CN116926235B - 镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了“镰孢菌RPA‑CRISPR/Cas检测试剂盒和方法”，属于分子检测技术，其中Cas蛋白为Cas12，所述试剂盒包括RPA引物和crRNA，所述镰孢菌包括层出镰孢菌，层出镰孢菌的RPA引物和crRNA分别为引物组合FproF2/FproR3、Fp‑crRNA2；本发明针对分布广、分离频率高、致病性强的玉米茎腐病病原菌，开发基于重组酶聚合酶扩增技术结合CRISPR/Cas12a的玉米茎腐病病原菌现场可视化快速检测技术，该技术可在37‑42℃恒温条件下进行反应，无需复杂的仪器设备，CRISPR/Cas12a可识别并切割特定核酸序列，从而在RPA基础上进一步增加了检测的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测试剂盒和方法。
背景技术
玉米是世界上第一大作物，也是我国最重要的粮食作物之一。玉米茎腐病作为严重威胁我国玉米生产的土传病害，已在我国20多个玉米生产省区相继发生报道，一般年份发病率为15%~20%，严重时可达70%以上，由此病害导致的产量损失在20%左右，严重时可达50%以上，其已成为影响我国区域玉米机械化采收前倒伏和籽粒损失的重要因素，并对国家构建粮食安全体系及保障区域玉米安全生产造成不利影响。
国内外大量研究表明，引起玉米茎腐病的病原菌种类比较多，目前已知的有30余种，我国主要分为肿囊腐霉Pythium inflatum和禾谷镰孢Fusarium graminearum两大类，其可由镰孢菌、腐霉菌、炭疽菌单独或复合侵染引起，且不同地区玉米茎腐病的致病菌存在差异。2017年，贺娟等报道禾谷镰孢F. graminearum和拟轮枝镰孢F. verticillioides是云南省玉米茎腐病的优势种群；2019年，刘树森等研究黄淮海夏玉米主产区茎腐病，认为河北省以拟轮枝镰孢菌F. verticillioides检出率最高，山东省以层出镰孢F. proliferatum和芒孢腐霉P. aristosporum为优势种；同年，郭成发现甘肃省四大生态区中禾谷镰孢复合种F. graminearum speciescomplex和拟轮枝镰孢F. verticillioides为玉米茎腐病的优势病原菌。2020-2021年，宋子硕在新疆共采集335株玉米茎腐病病样，共得到601个分离物，其中镰孢菌560株，占比93.18%，其中拟轮枝镰孢菌F. verticillioides、层出镰孢菌F. proliferatum、禾谷镰孢菌F. graminearum、尖孢镰刀菌F. oxysporum、腐皮镰孢菌F. solani为主要优势致病菌。
重组酶聚合酶扩增 (Recombinase polymerase amplification，RPA)是Piepenburg等人在2006年利用参与细胞DNA合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。与常规PCR需要仪器进行循环扩增不同的是，RPA在37~42℃条件下操作，只需少量的样本制备，即可在10 min内扩增低至1-10个DNA拷贝，具有高灵敏度、可选择性、便携性、快速与可以进行多重扩增等优点。目前已经广泛应用于扩增多种不同靶标，包括RNA、miRNA、ssDNA和dsDNA。RPA反应利用重组酶与寡核苷酸引物形成蛋白-DNA复合物，能够在双链DNA中寻找同源序列。一旦定位了同源序列，就会发生链置换反应形成并启动DNA合成，对模板上的靶标进行指数式扩增。单链DNA结合 (SSB) 蛋白与置换的DNA链结合并形成的D环，防止进一步替换。整个扩增反应迅速，从几个目标DNA拷贝开始，在几分钟内即可达到可检测的水平。
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一套来源于细菌和古细菌的免疫系统，识别并抵御外源性核酸。研究人员发现Cas12和Cas13家族具备collateral cleavage能力（或称为cleavagein trans），即Cas蛋白-crRNA二元复合体识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意底物。基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术结合成簇规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白系统（CRISPR associated enzyme systems，Cas蛋白）——CRISPR/Cas蛋白的分子检测技术的原理是：底物DNA或RNA首先经RPA或RT-RPA(Reverse transcription RPA)扩增，提高底物浓度；随后，转录酶将扩增后的DNA转录为RNA，并与RNA内切核酸酶、crRNA反应液混合。当Cas蛋白-crRNA复合体识别底物RNA后，发生顺式切割和反式切割，最后根据实验需求选择合适的检测方法，如电泳、实时荧光、比色法等进行检测分析。
关于镰孢菌的检测已有采用RPA检测的报道，但其检测的特异性和灵敏度有限。目前鲜有采用RPA联合CRISPR/Cas检测镰孢菌的报道。
发明内容
