CN109402215A

CN109402215A - 一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

Info

Publication number: CN109402215A
Application number: CN201811142473.XA
Authority: CN
Inventors: 苏超; 聂蓓蓓; 焦锋; 张敏娟; 钱永华; 梁嘉俊; 包立军; 高鸿鹏
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明公开了一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，包括以下步骤：步骤1、病原菌的分离；步骤2、致病性检测；步骤3、分离菌株的鉴定。本发明将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

Description

一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法。

背景技术

桑椹，市面上常见的一种水果，酸甜可口，深受消费者的青睐。桑椹不仅富含营养物质，还具有多种防病保健功效，因此，1993年卫生部将其列为“既是食品又是药品”的农产品之一^[1]。然而，桑椹在成熟过程中易被病原菌侵染致病，其中桑椹白化病是常见病害之一。近几年来，在我国江苏、浙江、四川、山东、山西、广东、广西和台湾等地都已发生过桑椹白化病，该病危害性大，且具有传染性，会严重破坏桑果产量及品质，防治不及时可导致果桑大面积减产甚至绝收，给农民造成了巨大的经济损失。

层出镰刀菌是一种常见的动、植物病原菌，该菌最早是由(Matsushima)Nirenberg1976年首先分离得到并定名的。因其具有广泛的地域分布及寄主范围，是生产上最难防治的重要病害之一。近年来,由层出镰刀菌侵染的作物新病害有上升趋势,如番茄叶斑病、番茄枯萎病、大蒜干腐病、小麦枯萎病、小麦根腐病、烟草叶斑病、烟草根腐病、燕麦枯萎病、红藻枯萎病、芦荟叶斑病、香蕉果腐病、茄子花腐病、地黄根腐病、百合枯萎病、芒果畸形病、苜蓿根腐病、洋葱干腐病、水稻穗腐病、国槐根茎腐烂病、苹果再植病、甘蔗梢腐病、玉米鞘腐病、玉米穗腐病等逐渐成为生产中不可忽视的问题。但目前还未有层出镰刀菌感染桑椹致其发生白化病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法。将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

其具体技术方案为：

一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，包括以下步骤：

步骤1、病原菌的分离

在无菌操作环境下，将桑椹病果用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分后，置于75％的酒精中浸泡几秒钟，在酒精灯火焰上灼烧一下，之后使用无菌刀片划开病果，将其切成小块，用无菌镊子取病果中间的小块置于PDA培养基上，每个培养基上放置4-5块,25℃恒温培养箱中暗培养。待菌落长出后根据菌落特征，采用顶端菌丝挑取法进行纯化，并将纯化的单一菌株移入PDA斜面培养基，4℃保藏备用。

步骤2、致病性检测

2.1实验室活体叶片接种将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3-5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况。以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异。

2.2田间桑椹接种在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响。每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况。以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离。

步骤3、分离菌株的鉴定

3.1形态学鉴定将保存的菌株Z4转接于PDA培养基上复苏活化后，用打孔器打取直径6mm的菌饼接入新的PDA培养基上,28℃培养，每天观察并记录纯化菌株的菌落形态、颜色及生长情况，并使用光学显微镜观察其大、小分生孢子的显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定。

3.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株基因组DNA，以其为模板，分别用真菌EF-1ɑ(EF-1H：5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3'，EF-2T：5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3')和ITS(ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')基因通用引物进行PCR扩增。扩增体系为25μl，其中模板DNA1μl，上下引物各1μl，ddH₂O10μl，Taq Mix12μl。扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的EF-1ɑ序列和ITS序列分别在GenBank数据库中进行数据库比较，下载同源性较高的序列，利用MEGA5.0软件，使用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

进一步，所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为：马铃薯浸粉3克，葡萄糖20克，琼脂14克，蒸馏水1升；所述合成低营养琼脂(SNA)培养基为：磷酸二氢钾1克，硝酸钾0.5克，葡萄糖0.2克，蔗糖0.2克，琼脂15克，蒸馏水1升。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

