ES2612786T3

ES2612786T3 - Uso de una fuente de L3 y/o L5 como vacuna o como diagnóstico para una enfermedad parasitaria

Info

Publication number: ES2612786T3
Application number: ES10781480.8T
Authority: ES
Inventors: Carlos Alonso Bedate; Manuel Soto Álvarez; Laura RAMÍREZ GARCÍA
Original assignee: Laboratorios Leti SA
Current assignee: Laboratorios Leti SA
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2030-11-12
Also published as: EA022221B1; IL219770A0; CO6551684A2; CN102712684A; CN107551264B; US10604551B2; PT2499158T; MX341066B; WO2011058137A1; US20120263746A1; HRP20170176T1; HK1176074A1; CY1118402T1; BR112012011395A2; SA110310855B1; AU2010317962B2; CN107551264A; PE20121553A1; BR112012011395B1; KR20120104567A

Abstract

Fuente de proteína ribosómica L5 que muestra propiedades inmunogénicas para su uso en un método para tratar o prevenir o retrasar una enfermedad parasitaria en un sujeto, donde dicha fuente de L5 es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y/o que es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 4 o donde dicha fuente de L5 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 y/o que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud con SEQ ID NO: 3, donde la similitud entre dos secuencias de aminoácidos es determinada por la comparación de la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido para la secuencia de un segundo polipéptido utilizando el programa informático BLAST X con la matriz de comparación BLOSUM62, dicho segundo polipéptido siendo definido por la SEQ ID NO con el que la similitud debe ser determinada.

Description

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proporciones de más de 2 indica que un adyuvante tiene propiedades Th1. La evaluación de la inducción de cada una de las citocinas mencionadas es realizada preferiblemente por ELISA en esplenocitos como se describe en el ejemplo. La evaluación de la inducción de una inmunoglobulina IgG1 o IgG2a es realizada preferiblemente por ELISA o Western blot como se describe en el ejemplo 1.

[0033] En una forma de realización preferida, un adyuvante de promoción de Th-1 es, o comprende, o consiste en, un oligodeoxinucleótido. Más preferiblemente, un oligodeoxinucleótido (ODN) comprende, o consiste en, CpG donde el C es no metilado (CpG ODN): 3'purina-CpG-5'pirimidina. Un oligodeoxinucleótido preferido es, o comprende, o consiste en, una secuencia de ODN modificada por fosforotioato. El uso de oligodesoxinucleótidos que tienen tal modificación es ventajosa ya que los oligodesoxinucleótidos por lo tanto usados son más estables que los oligonucleótidos no modificados y por lo tanto no se degradarán fácilmente una vez que estén en el flujo sanguíneo. Un adyuvante de promoción Th-1 preferido consiste en, o comprende, al menos un motivo CpG, al menos dos o al menos tres. Secuencias preferidas de los inmunoestimuladores ODN (5' a 3') fueron TCAACGTTGA (SEQ ID NO: 5) y GCTAGCGTTAGCGT (SEQ ID NO: 6). La persona experta no está limitada a las secuencias explícitamente descritasaquí. Él/ella puede diseñar otras secuencias y posteriormente probarlas para su propiedad de promoción de Th-1 tal y como se ha definido anteriormente en la presente. Este adyuvante CpG ODN identificado preferido es altamente atractivo ya que se ha demostrado en el ejemplo que la co-inoculación de LRPE con este adyuvante promotor de Th1 induce la protección contra una inoculación con parásitos L. major tanto en cepas de ratón BALB/c como C57BL/6. En ambos modelos, la protección se correlaciona con una producción específica de IFN-γ. En BALB/c, una restricción en la producción de IL-4 e IL-10 fue detectada también.

[0034] La invención proporciona un uso de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 adecuada como una vacuna 1) preventiva (profiláctica); 2) post-exposición/infección o 3) terapéutica/curativa. Una ventaja de la presente invención es que permite la preparación de una preparación médica para el tratamiento de un espectro más amplio de enfermedades parasitarias, es decir, una preparación médica con especificidad entre especies. En muchas enfermedades parasitarias, una vacuna dirigida contra una especie específica, solo funciona contra esa especie específica. Un ejemplo de una enfermedad parasitaria donde este es el caso es la leishmaniasis. Actualmente, la enfermedad se controla mediante fármacos, pero el tratamiento farmacológico no previene la propagación de la enfermedad y en muchos casos no es muy eficaz. En una forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es leishmaniasis o malaria. Más preferiblemente, una enfermedad parasitaria es provocada por una Leishmania o por una especie de Plasmodium. En otra forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es provocada por una especie diferente de la especie de la que se deriva una fuente de L3 y/o una de L5. En particular, la leishmaniasis causada por una especie del género Leishmania se pueden tratar usando una composición basada en una fuente de L3 y/o una de L5 de otra especie de Leishmania ya que como se ha demostrado en la parte experimental (véase ejemplo 2) homólogos de L3 y L5 de varias especies de Leishmania son altamente conservados (al menos 90% de identidad, véase tabla 1). Además, ya se ha demostrado en la parte experimental (véase ejemplos 1 y 3) que las proteínas L3 y L5 de Leishmania major son capaces de proteger contra una infección por Leishmania major o Leishmania braziliensis. En una forma de realización, la leishmaniasis provocada por L. major se trata con éxito con una composición que incluye una fuente de L3 y/o una de L5 de L. infantum, L. chagasi, L amazonensis o L. braziliensis. En otra forma de realización, la leishmaniasis provocada por L. chagasi o L. amazonensis se trata con éxito con una composición que incluye una fuente de L3 y/o una de L5 de L. infantum. En otra forma de realización, la leishmaniasis provocada por L. major o L. braziliensis se trata con éxito con una composición que incluye una fuente de L3 y/o una de L5 de L. major. Alternativamente, otras enfermedades parasitarias, tal como la malaria, se pueden tratar con éxito con una composición basada en una fuente de L3 y/o una de L5 de otras especies, por ejemplo basada en una fuente de L3 y/o una de L5 de

L. infantum o L. major o L. mexicana o L. braziliensis.

[0035] En el contexto de la invención, un sujeto se refiere a un humano o un animal. Un animal que está abarcado dentro del campo de la invención incluye un mamífero, preferiblemente un perro.