本发明的目的之一是针对上述问题，提供一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测试剂盒，Cas蛋白为Cas12，所述试剂盒包括RPA引物和crRNA，所述镰孢菌包括层出镰孢菌，层出镰孢菌的RPA引物和crRNA分别为引物组合FproF2/FproR3、Fp-crRNA2，序列如下：
FproF2: 5’-CGCGTCCTCTGCCCACCGATTTCACTTG-3’，
FproR3: 5’-AGCGGCTTCCTATTGTCGAATGGTTAGTCG-3’，
Fp-crRNA2: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCUCGAGCGGGGUAGCAGGC。
优选地，所述镰孢菌还包括拟轮枝镰孢菌和/或禾谷镰孢菌，
所述拟轮枝镰孢菌的RPA引物和crRNA分别为引物组合FverF1/FverR1、Fv-crRNA，序列如下：
FverF1：5’-GATTTCTCAAAGAAAACATGCTGACATCGC-3’，
FverR1：5’-AGCTCAGTGAGGTTGTGGAATGGGAGAGGGCAG-3’，
Fv-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCAUCGAUUCCCCCCUACGAC；
所述禾谷镰孢菌的RPA引物和crRNA分别为引物组合FgraF2/FgraR2、Fg-crRNA，序列如下：
FgraF2: 5’-GGGCGCTCATCATCACGTGTCAACCAGTC-3’，
FgraR2: 5’-CCATGTTAGTATGAGAATGTGATGACAGCAGTG-3’，
Fg-crRNA: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCUUGUCAAGAACCCAGGC。
优选地，所述的试剂盒还包括信号报告分子，所述信号报告分子的序列为：5’-TTATTATT-3’或5’-TTTTTTTTTT-3’；
优选所述信号报告分子的5’端标记荧光报告基团，3’端标记生物素亲和基团，或者，所述信号报告分子的两端分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团用于荧光信号检测，优选所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地，所述的试剂盒还包括RPA扩增试剂，所述RPA扩增试剂包含：RPA酶、MgOAc。
优选地，所述的试剂盒还包括CRISPR/Cas检测试剂，所述CRISPR/Cas检测试剂包含：cas12a蛋白、RNAse抑制剂、DTT，
所述cas12a蛋白选自AsCas12a、Lb4Cas12a、Lb5Cas12a、FnCas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a和BoCas12a，
优选所述cas12a蛋白为LbaCas12a。
本发明的再一目的是提供上述任一项所述的试剂盒在检测镰孢菌中的应用，所述镰孢菌包括层出镰孢菌。
本发明的再一目的是提供一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测方法，利用上述任一项所述的试剂盒检测，包括如下步骤：
S1、提取待测样本的DNA；
S2、RPA扩增：配制RPA反应体系，通过RPA方法扩增上述提取得到的待测样本的DNA，得扩增产物；
S3、CRISPR/Cas系统反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告分子、cas蛋白和crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。
在上述的镰孢菌RPA-CRISPR/Cas检测方法的技术方案中，所述RPA扩增的反应体系包括28.5~30.5 μL 补液缓冲液、10.5~12 μL ddH2O、10 μM的上下游引物各1~3 μL、RPA酶冻干粉、1~3 μL 模板DNA、1.5~3.5 μL 浓度为280 μmol/L的MgOAc；优选为29.5 μL 补液缓冲液、11.2 μL ddH2O、10 μM的上下游引物各2.4 μL、RPA酶冻干粉、2 μL 模板DNA、2.5 μL 浓度为280 μmol/L的MgOAc；RPA扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；
所述CRISPR/Cas系统反应的反应体系包括：NEBuffer 1.5~2.5 μL、5 μMLbaCas12a 0.8~1.2 μL、40U/μL RNAse Inhibitor 0.4~0.6 μL、0.1 M DTT 0.4~0.6 μL、10 μM信号报告分子1.5~2.5 μL和10 μM crRNA 0.8~1.2 μL；所述CRISPR/Cas系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；
所述读取检测信号采用实时定量PCR仪读取荧光信号或者采用CRISPR/Cas试纸条判断结果。
本发明的最后一目的是提供另一种检测方法：一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas一步法检测方法，利用前述任一项所述的试剂盒检测，包括如下步骤：
