CZ2001839A3

CZ2001839A3 - Peptidové fragmenty toxinu B cholery nebo enterotoxinu B jako vakcinační adjuvans

Info

Publication number: CZ2001839A3
Application number: CZ2001839A
Authority: CZ
Inventors: Neil Andrew Williams; Timothy Raymond Hirst
Original assignee: University Of Bristol
Priority date: 1998-09-07
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2001-08-15
Also published as: KR20010044842A; PL346549A1; JP2002524469A; AU5751699A; ZA200100758B; WO2000014114A1; CA2338384A1; GB9819484D0; AU772015B2; MXPA01002387A; NZ509631A; BR9913501A; NO20011075D0; IS5829A; NO20011075L; IL141695A0; GB0107375D0; EP1109828A1; EA200100314A1; CN1317013A

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje látku. Vynález zvláště popisuje látku, která je schopna vykazovat jednu nebo vice vlastnosti, které je možné použit v medicíně. Uvedenou látku je možné použít jako imunomodulátor a/nebo jako adjuvans a/nebo jako inhibitor průjmových onemocnění vyvolaných toxinem.

Vynález zvláště popisuje použití imunomodulační látky při úpravě imunitní odpovědi spojené s autoimunitním onemocněním. Vynález zvláště popisuje použití uvedené látky

Vynález zvláště popisuje použití látky jako adjuvans, které se používá v kombinaci s příbuzným nebo nepříbuzným antigenem. Vynález zvláště popisuje použiti látky za účelem inhibice průjmových onemocnění vyvolaných toxinem.

Vynález dále popisuje test pro vyhledávání činidel schopných interagovat s látkou podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Tepelně labilní enterotoxin mikroorganizmu Escherichia coli (E. coli) (Etx) a jeho blízce příbuzný homolog toxin cholery (Ctx) mikroorganizmu Vibrio cholerae jsou příklady proteinových toxinů, které se vážou na glykolipidové receptory na povrchu hostitelských buněk. Takový toxin obsahuje šest nekovalentně vázaných polypeptidových řetězců, které zahrnují jedinou podjednotku A (o molekulové hmotnosti 27 000) a pět identických podjednotek B (o molekulové hmotnosti 11 600), které se vážou na receptory gangliosidu GM-1 zjištěné na povrchu savčích buněk (popisuje se v publikaci Nashar et al., 1996 Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 226-230). Podjednotka A • ·· · · · · · ··· · · · ··♦·♦····· ·· ······ ··· · ·· ··· ·· ··· odpovídá za toxicitu způsobenou adenozindifosfátem (ADP) (ADPribosyltransferázová aktivita), zatímco podjednotky B (EtxB a CtxB) jsou netoxické oligoméry, které se váží a tvoří příčné vazby s glykolipidovými gangliosidy, jenž se nacházejí pouze na buněčném povrchu, nazývají se GM-1 a umožňují podjednotce A vstoupit do buňky.

Na rozdíl od slabé imunogenicity samotné podjednotky A, jak EtxB tak CtxB jsou výjimečně silnými imunogeny a jejich holotoxiny Etx a Ctx (které obsahují podjednotky A a B) jsou známy jako silná adjuvans v případě, že se aplikují orálním způsobem v kombinaci s antigeny, které nejsou příbuzné (popisuje se v publikaci Ruedl et al., 1996 Vaccine 14: 792798, Nashar et al., 1993 Vaccine 11: 235, Nashar and Hirst,

1995 Vaccine 13: 803, Elson and Ealding, 1984 J. Immunol. 133: 2892? Lycke and Holmgren 1986 Immunology 59: 301). Vzhledem k jejich imunogenicitě, jak EtxB tak CtxB se používají jako nosiče jiných epitopů a antigenů (popisuje se v publikaci Nashar et al., 1993 Vaccine 11: 235) a používají se jako komponenty vakcín proti choleře a průjmovým onemocněním způsobeným mikroorganizmem E. coli (popisuje se v publikaci Jetborn et al., 1992 Vaccine 10: 130).

Provedlo se několik studií imunodominantního epitopu podjednotek CtxB a EtxB z pohledu vývoje vakciny proti toxinu cholery a tepelně nestálému toxinu mikroorganizmu E. coli.

V dokumentu přihláška patentu UK č. 2 415 419A se popisuje syntetická vakcína proti choleře a tepelně nestálému toxinu mikroorganizmu E. coli, která obsahuje konjugát nosiče se syntetickým polypeptidem, jenž odpovídá části sekvence CtxB.

Dokument WO 85/02611 popisuje polypeptidy odpovídající určitým sekvencím EtxB, které je možné použít jako konjugáty nebo jako aktivní ingredience za účelem vytvoření protilátek proti podjednotce B a při vzniku ochrany hostitelských zvířat proti infekci enterotoxiny.

Dokument WO 89/10967 popisuje aminokyselinovou sekvenci, která reprezentuje zbytky v poloze 50 až 64 CtxB, které se mohou použit v kombinaci s epitopy heterologního organizmu, jako je Flagellum a/nebo Salmonella, ve vakcinačnich prostředcích za účelem vzniku ochrany proti infekci heterologním organizmem nebo proti stavům nebo poruchám způsobeným antigenem organizmu.

Dokument WO 90/03437 popisuje hybridní protein, který fúzuje s aktivní sekvencí podjednotky CtxB heterologního antigenů, který je možný použít pro vakcinační účely, zvláště pak napomáhá stabilizaci heterologních antigenů v prostředí střev.

