层营养颗粒，双层营养颗粒粒径为2.5mm；将双层营养颗粒外部包裹0.5g网状大豆蛋白纤维，于20℃的烘箱内完全干燥，得到三层营养颗粒，三层营养颗粒粒径为2.7mm；将10g蜂蜜以1400r/min搅拌5min直至蜂蜜出现较多气泡后，加入三层营养颗粒，以300r/min搅拌2h，取出，于20℃的烘箱内烘干，得到固体营养颗粒，固体营养颗粒粒径为3mm；将20g琼脂煮沸溶解用无菌水定容至1L，分装于三角瓶中，待琼脂呈现半凝固状态时，加入固体营养颗粒，进行2min的紫外线灭菌，凝胶完全冷却后得到培养基备用，培养基可以制备成平面或斜面。

接种体的分离：采集发病初期的西瓜叶片，在超净工作台上，剪取0.5cm×0.5cm的病键部，置于灭菌的培养皿中，先用75wt％乙醇溶液消毒30s，取出再用0.15wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，用无菌水清洗2次后，用灭菌滤纸吸干水分，插入平面培养基上，于28℃培养箱暗培养3d，待长出菌丝后转接到新的平面培养基，获得接种体；

接种体鉴定：当肉眼观察到菌落形态为橙红色后变为深灰色，且边缘整齐时，用显微镜观察，符合炭疽病菌的形态特征时，提取接种体的菌丝DNA进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，分析后进行DNA序列对比，得到西瓜炭疽病病原菌；

接种体保存：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体，进行3次单孢分离纯化,再转接到含6cm斜面培养基的冷冻离心管中，并于26℃的条件下暗培养4d，在斜面培养基上倒入1cm厚的灭菌矿物油，置于4℃保存；

接种体复壮：将保存的接种体转移培养在平面培养基上，于26℃的条件下暗培养4d，从菌丝边缘用打孔器打0.6cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病西瓜品种早佳8424的15日龄叶片上，放入温度为26℃、相对湿度85％的人工气候箱中昼夜各12h进行培养，等叶片发病后进行接种体分离，得到分离物；

接种孢子制备：将接种体复壮分离后获得的分离物转接到平面培养基上，于26℃的条件下暗培养7d，待菌丝长满平面培养基产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌纸过滤菌丝，制成1×10⁶个/ml分生孢子的悬浮液供接种使用；

鉴定材料准备：摘取早佳8424生长点以下第2片成熟叶10片，成熟叶为生长一致，无病虫危害的西瓜幼苗15日龄的完全展开真叶，将成熟叶用清水冲洗干净，晾干，放入70wt％乙醇中浸泡1min，0.5wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台中晾干，每次品种设3次重复，每次重复1/2(5片叶)成熟叶用无菌水配置的病原菌分生孢子悬浮液2ul接种，另外的1/2(5片叶)成熟叶接种2ul的无菌水；

对照品种选择：选取中抗品种Congo、高抗品种Charleston Gray作为各抗性等级的对照品种，以各鉴定材料与对照品种相比的相对抗性判定鉴定材料的相对抗性；

接种及接种后的管理：在每片成熟叶的中间部位用微量注射器刺破表皮后注入2ul的分生孢子悬浮液，接种后，放入铺有无菌水湿润滤纸的平面培养基中，并将平面培养基置于温度为26℃、相对湿度保持80％的人工气候箱黑暗保湿24h，以后每天光照12h；

发病指数的调查：接种后7d进行病情调查，观察每片叶子接种处的病斑发生情况，记载各病级叶片数，

将西瓜幼苗对炭疽病的抗性分级参照实施例1；

抗性评价：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对照品种病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在西瓜炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种或资源材料应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数＞30，参鉴品种或资源材料的空白对照的病情指数为0，该抗性鉴定结果有效。

本实施例早佳8424的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表1.1所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(5×10+7×3+9×2)/(9×15)×100＝65.9

表1.1：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

本实施例的Congo的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表2.1所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(3×10+5×4+7×1)/(7×15)×100＝54.3

表2.1：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

本实施例早Charleston Gray的3次接种病原菌分生孢子悬浮液重复试验数据如表3.1所示：以第一次鉴定试验为例计算数据：DI＝(0×12+1×2+3×1)/(3×15)×100＝11.1

表3.1：

接种无菌水重复试验的结果是均未感染炭疽病；

从以上数据可以看出，表1早佳8424品种DI平均值为64.0鉴定为感病品种，表2Congo品种的DI平均值为53.6鉴定为中度抗病品种，表3Charleston Gray品种的DI平均值为10.4鉴定为高抗病品种。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (10)

1.一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养基的制备：取琼脂和固体营养颗粒采用凝胶法制备培养基，并将培养基制备成平面培养基和斜面培养基，所述固体营养颗粒为维生素、石蜡、葡萄糖、氨基酸、明胶、网状大豆蛋白纤维、蜂蜜制备的多层球形颗粒；

接种体的分离：剪取西瓜叶片的病键部，于浓度为75wt％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用0.1wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，插入平面培养基中，于黑暗环境中暗培养2-3d，出菌丝后转接到新的平面培养基上，得到接种体；

接种体鉴定：提取接种体的菌丝DNA进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，并进行DNA序列对比，得到西瓜炭疽病病原菌接种体；

接种体保存：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体进行分离纯化，然后转接到斜面培养基于26-28℃进行暗培养3-4d；

接种体复壮：将保存的接种体在平面培养基上于26-28℃进行暗培养3-4d，将培养的菌丝接种于病感西瓜叶上，于温度为26-28℃、相对湿度为85-90％进行昼夜培养，待叶片发病后将接种体分离，得到分离物；

