CN116178518A

CN116178518A - 一种抗原多肽及其应用

Info

Publication number: CN116178518A
Application number: CN202111422800.9A
Authority: CN
Inventors: 赵巍; 张婷瑞; 徐士梅; 朱明星; 赵殷奇
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本发明提供了一种抗原多肽、一种编码抗原多肽的核酸、一种包含核酸的表达载体、一种包含抗原多肽、核酸或表达载体的细胞，以及一种包虫病的疫苗及其制备方法。本申请所述的抗原多肽可以诱导免疫应答，诱导特异性B细胞增殖。

Description

一种抗原多肽及其应用

技术领域：

本发明属于免疫生物学技术领域，具体涉及一种抗包虫病重组蛋白P29抗原多肽及其应用。

背景技术：

包虫病是一种寄生虫蚴虫感染人体或者家畜而引发的严重危害人畜健康的慢性感染性疾病，该病广泛的流行于世界各地畜牧业发达地区，包虫病的疫苗研究起步较晚，水平也相对滞后。到目前为止，包虫病的疫苗在国内外还没有一个成功转化为商品的疫苗上市。现有研究表明，细粒棘球蚴重组蛋白P29(rEg.P29)具有抗原性，在以小鼠及绵羊为感染模型的抗包虫病实验中均能够诱导动物免疫系统产生以Th1型细胞为主的免疫应答反应，rEg.P29免疫绵羊后，保护性免疫力即免于被感染的绵羊比例为94.5％，rEg.P29免疫小鼠后，再用原头蚴腹腔注射攻击小鼠，得到96.6％的保护性免疫力rEg.P29具有作为包虫病疫苗转化应用的可能性。

目前已经公开了多种与防治包虫病有关的蛋白或相关防治疫苗，例如专利CN113214374A和专利CN113214373A公开了两种包虫病新抗原，Cystatin蛋白和Murinoglobulin-2蛋白；专利CN105343873A公开了一种抗绵羊包虫病感染的基因rEg.P29分子工程疫苗及其制备方法和应用；专利CN106397610A公开了一种细粒棘球蚴多表位融合诊断抗原蛋白的制备方法及其应用，该方法是将抗原表位按照一定顺序串联，制备一种诊断性抗原。尽管兽医许可的大多数疫苗使用的是整个减毒或灭活的病原体，但事实上，大多数病原体蛋白质对于实现完全的保护性反应是不必要的，而且其中一些蛋白质可能还导致不必要的副作用，如过敏、自身免疫和脱靶反应。因此，设计生产基于表位的疫苗十分必要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种抗原多肽，该抗原多肽具有诱导淋巴细胞活化及增殖的效果。而且，冻干的肽的化学上比较稳定，采用该抗原多肽制备的疫苗在常规的冷链储存运输下依然稳定。更重要的是，通常情况下多肽的活化特异性细胞以及促进细胞增殖方面的效果都会弱于完整的蛋白，但是本申请提供的抗原多肽基本跟完整的蛋白效果接近。

本发明的第一方面，提供了一种抗原多肽，所述的抗原多肽来源于包虫病重组蛋白或其片段。

优选的，所述的包虫病选自多房棘球绦虫或细粒棘球绦虫感染所致。

优选的，所述的抗原多肽包含包虫病重组蛋白上的表位。

优选的，所述的抗原多肽来源于细粒棘球蚴重组蛋白rEg.P29上的表位。

进一步优选的，所述的抗原多肽来源于细粒棘球蚴重组蛋白rEg.P29上的B细胞抗原表位。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原多肽选自一个或多个SEQID NO：2的B细胞抗原表位。

所述的B细胞抗原表位为可以与BCR或者抗体结合的肽段。

优选的，所述的B细胞抗原表位可以为SEQID NO：2上一段连续、不连续的氨基酸序列。

优选的，所述的B细胞抗原表位可以为SEQID NO：2组成的重组蛋白上的空间上相邻的氨基酸残基组成。

优选的，所述的抗原多肽上包含至少一个抗原表位。

优选的，所述的抗原多肽包含SEQID NO：2中至少连续8个氨基酸。进一步优选的，所述的抗原多肽长度小于238aa。

优选的，所述抗原多肽包含SEQID NO：2中连续8-20个氨基酸，具体为连续8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸。