Dokument WO 94/06465 popisuje aminokyselinové fragmenty, které se vážou pomoci linkeru nebo bez něho na vhodný nosič tak, že aminokyselinový fragment vázaný na nosič tvoří opsonizační nebo ochranou imunitní odezvu na epitopy fragmentu.

Dokument WO 95/29701 popisuje vakcínu proti mikroorganizmu

Vibrio cholera, která obsahuje cholery (CTB) nebo fragment konjugát podjednotky toxinu B syntetického peptidu, který obsahuje jeho část.

Může to být například peptid CTP 3 obsahující sekvenci 50 až aminokyselin řetězce B spojeného s inertním nosičem.

Dokument WO 96/26282 popisuje expresívní systémy vhodné pro expresi genových produktů z rekombinantních kmenů organizmu Bordetella, kde genovým produktem může být molekula toxinu cholery.

• · 4 ·

Dokument WO 96/34893 popisuje hybridní molekuly mezi EtxB a CtxB, které se mohou použít jako vakcína a mohou zabránit a/nebo léčit onemocnění vyvolané enterotoxinem u jednotlivců.

Dokument WO 98/21344 popisuje podjednotku EtxB, která se upravila tak, aby zahrnovala začleněný antigenní peptid. Chimérová molekula antigen-EtxB se používá k vyvolání protilátkové odezvy proti antigennímu peptidu v hostitelském zvířeti.

Tyto studie se týkají použití i) peptidu, který obsahuje část sekvence CtxB/EtxB nebo ii) peptidu, který obsahuje část sekvence CtxB/EtxB spojeného s druhou entitou (jako je antigen) za účelem vyvoláni a/nebo dosáhnuti maxima imunologické odezvy na uvedený peptid. V těchto dokumentech se popisuje použití imunodominantního epitopu CtxB/EtxB nebo jeho částí, jako imunogenu při indukci imunologické odpovědi proti vývoje imunity proti choleře vyvolaným mikroorganizmem E. popisuje chimerový protein, oblast epitopu požadovaného mohl podjednotkám z pohledu průjmovým onemocněním

Dokument WO 91/07979 zahrnuje část CtxB a který se navrhl tak, aby se vyvolání imunitní odpovědi u Část CtxB je možné použít modulátor. Žádný ze shora použití peptidu CtxB/EtxB imunoterapeutického činidla odpověď.

Ukázalo se, že podjednotka použít jako vakcína subjektu na požadovaný jako adjuvans, a/nebo coli. který antigenu, za účelem antigen.

ale nikoli jako dokumentů nepopisuje jeho části jako upravit imunitní

EtxB je schopna působit jako uvedených nebo schopného imunomodulátor při poruchách imunity.

Dokument WO 97/02045 popisuje, že EtxB se váže na gangliosidové receptory GM-1, které se nacházejí na povrchu savčích buněk a že toto navázání vyvolává různé účinky na populaci lymfocytů, které zahrnují specifickou depleci T buněk CD8+ a spojenou aktivaci buněk B.

• · ······ · ·· · ······· • · ······ · · c ·········« ·· ······ ··· · ·· ··· ·· ··«

K těmto účinkům nedochází v případě, že se použije mutantni protein EtxB (G33D) (nevykazuje vazebnou aktivitu vůči GM-1). Tyto experimentální výsledky naznačují, že všechny funkce spojené s EtxB a CtxB je možné přisoudit kapacitě podjednotek EtxB a CtxB vázat se na receptor GM-1, protože mutanti nevykazují kapacitu vázat se na GM-1 (tak jako EtxB (G33D) ) , čímž nemohou působit jako adjuvans nebo jako imunomodulátory. Předchozí stav techniky naznačuje, že imunomodulace a jiné účinky Etx a Ctx jsou způsobeny prostřednictvím navázání GM-1. Do dnešní doby se zatím zkoumaly mutanti CtxB/EtxB, který vykazují kapacitu vázat se na receptor GM-1, ale nevykazují imunomodulační účinky. Překvapivě se zjistilo, že ne všechny účinky Etx a Ctx zprostředkovává navázání na GM-1.

Podstata vynálezu

V souladu s vynálezem jsme nezjistily, že imunomodulace a některé jiné účinky Etx a Ctx nejsou zprostředkovány prostřednictvím navázání na GM-1.

Vynález popisuje látku obsahující libovolný jeden nebo více zástupců uvedených ve skupině: aminokyselinová sekvence obsahující sekvenci prezentovanou jako SEQ ID NO: 2 nebo její variantu nebo její homolog nebo její fragment nebo její derivát nebo napodobeninu, která je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jako EtxB a/nebo CtxB, ale látka není schopna vykazovat vazebnou aktivitu vůči GM-1.

Vynález popisuje látku obsahující libovolný jeden nebo více zástupců zahrnutých ve skupině: aminokyselinová sekvence obsahující sekvenci prezentovanou jako SEQ ID NO: 2 nebo její variantu nebo její homolog nebo její fragment nebo její derivát nebo napodobeninu, která je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jako smyčka EtxB a/nebo CtxB, ale látka není schopna vykazovat vazebnou aktivitu vůči GM-1.