提取待测样本的DNA作为模板DNA；将模板DNA和RPA反应体系加入PCR管中，将CRISPR/Cas系统反应体系滴加在PCR管的管盖内部，盖上管盖，将PCR管置于RPA反应温度下进行RPA扩增，之后甩动PCR管或简短离心使管盖内的CRISPR/Cas系统反应体系溶液完全进入PCR管内的RPA扩增产物溶液中，再将PCR管置于CRISPR/Cas系统反应温度下反应，反应完毕读取检测信号，即得。
在上述的一步法检测方法的技术方案中，所述RPA扩增的反应体系包括5.7~6.1 μL 补液缓冲液、2.1~2.4 μL ddH2O、10 μM的上下游引物各0.2~0.6 μL、RPA酶冻干粉、0.2~0.6 μL 模板DNA、0.3~0.7 μL浓度为280 μmol/L的MgOAc；RPA扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；
所述CRISPR/Cas系统反应的反应体系包括：NEBuffer 1.5~2.5 μL、5 μMLbaCas12a 0.8~1.2 μL、40U/μL RNAse Inhibitor 0.4~0.6 μL、0.1 M DTT 0.4~0.6 μL、10 μM信号报告分子1.5~2.5 μL和10 μM crRNA 0.8~1.2 μL；所述CRISPR/Cas系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；
所述读取检测信号采用实时定量PCR仪读取荧光信号或者采用CRISPR/Cas试纸条判断结果。
本发明的有益效果是：
本发明针对分布广、分离频率高、致病性强的玉米茎腐病病原菌，开发基于重组酶聚合酶扩增技术结合CRISPR及CRISPR相关蛋白系统CRISPR/Cas12a的玉米茎腐病病原菌现场可视化快速检测技术。该技术可在37-42℃恒温条件下进行反应，无需复杂的仪器设备，CRISPR/Cas12a可识别并切割特定核酸序列，从而在RPA基础上进一步增加了检测的特异性和灵敏度。
附图说明
图1是RPA引物RPA反应产物的电泳检测结果，其中，图A是拟轮枝镰孢菌的特异性引物检测结果，图B是层出镰孢菌的的特异性引物检测结果，图C是FgraF1/FgraR1 RPA电泳检测结果，图D是禾谷镰孢菌的的特异性引物检测结果；图A-D中，泳道从左至右依次为：D2000 Marker、表1中序号1-8的样品。
图2是拟轮枝镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a的试纸条检测结果。
图3是层出镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a的试纸条检测结果。
图4是禾谷镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a的试纸条检测结果。
图5是总反应时间20min时一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度检测结果，其中，图A是拟轮枝镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：78.4 ng/μL、7.84 ng/μL、784 pg/μL、78.4 pg/μL、7.8 pg/μL、0.78 pg/μL；图B是层出镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：104.9 ng/μL、10.49 ng/μL、1.049 ng/μL、0.11 ng/μL、11 pg/μL；图C是禾谷镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：130.2 ng/μL、13.02 ng/μL、1.302 ng/μL、0.13 ng/μL、13 pg/μL。
图6是总反应时间30min时一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度检测结果，其中，图A是拟轮枝镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：78.4 ng/μL、7.84 ng/μL、784 pg/μL、78.4 pg/μL、7.8 pg/μL、0.78 pg/μL、78 fg/μL；图B是层出镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：104.9 ng/μL、10.49 ng/μL、1.049 ng/μL、0.11 ng/μL、11 pg/μL、1.1 pg/μL；图C是禾谷镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：130.2 ng/μL、13.02 ng/μL、1.302 ng/μL、0.13 ng/μL、13 pg/μL、1.3 pg/μL。