优选的，所述的抗原多肽包括：

A)SEQ ID NO：3-SEQID NO：26中的一种或两种以上的氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：26中的一种或两种以上的氨基酸序列同一性为80％以上；

C)与SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：26中的一种或两种以上的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

D)SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：26中的一种或两种所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的抗原多肽包含一个B细胞抗原表位，优选为SEQ ID NO：3-SEQIDNO：26中的任一种所示。

优选的，所述的抗原多肽包含2个以上B细胞抗原表位，优选为SEQ ID NO：3-SEQIDNO：26中的两种以上。其中，所述的两种以上的B细胞抗原表位直接连接或者通过接头连接。

更进一步优选的，所述抗原多肽包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列。

更优选地，所述抗原多肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：22所示的序列。

本发明的第二方面，提供了一种编码上述抗原多肽的核酸。

本发明的第三方面，提供了一种包含上述核酸的表达载体。

优选的，所述的表达载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如启动子、终止子或酶切位点等等。

优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体、真核表达载体或病毒表达载体，优选为原核表达载体，例如大肠杆菌系列。

优选的，所述的表达载体可以为质粒、粘粒、噬菌体或病毒等。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述的抗原多肽、上述的核酸或上述的表达载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了一种上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体或上述的细胞在制备治疗或预防包虫病的产品中的应用。

优选的，所述的“产品”包括但不限于疫苗、抗体、药物、试剂盒；优选地，所述的产品为疫苗和/或抗体。

本发明的第六方面，提供一种包虫病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括检测上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体或上述的细胞的试剂。

本发明的第七方面，提供了一种包虫病的疫苗，所述的疫苗包括上述的抗原多肽、上述核酸、上述表达载体或上述细胞，以及免疫学上可接受的载体。

优选的，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂等等。

优选的，所述佐剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)、CpG、铝盐佐剂(氢氧化铝或者磷酸铝)、LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子、GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

进一步优选地，所述的佐剂选自FCA、CpG、铝佐剂和/或花生油乳化佐剂。

在本发明的具体实施方案中，所述的佐剂为FCA和/或CpG。

优选的，所述的疫苗包括肽段疫苗、蛋白疫苗、mRNA疫苗和DNA疫苗。

本发明的第八方面，提供了一种上述疫苗的制备方法，所述的制备方法包括将上述的抗原多肽与上述免疫学上可接受的载体混合。

本发明的第九方面，提供了一种抗包虫病抗体的筛选方法，所述的筛选方法包括将待筛选物与上述的抗原多肽混合。

其中，所述的抗体筛选的方法不是治疗方法。该方法用来筛选中和抗体，对抗体的药效进行检测和比较，以确定哪些抗体可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第十方面，提供了一种诱导特异性免疫应答的方法，包括向个体施加上述的抗原多肽、上述的核酸、上述的表达载体、上述的细胞或上述的疫苗。

优选的，所述的特异性免疫应答包括T细胞应答和/或B细胞应答。

优选的，上述免疫应答是针对包虫病的免疫应答，进一步优选的，上述免疫应答是针对包虫病重组抗原P29的免疫应答。

本发明的第十一方面，提供了一种抗体，所述的抗体可以与本发明所述的抗原多肽结合。

本发明中的抗原多肽，也可以用于免疫学方法进行抗体鉴定。所述的免疫学方法例如微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)、免疫印迹法、快速测定法(如快速斑点免疫结合试验、液相芯片法等)。

本发明所述的“多个”为2个以上，包括但不限于2-50个，优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。

本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。

本发明所述的“核酸”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。

本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本问列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。

本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。

附图说明：

图1：rEg.P29表达纯化的SDS-PAGE分析，其中，M：marker，泳道1：IPTG诱导前含有pET28a的大肠杆菌，泳道2：IPTG诱导6h后含有pET28a-P29的大肠杆菌，泳道3：通过his亲和层析纯化的rEg.P29。

图2：rEg.P29免疫小鼠血清特异性抗体与rEg.P29蛋白结合，其中，M：marker，泳道1：一抗为抗His标签抗体的小鼠血清，泳道2：一抗为PBS组小鼠血清，泳道3：一抗为rEg.P29+FCA组小鼠血清，泳道4：一抗为rEg.P29+CpG组小鼠血清。