接种孢子制备：将分离物转接于平面培养基上，于26-28℃培养箱进行暗培养7-8d，待菌丝长满平面培养基后，洗下孢子，制备成悬浮液；

鉴定材料准备：选取西瓜幼苗的成熟叶，放入75wt％乙醇中浸泡1min，1wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，将1/2的成熟叶接种悬浮液，1/2的成熟叶接种无菌水；

对照品种选择：选取中抗品种、高抗品种作为各抗性等级的对照品种，以各鉴定材料与对照品种相比的相对抗性判定鉴定材料的相对抗性；

接种及接种后的管理：每片成熟叶接种后，将平面培养基置于温度26-28℃、相对湿度80％条件下的人工气候箱内培养；

发病指数的调查：接种7-8d后进行病情调查，观察每片成熟叶接种处的病斑发生情况，记载各个病级叶片数；

抗性评价：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较。

2.根据权利要求1所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述接种体的分离步骤的具体操作为：采集发病初期的西瓜叶片，剪取0.5cm×0.5cm的病键部，置于灭菌的培养皿中，于浓度75wt％乙醇溶液中浸泡30s，取出用0.1wt％次氯酸钠溶液浸泡1min后，用无菌水清洗2次后，用灭菌滤纸吸干水分，插入平面培养基上，于28℃培养箱暗培养2d，待长出菌丝后转接到新的平面培养基，获得接种体。

3.根据权利要求2所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述接种体保存步骤的具体操作为：将鉴定为西瓜炭疽病病原菌的接种体，进行3次单孢分离纯化,再转接到含6cm斜面培养基的冷冻离心管中，并于28℃的条件下暗培养3d，在斜面培养基上倒入1cm厚的灭菌矿物油，置于4℃保存。

4.根据权利要求3所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述接种体复壮步骤的具体操作为：将保存的接种体在平面培养基上于28℃的条件下暗培养3d，从菌丝边缘用打孔器打0.6cm大小的菌丝块接种在表面消毒的感病西瓜品种早佳8424的15日龄叶片上，放入温度为28℃、相对湿度90％的人工气候箱中昼夜各12h进行培养，等叶片发病后进行接种体分离，得到分离物。

5.根据权利要求4所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述接种孢子制备步骤的具体操作为：将接种体复壮分离后获得的分离物转接到平面培养基上，于28℃的条件下暗培养8d，待菌丝长满平面培养基产生分生孢子后，用无菌水洗下孢子，用3层灭菌纸过滤菌丝，制成1×10⁶个/ml分生孢子的悬浮液供接种使用。

6.根据权利要求5所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述鉴定材料准备步骤的具体操作为：选择生长点以下第2片成熟叶，每品种或资源材料设3次重复，每次重复不少于4片成熟叶，每次重复1/2成熟叶用无菌水配置的病原菌分生孢子悬浮液2ul接种，另外的1/2成熟叶接种2ul的无菌水；

所述成熟叶为生长一致，无病虫危害的西瓜幼苗15日龄的完全展开真叶，将成熟叶用清水冲洗干净，晾干，放入75wt％乙醇中浸泡1min，1wt％次氯酸钠溶液浸泡2min后，用无菌水冲洗3次，然后在超净工作台中晾干。

7.根据权利要求6所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述接种及接种后管理步骤的具体操作为：在每片成熟叶的中间部位用微量注射器刺破表皮后注入2ul的分生孢子悬浮液，接种后，放入铺有无菌水湿润滤纸的平面培养基中，并将平面培养基置于温度为28℃、相对湿度为90％的人工气候箱黑暗保湿24h，以后每天光照12h。

8.根据权利要求1所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述发病指数的调查的具体操作为：接种7d后进行病情调查，观察每片成熟叶接种处的病斑发生情况，记载各病级叶片数。

9.根据权利要求1所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述抗性评价步骤的具体操作为：以参鉴品种的病情指数分别与对照品种的病情指数进行比较，以3次重复病情指数平均数与对照品种病情指数进行比较，以此作为抗性划分依据，在西瓜炭疽病抗性鉴定中，参鉴品种或资源材料应进行3次鉴定实验，实验以感病对照品种的病情指数＞30，参鉴品种或资源材料的空白对照的病情指数为0，该抗性鉴定结果有效。

10.根据权利要求1-9任一所述的一种西瓜炭疽病抗性室内鉴定的方法，其特征在于，所述培养基的制备方法为：

将维生素、石蜡、葡萄糖、氨基酸混合加入无菌去离子水中，得到悬浮液，随后加入淀粉搅拌成糊状物，将糊状物涂抹至粒径为2mm球形模具上，制备成为球形颗粒，待球形颗粒表面风干后取出，置于40-45℃的干燥箱内干燥，得到内层营养颗粒；

将内层营养颗粒置于明胶与葡萄糖的凝胶状混合物中，于30-35℃的温度下以200-400r/min搅拌1h，静置消泡2h后，于-1-2℃凝固，自然风干得到双层营养颗粒，所述双层营养颗粒粒径为2.5mm；

将双层营养颗粒外部包裹网状大豆蛋白纤维，于20-25℃的烘箱内干燥，得到三层营养颗粒，所述三层营养颗粒粒径为2.7mm；

将蜂蜜以1200-1400r/min搅拌5-10min后，加入第三层营养颗粒，以300-400r/min搅拌2h，取出，于20-25℃的烘箱内烘干，得到固体营养颗粒，所述固体营养颗粒粒径为3mm；

将固体营养颗粒加入半凝固态的琼脂中，进行1-2min的紫外线灭菌，凝胶完全冷却后得到培养基备用。