图7是总反应时间40min时一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的灵敏度检测结果，其中，图A是拟轮枝镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：78.4 ng/μL、7.84 ng/μL、784 pg/μL、78.4 pg/μL、7.8 pg/μL、0.78 pg/μL、78 fg/μL、7.8 fg/μL；图B是层出镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：104.9 ng/μL、10.49 ng/μL、1.049 ng/μL、0.11 ng/μL、11 pg/μL、1.1 pg/μL、0.11pg/μL、11 fg/μL；图C是禾谷镰孢菌检测结果，试纸条上模板浓度从左至右依次是：130.2 ng/μL、13.02 ng/μL、1.302 ng/μL、0.13 ng/μL、13 pg/μL、1.3 pg/μL、0.13 pg/μL、13 fg/μL。
图2-7中，试纸条上位于上方的条带是检测带，位于下方的条带是质控带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本发明实施例中实验用菌株来源如表1中所示：
表1
实施例1、引物设计、筛选及RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立
一、目标种RPA引物和crRNA设计
根据GenBank中目标物种（拟轮枝镰孢菌F. verticillioides、层出镰孢菌F. proliferatum和禾谷镰孢菌F. graminearum）与近缘物种的翻译延伸因子基因（Translation Elongation Factor 1 alpha，TEF-1α），设计目标物种的RPA引物和crRNA。为提高引物和crRNA特异性，根据镰孢菌的亲缘关系，选择多个目标物种及其近缘物种的不同单倍型序列进行序列比对分析，根据SNP位点，人工设计RPA特异性引物和crRNA，引物和crRNA设计所用TEF-1α基因序列如表2所示。引物和crRNA由北京擎科生物科技股份有限公司合成。
表2
表2中的物种都是镰刀属物种，属于同属近缘种。其中，拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides与尖孢镰刀菌F. oxysporum、亚粘团镰孢菌F. subglutinans和层出镰孢菌F. proliferatum属同一单系群的近缘物种；禾谷镰孢菌Fusarium graminearum与半裸镰孢菌F. incarnatum、木贼镰孢菌F. equiseti、黄色镰孢菌F. culmorum属同一单系群的近缘物种。
通过DNAMAN软件进行表2的多序列比对，找到了目标物种与其近缘物种的TEF-1α基因的SNP位点。同时，检测了本实验室所保存的拟轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、禾谷镰孢菌菌株的TEF-1α基因序列以进一步确认菌种的正确性，并根据找到的SNP位点，利用所测得的TEF-1α基因序列人工设计RPA特异性引物和crRNA。拟轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、禾谷镰孢菌菌株的TEF-1α基因序列依次如SEQ ID NO.1~3所示。
设计的RPA特异性引物和crRNA的序列如下所示：
1、拟轮枝镰孢菌：
FverF1（SEQ ID NO.4）: 5’-GATTTCTCAAAGAAAACATGCTGACATCGC-3’，引物设计位置为112-141bp区间。
FverF2（SEQ ID NO.5）:
5’-TCCTTCTATCGCGCGTTCTTTGCCCATCGATTC-3’，引物设计位置为224-256 bp区间。
FverR1（SEQ ID NO.6）:
5’-AGCTCAGTGAGGTTGTGGAATGGGAGAGGGCAG-3’，引物设计位置为368-400 bp区间。
针对目标序列，设计crRNA如下，下划线标注靶序列结合区，粗体标注部分可与cas12a蛋白结合：
Fv-crRNA（SEQ ID NO.7）:
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCCAUCGAUUCCCCCCUACGAC。
2、层出镰孢菌：
FproF1（SEQ ID NO.8）: 5’-GATCCTGACCAAGATCTGGCGGGGTACATCTTGG-3’，引物设计位置为92-125 bp区间。
FproF2（SEQ ID NO.9）:
5’-CGCGTCCTCTGCCCACCGATTTCACTTG-3’，引物设计位置为240-267 bp区间。
FproR1（SEQ ID NO.10）:
5’-CACGTTTCGAATCGCAAGTGAAATCGGTGGGCAG-3’，引物设计位置为248-281 bp区间。
FproR2（SEQ ID NO.11）:
5’-CGCTGCTTGACACGTGACAATGCGCTCATTGAGGTTGTGGAC-3’，引物设计位置为387-428 bp区间。
FproR3（SEQ ID NO.12）:
5’-AGCGGCTTCCTATTGTCGAATGGTTAGTCG-3’，引物设计位置为427-456 bp区间。
针对目标序列，设计crRNA如下，下划线标注靶序列结合区，粗体标注部分可与cas12a蛋白结合：
Fp-crRNA1（SEQ ID NO.13）:
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCUUCGAUCGCGCGUCCUCUG，
Fp-crRNA2（SEQ ID NO.14）:
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCUCGAGCGGGGUAGCAGGC。
3、禾谷镰孢菌：
FgraF1（SEQ ID NO.15）:
5’-TGTGAGTACCACCGCATCCCAACCCCGCCGACAC-3’，引物设计位置为56-89 bp区间。
FgraF2（SEQ ID NO.16）:
5’-GGGCGCTCATCATCACGTGTCAACCAGTC-3’，引物设计位置为403-431 bp区间。
FgraR1（SEQ ID NO.17）:
5’-GACGACTGTCGCTCGAGTGGCAGGGTATGAGCCCCAACGG-3’，引物设计位置为337-376bp区间。
FgraR2（SEQ ID NO.18）:
5’-CCATGTTAGTATGAGAATGTGATGACAGCAGTG-3’，引物设计位置为602-634 bp区间。
针对目标序列，设计crRNA如下，下划线标注靶序列结合区，粗体标注部分可与cas12a蛋白结合：
Fg-crRNA（SEQ ID NO.19）:
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCUUGUCAAGAACCCAGGC。
二、引物筛选及RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立
1、DNA提取
供试菌株用高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350）（天根生化科技（北京）有限公司）提取DNA，采用Nanodrop超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）对DNA进行准确定量。
2、引物筛选
采用TwistDX公司（英国）的TwistAmp® Basic RPA试剂盒（货号：TABAS03KIT）进行RPA反应，反应体系参考试剂盒说明书，具体配比为：分别将29.5 μL 补液缓冲液、11.2 μL ddH2O、上下游引物（10 μM）各2.4 μL加入到RPA酶冻干粉中，待干粉溶解后，加入2 μL 模板DNA，最后加入2.5 μL MgOAc（280 μmol/L），混匀后放入金属浴中，39℃孵育20 min。将RPA反应产物与Tris饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合，12000 rpm离心5 min，取5 μL上清液电泳检测RPA产物，筛选特异性强的RPA引物。
采用前面设计的引物对表1的菌株按照上述步骤进行RPA反应：
拟轮枝镰孢菌分别采用了引物组合FverF1/FverR1、FverF2/FverR1进行RPA反应，在模板浓度、反应时间、引物等各试剂浓度均相同的条件下，FverF2/FverR1的扩增条带颜色浅、其扩增效率低、灵敏度不高；而FverF1/FverR1的扩增产物其电泳条带亮度高、条带明显，表明引物扩增效率高、灵敏度高，因此选择FverF1/FverR1进行后续实验，采用FverF1/FverR1对表1中序号1-8的样品进行RPA反应，只有拟轮枝镰孢菌扩增出条带，表明FverF1/FverR1对拟轮枝镰孢菌具有特异性（图1A）。
层出镰孢菌分别采用了引物组合FproF1/FproR1、FproF1/FproR2、FproF2/FproR3进行RPA反应，三对引物均仅对层出镰孢菌扩增出了特异条带。但在后续CRISPR/Cas切割实验中，发现FproF1/FproR1/Fp-crRNA1和FproF1/FproR2/Fp-crRNA1切割效率低、实验结果不稳定，在模板浓度最高的情况下，CRISPR/Cas切割体系需要反应1个小时以上才能显示出检测带，而FproF2/FproR3/Fp-crRNA2则在切割10min时即能在试纸条上显示出清晰的检测带，因此确定以FproF2/FproR3进行后续的实验。采用FproF2/FproR3对表1中序号1-8的样品进行RPA反应，只有层出镰孢菌扩增出条带，表明FproF2/FproR3对层出镰孢菌具有特异性（图1B）。
禾谷镰孢菌分别采用了引物组合FgraF1/FgraR1、FgraF2/FgraR2进行RPA反应，FgraF1/FgraR1对禾谷镰孢菌和藤仓镰孢菌均扩增出了条带，对其他物种也有扩增杂带出现（图1C），其特异性不好。而采用FgraF2/FgraR2对表1的8个样品进行检测，其仅对禾谷镰孢菌扩增出了特异条带（图1D），而对其它物种则未能扩增出条带，表明FgraF2/FgraR2对禾谷镰孢菌具有特异性，最终确定以FgraF2/FgraR2进行后续的实验。
经过筛选，3个目标物种确定出最优引物和crRNA用于后续实验：拟轮枝镰孢菌采用FverF1/FverR1/Fv-crRNA，层出镰孢菌采用FproF2/FproR3/Fp-crRNA2，禾谷镰孢菌采用FgraF2/FgraR2/Fg-crRNA。
3、CRISPR/Cas12a检测体系的建立
CRISPR/Cas12a检测体系采用New England Biolabs公司（英国）的EnGen®LbaCas12a（Cpf1）核酸酶及配套试剂。采用Tiosbio®Cas12/13专用核酸检测试纸条（北京宝盈同汇生物技术有限公司，中国）进行可视化检测。
拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides的CRISPR/Cas12a检测体系包括12.2 μL DEPC-H2O、2 μL NEBuffer、0.4 μL LbaCas12a（Cpf1）（5 μM）、0.5 μL RNAse Inhibitor（RNAse抑制剂）（40U/μL）、0.5 μL DTT（0.1 M）、2 μL报告分子（10 μM）、0.4 μL crRNA（10 μM）、2 μL RPA反应产物，混匀后放入金属浴中，37℃孵育20 min。反应完成后，加入80 μL去离子水，混合均匀后，将试纸条样品端浸于反应液中，观察条带。其中，报告分子的序列为5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’ 或5’-FAM-TTTTTTTTTT-Biotin-3’ (SEQ ID NO.20)，经实验验证这两个报告分子均能应用于本实施例中。
层出镰孢菌Fusarium proliferatum和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum的CRISPR/Cas12a检测体系包括12.2 μL DEPC-H2O、2 μL NEBuffer、1 μL LbaCas12a（Cpf1）（5 μM）、0.5 μL RNAse Inhibitor（40U/μL）、0.5 μL DTT（0.1 M）、2 μL报告分子（FAM-TTATTATT-Biotin或FAM-TTTTTTTTTT-Biotin）（10 μM）、1 μL crRNA（10 μM）、2 μL RPA反应产物，混匀后放入金属浴中，37℃孵育20 min。反应完成后，加入80 μL去离子水，混合均匀后，将试纸条样品端浸于反应液中，观察条带。
采用拟轮枝镰孢菌的RPA-CRISPR/Cas12a检测体系（FverF1/FverR1/Fv-crRNA）检测表1的8个菌株，试纸条检测结果如图2所示，试纸条从左至右1-8分别代表表1中序号1-8的菌种的检测结果，从图中可以看出，仅有表1中序号1、2的拟轮枝镰孢菌显示出检测带（当扩增和切割效率高时，通常不会出现质控带），其余菌株则未出现检测带，表明该检测体系对拟轮枝镰孢菌具有特异性。
采用层出镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a检测体系（FproF2/FproR3/Fp-crRNA2）检测表1的8个菌株，试纸条检测结果如图3所示，试纸条从左至右1-8分别代表表1中序号1-8的菌种的检测结果，从图中可以看出，仅有表1中序号3的层出镰孢菌显示出检测带，其余菌株则未出现检测带，表明该检测体系对层出镰孢菌菌具有特异性。
采用禾谷镰孢菌的RPA-CRISPR/Cas12a检测体系（FgraF2/FgraR2/Fg-crRNA）检测表1的8个菌株，试纸条检测结果如图4所示，试纸条从左至右1-8分别代表表1中序号1-8的菌种的检测结果，从图中可以看出，仅有表1中序号4、5的禾谷镰孢菌显示出检测带，其余菌株则未出现检测带，表明该检测体系对禾谷镰孢菌具有特异性。
以上结果表明，只有目标物种有检测条带，其他对照物种无检测条带，说明目标物种的特异性引物和crRNA对目标物种的检测具有良好的特异性。
发明人同时对CRISPR/Cas12a不同切割时间也做了研究，底物足够的情况下，切割5分钟即能通过试纸条检测到目标物种，采用本发明确定的RPA引物，切割10分钟时均能通过试纸条检测到目标物种。
实施例2、RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的建立优化及灵敏度检测
进一步优化实施例1建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，使整个反应更加快速高效，同时大幅度降低成本。建立一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，相较于RPA完成后再加入CRISPR/Cas12a检测体系的方法，一步法节省操作的同时，还避免了开盖污染。
一、一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系
（1）拟轮枝镰孢菌的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系如下：
分别将29.5 μL 补液缓冲液、11.2 μL ddH2O、各2.4 μL上下游引物（10 μM）加入到RPA酶冻干粉中，待干粉溶解后，分装为五等份于五个PCR管中，即RPA反应体系减少至实施例1中RPA反应体系的1/5，向PCR管中加入0.5μL 模板DNA和0.5 μL MgOAc（280 μmol/L）；再将混合好的拟轮枝镰孢菌切割体系滴加在PCR管盖上，每一个PCR管管盖上的切割体系包含：2 μL NEBuffer、0.4 μL LbaCas12a（Cpf1）（5 μM）、0.5 μL RNAse Inhibitor（40U/μL）、0.5 μL DTT（0.1M）、2 μL报告分子（10 μM）和0.4 μL crRNA（10μM）。盖上管盖，将PCR管放入金属浴中，39℃孵育10~30 min（RPA反应时间），之后手动甩动PCR管或简短离心，使管盖上的溶液完全混入于反应液中，再将PCR管放入金属浴中，39℃孵育10 min（切割时间）；反应完成后，加入30 μL去离子水，混合均匀后，将试纸条样品端浸于反应液中，观察条带。