β • 4 • ·

Vysoce preferované provedeni vynálezu popisuje látku obsahující libovolný jeden nebo více zástupců zahrnutých ve skupině: aminokyselinová sekvence obsahující sekvenci prezentovanou jako SEQ ID NO: 2 nebo její variantu nebo její homolog nebo její fragment nebo její derivát nebo napodobeninu, která je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jako β4-α2 smyčka EtxB a/nebo CtxB, ale látka není schopna vykazovat vazebnou aktivitu vůči GM-1.

Látka podle vynálezu může být aminokyselinová sekvence nebo její chemický derivát. Uvedenou látkou může být syntetický peptid nebo varianta syntetického peptidu, jako je retroinverzní peptid D. Látka může být dokonce organickou sloučeninou nebo jinou chemickou sloučeninou. Dalším příkladem jsou napodobeniny SEQ ID NO: 2.

Látka podle vynálezu může působit podobným nebo stejným způsobem jako EtxB a/nebo CtxB.

Termín „stejný nebo podobný znamená spíše kvalitativní než kvantitativní termín. Může být nutné, aby látka vykazovala zvýšenou vazebnou aktivitu.

Pro odborníka je poměrně jednoduché vytvořit test vhodný pro stanovení, zda látka je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jako EtxB a/nebo CtxB. Test může například určit a/nebo měřit účinek na buněčnou populaci, jako je populace lymfocytů. Tyto účinky zahrnují, ale nejsou omezeny na vyvolání apoptózy T buněk CD8+, zvýšenou aktivitu T buněk CD4+ a polyklonální aktivaci B buněk. Navíc nebo jako alternativa mohou být tyto testy založeny na stanovení a/nebo měření určitých buněčných markérů, které se vyskytují na povrchu buněk a které udávají aktivaci jistých vnitrobuněčných jevů (například měření zesílení exprese CD25).

····

Látka podle vynálezu není schopna vykazovat vazebnou aktivitu vůči GM-1.

Test vhodný pro stanovení chybějící vazebné aktivity vůči GM-1 je pro odborníka jednoduše determinovatelný. Test například může využívat GM-1 vázaný na pevný povrch, přičemž látka prochází přes navázaný GM-1. Ředění látky je rozhodující při jejím navázání na GM-1. Test se popisuje v dokumentu WO 97/02045.

vazebná aktivita látky je nezbytně jak se zjistilo v případě podjednotek Ctx a EtxB v plné délce. Primární vazebná kapacita je v případě Ctx a EtxB v plné délce vazebná kapacita na GM-1. navázání.

Je nutné poznamenat, že závislá na primárním navázáni,

S tímto ohledem látka může vykazovat jediné však látka může vykazovat vazebnou aktivitu.

V některých případech vykazovat víc jak jednu schopnost

Upřednostňuje se, a/nebo v podstatě čistá.

aby látka byla v podstatě izolovaná

Termín „izolovaný a „čistý znamená molekuly a to buď sekvence nukleové aminokyseliny, odstranily z jejich nebo separovaly od kterým jsou přirozeně nebo ředidly, které látky, na kterou se bude pohlížet stále jako na kyseliny nebo přirozeného prostředí a/nebo se jednoho jiného

Protein se může které se izolovaly alespoň spoj ené.

nebudou interferovat s komponentu, se míchat s nosiči účelem použití izolovanou.

Vynález je založen na překvapujícím zjištění, že existují mutanti, který jsou schopni se vázat na receptor GM-1, ale které nevykazují imunomodulační účinek. Tyto mutanti umožňují objasnit mechanizmus, kterým podjednotky B molekul Ctx a/nebo

Etx působí. Zvláště pak jde o imunomodulační účinek vis-a-vis.

Vynález dále popisuje látku, kterou je možné použít v medicíně.

Vynález dále imunomodulátor.	popisuj e	látku,	kterou	je	možné	použít	jako
Vynález dále	popisuj e	látku,	kterou	je	možné	použít	jako
adjuvans.
Vynález dále	popisuj e	látku,	kterou	je	možné	použít	jako
inhibitor průjmového onemocnění indukovaného	toxinem.

Vynález dále popisuje látku, která navíc obsahuje antigen nebo antigenní determinantu.

Vynález dále popisuje farmaceutický prostředek obsahující látku podle vynálezu, která se smíchala s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, ředidly nebo ekcipienty.

Vynález dále popisuje použití látky podle vynálezu vhodné při výrobě léku, který je schopen léčit a/nebo předcházet a/nebo upravovat onemocnění a/nebo stavy spojené s poruchami imunity a/nebo poruchy zprostředkované toxinem.

Vynález . dále popisuje testovací metodu vhodnou pro stanovení jednoho nebo více činidel, které jsou schopny interagovat s látkou a/nebo ovlivňovat látku podle vynálezu. Test zahrnuje kontakt látky s testovaným činidlem a pak stanovení, zda činidlo ovlivňuje látku.

Vynález dále popisuje činidlo identifikované testovací metodou podle vynálezu.

Způsob léčby, který zahrnuje aplikaci látky podle vynálezu subjektu na základě léčby a/nebo prevence a/nebo modulace onemocnění a/nebo stavů spojených s poruchami imunity a/nebo poruch zprostředkovaných toxinem.

♦ ···

Imunomodulátor

Termín „imunomodulátor znamená látku, která je schopna upravit imunitní odpověď zahrnující například účinek na buňku, jako jsou lymfocyty, který přednostně vede k vyvolání apoptózy u T buněk CD8+ a/nebo zesíleni aktivace buněk CD4+ a/nebo polyklonální aktivace B buněk.