[0036] En una forma de realización preferida, una medicina (o preparación médica o composición farmacéutica o medicamento) tal y como se define aquí se utiliza para aumentar la capacidad de un sistema inmune humano o animal para luchar contra una infección y/o una enfermedad, más preferiblemente una infección parasitaria y/o una enfermedad parasitaria. En particular, se puede usar para la administración a un sujeto humano o animal. Una medicina tal y como se define aquí se administra preferiblemente parenteralmente, por ejemplo por inyección o infusión por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial o intralesional. Un modo de administración preferido es subcutáneo. La invención no está limitada a un modo específico de administración de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Un modo preferido de administración es la administración oral utilizando una cápsula o un comprimido. Alternativamente una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se puede administrar localmente vía un catéter o una bomba, o un supositorio. Alternativamente, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se puede administrar tópicamente. La formulación de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 o de una composición que incluye una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 depende del modo elegido de administración y aplicación (terapéutica). Un soporte farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica adecuada, compatible, para entregar una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 a un sujeto. Por ejemplo agua esterilizada, o sólidos inertes o excipientes se pueden utilizar como el portador, normalmente complementados con adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes tamponantes, agentes de dispersión y similares. Las composiciones serán bien en forma líquida, por ejemplo una suspensión estabilizada de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5, o una composición que incluye una fuente

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de L5 o una fuente de L3 y una de L5, o en sólida y/o seca: por ejemplo polvo. Para la administración oral y rectal, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se puede administrar en forma de dosificación sólida, tal como cápsulas, comprimidos, supositorios y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elixires, jarabes, cremas, pomadas y suspensiones. Otra forma puede ser una forma semi-sólida o semi-líquida donde una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 están presentes como una forma líquida en o sobre un soporte sólido tal como un parche.

[0037] Una medicina se puede combinar con un medio farmacéuticamente aceptable o vehículo de entrega por técnicas convencionales conocidas en la técnica. Por ejemplo, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y opcionalmente un adyuvante puede ser disuelto en la solución salina tamponada con fosfato (PBS). Métodos para preparar las composiciones administrables parentalmente se conocen bien en la técnica y se describen en más detalles en varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA. Una medicina es preferiblemente administrada en una dosis terapéuticamente efectiva, es decir, una que aumentará la capacidad del sistema inmune humano o animal para luchar contra una infección y/o una enfermedad tal y como se define aquí. Preferiblemente, una dosis terapéuticamente efectiva de una preparación médica de la invención es capaz de suscitar una respuesta inmune tal y como se define aquí: una dosis es eficaz terapéuticamente cuando es capaz de suscitar una respuesta inmune en un sujeto tratado, lo que preferiblemente significa que es capaz de promover o desencadenar una respuesta inmune Th1 contra un antígeno dado L3 y/o L5 y/o que es capaz de prevenir y/o retardar el desarrollo de una lesión dérmica o mucosa y/o induce una reducción significativa de la carga parasitaria en un lesión dérmica y/o mucosa y/o en una oreja y/o en un ganglio linfático de drenaje (DGL) que preferiblemente drena cualquiera de estas regiones infectadas (dérmica, región mucosa, oreja), al igual que en un órgano interno tal como el hígado, bazo, médula ósea, riñón, cerebro, etc.. La evaluación de la presencia de un lesión dérmica se describe en el ejemplo 1 (véase la figura 4: inflamación de la almohadilla plantaria). La evaluación de una carga parasitaria se describe en el ejemplo (véase figura 4). Una dosis terapéuticamente efectiva de una medicina de la invención preferiblemente prevendrá el desarrollo de un lesión dérmica y/o inducirá preferiblemente una reducción de la carga parasitaria en una oreja de aproximadamente 3 órdenes de magnitud y/o de aproximadamente una magnitud similar en un DGL después de un período de tiempo que comprende primero una vacunación utilizando una composición de la invención seguida de una infección secuencial con un parásito y un plazo de espera de aproximadamente 6 semanas. En una forma de realización preferida, una medicina tal y como se define aquí es una vacuna. En una forma de realización más preferida, al menos 12 µg de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se está usando en una vacuna. La cantidad de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 usada se refiere a la cantidad total de L3 y L5 usada. En una forma de realización aún más preferida, al menos 12-20µg de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 debe ser usada para proporcionar una respuesta inmune opcionalmente en combinación con al menos 50µg de un adyuvante, preferiblemente un adyuvante promotor de Th1 tal como por ejemplo, CpG ODN. Una vacuna tal y como se define aquí puede ser una vacuna profiláctica o terapéutica. El volumen en el que una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferiblemente un adyuvante de promoción de Th1 puede ser disuelto puede variar de 100-500 microlitros.

Composición

[0038] En otro aspecto, está prevista una composición que incluye una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferiblemente un adyuvante promotor de Th1. Una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y un adyuvante se han sido definidos aquí. En una forma de realización preferida, una composición consiste en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y un adyuvante promotor de Th1. Un adyuvante promotor de Th1 preferido es un CpG ODN. Una composición preferida comprende o consiste en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y opcionalmente un adyuvante, preferiblemente un adyuvante promotor de Th1 disuelto en PBS. En otra forma de realización preferida, está abarcado también por la presente invención que una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y un adyuvante, preferiblemente un adyuvante promotor de Th1 son administrados consecutivamente. Por lo tanto, ambos componentes no necesitan estar físicamente presentes en una composición única en tanto que ambos son administrados a un sujeto.

[0039] Tal composición puede comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable y/o portador.

[0040] Tal composición es preferiblemente para el uso como una medicina. La medicina es preferiblemente una vacuna. Medicina, adyuvante y vacuna ya se han definido extensivamente aquí. Una composición puede ser en forma líquida, sólida o semi-líquida o semi-sólida como ya se ha definido aquí.