图3：rEg.P29免疫小鼠可诱导抗rEg.P29特异性抗体产生。

图4：B细胞优势表位肽筛选，rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠血清分别识别包被在ELISA板上的B1-24表位肽或rEg.P29。

图5：B细胞优势表位肽与特异性抗体反应，即rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠血清分别识别包被在ELISA板上的B4，B6，B7，B8，B11，B12，B15，B16，B17，B20或rEg.P29。

图6：B细胞优势表位与特异性IgG抗体亚型结合检测，即rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠血清分别识别包被在ELISA板上的B4，B6，B7，B8，B11，B12，B15，B16，B17，B20或rEg.P29。

图7：B细胞优势表位特异性抗体IgG滴度，即rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠血清分别识别包被在ELISA板上的B4，B6，B7，B8，B11，B12，B15，B16，B17，B20或rEg.P29。

图8：B20和rEg.P29分别刺激rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠的脾脏淋巴细胞活化结果，其中，unsti表示对照组，即未加入B20或rEg.P29刺激的脾脏淋巴细胞组。

图9：B20和rEg.P29分别刺激rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠的脾脏B淋巴细胞增殖结果，其中，Medium表示未加入B20或rEg.P29刺激的脾脏淋巴细胞组。

图10：B20和rEg.P29分别刺激rEg.P29+FCA免疫小鼠、rEg.P29+CpG免疫小鼠或PBS组小鼠的脾脏B淋巴细胞增殖柱状图，其中，Medium表示未加入B20或rEg.P29刺激的脾脏淋巴细胞组。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明实施例中所用到的ICR小鼠是Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标进行选育，以后美国癌症研究所(Institute of Cancer Research)分送各国饲养实验，各国称之为ICR小鼠。

实施例1 rEg.P29重组蛋白的表达纯化

rEg.P29开放阅读框基因序列(GenBank序列号：AF078931)：(SEQ ID NO：1)

ATGTCCGGATTTGACGTTACTAAGACTTTCAATAGATTTACCCAGCGGGCTGGTGAGCTTGTAAATAAGAATGAAAAGACCTCATATCCTACCCGAACCTCAGATCTTATCCATGAGATCGACCAAATGAAAGCATGGATCAGCAAGATCATCACCGCTACTGAGGAATTCGTAGACATCAACATTGCATCTAAAGTCGCGGATGCTTTCCAGAAGAATAAGGAGAAGATTACTACTACCGACAAACTGGGTACTGCTCTCGAGCAGGTTGCTTCCCAATCAGAAAAGGCAGCTCCCCAACTTTCTAAAATGCTGACGGAAGCTTCTGATGTCCATCAGCGTATGGCCACTGCCAGAAAGAATTTCAATAGTGAGGTTAATACCACCTTCATTGAAGATTTGAAAAACTTCTTGAACACCACGCTTAGCGAGGCCCAGAAAGCAAAGACCAAGCTGGAGGAGGTTCGACTAGATTTGGACTCTGACAAGACTAAATTGAAGAATGCTAAGACTGCGGAACAGAAGGCCAAGTGGGAGGCCGAGGTGCGAAAAGACGAAAGTGACTTCGATCGAGTGCACCAAGAATCTCTTACTATCTTTGAGAAGACTTGCAAAGAATTCGATGGGTTGAGCGTTCAGCTGTTGGATCTGATCCGTGCAGAGAAGAATTACTACGAAGCCTGTGCCAAAGAGTGCAGTATGATGCTGGGCGAGTAG

rEg.P29开放阅读框氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

MSGFDVTKTFNRFTQRAGELVNKNEKTSYPTRTSDLIHEIDQMKAWISKIITATEEFVDINIASKVADAFQKNKEKITTTDKLGTALEQVASQSEKAAPQLSKMLTEASDVHQRMATARKNFNSEVNTTFIEDLKNFLNTTLSEAQKAKTKLEEVRLDLDSDKTKLKNAKTAEQKAKWEAEVRKDESDFDRVHQESLTIFEKTCKEFDGLSVQLLDLIRAEKNYYEACAKECSMMLGE