（2）层出镰孢菌和禾谷镰孢菌的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系如下：
分别将29.5 μL 补液缓冲液、11.2 μL ddH2O、各2.4 μL上下游引物（10 μM）加入到RPA酶冻干粉中，待干粉溶解后，分装为五等份于五个PCR管中，即RPA反应体系减少至实施例1中RPA反应体系的1/5，向PCR管中加入0.5μL 模板DNA和0.5 μL MgOAc（280 μmol/L）；再将混合好的层出镰孢菌或者禾谷镰孢菌切割体系滴加在PCR管盖上，每一个PCR管管盖上的切割体系包含：2 μL NEBuffer、1 μL LbaCas12a（Cpf1）（5 μM）、0.5 μL RNAseInhibitor（40U/μL）、0.5 μL DTT（0.1 M）、2 μL报告分子（10 μM）和1 μL crRNA（10 μM）。盖上管盖，将PCR管放入金属浴中，39℃孵育10~30 min（RPA反应时间），之后手动甩动PCR管或简短离心，使管盖上的溶液完全混入与反应液中，再将PCR管放入金属浴中，39℃孵育10min（切割时间）；反应完成后，加入30 μL去离子水，混合均匀后，将试纸条样品端浸于反应液中，观察条带。
二、灵敏度检测
将目标物种的模板DNA（拟轮枝镰孢菌模板浓度为78.4 ng/μL、层出镰孢菌模板浓度为104.9 ng/μL、禾谷镰孢菌模板浓度为130.2 ng/μL）分别按10倍梯度稀释，100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共8个浓度，采用前面建立的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，RPA反应时间分别为10 min、20 min和30 min，切割时间为10 min不变，确定检测灵敏度。每个浓度梯度重复3次。
灵敏度检测结果如图5-7所示：
如图5所示，总反应时间在20min内（RPA反应10 min、切割10 min），拟轮枝镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为7.8 pg/μL（图5A）、层出镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为0.11 ng/μL（图5B）、禾谷镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条灵敏度为0.13 ng/μL（图5C）。
如图6所示，总反应时间在30min内（RPA反应20 min、切割10 min），拟轮枝镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为0.78 pg/μL（图6A）、层出镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为11 pg/μL（图6B）、禾谷镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条灵敏度为13 pg/μL（图6C）。
如图7所示，总反应时间在40min内（RPA反应30 min、切割10 min），拟轮枝镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为78 fg/μL（图7A）、层出镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条检测灵敏度为0.11 pg/μL（图7B）、禾谷镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a试纸条灵敏度为0.13 pg/μL（图7C）。
实施例3、应用
将田间采集的疑似玉米茎腐病病害样品进行DNA粗提取，将病害样品的组织加入1.5 mL离心管中，向管中加入30 μL的缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH8.0），将离心管置于95℃反应5 min，取上清液为DNA模板，采用实施例2建立的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系对病害样品进行检测，总反应时间为20 min（RPA反应10 min、切割10 min）。同时，采用镰孢菌常规分离、培养基培养方法鉴定病原种类。
总共采集了5份样品，一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测及常规病原菌分离培养鉴定方法检测结果如表3所示：
表3
田间病害样品通过一步法RPA-CRISPR/Cas12a可检出拟轮枝镰孢菌、层出镰孢菌和禾谷镰孢菌，传统分离培养方法也同样分离出了三种病原菌，并且每份样品的两种方法检测结果一致，本发明建立的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测方法可实现田间玉米茎腐病病原的现场快速检测，且结果准确可靠。
Claims (8)