[0041] En una forma de realización preferida, otros compuestos se usan consecutivamente o simultáneamente con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 para mejorar la especificidad del tratamiento terapéutico o profiláctico. Resulta ventajoso por ejemplo el uso de otros compuestos que mejorarán además la respuesta inmune del sujeto tratado. Más preferiblemente, tales compuestos no están presentes en una composición única junto con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Por ejemplo dichos compuestos se seleccionan de un grupo que consiste en una fuente de otras proteínas de un parásito que causa una enfermedad parasitaria (19) tal como la Leishmaniasis. A una fuente de una proteína dada se le da lo mismo sentido que a una fuente de L3 o L5 tal y como se ha definido anteriormente aquí. Una proteína preferida es en este contexto otra proteína ribosómica tal como S6 o S4. Proteínas descritas en este contexto son una histona tal como una H2A, H2B, H3, H4, u otra proteína ribosómica tal como Li2A (LiP), LiP2b (LiP'), LiP0, L2, L7, L8, L16 y L19.

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[0042] Una proteína H2A descrito se representa por SEQ ID NO: 7. Un ácido nucleico descrito que codifica una H2A se representa por SEQ ID NO:8. Una proteína H2B descrita se representa por SEQ ID NO: 9. Un ácido nucleico descrito que codifica una H2B se representa por SEQ ID NO: 10. Una proteína H3 descrita se representa por SEQ ID NO: 11. Un ácido nucleico descrito que codifica una H3 se representa por SEQ ID NO: 12. Una proteína H4 descrita se representa por SEQ ID NO: 13. Un ácido nucleico descrito que codifica una H4 se representa por SEQ ID NO: 14. Una Li2A descrita también denominada proteína LiP2a se representa por SEQ ID NO: 15 o 16. Un ácido nucleico descrito que codifica una Li2A se representa por SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 17 es una secuencia genómica. La persona experta podría derivar secuencias codificantes a partir de esta secuencia genómica. Tales secuencias codificantes corresponden a un ácido nucleico que codifican un ARNm codificante para una proteína Li2A representada por SEQ ID NO: 15 o 16: un de nucleótido de 791 a 1111 y uno de 1662 a 1982 de SEQ ID NO: 17.

[0043] Una proteína LiP2b descrita se representa por SEQ ID NO: 18. Un ácido nucleico descrito que codifica una LiP2b se representa por SEQ ID NO: 19. Una proteína LiP0 descrita se representa por SEQ ID NO: 20. Un ácido nucleico descrito que codifica una LiP0 se representa por SEQ ID NO: 21.

[0044] SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14,19 y 21 son secuencias genómicas. La persona experta podría derivar otras secuencias codificantes preferidas a partir de estas secuencias genómicas. Tales otras secuencias codificantes corresponden a un ácido nucleico que codifica un ARNm codificante para la proteína respectiva: estas secuencias de ácidos nucleicos se representan por SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71,72 y 73 respectivamente.

[0045] Una proteína L2 descrita se representa por SEQ ID NO: 22. Un ácido nucleico descrito que codifica L2 se representa por SEQ ID NO: 23. Una proteína L7 descrita se representa por SEQ ID NO: 24. Un ácido nucleico descrito que codifica una L7 se representa por SEQ ID NO: 25. Una proteína L8 descrita se representa por SEQ ID NO: 26. Un ácido nucleico descrito que codifica una L8 se representa por SEQ ID NO: 27. Una proteína L16 descrita se representa por SEQ ID NO: 28. Un ácido nucleico descrito que codifica una L16 se representa por SEQ ID NO: 29. Una proteína L19 descrita se representa por SEQ ID NO: 30. Un ácido nucleico descrito que codifica una L19 se representa por SEQ ID NO: 31. Una proteína S4 preferida se representa por SEQ ID NO: 32. Un ácido nucleico preferido que codifica una S4 se representa por SEQ ID NO: 33. Una proteína S6 preferida se representa por SEQ ID NO: 34. Un ácido nucleico preferido que codifica una S6 se representa por SEQ ID NO: 35. Otro ejemplo es el uso de poliproteínas que contienen diferentes antígenos de parásito (63, 65). Un ejemplo de una poliproteína es la proteína Q según se identifica en la EP 1 141 305. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Q se representa por SEQ ID NO: 36. Una proteína Q codificada correspondiente se representa por SEQ ID NO: 37. La proteína Q o una parte o un fragmento de la misma o una fuente de proteína Q o una fuente de un fragmento de proteína Q se puede utilizar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Otro ejemplo de una poliproteína es Leish-110f (69). Leish-110f o una parte o un fragmento de la misma o una fuente de Leish-110f o una fuente de un fragmento de Leish-110f se puede utilizar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5.

[0046] En el párrafo siguiente, una fuente de una proteína de histona se toma como un ejemplo de una proteína que se puede usar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Lo mismo ocurre con otras proteínas definidas anteriormente, preferiblemente otras proteínas ribosómicas que L3 y/o L5. Compuestos preferidos incluyen una proteína de histona o fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha histona o dicho fragmento de histona. Más preferiblemente, una proteína de histona es H2A, H2B, H3 y/o H4 como se identifica en la EP 1 687 023. Histonas H2A, H2B, H3 y H4 son proteínas nucleares bien conservadas y su secuencia es bien conocida en la técnica, véase la referencia 39. Preferiblemente las histonas son obtenidas a partir de un organismo que está cerca de la enfermedad que causa el organismo en el árbol evolutivo. Por lo tanto, de interés particular como una fuente de histonas para su uso en el tratamiento de enfermedades parasitarias tales como la leishmaniasis son los protozoos y en particular los miembros de la familia de los tripanosomátidos, más en particular especies diferentes del protozoo tripanosómico Leishmania.

[0047] Otros compuestos preferidos incluyen otra proteína ribosómica o fragmento de la misma o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína o fragmento de la misma. Ejemplos de otra proteína ribosómica incluyen S6 y S4.

[0048] Otras composiciones descritas incluyen un extracto de proteína ribosómica según se identifica en la WO 2009/090175.

