CN112592956B - 大豆炭疽病抗性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆炭疽病抗性鉴定方法，包括以下步骤：利用平头炭疽菌，配制浓度为35～45mg/L的菌丝悬浮液；将待抗性鉴定的大豆播种于无菌土上于无菌的温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期，采荚；将菌丝悬浮液均匀喷洒到豆荚上，直到豆荚上菌丝悬浮液溢流停止喷雾，待豆荚上菌丝悬浮液不再溢流后置于培养皿中进行培养；接种4～6d后采用图像分析系统扫描计算病斑面积占全荚面积百分比，分析各待抗性鉴定的大豆的病情指数；根据大豆炭疽病病情指数进行品种的抗感特性评价。本发明的大豆炭疽病抗性鉴定方法，使用方便、能快速有效区分大豆炭疽病抗性。

Description

大豆炭疽病抗性鉴定方法

技术领域

本发明属于作物抗性育种技术领域，具体涉及一种大豆炭疽病抗性鉴定方法。

背景技术

大豆炭疽病是大豆生产，尤其是鲜食大豆生产中主要病害之一。大豆各部位都可能受到炭疽病的侵染，豆荚及叶片的症状为黑褐色“同心轮”状或条状病斑，茎上呈褐色条形病斑。大豆炭疽病发生南方重于北方，尤其是对南方鲜食大豆生产造成严重影响，严重田块病荚率可达85％以上，一旦发生导致外观品质下降，造成重大的经济损失。在生产上，防治主要使用的是杀菌剂，可在一定程度上控制和减小该病害的损失，然而生化防治会增加生产成本导致生态环境和食品安全问题，同时也易导致病原菌产生抗药性导致防治效果不稳定。因此选育和推广抗病品种是防治该病最经济有效安全的方法，而抗性鉴定是抗病育种研究的前提和基础。目前大豆炭疽病抗性鉴定主要采取的方法是活体孢子喷雾接种法。即在大豆豆荚鼓粒初期对豆荚进行孢子喷雾接种，接种后，套袋保湿24h，待感病材料发病到最高级的时候统计发病情况。活体接种一般在田间自然环境中进行虽然更接近自然发病，然而对于抗性鉴定而言易受温度、湿度等不可控环境因素影响会造成结果准确性较低，需要多年数据才能得到较准确的抗性鉴定结果。同时活体接种比较耗时耗力只适用于小样本量抗性鉴定，且一个种植季每份材料只能接种一次，因此整体鉴定效率较低。同时有些高感材料接种后发病较快，故待感病材料发病到最高级的统计发病情况进行鉴定会导致对抗性材料筛选压力太小，较难筛选到优异的抗性材料。

综上所述，采用孢子悬浮液活体侵染虽然更接近自然发病(抗性鉴定结果更准确)，但此方法比较耗时耗力只适用于小样本量抗性鉴定，且一个种植季每份材料只能接种一次，因此整体鉴定效率较低。因此，需要对该技术进行改进。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种使用方便、能快速有效区分抗性的大豆炭疽病抗性鉴定方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆炭疽病抗性鉴定方法，包括以下几个步骤：

步骤A：材料准备：

利用平头炭疽菌，配制浓度为35～45mg/L的菌丝悬浮液；

将待抗性鉴定的大豆播种于无菌土上于无菌的温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期，采荚；

步骤B:离体豆荚菌丝喷雾接种:

将菌丝悬浮液均匀喷洒到豆荚上，直到豆荚上菌丝悬浮液溢流停止喷雾，待豆荚上菌丝悬浮液不再溢流后置于培养皿(15cm培养皿)中，培养皿中事先放置用于保湿的含无菌水的滤纸(培养皿中事先放置滤纸并加入3mL无菌水用于保湿)；接种后，将装有豆荚的培养皿置于光照植物培养箱内25±1℃黑暗培养24h后改为14h黑暗/10h光周期培养，培养温度为25±1℃；

步骤C:抗性评价:

接种4～6d后采用图像分析系统扫描计算病斑面积占全荚面积百分比，分析各待抗性鉴定的大豆的病情指数；根据大豆炭疽病病情指数进行品种的抗感特性评价；

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个豆荚面积的10.00％以下；

2级：病斑面积占整个豆荚面积的10.01％～35.00％；

3级：病斑面积占整个豆荚面积的35.01％～65.00％；

4级：病斑面积占整个豆荚面积的65.01％～90.00％；

5级：病斑面积占整个豆荚面积的90.00％以上；

病情指数计算公式为：

病情指数(DI，Disease index)＝[(∑各级病荚数×各级严重度)/(调查总荚数×5)]×100；

根据病情指数将大豆炭疽病的抗性等级分为5类：

高抗(HR，Highly resistant)：(0≤DI<15)；

抗病(R，Resistant)：(15≤DI<35)；

中抗(MR，Moderately resistant)：(35≤DI<65)；

感病(S，Susceptible)：(65≤DI<85)；

高感(HS，Highly susceptible)：(DI≥85)。

作为本发明的大豆炭疽病抗性鉴定方法的改进：接种5d后采用万深图像分析系统扫描计算病斑面积占全荚面积百分比。

作为本发明的大豆炭疽病抗性鉴定方法的进一步改进：

所述步骤A为：

A.1)、菌丝悬浮液制备：

平头炭疽菌菌株在PDA培养基平板上培养5d后用打孔器取5个直径为4mm的菌丝块，加入到200mL的PDB中，放入摇床，100rpm/min，25℃孵育5天；将菌丝体过滤后用无菌水洗涤3次(从而洗净PDB培养液)，2500rpm/min离心收集菌丝体，打碎菌丝体，按35～45mg/L(优选40mg/L)的浓度配置菌丝悬浮液；

A.2)、大豆材料：

将待抗性鉴定的大豆播种在含无菌土的容器中置于温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期采荚进行离体菌丝喷雾接种。

本发明具有如下技术优势：

将现有方法用孢子悬浮液改为菌丝悬浮液作为病源接种。菌丝悬浮液制备培养时间短，制备简易、快速、量大且培养箱保存5天内致病力不变；有利于大规模鉴定。

采用离体豆荚接种替代活体接种，接种后置于培养箱中在可控环境条件下发病，避免了环境因素对鉴定结果的影响鉴定结果更稳定更准确；采用离体豆荚接种每份大豆材料一季可多次采样多次接种，可比活体接种得到更多数据，同样有利于大规模鉴定。如按照现有方法待待感病材料发病到最高级的统计发病情况，本发明第3天就要统计发病情况，而3天还不能很好地区分较抗材料的抗性等级，待第5天统计发病情况得出的结果较为符合正态分布，故统计时间定为接种后第5天较为科学。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是不同调查时间抗性类型分布图；

图2是部分高抗，抗，中抗，感及高感材料。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

步骤A:材料准备：

菌丝悬浮液制备：平头炭疽菌CT5菌株在PDA培养基平板上培养5d后用打孔器取5个直径为4mm的菌丝块，加入到200mL的PDB培养基中，放入摇床，100rpm/min，25℃孵育5天。将菌丝体过滤后用无菌水洗涤3次从而洗净PDB培养液，2500rpm/min离心收集菌丝体，用搅拌机低速20s打碎菌丝体，按40mg/L的浓度配置菌丝悬浮液。

大豆材料：

将96份待抗性鉴定的大豆材料播种在含无菌土的直径28CM的盆中置于温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期采荚进行离体菌丝喷雾接种。每次对可取样材料取样15～20个荚，每份大豆材料采样4～6次。

步骤B:离体豆荚菌丝喷雾接种:

将菌丝悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒到豆荚上，直到豆荚上菌丝悬浮液溢流停止喷雾，待豆荚上菌丝悬浮液不在溢流后置于15cm培养皿中，每份大豆材料同一次的取样放入同一个培养皿中。

培养皿中事先放置滤纸并加入3mL无菌水用于保湿。接种后，将装有豆荚的培养皿置于光照植物培养箱内25℃黑暗培养24h后改为14h黑暗/10h光周期培养，培养温度25℃。

步骤C:抗性评价:

分别于接种4d、5d、6d后采用万深图像分析系统扫描计算病斑面积，分析各大豆资源的病情指数。根据大豆炭疽病病情指数进行抗性评价。

抗性水平按照以下标准进行确定：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个豆荚面积的10.00％以下；

2级：病斑面积占整个豆荚面积的10.01％～35.00％；

3级：病斑面积占整个豆荚面积的35.01％～65.00％；

4级：病斑面积占整个豆荚面积的65.01％～90.00％；

5级：病斑面积占整个豆荚面积的90.00％以上。

病情指数计算公式为：

病情指数(DI，Disease index)＝[(∑各级病荚数×各级严重度)/(调查总荚数×5)]×100。根据病情指数将大豆炭疽病的抗性等级分为5类：

高抗(HR，Highly resistant)：(0≤DI<15)；

抗病(R，Resistant)：(15≤DI<35)；

中抗(MR，Moderately resistant)：(35≤DI<65)；

感病(S，Susceptible)：(65≤DI<85)；

高感(HS，Highly susceptible)：(DI≥85)。

结果与分析：分别于接种后第4天、第5天、第6天采用万深图像分析系统分析大豆的病斑面积计算病情指数后进行抗性评价。结果显示接种后第5天96份大豆材料中有8份高抗材料、19份抗病材料、36份中抗材料、13份感病材料和20份高感材料各抗性类型分布较为符合正态分布(图1，表1)，故调查分析时间定为接种后第5天。从发病严重程度来看不同大豆材料对炭疽病的抗性存在明显的差异，高抗种质豆荚表面只有细小的点状病斑，随着抗性减弱点状病斑变大或者形成块状病斑，高感种质则是病斑几乎覆盖整个荚表面(图2)。