1.一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括RPA引物和crRNA，所述镰孢菌为层出镰孢菌，所述RPA引物为引物组合FproF2和FproR3，crRNA为Fp-crRNA2，序列如下：
FproF2: 5’-CGCGTCCTCTGCCCACCGATTTCACTTG-3’，
FproR3: 5’-AGCGGCTTCCTATTGTCGAATGGTTAGTCG-3’，
Fp-crRNA2: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCUCGAGCGGGGUAGCAGGC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括信号报告分子，所述信号报告分子的序列为：5’-TTATTATT-3’或5’-TTTTTTTTTT-3’。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RPA扩增试剂，所述RPA扩增试剂包含：RPA酶、MgOAc。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括CRISPR/Cas12a检测试剂，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包含：Cas12a蛋白、RNAse抑制剂、DTT，
所述Cas12a蛋白选自AsCas12a、Lb4Cas12a、Lb5Cas12a、FnCas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a和BoCas12a。
5.一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，其特征在于，利用权利要求1至4任一项所述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
S1.提取待测样本的DNA；
S2.利用权利要求1至4任一项所述的试剂盒中的RPA引物进行RPA扩增：配制RPA反应体系，通过RPA方法扩增上述提取得到的待测样本的DNA，得扩增产物；
S3.利用权利要求1至4任一项所述的试剂盒中的Fp-crRNA2进行CRISPR/Cas12a系统反应检测：取上述扩增产物，加入信号报告分子、Cas12a蛋白和Fp-crRNA2，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：
所述RPA扩增的反应体系包括28.5~30.5 μL补液缓冲液、10.5~12 μL ddH2O、10 μM的引物FproF2和FproR3各1~3 μL、RPA酶冻干粉、1~3 μL 模板DNA、1.5~3.5 μL 浓度为280 μmol/L的MgOAc；RPA扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；
所述CRISPR/Cas12a系统反应的反应体系包括：NEBuffer 1.5~2.5 μL、5 μMLbaCas12a 0.8~1.2 μL、40 U/μL RNAse Inhibitor 0.4~0.6 μL、0.1 M DTT 0.4~0.6 μL、10 μM信号报告分子1.5~2.5 μL和10 μM Fp-crRNA2 0.8~1.2 μL；所述CRISPR/Cas12a系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；
所述读取检测信号采用实时定量PCR仪读取荧光信号或者采用CRISPR/Cas12a试纸条判断结果。
7.一种镰孢菌RPA-CRISPR/Cas12a一步法检测方法，其特征在于：利用权利要求1至4任一项所述的试剂盒检测，包括如下步骤：
提取待测样本的DNA作为模板DNA；将模板DNA和RPA扩增试剂加入PCR管中，将CRISPR/Cas12a系统反应体系滴加在PCR管的管盖内部，盖上管盖，将PCR管置于RPA反应温度下进行RPA扩增，之后甩动PCR管或简短离心使管盖内的CRISPR/Cas12a系统反应体系溶液完全进入PCR管内的RPA扩增产物溶液中，再将PCR管置于CRISPR/Cas12a系统反应温度下反应，反应完毕读取检测信号，即得。
8.根据权利要求7所述的一步法检测方法，其特征在于：
所述RPA扩增的反应体系包括5.7~6.1 μL 补液缓冲液、2.1~2.4 μL ddH2O、10 μM的引物FproF2和FproR3各0.2~0.6 μL、RPA酶冻干粉、0.2~0.6 μL 模板DNA、0.3~0.7 μL浓度为280 μmol/L的MgOAc；RPA扩增的反应条件是：37~42℃反应10~30 min；
所述CRISPR/Cas12a系统反应的反应体系包括：NEBuffer 1.5~2.5 μL、5 μMLbaCas12a 0.8~1.2 μL、40 U/μL RNAse Inhibitor 0.4~0.6 μL、0.1 M DTT 0.4~0.6 μL、10 μM信号报告分子1.5~2.5 μL和10 μM Fp-crRNA2 0.8~1.2 μL；所述CRISPR/Cas12a系统反应条件是：37~42℃反应5~30 min；
所述读取检测信号采用实时定量PCR仪读取荧光信号或者采用CRISPR/Cas12a试纸条判断结果。
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