[0049] Cada uno de los compuestos o fuentes de cada uno de estos compuestos se pueden utilizar en combinación con una fuente de L5 o de L3 y L5. El uso combinado puede ser secuencial o simultáneo.

[0050] En una forma de realización preferida, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se usa en combinación con una fuente de S4 y/o una de S6. Más preferiblemente una fuente de L3, una de L5, una de S4 y una de S6 se usan en combinación. En otra forma de realización más preferida, una fuente de L3, una de L5 y una de S4 se usan en combinación. En otra forma de realización más preferida, una fuente de L3, una de L5 y una de S6 se usan en combinación. Se demostró (véase el ejemplo 5) que el uso combinado de L3, L5 y S4 estaba aportando protección sinergística en comparación con el uso de L3 o L5 o solo S4. En este contexto, una proteína S4 preferida se representa por SEQ ID NO: 32. Un ácido nucleico preferido que codifica una S4 se representa por SEQ ID NO: 33. Una proteína S6

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preferida se representa por SEQ ID NO: 34. Un ácido nucleico preferido que codifica una S6 se representa por SEQ ID NO: 35. El término "fuente", cuando se usa en "una fuente de S4 y/o una de S6" tiene el mismo sentido que el término "fuente" cuando se usa en "fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5".

[0051] Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de S4 es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32 y/o que es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 33.

[0052] Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de S6 es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 y/o que es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO: 35.

[0053] Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fuente de S4 es un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 33 y/o que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud con SEQ ID NO: 32.

[0054] Dependiendo del tipo de fuente usado (basado en proteína o basado en ácido nucleico), la persona experta sabrá qué tipo de formulación es adecuada. Una fuente de Se puede administrar como tal (proteína o ácido nucleico desnudos). Alternativamente, una fuente basada en ácido nucleico se puede administrar utilizando un constructo de ácidos nucleicos tal y como se define aquí.

Fuente de S6

[0055] En otro aspecto de la divulgación se proporciona una fuente de S6 o una composición que comprende o consiste en una fuente de S6 pero que no comprende una fuente de L3 y/o una de L5 y/o una de S4. Se demostró (véase el ejemplo 4) que el uso de S6 solo estaba aportando protección contra la infección de la Leishmania.

[0056] El término "fuente" cuando se usa en "una fuente de S6" tiene el mismo sentido que el término "fuente" cuando se usa en "una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5".

[0057] Cada uno del uso o método o tipos de composiciones definidos aquí que comprenden una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 también se aplican a una fuente de S6.

[0058] Por consiguiente, se describe una fuente de S6 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34 y/o que es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad con SEQ ID NO:

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[0059] Por consiguiente, se describe una fuente de S6 que es un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 35 y/o que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad o similitud con SEQ ID NO: 34.

Método

[0060] En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir y/o tratar una enfermedad parasitaria y/o retardar su progresión y/o es capaz de suscitar una respuesta inmune tal y como se define aquí: un método es terapéuticamente eficaz cuando es capaz de suscitar una respuesta inmune en un sujeto tratado lo que preferiblemente significa que es capaz de promover o desencadenar una respuesta inmune Th1 contra un antígeno dado L5, o L3 y L5 y/o contra una fuente dada L5 o una fuente de L3 y una de L5 y/o que es capaz de prevenir y/o retardar el desarrollo de un lesión dérmica o en la mucosa y/o inducir una reducción significativa de la carga parasitaria en un lesión dérmica y/o de la mucosa y/o en una oreja y/o en un ganglio linfático de drenaje (DGL) que preferiblemente drena cualquiera de estas regiones infectadas (región dérmica, mucosa, oreja), al igual que en un órgano interno tal como el hígado, el bazo, la médula ósea, el riñón, el cerebro, etc. aquí. En este método, una vacuna de la invención funciona como una vacuna terapéutica. Típicamente, hay un período de tiempo entre la infección y la enfermedad. En este caso, una vacuna actuaría como un producto inmunitario farmacológico que prevendría y/o trataría la enfermedad y/o retardaría su progresión suscitando en el huésped una respuesta inmune que contrarresta el efecto patológico de la infección. Una vacuna terapéutica difiere de una vacuna profiláctica en que una vacuna terapéutica inducirá protección en un paciente que ya tiene la infección o la enfermedad. La invención abarca bien una vacuna terapéutica o una vacuna profiláctica. En este método, opcionalmente una fuente de S4 y/o una de S6 se pueden utilizar en combinación con una fuente de L5

o una fuente de L3 y una de L5.

Uso

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[0061] En otro aspecto, se proporciona otro uso de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 para el diagnóstico de una enfermedad parasitaria en un sujeto. Una enfermedad parasitaria, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y un sujeto se han definido anteriormente en la presente. En este uso, opcionalmente una fuente de S4 y/o una de S6 se pueden utilizar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5.

[0062] Una ventaja de la presente invención es que esta permite alcanzar un diagnóstico específico y temprano de un espectro más amplio de enfermedades parasitarias. Un ejemplo de una enfermedad parasitaria donde este es el caso es la leishmaniasis. En una forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es leishmaniasis o malaria. Más preferiblemente, una enfermedad parasitaria es provocada por una especie de Leishmania o por una de Plasmodium. En otra forma de realización preferida, una enfermedad parasitaria es provocada por una especie diferente de las especies de las que se deriva una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. En particular, la leishmaniasis provocada por una especie del género Leishmania se puede diagnosticar usando una composición basada en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 de otras especies de Leishmania. En una forma de realización, la leishmaniasis provocada por L. major se diagnostica con éxito con una composición que incluye una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 de L. major, L. infantum, L. brazilienzis o L. mexicana. Alternativamente, otras enfermedades parasitarias, tal como la malaria, se pueden diagnosticar con éxito con una composición basada en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 de otras especies, por ejemplo basado en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 de L. infantum, L. major, L. braziliensis o L. mexicana.