表1、病情指数、抗性评价统计

从试验结果来看，本鉴定方法能快速稳定有效地区分不同大豆材料对大豆炭疽病的抗性，且不同抗性类型分布科学合理。

采用活体孢子喷雾接种法对表1中材料进行检测，从而验证本发明检测结果的正确性，结果如下：

对于抗和高抗材料，采用本发明的方法鉴定结果与活体孢子喷雾接种鉴定结果较为一致，而对中抗、感、高感材料时，本发明的鉴定结果会导致抗性等级降低。因此，采用本发明的方法对抗性材料筛选，能有效筛选到优异的抗性材料，且能快速稳定有效地区分不同大豆材料对大豆炭疽病的抗性，且不同抗性类型分布科学合理，得到的数据较适合用于关联分析发掘抗性基因。同时本鉴定方法鉴定为高抗的材料可作为传统抗病育种的抗源。

说明：

1、接种后第4天采用万深图像分析系统分析大豆的病斑面积计算病情指数后进行抗性评价，如图1的上图所示：

接种后第4天抗性评价结果显示，抗性材料偏多，其中抗性材料和高抗材料一共47份占比48.96％，明显不符合正态分布。

2、接种后第6天采用万深图像分析系统分析大豆的病斑面积计算病情指数后进行抗性评价，如图1的下图所示：

接种后第6天抗性评价结果显示，感病材料偏多，其中抗性材料和高抗材料一共47份占比70.83％，不符合正态分布。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.大豆炭疽病抗性鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

步骤A：材料准备：

利用平头炭疽菌，配制浓度为35～45mg/L的菌丝悬浮液；

将待抗性鉴定的大豆播种于无菌土上于无菌的温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期，采荚；

步骤B:离体豆荚菌丝喷雾接种:

将菌丝悬浮液均匀喷洒到豆荚上，直到豆荚上菌丝悬浮液溢流停止喷雾，待豆荚上菌丝悬浮液不再溢流后置于培养皿中，培养皿中事先放置用于保湿的含无菌水的滤纸；接种后，将装有豆荚的培养皿置于光照植物培养箱内25±1℃黑暗培养24h后改为14h黑暗/10h光周期培养，培养温度为25±1℃；

步骤C:抗性评价:

接种5d后采用万深图像分析系统扫描计算病斑面积占全荚面积百分比，分析各待抗性鉴定的大豆的病情指数；根据大豆炭疽病病情指数进行品种的抗感特性评价；

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个豆荚面积的10.00％以下；

2级：病斑面积占整个豆荚面积的10.01％～35.00％；

3级：病斑面积占整个豆荚面积的35.01％～65.00％；

4级：病斑面积占整个豆荚面积的65.01％～90.00％；

5级：病斑面积占整个豆荚面积的90.00％以上；

病情指数计算公式为：

病情指数(DI，Disease index)＝[(∑各级病荚数×各级严重度)/(调查总荚数×5)]×100；

根据病情指数将大豆炭疽病的抗性等级分为5类：

高抗(HR，Highly resistant)：0≤DI<15；

抗病(R，Resistant)：15≤DI<35；

中抗(MR，Moderately resistant)：35≤DI<65；

感病(S，Susceptible)：65≤DI<85；

高感(HS，Highly susceptible)：DI≥85。

2.根据权利要求1所述的大豆炭疽病抗性鉴定方法，其特征是：

所述步骤A为：

A.1)、菌丝悬浮液制备：

平头炭疽菌菌株在PDA培养基平板上培养5d后用打孔器取5个直径为4mm的菌丝块，加入到200mL的PDB中，放入摇床，100rpm/min，25℃孵育5天；将菌丝体过滤后用无菌水洗涤3次，2500rpm/min离心收集菌丝体，打碎菌丝体，按35～45mg/L的浓度配置菌丝悬浮液；

A.2)、大豆材料：

将待抗性鉴定的大豆播种在含无菌土的容器中置于温室中生长，待生长至豆荚鼓粒初期采荚进行离体菌丝喷雾接种。

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