Termín „diferenciální účinek na leukocyty zahrnuje specifickou depleci buněk CD8+ (prostřednictvím apoptózy), zesílenou aktivitu T buněk CD4+ a/nebo spojenou aktivaci B buněk.

Upřednostňuje se, aby imunomodulátor byl schopen negativně regulovat patologickou· odezvu Thi a/nebo imunitní odpovědi spojené s Th2.

Upřednostňuje se, aby imunomodulátor byl schopen pozitivně regulovat produkci protilátek na povrchu sliznic.

Adj uvans

Termín „adjuvans je látka, která nespecificky zvyšuje imunitní odpověď na antigen.

Adjuvans zahrnuje libovolnou látku, která je schopna ovlivňovat rozsah imunitní odpovědi na entitu, jako je antigen a/nebo antigenní determinanta tím, že se změní antigenicita změní specifická reaktivita a antigenů nebo se mechanizmy spojené s efektorem hostitele.

nespecifické

To znamená, že imunitní určitým adjuvans odpověď vyvolaná v hostitelské směrem. V preferovaném provedení je schopné působit jako sliznični adjuvans.

je řízena podle vynálezu buňce

Upřednostňuje se, aby adjuvans bylo schopno prodloužit působení antigenů a poskytnout u savce trvalou imunologickou odpověď.

Termín „antigen znamená entitu, která v případě, že se •t ·«··

Antigen zavede do imunokompetentniho hostitele, stimuluje produkci protilátek, které specifických protilátek nebo kombinovat s entitou. Antigen může být čistá látka, nebo rozpustný nebo částicový materiál (zahrnující buněčné vhodnou antigen se mohou směs látky buňky nebo fragmenty).

antigenní reaguj lei tolerogen, alergen, jako kombinace. Tyto

Termín stimuluj e reakci typu

V tomto smyslu termín zahrnuje libovolnou determinantu, zkříženě, autoantigen, aloantigen, samoantigen, xenoantigen, hapten a imunogen nebo jeho termíny je možné v textu „alergen alergickou části stejně zaměnit.

zahrnuje libovolný reakci vyvolávající zdrojů alergenů jsou

Příklady běžných žito, plísně, divoký oves, „Bermuda, kvasinky, bříza, ořechy, buk, Aspergillus spp., Cladosporium

Basidospores, morče, křeček, pteronyssinus, antigen, který hypersenzitivní například

Kentucky

Cupressae, dub, spp., Alternaria trávy,

Blue, olivy,

Ascomycetes pšenice, saranče, komár, spp., králík, kočka, pes, kůň, papoušek, holub, kachna, kuře, Dermatophagoides D. farinae, Euroglyphus maynei, šváb, mouchy, mléčné produkty, nápoje, káva, čokoláda, antibiotika, sulfasalazin, mořské potraviny, luštěniny, vejce, ovoce, rajčata, penicilíny, , ořechy, cereálie, houby, alkoholické vosy, krve, proti karbamazepin,· solfoamidy a jiná žihadlo od včely a produkty vylučované při kousnutí mravence a komára do sérum, vakcíny, kontrastní média, léky (zahrnující léky

Antigenní determinanta

Termín „antigenní determinanta znamená místo na antigenu, které rozeznávají protilátky nebo receptor T buněk. Přednostně • ··· • · · · je to krátký peptid získaný z proteinového antigenu jako jeho část. Termín také zahrnuje epitopy glykopeptidů a sacharidů. Termín také zahrnuje upravené sekvence aminokyselin nebo cukrů, které stimulují odpověď, když rozeznají celý organizmus.

Je výhodné, jestliže antigenní determinanta je antigenní determinantou infekčního činidla (jako je bakterie nebo virus), která způsobuje infekční onemocnění.

V případě, že infekční činidlo je EBV pak antigenní determinantou může být antigenní determinanta gp340 nebo gp350 nebo determinanta latentního proteinu (například EBNA, 1, 2

3A, 3B, 3C a -LP,

LPM-1,

-2A a 2B nebo EBER) . Jestliže infekčním činidlem je virus chřipky, pak antigenní determinantou může být antigenní determinanta virového obalového proteinu (například haemaglutinin a neuraminidáza) nebo vnitřní protein (například jaderný protein). V případě, že infekční činidlo se vybralo ze skupiny zahrnující enteropatogenní, enterotoxigenní, enteroinvazivní, enterohaemoragické a enteroagregační mikroorganizmus E. coli, pak antigenní determinantou může být antigenní determinanta bakteriálního toxinu nebo adhezivní faktor.

Je také výhodné, když antigenní determinantou je antigenní determinanta z autoantigenu.

Činidlo

Činidlem může být aminokyselinová sekvence nebo její chemický derivát.

Látku může dokonce tvořit organická sloučenina nebo jiná chemikálie.

Činidlo může být tvořeno nukleotidovými sekvencemi, kterými mohou být „sence nebo „antisence sekvence.

Činidlem mohou být protilátky.

V preferovaném provedení vynálezu činidlo je buněčný receptor, který je zabírán látkou.

• · · ·· ···

Inhibitor průjmového onemocněni vyvolaného toxinem

Termín „inhibitor průjmového onemocnění vyvolaného toxinem znamená libovolnou látku, která je schopna ovlivňovat aktivitu holotoxinů Etx/Ctx tak, že je možné se vyhnout patologickým důsledkům Etx/Ctx, jako je průjem.