附图说明

图1是桑椹白化病果田间形态；

图2是桑活体叶片接种症状，其中，A、B、C.对照组 D、E、F.处理组 G、H、I、J.处理组局部放大；

图3是田间桑椹接种症状，其中，A～I.对照组 J～R.处理组；

图4是病原菌Z4在PDA上的形态，A.正面形态 B.背面形态；

图5是分生孢子，其中，A.大型分生孢子 B.小型分生孢子；

图6是病原菌Z4PCR扩增产物；

图7是基于EF序列构建的系统发育树；

图8是病原菌Z4PCR扩增产物；

图9是基于ITS序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1病果桑椹白化病果于2017年5月采自陕西五泉实验基地。

1.1.2田间接种材料陕西杨凌新天地试验基地果桑大十。

1.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯浸粉3克，葡萄糖20克，琼脂14克，蒸馏水1升。合成低营养琼脂(SNA)培养基：磷酸二氢钾1克，硝酸钾0.5克，葡萄糖0.2克，蔗糖0.2克，琼脂15克，蒸馏水1升。

1.2病原菌的分离

1.3致病性检测

1.3.1实验室活体叶片接种将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3-5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况。以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异。

1.3.2田间桑椹接种在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响。每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况。以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离。

1.4分离菌株的鉴定

1.4.1形态学鉴定将保存的菌株Z4转接于PDA培养基上复苏活化后，用打孔器打取直径6mm的菌饼接入新的PDA培养基上,28℃培养，每天观察并记录纯化菌株的菌落形态、颜色及生长情况，并使用光学显微镜观察其大、小分生孢子的显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定。

1.4.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株基因组DNA，以其为模板，分别用真菌EF-1ɑ(EF-1H：5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3'，EF-2T：5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3')和ITS(ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')基因通用引物进行PCR扩增。扩增体系为25μl，其中模板DNA1μl，上下引物各1μl，ddH₂O10μl，Taq Mix12μl。扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的EF-1ɑ序列和ITS序列分别在GenBank数据库中进行数据库比较，下载同源性较高的序列，利用MEGA5.0软件，使用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

2结果与分析

2.1田间病害症状

桑树上，染病的桑椹整个或者部分呈白色，果柄部位枯黄，常见整个枝条所结桑椹全部染病(图1)，经过雨水冲击后病果颜色发黄。

2.2致病性测定结果

2.2.1实验室活体叶片的致病性检测从样品中分离得到的菌株，接种10天后出现明显症状(如图2)，接种幼苗的叶片上出现大面积病斑，边缘周围枯黄或变黑，并有白色的霉层形成。对照组生长健康，无发病现象。发病的叶片组织分离、纯化获得的菌株与原接种物的菌落形态完全一致，将再分菌株进行分子鉴定，和待测菌株为相同菌株，表明该分离菌株对桑树叶片具有致病性。

2.2.2田间桑椹的致病性检测人工接种结果表明，待测菌株接种桑椹发病率为100％，且发病植株症状表现与田间的症状基本一致(图3)，经过形态观察与分子鉴定确定从发病植株分离得到的镰刀菌与用于接种的镰刀菌相同，符合柯赫氏法则，表明原接种菌株是桑椹白化病的致病菌。

2.3病原菌鉴定结果

2.3.1形态学鉴定菌株在PDA平板上，28℃培养5d菌落直径平均为46mm。菌落呈圆形，生长茂盛，外围的菌丝体生长相对稀疏，初为白色、后为紫红色、逐渐变为深紫色。气生菌丝发达、棉絮状(如图4)。根据显微观察结果，大型分生孢子较少，呈纺锤型或镰刀型，稍弯曲，向两端逐渐变尖(图5),具有2～5个隔膜，大小(12.19～22.99)μm×(2.05～3.03)μm，小型分生孢子较多，一端尖细、一端钝圆，大小(4.14～7.42)μm×(2.39～3.81)μm，无隔膜或者有1个隔膜，菌株形态特征与层出镰刀菌相符。