取出本室保存的含有rEg.P29/pET28a重组质粒及空载质粒pET28a的BL21菌株，在超净工作台上用接种环挑取菌株，分别接种于卡那霉素(Kana)终浓度为50μg/mL的LB固体培养基平板培养皿，放入提前开好的37℃培养箱，过夜。次日观察菌落生长情况，挑取单个单克隆菌落，将重组菌接种于含卡那霉素(Kana)终浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡过夜，200rpm至有明显黄色在OD₆₀₀nm波长下OD＝0.6时，再以1∶100的比例接种于LB液体培养基中扩大培养，37℃培养6h后OD＝0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃摇床振荡诱导6h，收集菌体，12％SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

rEg.P29的纯化：诱导表达后，经检测该蛋白属于融合蛋白，纯化后得到纯度较高的重组蛋白rEg.P29，SDS-PAGE可在31KD左右检测到目的蛋白(图1所示)。BCA法检测蛋浓度为1mg/mL，内毒素含量为0.358EU/mL。

实施例2 rEg.P29免疫小鼠血清特异性抗体与rEg.P29结合

SDS-PAGE电泳后按常规方法电转印至硝酸纤维素膜。用5％脱脂奶粉37℃封闭2h，再用PBST(含0.5‰Tween-20)洗3次；将膜浸泡于1∶100稀释的免疫血清中，4℃过夜；洗涤后将膜与1∶100稀释的羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)孵育，37℃摇床上60r/min反应2h，再用PBST洗4次后，加入新配制的显色液显色5min，用蒸馏水冲洗终止反应。

Western blot检测结果显示，rEg.P29不能被PBS组的小鼠血清样本识别，但可以被小鼠单克隆His标签抗体和免疫组小鼠血清识别(图2所示)。

实施例3 rEg.P29蛋白的免疫效应

1、动物免疫

24只ICR小鼠分为2组，A组为免疫组，注射rEg.P2910μg/100μl加弗氏佐剂的乳化剂；B组为对照组，注射弗氏佐剂加PBS的乳化剂每只100μl(总体积)，每两周免疫1次，共3次。抗原根据Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝胶分析软件进行定量。至实验结束时，A组有2只小鼠死亡，B组有3只小鼠死亡。

2、攻击感染

实验动物感染模型的建立：免疫小鼠8周后，每只小鼠腹腔注射0.1ml原头蚴悬液，即每只小鼠感染约1500个活原头蚴。

3、免疫保护力观察

(1)攻击感染20周后剖杀小鼠，切开小鼠腹部，称取小鼠脾脏，计算脾指数，公式：

脾指数＝脾的重量(mg)/小鼠体重(g)；

(2)计数肝脏及肠系膜处的棘球蚴包囊，计算免疫保护力，公式：

免疫保护力(％)＝(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100。

4、结果

rEg.P29诱导小鼠抗包虫感染的保护作用：rEg.P29免疫组和PBS对照组的平均棘球蚴包囊直径分别为0.9mm和8.1mm；其中以rEg.P29重组抗原免疫ICR小鼠可获得96.6％的免疫保护力，脾指数升高，与PBS对照组相比差异有显著性(P<0.05)(表1)。

表1 rEg.P29免疫小鼠攻击感染后的棘球蚴包囊数、免疫保护力及脾指数

注：与PBS对照组比较，^*P<0.05

实施例4 rEg.P29免疫小鼠诱导抗rEg.P29特异性抗体产生

将纯化后的rEg.P29用无酶水缓冲液调整浓度至1mg/mL，与弗氏佐剂(rEg.P29与弗氏佐剂的体积比为1:5)或CpG佐剂(rEg.P29与CpG佐剂的体积比为1:2)进行混合，以100μg/只的剂量进行腹部皮下免疫一次，每7天进行一次加强(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂)。对照组同法注射生理盐水100μL/只。

多肽的确定和制备：依据本实验室已有的rEg.P29的氨基酸序列，通过ABCPred等生物信息学软件对rEg.P29的B细胞抗原表位进行预测分析，经过对比筛选选取亲水性等表现较好的多条长度为16个氨基酸的多肽。送至上海生工有限公司进行合成，合成的多肽纯度≥95％。多肽序列见表2：

表2 rEg.P29的B细胞表位肽

使用合成的24条B细胞表位肽(表2)和rEg.P29包被ELISA板，Eg.P29免疫小鼠血清作为一抗，用ELISA方法检测B细胞表位肽(表2)与rEg.P29免疫小鼠血清中抗体的免疫反应性。分析检测结果，以确定阳性反应肽段。ELISA试验步骤：