Vynález popisuje vysoce překvapující zjištění:

i) látka podle vynálezu je schopna působit jako imunomodulátor a/nebo jako adjuvans a/nebo jako inhibitor průjmu vyvolaného toxinem, který je schopen ovlivnit průjmové onemocnění způsobené enterotoxinem.

ii) látka podle vynálezu je schopna působit stejným nebo podobným způsobem, jako EtxB a/nebo CtxB. Aktivita látky podle vynálezu se může zprostředkovat tak zvanou β4-α2 smyčkou EtxB a CtxB, která je flexibilní smyčkou, která zahrnuje aminokyselinové zbytky 45 až 65.

iii) molekuly EtxB s bodovou mutací na třech oddělených místech ve smyčce β4-α2 (polohy 51, 56 a 57) si uchovávají vazebnou aktivitu na GM-1, ale chybí jim jiné aktivity, jako je toxicita a kapacita pozitivně regulovat CD25 a způsobit apoptózu T buněk pozitivních na CD8. Navíc holotoxiny Ctx obsahující podjednotky B s mutacemi také vykazují defekt ve schopnosti způsobit sekreci elektrogenního chloridu, což je primární sekreční jev odpovědný za zprostředkování průjmového onemocnění. Toto zjištění je zvláště překvapující, protože se uvažovalo, že flexibilní smyčky slouží pouze ke spojení dvou < elementů sekundární struktury a pouze řídce vykazuji samy důležitou úlohu, iv) není nutné, aby vazebná aktivita látky závisela na primárním navázání, jak se zjistilo u Ctx a EtxB v plné délce. V případě Ctx a EtxB v plné délce je primární aktivita vazebnou aktivitou GM-1.

·♦·· • · · ·

13'

Toxiny Ctx/Etx

Termín „Ctx znamená toxin cholery a termín „CtxB znamená podjednotku B toxinu cholery. V jiných textech je možné tyto termíny definovat jako CT nebo Ct nebo CTB nebo CtB.

Termín „Etx znamená tepelně nestabilní enterotoxin z mikroorganizmu E. coli a termín „EtxB je podjednotka B Etx. V jiných textech je možné tyto termíny definovat jako LT nebo Lt a LTB nebo LtB.

Smyčka β4-α2

Vynález popisuje látku obsahující sekvenci EVPGSQH (SEQ ID NO: 2), která je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jako EtxB a/nebo CtxB nebo jejich varianta nebo jejich homolog nebo fragment nebo derivát nebo jejich napodobenina, ale které nejsou schopny vykazovat vazebnou aktivitu na GM-1.

Věří se, že navázání pět podjednotek Etx/CtxB na

GM-1 je interakce s vysokou afinitou, která umožňuje, aby se obj evila relativně nízká afinitní sekundární vazebná aktivita

EtxB/CtxB.

Toto navázání je zprostředkováno smyčkou β4-α2

EtxB/CtxB.

St^4-a2. Struktura smyčky β4-α2

EtxB/CtxB je možné pochopit na základě odkazu na molekulovou strukturu Etx, jak se popisuje v publikaci Sixma 230, 890-918), jak se uvádí

Mol. Biol. (1993) na obrázku

Každá podjednotka B Etx nebo Ctx obsahuje malou Nterminální dvoušroubovici (al), dva třiřetězcové paralelní listy (list I složený ze řetězců β2, β3, β4 a list II složený z řetězců βΐ, β5 a βδ) a dlouhý α-helix (a2) . Dva beta listy tvoří beta válec. Smyčka spojující uvedené elementy sekundární struktury v podjednotce B se může rozdělit do dvou tříd ·· ···· s ohledem na dva konce listů. Na jednom konci podjednotky, což je „úzký konec (nebo konec „A) je smyčka v obecném případě krátká a zahrnuje spojení β1-β2, β3-β4 a α2-β5, stejně jako Ckonec. Podjednotka rozšiřuje druhý konec s daleko delší smyčkou spojující elementy sekundární struktury ccl-βΐ, β2-β3, β4-α2. Nejdelší smyčka spojuje elementy β4 a a2 (zde se popisuje jako smyčka β4-α2) a zahrnuje zbytky Glu 51 až Asp 59 a přesahuje celou plochu beta listů. Tato smyčka je docela flexibilní, ale po navázání laktózy se stává znatelně méně mobilní (popisuje se v publikaci Sixma et al. , Nátuře (1992) 355, 561-564). Vynález dále popisuje, že smyčka β4-α2 EtxB/CtxB je odpovědná za sekundární vazebnou aktivitu a tak se používá při izolaci ze zbytku molekuly CtxB/EtxB (například jako peptid), což umožní, že se objeví sekundární vazebná aktivita, když není přítomna první. Selektivní mutace smyčky β4-α2 nebo peptidů odvozeného z této smyčky se může využít z pohledu zvýšení afinity sekundární vazebné aktivity. Zvýšením aktivity sekundární vazebné afinity je možné zabránit interakci s GM-1.

Termín „smyčka β4-α2 EtxB/CtxB je entita, která je odpovědná za sekundární vazebnou aktivitu podjednotek B toxinů, jako je toxin cholery a tepelně nestabilní toxin mikroorganizmu E. coli. Když se smyčka β4-α2 použije při izolaci ze zbytku molekuly EtxB a/nebo CtxB (například jako peptid), může se objevit sekundární vazebná aktivita v nepřítomnosti první vazebné aktivity a je zde označena jako aktivita nebo jako vazebná aktivita.