2.3.2分子生物学鉴定对菌株进EF-1a序列测定，电泳检测结果如图6，片段大小为688bp，将序列上传至NCBI数据库，得GenBank登录号为：MH281939。依据构建基于EF-1a序列的系统发育树(如图7)，发现供试菌与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)在99％Boostrap水平相聚于同一群。对菌株进行ITS序列测定，电泳检测结果如图8，片段大小为564bp，将序列上传至NCBI数据库，得GenBank登录号为：MH486974。依据构建基于r DNA-ITS序列的系统发育树(如图9)，发现供试菌与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)在100％Boostrap水平相聚于同一群。因此，表明从桑椹白化病果中分离的病原菌Z4为层出镰刀菌。

3讨论

桑椹白化病多是由致病菌感染所致，引起该病害的病菌很多，已报道的桑椹白化病致病菌有核盘菌、桑实杯盘菌、桑椹核地杖菌、肉阜状杯盘菌、桑茎点霉等。发病后，桑椹由于感染菌的不同所导致的发病情况和症状也不尽相同^[1,32]。

本发明在研究桑椹白化病果时，分离得到一株疑似致病菌。通过对其形态特征、培养性状的研究，初步鉴定为镰刀菌，但由于镰刀菌形态复杂，又易受外界环境影响发生变异，通过形态学观察很难准确鉴定到种。因此需借助分子鉴定手段。其中ITS基因片段具有高度的保守性，且介于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，现已被广泛的用于植物病原真菌的鉴定和分类。相比较ITS基因，EF-1a基因在镰刀菌基因组中为单一拷贝，其在镰刀菌种的水平上有丰富的遗传进化信息，且表现出较高的保守性，是镰刀菌鉴定的有效工具^[26,33]。本发明结合ITS基因和EF-1a基因序列分析，完成了桑椹白化病果病原菌的分子鉴定，确定了该病原菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。然后，根据柯赫氏法则，通过实验室活体叶片接种和田间桑椹接种结果表明，该菌具有较强的侵染能力，不仅对桑椹具有致病性，同时也会导致桑叶的发病。查阅相关文献可知,本发明的层出镰刀菌侵染所致的桑椹白化病是该菌在桑椹上的首次报道,将其定名为桑椹层出镰刀菌白化病。这为桑椹白化病的田间诊断提供了理论依据，丰富了桑椹白化病的病原菌库，同时也为下一步开展对桑椹白化病的发病规律及防治方法的研究具有重要意义。

1、核苷酸序列：

EF引物

CCTTTAGTCGTCGTCATCGGCCACGTCGACTCTGGCAAGTCGACCACTGTGAGTACTACCCTGGACGTTGAGCTTATCTGCCATCGTGATCCTGACCAAGATCTGGCGGGGTACATCTTGGAAGACAACATGCTGACATCGCTTCACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATCGACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTAGTCACTTTCCCTTCGATCGCGCGTCCTCTGCCCACCGATTTCACTTGCGATTCGAAACGTGCCTGCTACCCCGCTCGAGACCAAAAATTTTGCGATATGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCATTTACCCCGCCACTCGAGCGATGGGCGCGTTTTTGCCCTTTCCTGTCCACAACCTCAATGAGCGCATTGTCACGTGTCAAGCAGCGACTAACCATTCGACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGATATTGCTCTCTGGAAGTTCGAGACTCCTCGCTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGTCGCTCATACCTCATCCTACTTCCTCATACTAACACATCATTCAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCATGGGTTACTTTCCA

ITS引物

AAGGTCTCGTTGGTGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGCAGGAAA

2、菌种培养方法

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯浸粉3克，葡萄糖20克，琼脂14克，蒸馏水1升。28℃培养。4℃冰箱保藏。

3、致病作用：导致桑椹发生白化病。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtaagg aagacaagac 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagtacca gtgatcatgt t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 5