(1)用coating buffer稀释多肽至其浓度为10μg/mL，rEg.P29浓度为10μg/mL，每孔100μL加入酶标板中进行包被，4℃过夜孵育。

(2)次日，倾倒包被液，用PBST洗3次，拍干后加入含10％FBS(肽牛血清)的PBS，每孔200μL，37℃孵育2h。

(3)倾倒封闭液，用PBST洗5次，然后加入rEg.P29免疫小鼠血清(用含10％FBS的PBS按照1:100的比例进行稀释)，每孔100μL，37℃孵育2h。

(4)倾倒一抗孵育液，用PBST洗5次，然后加入Goat anti-mouse IgG，(用含10％FBS的PBS按照1:5000的比例进行稀释)，每孔100μL，37℃孵育1h。

(5)倾倒二抗孵育液，用PBST洗7次，然后加入TMB显色液每孔100uL，显色8～10min后加入终止液终止反应。在15min内用A450nm酶标仪下测定OD450。

(6)分析数据

分别于第三次免疫后7，14，21，28，35天分离rEg.P29免疫组和对照组血清，将其分别加入rEg.P29包被的微量反应孔中，使用ELISA方法检测血清抗rEg.P29特异性抗体。rEg.P29免疫小鼠血清中IgG，IgM，IgA以及IgE抗体含量明显高于对照组(图3)，差别具有统计学意义。

实施例5 B细胞优势表位的鉴定

(1)B细胞优势表位筛选

用生物信息学预测出的24条B细胞表位肽(表2)及rEg.P29包被ELISA板，将稀释后的rEg.P29免疫小鼠的血清作为一抗，检测特异性抗体IgG，IgM，IgE和IgA。

检测结果如图4，结果可知在rEg.P29+FCA组抗B4，B6，B7，B8，B11，B12，B15，B16，B17，B20特异性IgG抗体显著高于其他B细胞表位肽,而在rEg.P29+CpG组,仅有抗B11和B20特异性IgG抗体显著高于其他B细胞表位肽.

(2)B细胞优势表位肽抗体检测

对各条B细胞表位肽及rEg.P29的特异性抗体进行检测，检测结果如图5。由图可知，B细胞表位肽均与IgG结合，B7、B8、B12、B15、B16、B20与IgM有结合。IgE、IgA与表位肽没有结合。

(3)B细胞优势表位肽IgG亚型检测

利用步骤(1)筛选出来的10条表位肽及rEg.P29包被ELISA板，稀释后的rEg.P29免疫小鼠的血清作为一抗，检测各条B细胞表位肽的特异性IgG亚型。

检测结果如图6知，在rEg.P29+FCA组中B细胞表位肽均与IgG3没有结合，IgG1和IgG2b均能与表位肽结合。B4，B15，B16，B20能与IgG2a反应，B4，B6，B8，B11，B15，B16，B20与IgG2c有结合。

(4)B细胞优势表位肽抗体滴度检测

利用步骤(1)筛选出来的10条表位肽(B4，B6，B7，B8，B11，B12，B15，B16，B17，B20)及rEg.P29分别包被ELISA板，不同稀释倍数的rEg.P29免疫小鼠的血清作为一抗，检测特异性抗体。

检测结果如图7由结果可知，B4、B15滴度为1：25600，B6、B7、B8滴度为1：12800，B11、B12、B20为1：3200，B16、B17滴度为1：1600。作为对照的rEg.P29滴度可达到1：64000。

综合图4，5，6，7结果来看，我们可知不同的佐剂或许会因为其作用机制不同而筛选出不同的B细胞表位肽，CpG佐剂是一种含有CpG序列的寡脱氧核苷酸，具有很强的免疫激活特性和很少的副作用，是一种可用于人的佐剂。结果表明，CpG和弗氏佐剂均能增强体液免疫反应。考虑到该疫苗的转化应用，我们倾向于在后续实验中使用CpG佐剂。再结合特异性抗体的种类，抗体滴度综合评价可知在上述表位肽中B20针对两个佐剂免疫组的血清均能产生抗B20特异性IgM,IgG,IgG2b,IgG2c抗体，并且其抗体滴度为1：3200，综合评价我们认为B20的作用或许更接近rEg.P29，为了进一步验证，我们又检测了其诱导特异性B淋巴细胞活化和增殖的能力。