[0063] En principio, cualquier sujeto podría ser diagnosticado utilizando la invención. El método de diagnóstico se puede aplicar siempre que sea necesario en un sujeto. Preferiblemente, un sujeto diagnosticado es un sujeto sospechoso de tener un riesgo de haber sido infectado con dicho parásito que causa dicha enfermedad parasitaria. Un sujeto sospechoso de tener un riesgo de haber sido infectado con dicho parásito puede habitar en una zona endémica o habervisitado una zona endémica. Una zona endémica incluye el norte de África desde Argelia hasta Arabia Saudí, Kenya, Sudán, Etiopia. También incluye el sur de Europa: los países mediterráneos como España, Francia, Grecia, etc. También incluye América Central (todos los países) y América del Sur: Brasil, Venezuela, Perú, Bolivia, Colombia, norte de Argentina, Paraguay, Uruguay, Asia Central hasta el Sudeste de Asia: India, Irán, Iraq, Mogolia, Afganistán, Nepal, Bangladesh.

[0064] En el contexto de la invención, un uso tal y como se define aquí es preferiblemente un uso in vitro o ex vivo. Preferiblemente significa que dicho uso se realiza a partir de una muestra de dicho sujeto. Muestras preferidas incluyen sangre, suero, plasma, saliva, líquido cefalorraquídeo u orina. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de sangre o de suero obtenida de un sujeto.

[0065] En una forma de realización preferida, un diagnóstico se alcanza antes de la aparición de un síntoma de dicha enfermedad parasitaria, denominado diagnóstico pre-sintomático o diagnóstico de un sujeto asintomático. En este contexto, "pre-sintomático" se refiere preferiblemente al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos seis días, al menos siete días, al menos ocho días, al menos nueve días, al menos diez días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días o más antes de la aparición de un primer síntoma. Un primer síntoma o un primer signo clínico asociado a una enfermedad parasitaria tal como la leishmaniasis se puede seleccionar de la lista siguiente: fiebre, esplenomegalia, hepatomegalia, linfadenopatía, conjuntivitis, dermatitis onicogrifosis, queratoconjuntivitis, apatía y caquexia. La mayor parte de ellos se pueden detectar de forma simple mediante examen externo físico. Cada uno de conjuntivitis, dermatitis, onicogrifosis, queratoconjuntivitis es una forma de alteración cutánea.

[0066] Un primer síntoma preferido relacionado con la leishmaniasis es la linfadenopatía. Se puede detectar por examen externo físico tal como el palpamiento.

[0067] En otra forma de realización preferida, se obtiene un diagnóstico antes de la aparición de algunos de los síntomas de dicha enfermedad parasitaria, denominado diagnóstico de un sujeto oligosintomático. En este contexto, "oligosintomático" se refiere preferiblemente a un sujeto con un máximo de tres de los síntomas tal y como se han definido anteriormente.

[0068] En otra forma de realización preferida, se alcanza un diagnóstico antes de la aparición de todos los síntomas de dicha enfermedad parasitaria, denominado diagnóstico de un sujeto sintomático. En este contexto, "sintomático" se refiere preferiblemente a un sujeto con al menos cuatro de los síntomas tal y como se ha definido anteriormente incluyendo una forma de alteración cutánea tal y como se ha definido anteriormente.

[0069] La persona experta entenderá que el tipo más importante de diagnóstico es el diagnóstico de sujetos asintomáticos, dado que esto ayudará a prevenir la propagación de la enfermedad y se podría ayudar y curar a los sujetos asintomáticos de forma más eficaz si son diagnosticados en tal fase.

[0070] En este uso, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y/o una fuente de S4 y/o una de S6 pueden ser una proteína L5 o una proteína L3 y una proteína L5 y/o una proteína S4 y/o una S6 o fragmento de proteína que se usan para la detección de la presencia de un anticuerpo en una muestra como se explica en la siguiente sección.

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[0071] Alternativamente, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 y/o una fuente de S4 y/o una de S6 pueden ser una molécula de ácido nucleico que se utiliza para detectar la presencia de un ácido nucleico L3 y/o L5 y/o un S4 y/o un S6 en una muestra como se explica en la siguiente sección.

Método

[0072] En otro aspecto se proporciona un método para el diagnóstico de una enfermedad parasitaria en un sujeto utilizando una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5, el método comprende la determinación de si un anticuerpo que reconoce una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 está presente en una muestra obtenida del sujeto. Opcionalmente, una fuente de S4 y/o una de S6 también se pueden usar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Un método preferido de la invención es en cuanto a un uso preferido de la invención realizado in vitro o ex vivo preferiblemente. Una definición se ha dado aquí anteriormente.

[0073] En un método preferido, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 está presente en una composición. En una forma de realización preferida, otro compuesto está presente en dicha composición. Alternativamente, ningún otro compuesto está presente en dicha composición.

[0074] En una forma de realización preferida, otros compuestos se usan consecutivamente o simultáneamente con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 para mejorar la especificidad del método. Resulta ventajoso por ejemplo usar otros compuestos que podrán discriminar entre sujeto asintomático, oligosintomático o sintomático y sujeto vacunado. Más preferiblemente, tales compuestos no están presentes en una composición única junto con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Cada una de las proteínas identificadas en la sección titulada composición se pueden utilizar en este contexto. Por ejemplo dichos compuestos son seleccionados de un grupo que consiste en una fuente de otras proteínas de un parásito que causa una enfermedad parasitaria (19) tal como la Leishmaniasis. A una fuente de una proteína dada se le da el mismo significado que a una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 tal y como se ha definido aquí anteriormente. Una proteína preferida es en este contexto S6 o S4. Proteínas descritas son una histona tal como una H2A, H2B, H3, H4, otra proteína ribosómica tal como Li2A (LiP), LiP2b (LiP'), LiP0, L2, L7, L8, L16 y L19.