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctttagtcg tcgtcatcgg ccacgtcgac tctggcaagt cgaccactgt gagtactacc 60

ctggacgttg agcttatctg ccatcgtgat cctgaccaag atctggcggg gtacatcttg 120

gaagacaaca tgctgacatc gcttcacaga ccggtcactt gatctaccag tgcggtggta 180

tcgacaagcg aaccatcgag aagttcgaga aggttagtca ctttcccttc gatcgcgcgt 240

cctctgccca ccgatttcac ttgcgattcg aaacgtgcct gctaccccgc tcgagaccaa 300

aaattttgcg atatgaccgt aatttttttg gtggggcatt taccccgcca ctcgagcgat 360

gggcgcgttt ttgccctttc ctgtccacaa cctcaatgag cgcattgtca cgtgtcaagc 420

agcgactaac cattcgacaa taggaagccg ctgagctcgg taagggttcc ttcaagtacg 480

cctgggttct tgacaagctc aaggccgagc gtgagcgtgg tatcaccatc gatattgctc 540

tctggaagtt cgagactcct cgctactatg tcaccgtcat tggtatgttg tcgctcatac 600

ctcatcctac ttcctcatac taacacatca ttcagacgct cccggtcacc gtgatttcat 660

caagaacatg atcatgggtt actttcca 688

<210> 6

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggtctcgt tggtgaccag cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaacccctg 60

tgaacatacc aattgttgcc tcggcggatc agcccgctcc cggtaaaacg ggacggcccg 120

ccagaggacc cctaaactct gtttctatat gtaacttctg agtaaaacca taaataaatc 180

aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag caaaatgcga 240

taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 300

gccagtattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcaag cccccgggtt 360

tggtgttggg gatcggcgag cccttgcggc aagccggccc cgaaatctag tggcggtctc 420

gctgcagctt ccattgcgta gtagtaaaac cctcgcaact ggtacgcggc gcggccaagc 480

cgttaaaccc ccaacttctg aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt 540

aagcatatca atagccgcag gaaa 564

Claims

1.一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、病原菌的分离

在无菌操作环境下，将桑椹病果用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分后，置于75％的酒精中浸泡几秒钟，在酒精灯火焰上灼烧一下，之后使用无菌刀片划开病果，将其切成小块，用无菌镊子取病果中间的小块置于PDA培养基上，每个培养基上放置4-5块,25℃恒温培养箱中暗培养；待菌落长出后根据菌落特征，采用顶端菌丝挑取法进行纯化，并将纯化的单一菌株移入PDA斜面培养基，4℃保藏备用；

步骤2、致病性检测

2.1实验室活体叶片接种将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3-5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况；以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异；

2.2田间桑椹接种在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响；每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况；以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离；

步骤3、分离菌株的鉴定

3.1形态学鉴定将保存的菌株Z4转接于PDA培养基上复苏活化后，用打孔器打取直径6mm的菌饼接入新的PDA培养基上,28℃培养，每天观察并记录纯化菌株的菌落形态、颜色及生长情况，并使用光学显微镜观察其大、小分生孢子的显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定；

3.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株基因组DNA，以其为模板，分别用真菌EF-1ɑ：EF-1H：5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3'，EF-2T：

5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3'和ITS：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'基因通用引物进行PCR扩增；扩增体系为25μl，其中模板DNA1μl，上下引物各1μl，ddH₂O10μl，Taq Mix12μl；扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序；获得的EF-1ɑ序列和ITS序列分别在GenBank数据库中进行数据库比较，下载同源性较高的序列，利用MEGA5.0软件，使用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

2.根据权利要求1所述的分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基为：马铃薯浸粉3克，葡萄糖20克，琼脂14克，蒸馏水1升；所述合成低营养琼脂SNA培养基为：磷酸二氢钾1克，硝酸钾0.5克，葡萄糖0.2克，蔗糖0.2克，琼脂15克，蒸馏水1升。