B20氨基酸序列：(SEQ ID NO：22)

TKLKNAKTAEQKAKWE

实施例6 B20和rEg.P29诱导特异性B细胞活化

取小鼠脾脏，剪碎后置于滤网轻轻研磨，边研磨边滴加样本稀释液，将脾脏制备为约5ml的细胞悬液，缓慢滴加到5ml小鼠脾脏淋巴细胞分离液上方，450g室温离心20分钟，取淋巴细胞层，加入清洗液洗涤后弃上清获得小鼠脾脏淋巴细胞。加入或不加入rEg.P29或B20刺激，37度，5％CO₂培养1天后分别用流式细胞术检测其活化标志CD25和CD69。如图8所示，B20和rEg.P29刺激培养后一天，相对于PBS组，免疫组CD69和CD25表达升高，说明B20和rEg.P29均可以诱导rEg.P29免疫组小鼠特异性B细胞活化，但是B20诱导特异性B细胞活化的能力稍弱于rEg.P29。

实施例7 B20和rEg.P29诱导特异性B细胞增殖

如实施例6所述获取rEg.P29免疫小鼠脾脏淋巴细胞，用预热的PBS洗涤2次，然后加入CFSE(Invitrogen,Carlsbad,USA，终浓度为2.5mol/L)，37℃避光孵育15min。用预冷的RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)终止反应，在4℃下孵育5分钟，用预冷的RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)洗涤两次。然后将CFSE标记的细胞加入或不加入B20或rEg.P29进行培养。37度，5％CO₂培养，在第3天，5天分别收集细胞样本，用荧光标记单克隆抗体在4度避光染色进行表型分析。

如图9所示，相对于PBS组，B20或rEg.P29刺激后CFSE荧光强度均在第三天下降，第五天继续下降，说明B20或rEg.P29刺激能够诱导rEg.P29免疫小鼠脾脏特异性B淋巴细胞增殖，并且两者之间无统计学差异(图10)。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种抗原多肽及其应用

<130> P0102021100791

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccggat ttgacgttac taagactttc aatagattta cccagcgggc tggtgagctt 60

gtaaataaga atgaaaagac ctcatatcct acccgaacct cagatcttat ccatgagatc 120

gaccaaatga aagcatggat cagcaagatc atcaccgcta ctgaggaatt cgtagacatc 180

aacattgcat ctaaagtcgc ggatgctttc cagaagaata aggagaagat tactactacc 240

gacaaactgg gtactgctct cgagcaggtt gcttcccaat cagaaaaggc agctccccaa 300

ctttctaaaa tgctgacgga agcttctgat gtccatcagc gtatggccac tgccagaaag 360

aatttcaata gtgaggttaa taccaccttc attgaagatt tgaaaaactt cttgaacacc 420

acgcttagcg aggcccagaa agcaaagacc aagctggagg aggttcgact agatttggac 480

tctgacaaga ctaaattgaa gaatgctaag actgcggaac agaaggccaa gtgggaggcc 540

gaggtgcgaa aagacgaaag tgacttcgat cgagtgcacc aagaatctct tactatcttt 600

gagaagactt gcaaagaatt cgatgggttg agcgttcagc tgttggatct gatccgtgca 660

gagaagaatt actacgaagc ctgtgccaaa gagtgcagta tgatgctggg cgagtag 717

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Gly Phe Asp Val Thr Lys Thr Phe Asn Arg Phe Thr Gln Arg

1 5 10 15

Ala Gly Glu Leu Val Asn Lys Asn Glu Lys Thr Ser Tyr Pro Thr Arg

20 25 30

Thr Ser Asp Leu Ile His Glu Ile Asp Gln Met Lys Ala Trp Ile Ser

35 40 45

Lys Ile Ile Thr Ala Thr Glu Glu Phe Val Asp Ile Asn Ile Ala Ser

50 55 60

Lys Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn Lys Glu Lys Ile Thr Thr Thr

65 70 75 80

Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu Lys

85 90 95

Ala Ala Pro Gln Leu Ser Lys Met Leu Thr Glu Ala Ser Asp Val His

100 105 110

Gln Arg Met Ala Thr Ala Arg Lys Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr

115 120 125

Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu

130 135 140

Ala Gln Lys Ala Lys Thr Lys Leu Glu Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp

145 150 155 160

Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gln Lys Ala

165 170 175

Lys Trp Glu Ala Glu Val Arg Lys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Arg Val

180 185 190

His Gln Glu Ser Leu Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp

195 200 205

Gly Leu Ser Val Gln Leu Leu Asp Leu Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr

210 215 220

Tyr Glu Ala Cys Ala Lys Glu Cys Ser Met Met Leu Gly Glu

225 230 235

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Gln Ser Glu Lys Ala Ala Pro Gln Leu Ser Lys Met Leu Thr Glu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Arg Met Ala Thr Ala Arg Lys Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ser Asp Leu Ile His Glu Ile Asp Gln Met Lys Ala Trp Ile Ser Lys

1 5 10 15

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Glu Val Arg Lys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Arg Val His Gln Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Ser Lys Ile Ile Thr Ala Thr Glu Glu Phe Val Asp Ile Asn Ile

1 5 10 15

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Glu Glu Val Arg Leu Asp Leu Asp Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr Tyr Glu Ala Cys Ala Lys Glu Cys Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Lys Thr Ser Tyr Pro Thr Arg Thr Ser Asp Leu Ile His Glu Ile

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Phe Thr Gln Arg Ala Gly Glu Leu Val Asn Lys Asn Glu Lys Thr

1 5 10 15

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys Glu Phe Asp Gly Leu Ser Val Gln

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ser Lys Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn Lys Glu Lys Ile Thr Thr

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Thr Ala Glu Gln Lys Ala Lys Trp Glu Ala Glu Val Arg Lys Asp Glu

1 5 10 15

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Arg Val His Gln Glu Ser Leu Thr Ile Phe Glu Lys Thr Cys Lys Glu

1 5 10 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Lys Met Leu Thr Glu Ala Ser Asp Val His Gln Arg Met Ala Thr Ala

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Lys Glu Lys Ile Thr Thr Thr Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln

1 5 10 15

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Thr Asp Lys Leu Gly Thr Ala Leu Glu Gln Val Ala Ser Gln Ser Glu

1 5 10 15

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Val Asp Ile Asn Ile Ala Ser Lys Val Ala Asp Ala Phe Gln Lys Asn

1 5 10 15

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Phe Asp Val Thr Lys Thr Phe Asn Arg Phe Thr Gln Arg Ala Gly Glu

1 5 10 15

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Leu Ser Val Gln Leu Leu Asp Leu Ile Arg Ala Glu Lys Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gln Lys Ala Lys Trp Glu

1 5 10 15

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser Glu Ala Gln Lys Ala Lys Thr Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Asn Phe Asn Ser Glu Val Asn Thr Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Asp Leu Asp Ser Asp Lys Thr Lys Leu Lys Asn Ala Lys Thr Ala Glu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Thr Thr Phe Ile Glu Asp Leu Lys Asn Phe Leu Asn Thr Thr Leu Ser

1 5 10 15

Claims

1.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽选自一个或多个SEQ ID NO：2的B细胞抗原表位。

2.根据权利要求1所述的抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽包含SEQ ID NO：2中连续8-20个氨基酸，优选的，所述的抗原多肽包括：

A)SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：26中的一种或两种以上的氨基酸序列；

3.一种编码权利要求1或2所述抗原多肽的核酸。

4.一种包含权利要求3所述核酸的表达载体。

5.一种包含权利要求1或2所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸或权利要求4所述表达载体的细胞。

6.一种权利要求1或2所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述表达载体或权利要求5所述的细胞在制备治疗或预防包虫病的产品中的应用。

7.一种包虫病的疫苗，其特征在于，所述的疫苗包括权利要求1或2所述的抗原多肽、权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的细胞，以及免疫学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述的免疫学上可接受的载体包括佐剂、稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、转染促进剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂和/或增效剂，优选的，所述的佐剂选自FCA或CpG。

9.一种权利要求7-8任一所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求1或2所述的抗原多肽与免疫学上可接受的载体混合。

10.一种抗包虫病抗体的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括将待筛选物与权利要求1或2所述的抗原多肽混合。