Upřednostňuje se, aby látka podle vynálezu obsahovala izolovanou smyčku β4-α2 EtxB/CtxB.

Upřednostňuje se, aby látka obsahovala napodobeninu izolované smyčky β4-α2 EtxB/CtxB.

·♦·· • · ·· ···

Upřednostňuje se, když látka .obsahuje ·· «··· •4 •· · · ··999 napodobeninu izolované smyčky β4-α2

EtxB/CtxB s vysokou afinitní vazebnou aktivitou.

Upřednostňuje se, aby látka obsahovala peptid, který zahrnuje přibližně 5 až 40 aminokyselin.

Upřednostňuje se, aby peptid obsahoval méně než 25 aminokyselin.

Jestliže peptid je fúzni protein, upřednostňuje se, aby obsahoval více než 25 aminokyselin.

Upřednostňuj e	se,	aby	látka	obsahovala	sekvenci
VEVPGSQHIDSQ (SEQ ID	NO: 3)	•
Upřednostňuj e	se,	aby	látka	obsahovala	sekvenci
GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI	(SEQ	ID NO:	4) .
Upřednostňuj e	se,	aby	látka	obsahovala	sekvenci
GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI	(SEQ	ID NO: 5)	odvoditelnou	ze zbytků

v poloze 45 až 65 prasečího mikroorganizmu E. coli.

Přednostně látka obsahuje zbytky v poloze 45 až 65 odvoditelné z EtxB lidské varianty mikroorganizmu E. coli a z EtxB prasečí varianty organizmu E. coli.

Aminokyselinová sekvence

Vynález popisuje látku obsahující aminokyselinové sekvence podle vynálezu, které jsou schopny působit jako imunomodulátory a/nebo adjuvans a/nebo inhibitor průjmového onemocnění způsobeného toxinem, který je schopen ovlivnit průjmové onemocnění způsobené enterotoxinem. Látka se může také použít v testech vhodných pro identifikaci jednoho nebo více činidel schopných interagovat a/nebo ovlivňovat aktivitu látky.

• ···

9

9 9 «0 ··«· • ♦ · ♦ 9 999

Termín „aminokyselinová sekvence znamená peptidovou, polypeptidovou sekvenci, proteinovou sekvenci nebo její části.

Ovlivnění

Termín „ovlivnění znamená úpravu, jako je léčba, prevence, potlačení, zmírnění, opětné získání a úpravu aktivity látky.

Termín „úprava znamená znemožnění, umlčení, mutaci, odstranění, zvýšení, snížení, agonizaci, antagonizaci, snížení nebo blokování aktivity látky.

Varianty, homology a deriváty

Preferované aminokyselinové sekvence podle vynálezu jsou SEQ ID NO:· 2 nebo SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 nebo sekvence získatelné z látky podle vynálezu, ale také zahrnují homologní sekvence získatelné z libovolného zdroje jako jsou příbuzné virové/bakteriální proteiny, buněčné homology a syntetické peptidy, stejně jako jejích varianty nebo deriváty.

Vynález pokrývá varianty, homology nebo deriváty zde prezentovaných aminokyselinových sekvencí stejně jako varianty, homology nebo deriváty nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence.

V souladu s vynálezem se vybere homologní sekvence tak, aby zahrnovala aminokyselinovou sekvenci, která může vykazovat alespoň 75, 85 nebo 90 % shodu. Upřednostňuje se alespoň 95 nebo 98 % shoda na úrovni aminokyselinové sekvence s alespoň 7 aminokyselinami SEQ ID NO: 2. Homologie se zvláště v typickém případě zvažuje s ohledem na tyto oblasti sekvence (jako jsou aminokyseliny v poloze 51, 56 a 57), o kterých se ví, že jsou podstatné při aktivitě, která je stejná nebo podobná EtxB a/nebo CtxB spíše než u nepodstatných okolních sekvencí.

····

Ačkoli homologii je možné také zvažovat jako podobnost (to znamená, že aminokyselinové zbytky máji podobné chemické vlastnosti/funkce), v souladu s vynálezem se preferuje vyjadřovat homologii jako shodu sekvenci.

Porovnání homologie je možné uskutečnit manuálně nebo více obvyklé je dostupnými počítačovými programy. Tyto běžně dostupné počítačové programy mohou vypočítat procento homologie mezi dvěmi nebo více sekvencemi.

Procento homologie je možné stanovit porovnáním kontinuálních sekvenci, to znamená, že jedna sekvence je uspořádána s jinou sekvencí a každá aminokyselina v jedné sekvenci se přímo porovnává s odpovídající sekvencí, vždy jeden zbytek v jednom okamžiku. Tato metoda se nazývá uspořádání „bez děr. V typickém případě uspořádání „bez děr se provádí pouze při relativně malém počtu zbytků.

Ačkoli jde o velmi jednoduchou metodu, je nutné vzít na příklad do úvahu, že jinak shodný pár sekvencí jeden inzert nebo delece způsobí, že následující aminokyselinové zbytky se vyjmou z uspořádání, což vede k velkému snížení hodnoty procenta homologie, když se provádí celkové uspořádání. Navrhují se různé metody porovnání sekvencí, aby se provedlo optimální uspořádání, které zvažuje možné inzerce a delece, aniž dochází k penalizaci zdroje homologie. Toho je možné dosáhnout začleněním děr do uspořádání sekvence za účelem pokusit se maximalizovat lokální homologii.