[0075] Otro ejemplo es el uso de poliproteínas que contienen diferentes antígenos de parásito (59, 61). Un ejemplo de una poliproteína es la proteína Q según se identifica en la EP 1 141 305. La proteína Q o una parte o un fragmento de la misma o una fuente de proteína Q o una fuente de un fragmento de proteína Q se puede utilizar en combinación con una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Antígenos preferidos son S4 y S6 o fragmentos de los mismos, o una molécula de ácido nucleico que codifica S4 o S6. Antígenos descritos incluyen una proteína de histona o fragmento de la misma o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha histona, donde una proteína de histona es H2A, H2B, H3 y/o H4 como se identifica en la EP 1 687 023. Histonas H2A, H2B, H3 y H4 son proteínas nucleares bien conservadas y su secuencia es bien conocida en la técnica, véase referencia 39. En una parte de la divulgación las histonas son obtenidas a partir de un organismo que está cerca del organismo causante de la enfermedad en el árbol evolutivo. Por lo tanto, de interés particular como una fuente de histonas para su uso en el tratamiento de enfermedades parasitarias tales como la leishmaniasis son los protozoos y en particular los miembros de la familia de los tripanosomátidos, como por ejemplo Plasmodium, tal como Plasmodium falciparum o más en particular especies diferentes del protozoo tripanosómico Leishmania.

[0076] En un método de diagnóstico más preferido, una enfermedad parasitaria se diagnostica cuando una cantidad detectable de un anticuerpo que reconoce una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5, preferiblemente proteína o péptido o parte de proteína está presente y/o cuando está presente un aumento de la cantidad de dicho anticuerpo. En un sujeto control o sano, dicho anticuerpo es generalmente no detectable.

[0077] La detección de la presencia de dicho anticuerpo se realiza usando métodos conocidos por la persona experta tal como un ELISA. Formas preferidas de detección son descritas en el ejemplo 1.

[0078] Un anticuerpo que reconoce una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5, preferiblemente una proteína o péptido o parte de proteína preferiblemente se refiere a que al menos un anticuerpo está presente que es capaz de reconocer al menos un compuesto presente en una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Dicho compuesto puede ser una proteína L5, o una proteína L3 y una proteína L5, o un fragmento de proteína L5 o una L3 y una L5 o parte de proteína o péptido. Lo mismo ocurre para un anticuerpo que reconoce una fuente de S4 y/o una de S6.

[0079] En otro método, una molécula de ácido nucleico L5, o una L3 y una de L5 es detectada utilizando otra molécula de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico L5, o L3 y L5 es preferiblemente una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula L5, o una L3 y una de L5 como se ha identificado anteriormente aquí o una parte de la misma. Otra molécula de ácido nucleico es preferiblemente un cebador diseñado para ser capaz de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico L5, o una L3 y una de L5 en una reacción por PCR o por transferencia de Northern. Lo mismo ocurre para un cebador capaz de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico S4 y/o S6. Cebadores preferidos para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico L5 o una L3 y L5 comprenden o consisten en las secuencias siguientes:

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adsorción se puede conseguir mediante el contacto de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad adecuada de tiempo. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero es típicamente entre 1 hora y 1 día. En general, poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o polivinilcloruro) con una cantidad de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 que varía de 10 ng a 1 g, y preferiblemente 100 ng, es suficiente para enlazar una cantidad adecuada de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5. Aquí también, cuando una cantidad o cantidad de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 es dada, define la cantidad total de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 usada.

[0085] La fijación covalente de una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 a un soporte sólido se puede conseguir generalmente reaccionando primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, en el polipéptido. Por ejemplo, una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 se pueden estar ligadas a un soporte que tiene un recubrimiento de polímero apropiado utilizando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el polipéptido (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) en A12-A13).

[0086] En formas de realización determinadas, un ensayo es un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA). Este ensayo se puede realizar poniendo en contacto primero una fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 que ha sido inmovilizada en un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de manera que los anticuerpos específicos para dicha fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5 de la muestra se dejen enlazar a la fuente de L5 inmovilizada o una fuente de L3 y una de L5. La muestra no unida se retira luego de la fuente inmovilizada y un reactivo de detección capaz de unión se añade al complejo inmovilizado [anticuerpo]/[fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5]. La cantidad de reactivo de detección que permanece ligado al soporte sólido se determina luego usando un método apropiado para el reactivo de detección específico.

[0087] Una vez que la fuente de L5, o la fuente de L3 y la L5 han sido inmovilizadas en el soporte, los sitios de unión a proteínas restantes en el soporte son bloqueados típicamente. Cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los técnicos en la materia, tales como albúmina de suero bovino (BSA) o Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se pueden emplear. La fuente de L5 inmovilizada, o la fuente inmovilizada L3 y las fuentes inmovilizadas L5, son luego incubadas con la muestra, y el anticuerpo (si está presente en la muestra) se deja enlazar con dicha fuente. Una muestra se puede diluir con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, período de incubación) es ese periodo de tiempo que sea suficiente para permitir detectar la presencia de anticuerpo dentro de una muestra. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de la unión que es al menos 95% del alcanzado en equilibrio entre el anticuerpo unido y no unido. Los técnicos en la materia reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar equilibrio se puede determinar fácilmente evaluando el nivel de unión que ocurre durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, un período de incubación de aproximadamente 30 minutos es suficiente generalmente.

[0088] La muestra no unida puede luego retirarse mediante lavado del soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS conteniendo 0,1% de Tween 20. El reactivo de detección puede entonces ser añadido a un soporte sólido. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se une al complejo inmovilizado [anticuerpo]/[fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5] y que se puede detectar por cualquiera variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un agente aglutinante (tal como, por ejemplo, proteína A, proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo indicador.

[0089] Grupos indicadores preferidos incluyen enzimas (tal como la peroxidasa de rábano), sustratos, cofactores, inhibidores, tintes, radionucleidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del agente aglutinante con el grupo indicador se puede conseguir utilizando métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Los agentes aglutinantes comunes también se puede adquirir conjugados con una variedad de grupos indicadores de muchas fuentes (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA and Pierce, Rockford, IL).