Tyto více komplexní metody přiřazují ke každé díře, která se objeví v uspořádání, hodnotu „gap penalties . Přičemž při stejném počtu shodných aminokyselin existuje uspořádání s co možná nejmenším počtem děr, což odráží příbuznost dvou porovnávaných sekvencí, kdy se dosáhne vyššího skóre, než v případě uspořádání, kde se vyskytuje velký počet děr. V typickém případě se používá „počet afinitních děr při a

menší penalt zbytku • 444 ·

• ♦ 4····

4 • 4 4 4 4

4«4 »44

44444 •4 •4 •4 •4 hodnotě v díře. V tomto případě se nejběžněj i skóre

Vysoká hodnota „gap penalties bude samozřejmě produkovat optimální uspořádání s několika málo dírami. Většina programů vhodná pro hodnoceni uspořádání sekvencí umožňuj e upravit hodnotu „gap penalties .

Preferuj e se však

Když se například použití použije nastavených standardních program GCG Wisconsin hodnot.

Bestfit (popisuj e se dále v textu) standardní hodnota gap penalty v případě aminokyselinových sekvencí je

-12 v případě děr a v případě každé extenze -4.

Výpočet maximální hodnoty procenta homologie nejdříve vyžaduje produkci optimálního uspořádání, kdy se bere do úvahu hodnota „gap penalties. Vhodným počítačovým programem, který provádí takové uspořádání je GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA, popisuje se v publikaci Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Příkladem jiného softwaru, který se používá k porovnání sekvencí, je program BLAST (popisuje se v publikaci Ausubel et al., 1999 ibid Chapter 18), FASTA (popisuje se v publikaci Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) a GENEWORKS. Oba programy BLAST a FASTA jsou vhodné pro vyhledávání online a offline (popisuje se v publikaci Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 až 7-60). Preferuje se však použití programu GCG Bestfit.

Ačkoliv procenta konečné homologie mohou vyjadřovat míru identity, proces samotného uspořádání není založen na vyhodnocení porovnání páru 0 nebo 1. Místo toho se používá pro vyjádření skóre pro každé porovnání páru matrice s měřítkem vyjadřující skóre podobnosti, která je založená na chemické podobnosti a evolučním vývoji páru. Příkladem takové běžně používané matrice je BLOSUM62, což je standardní matrice vhodná pro programy BLAST. Programy GCG Wisconsin v obecném případě používají obecné standardní hodnoty nebo tabulku

• ·· •	9 999 9 •	• · • ·	• 44« • ··♦	«4 * 4 • ·	9 • * •
• • 4 ·	• •	• · 44	• 44·	• 4 44	• • •4

symbolického porovnání (popisuje se v manuálech). V případě programu GCG se preferuje použití obecných standardních hodnot nebo v případě jiného softwaru se používá standardní matrice, jako je BLOSUM62.

V případě, že software produkoval optimální uspořádání je možné vypočítat hodnotu procenta homologie, přičemž se upřednostňuje procento identity sekvence. Software v typickém případě toto provede jako část porovnání sekvence a vytvoří numerický výsledek.

Terminy „varianta nebo „derivát ve vztahu k aminokyselinovým sekvencím podle vynálezu, které se prezentují jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 5 zahrnují libovolnou substituci, variaci, modifikaci, nahrazení, deleci nebo adici jedné (nebo více) aminokyselin ze sekvence nebo do sekvence, přičemž výsledná entita si uchovává aktivitu. Přednostně vykazuje alespoň stejnou a/nebo podobnou aktivitu jako CtxB a/nebo EtxB.

Sekvence SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 5 se mohou modifikovat, aby se daly použít podle vynálezu. V typickém případě se provádějí modifikace tak, že aktivita sekvence zůstává zachována. Může s.e substituovat 1, 2 nebo 3 až 10 nebo 20 aminokyselin, přičemž upravená sekvence si zachovává svoji aktivitu.

Látka podle vynálezu může také obsahovat delece, inzerce nebo substituce aminokyselinových zbytků, které produkují tiché změny a dávají vzniku funkčně shodné látce. Substituce aminokyselin se mohou provést na základě podobnosti polarity, náboje, rozpustnosti, hydrofobicity, hydrofility a/nebo amfipatické podstaty zbytků, přičemž se zachovává sekundární vazebná podstata. Negativně nabité aminokyseliny zahrnují kyselinu aspartovou a glutamovou. Pozitivně nabité aminokyseliny zahrnují lyzin a arginin a aminokyseliny ····

			·· •	• · · ♦	• · ·
		20	• • ···	• · ♦ · • · · • ·ν ···	• · • · · · • · · ·* ·
s nenabitou	polární	skupinou, která	vykazuj e	podobné	hodnoty
hydrofility,	dále	leucin, izoleucin,	valin,	glycin,	alanin,

asparagin, glutamin, serin, treonin, fenylalaniri a tyrozin.

Konzervativní substituce se mohou připravit například podle tabulky uvedené dále v textu. Aminokyseliny ve stejném bloku ve stejném sloupci a přednostně ve stejném řádku ve třetím odstavci se mohou vzájemně substituovat.

Alifatická	Nepolární	G A P
I L V
polární bez náboje	C S T M
N Q
polární s nábojem	D E
K R
Aromatická		H F W Y

Nukleotidová sekvence

Vynález popisuje nukleotidové sekvence kódující látku podle vynálezu schopnou působit jako templát nebo jako cíle při testech (jako je například kvasinkový dvouhybridní test) vhodných pro identifikaci jednoho nebo více činidel a/nebo jejich derivátů, které jsou schopny ovlivnit látku.