[0090] El reactivo de detección es luego incubado con el complejo inmovilizado [anticuerpo]/[fuente de L5 o una fuente de L3 y una de L5] durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo ligado. Una cantidad apropiada de tiempo puede generalmente ser determinada a partir de las instrucciones del fabricante o por evaluación del nivel de unión que se produce en un periodo de tiempo. El reactivo de detección no unido se retira luego y el reactivo de detección unido se detecta utilizando el grupo indicador.

[0091] El método empleado para la detección del grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radiactivos, los métodos de recuento por centelleo o autoradiográficos son apropiados generalmente. Los métodos espectroscópicos se pueden utilizar para detectar tintes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar utilizando avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Grupos indicadores enzimáticos se pueden detectar generalmente por la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico u otro de los productos reactivos.

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i. una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con SEQ ID NO: 2 o 4 o 49 o 51 o 53 o 55 o 65 (como ejemplo).

ii. unas secuencias de nucleótidos cuya cadena complementaria hibridiza a una molécula de ácido nucleico de la secuencia de (i);

iii. una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético.

iv. una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o 4 o 49 o 51 o 53 o 55 o 65.

[0101] En toda esta solicitud, cada vez que se hace referencia a una secuencia de aminoácidos específica SEQ ID NO (tomar SEQ ID NO: 1 o 3 o 48 o 50 o 52 o 54 o 56 como ejemplo), se puede reemplazar por:

un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o 3 o 48 o 50 o 52 o 54 o 56.

[0102] Cada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos descrita aquí en virtud de su identidad o porcentaje de similitud (al menos 60%) con una secuencia de nucleótidos dada o secuencia de aminoácidos respectivamente tiene en otra forma de realización preferida una identidad o una similitud de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de identidad o similitud con la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos dada respectivamente. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia o la similitud se determina por la comparación de la longitud entera de las secuencias según se identifica aquí.

[0103] "Secuencia de identidad" se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótido), como se determina por la comparación de las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula basada en la longitud total de dos SEQ ID NO dadas o en parte de la misma. Parte de la misma preferiblemente se refiere al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de ambas SEQ ID NO. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, si es necesario, según se determina por la correspondencia entre cadenas de tales secuencias.

[0104] La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos, incluyendo, pero no limitado a, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)).

[0105] Métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor correspondencia entre las secuencias evaluadas. Métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos disponibles públicamente. Métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen por ejemplo el paquete de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

[0106] Parámetros preferidos para comparar secuencias de polipéptidos incluyen el siguiente: algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: BLOSUM62 de Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); penalización de espacio: 12; y penalización de longitud del espacio: 4. Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "Ogap" de Genetics Computer Group, situado en Madison, WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de aminoácidos (junto con ninguna penalización para espacios finales).

[0107] Parámetros preferidos para la comparación de ácidos nucleicos incluyen el siguiente: algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: coincidencia=+10, no coincidencia=0; penalización por espacio: 50; penalización por longitud del espacio: 3. Disponible como el programa Gap de Genetics Computer Group, situado en Madison, Wis. Anteriormente se han dado los parámetros por defecto para comparaciones de ácidos nucleicos.

[0108] Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, la persona experta también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como será claro para la persona experta. Sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas

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recombinantes más CpG ODN. (*P < 0,05) Diferencias en la almohadilla plantaria inflamada entre L3 más CpG ODN, L5 más CpG ODN, L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y grupos de control (solución salina y adyuvante) fueron significativas estadísticamente en la semana seis después de la infección.

Figura 12. Carga parasitaria en los ratones vacunados. Las cargas parasitarias fueron determinadas en el bazo y en el DLN en la semana siete después de la infección. (A) Grupos de ratones de control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes sin adyuvante. (B) Grupos de ratones de control y grupos de ratones vacunados con las proteínas recombinantes más CpG ODN. (*P < 0,05) Diferencias en las cargas parasitarias de bazo entre L3 más CpG ODN, L5 más CpG ODN, L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y grupos de control (solución salina y adyuvante) fueron significativas estadísticamente. (*P < 0,05) Diferencias en las cargas parasitarias poplíteas entre L3 más L5 más CpG ODN o L3 más L5 más S6 más CpG ODN y grupos de control (solución salina y adyuvante) fueron significativas estadísticamente.

Figura 13. Representación esquemática de los constructos quiméricos propuestos. Los cebadores diseñados y los sitios de corte seleccionados para la clonación se muestran.

Ejemplos

Ejemplo 1: clonación de proteínas L3 y L5 de Leishmania major y efecto protector conferido por estas proteínas contra la infección de Leishmania major

Material y métodos

Cepas de ratones y parásitos.

[0114] Ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad) fueron comprados de Harlan Interfauna Ibérica S.A. (Barcelona, España).

[0115] Parásitos de L. major (WHOM/IR/-/173) fueron mantenidos en un estado virulento por pasaje en ratones BALB/c. Amastigotos de L. major fueron obtenidos y transformados en promastigoto mediante el cultivo a 26 °C en medio de Schneider (Gibco, BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 20% de suero fetal de ternera.

CpG-ODN.

[0116] CpG-ODN modificado con fosforotioato (5'-TCAACGTTGA-3' y 5'-GCTAGCGTTAGCGT-3') (SEQ ID NO: 5, 6) fueron sintetizados por Isogen (Países Bajos). Clonación de secuencias de ADN que codifican para proteínas ribosómicas de L. major L3 y L5.

[0117] El marco de lectura abierto (ORF) que codifica para las proteínas L3 y L5 de L. major se obtuvo de la base de datos genómica de L. major (www.genedb.ORG/genedb/leish) utilizando las secuencias de las proteínas L3 y L5 de S. cerevisiae como sondas (56). Para la expresión de las proteínas rLmL3 y rLmL5, sus regiones codificantes (CR) fueron amplificadas por PCR utilizando como modelo el ADN de L. major (MHOM/IL/80(Friedlin)). ADNs amplificados fueron clonados en el plásmido de PBluescript (Stratagene, La Jolla CA) y ordenados antes de clonación en el vector de expresión pQE30 (QIAGEN, Hilden, Alemania).

[0118] Para la clonación de la región codificante de LmL3, los cebadores empleados fueron: sentido, 5'-CGGGATCCATGTCTCACTGCAAGTTCGAG -3' (posiciones 1 a 20 de la región codificante de LmL3 (LmjF34.2880)) (SEQ ID NO: 44); antisentido, 5'-AACTGCAGTTACTTCTTCGCGGCCTTTG -3' (antisentido y complementario para las posiciones 1241 a 1260 de la región codificante de LmL3 (LmjF34.2880)) (SEQ ID NO: 45). Los sitios de restricción BamHI y PstI (subrayados) fueron incluidos para fines de clonación.

[0119] Para la clonación de la región codificante de LmL5, los cebadores empleados fueron: sentido, 5'-CGGGATCCATGTGCACGC TGGCAAATTG -3' (posiciones 1 a 20 de la región codificante de LmL5 (LmjF35.1890)) (SEQ ID NO: 46); antisentido, 5'-CCCAAGCTTTTACTTGCCGAGGCGCTCGC-3' (antisentido y complementario para las posiciones 968-987 de la región codificante de LmL5 (LmjF35.1890.319)) (SEQ ID NO: 47). Los sitios de restricción BamHI y HindIII (subrayado) fueron incluidos para fines de clonación.

Purificación de proteína.

[0120] Las proteínas rLmL3 y rLmL5 fueron sobreexpresadas en el Escherichia coli transformado con los plásmidos pQE-LmL3 o con pQE-LmL5 y purificadas bajo condiciones de desnaturalización sobre columnas de agarosa de ácido Ni-nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen). Después de la unión a agarosa de Ni-NTA las proteínas recombinantes de fueron redobladas en la columna de afinidad como se describe (57). Las proteínas recombinantes fueron pasadas a través de una columna de polimixina-agarosa (Sigma, St. Louis, Mo.). El contenido de endotoxina residual (<12pg/µg de proteína recombinante) fue medido por ensayo de amebocitos del Limulus cromogénico cuantitativo QCL-1000 (BioWhittaker, Walkersville, Md.).

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L. infantum SKSLPKKAKKEGVAHKSYKTKKLSGAEKRAAAKAKVAAIRERLGK

Tabla 1

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LmL3

L. major: L. infantum L. mexicana

L. major: 100,0% (100.0%) 99,5% (99,5%) 98,6% (99,5%)

L. infantum: 100,0% (100,0%) 98,1% (99,0%)

L. mexicana: 100,0% (100,0%)

B Se muestran los valores de identidad y similaridad (entre paréntesis)

LmL5

L. major: L. infantum L. braziliensis L. mexicana

L. major: 100,0% (100,0%) 99,3% (100,0%) 94,8% (97,4%) 99,3% (99,7%)

L. infantum: 100,0% (100,0%) 94,8% (97,4%) 99,3% (99,7%)

L braziliensis: 100,0% (100,0%) 94,8% (97,4%)

L. mexicana: 100,0% (100,0%)

Ejemplo 3: La vacunación con rLmL3 + CpG-ODN y rLmL5 + CpG-ODN protege a los ratones BALB/c contra la exposición a L. braziliensis.

[0138] Hemos analizado el efecto de la inmunización de las proteínas recombinantes de L. major rLmL3 y rLmL5 combinadas con un adyuvante de inducción de Th1 (CpG-ODN) en el desarrollo de la leishmaniasis cutánea provocada por la infección con L. braziliensis. Para tal fin, grupos de cinco ratones fueron independientemente inmunizados con 10 µg de rLmL3 o 10 µg de rLmL5 en combinación con 50 µg de CpG-ODN (25 µg de CpG-1 [5'-TCAACGTTGA-3'] más 25 µg de CpG-2 [5'-GCTAGCGTTAGCGT-3') ] (SEQ ID NO: 5 y 6)). Como control, grupos de cinco ratones fueron inmunizados con 50 µg de CpG-ODN solo o con PBS (tampón empleado como excipiente). Los ratones fueron inoculados en la dermis de la oreja (oreja izquierda). Cada grupo fue estimulado dos y cuatro semanas más tarde con la misma dosis usada para el cebado. La exposición parasitaria se efectuó por inyección en la oreja (no tratada) derecha con 105 promastigotos fijos de L. braziliensis (MHOM/BR/01/BA788) combinado con dos pares de glándulas salivales de mosca de arena Lutzomya intermedia. En este modelo de infección, después de la exposición al parásito, los ratones BALB/c desarrollaron lesión inflamatoria en las orejas infectadas que progresó firmemente y alcanzó un máximo de aproximadamente en la semana 5. Posteriormente, el tamaño de la lesión retrocedió y se observó cicatrización completa de la oreja aproximadamente en la semana 9 post-infección (72). Hemos analizados el desarrollo de la lesión cutánea en los cuatro grupos de ratones hasta 5 semanas después de la exposición parasitaria midiendo el grosor de la lesión con un calibrador métrico. Como se muestra en la figura 7A, las lesiones de oreja de ratones vacunados con rLmL3 + CpG-ODN o rLmL5 + CpG-ODN fueron inferiores significativamente comparadas con PBS en los grupos de control de CpG-ODN. Además, la carga parasitaria fue analizada en la semana 5 después de la infección en las orejas infectadas. El número de parásitos fue determinado por ensayo de dilución limitante como se describe (73). Una reducción en la carga parasitaria fue observada en los ratones vacunados cuando se comparó con los grupos de control. Se descubrieron diferencias significativas en el grupo rLmL5 + CpG-ODN con respecto a ambos grupos de control (P < 0,05, prueba de t Student). Además, no se detectaron parásitos en la oreja en cuatro de los cinco ratones (grupo rLmL5

+ CpG-ODN) y uno de los cinco ratones en el grupo rLmL3 + CpG-ODN (Fig. 7B). Así, se concluyó que los ratones vacunados con las proteínas ribosómicas L3 y L5 de L. major expresadas como proteínas recombinantes y combinadas con CpG-ODN estaban protegidas contra una exposición heteróloga con L. braziliensis.

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Claims

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