Termín „nukleotidová sekvence znamená nukleotidové sekvence, oligonukleotidové sekvence, polynukleotidové sekvence a jejich varianty, homology, fragmenty a deriváty (jako jejich části). Nukleotidovou sekvencí může být DNA nebo RNA genomového nebo syntetického nebo rekombinantního původu, která může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová podle toho zda reprezentuje antikódující nebo kódující řetězec nebo jejich kombinace. Upřednostňuje se, aby se nukleotidová sekvence připravila použitím metody rekombinace DNA (například rekombinantní DNA).

• · · · • · · ·

Termín „nukleotidová sekvence přednostně znamená DNA.

Látka kódující nukleotidovou sekvenci může být stejná jako přirozeně se vyskytující forma. Upřednostňuje se, aby nukleotidová sekvence kódující látku nebyla přirozená nukleotidová sekvence nebo její varianta, homolog, fragment nebo derivát. V preferovaném provedení podle vynálezu se popisuje přirozená nukleotidová kódující sekvence podle vynálezu ve svém přirozeném prostředí, která je řízena svým nativním promotorem, který je také ve svém přirozeném prostředí. Toto preferované provedení vynálezu se nazývá „nepřirozená nukleotidová sekvence.

Termín „přirozeně se vyskytující znamená látku s aminokyselinovou sekvencí, která se nachází běžně v přírodě.

Termín „biologicky aktivní znamená látku, která má regulační nebo biochemickou funkci přirozeně se vyskytující látky.

Varianty, homology a deriváty

Termíny „varianta, „homolog nebo „derivát ve vztahu k nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 1 podle vynálezu zahrnuje libovolnou substituci, variantu, modifikaci, nahrazeni, deleci nebo adici jedné (nebo více) nukleové kyseliny v sekvenci, přičemž výsledná nukleotidová sekvence kóduje látku vykazující aktivitu, která přednostně vykazuje alespoň stejnou aktivitu jako SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4a SEQ ID NO: 5.

Jak se uvádí shora v textu s ohledem na sekvenční homologii, existuje alespoň 75 %, více se upřednostňuje alespoň 85 %, alespoň 90 % homologie se sekvencemi uvedenými ve zde uvedených sekvencích. Upřednostňuje se existence alespoň 95 % nebo 98 % homologie. Stanovení nukleotidové homologie porovnáním sekvencí se může provést způsobem, který se popisuje shora v textu. Preferovaným programem pro porovnání sekvencí je program GCG Wisconsin Bestfit popsaný shora v textu. Skóre standardní matrice má pro každý identický nukleotid hodnotu 10 pro nesprávné párování vykazuje hodnotu 9. Standardní hodnota „gap penalty je -50 a hodnota „gap penalty pro extenzi je v případě každého nukleotidu -3.

Vynález popisuje nukleotidové sekvence, které jsou schopny selektivně hybridizovat se zde prezentovanými sekvencemi nebo s libovolnou variantou, fragmentem nebo derivátem nebo s komplementem popsaným shora v textu. Nukleotidové sekvence tvoří přednostně alespoň 15 nukleotidů, více se upřednostňuje alespoň 20, 30, 40 nebo 50 nukleotidů.

Termín „delece se definuje jako změna nukleotidové nebo aminokyselinové sekvence, kde jeden nebo více nukleotidů nebo aminokyselinových zbytků nejsou přítomny.

Termín „inzerce nebo „adice je taková změna v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci, která vede k adici jednoho nebo více nukleotidů nebo aminokyselinových zbytků, což se porovnává s přirozeně se vyskytující látkou.

Termín „substituce znamená nahrazení jednoho nebo více nukleotidů nebo aminokyselin odlišnými nukleotidy nebo aminokyselinami.

Hybridizace

Termín „hybridizace znamená „způsob, kterým se řetězec nukleové kyseliny spojuje s komplementárním řetězcem prostřednictvím párování baží stejně jako se provádí amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR).

Nukleotidové sekvence podle vynálezu, které se mohou selektivně hybridizovat se zde prezentovanými nukleotidovými sekvencemi nebo s jejich komplementem, budou v obecném případě vykazovat alespoň 75 %, přednostně alespoň 85 nebo 90 %, více se upřednostňuje alespoň 95 % nebo

% homologii s odpovídajícími nukleotidovými sekvencemi alespoň 20, přednostně alespoň 25 nebo 30, zahrnující oblast například alespoň

40, 60 nebo 100 nebo více kontinuálních nukleotidů.

Preferované nukleotidové sekvence podle vynálezu budou obsahovat oblasti, které jsou homologní s nukleotidy obsahujícími SEQ ID NO: 1, přednostně alespoň 80 nebo 90 % více se upřednostňuje alespoň 95 % homologie se sekvencí

SEQ

ID NO: 1.

Termín „selektivně hybridizovatelný znamená, že nukleotidová sekvence použitá jako sonda se používá za podmínek, kdy se zjistilo, že cílová nukleotidová sekvence podle vynálezu hybridizuje se sondou na úrovni podstatně vyšší než je pozadí. Může dojít k hybridizaci pozadí, protože jsou přítomny jiné nukleotidové sekvence, například v knihovně cDNA nebo genomové DNA. Pozadí vyvolává sílu signálu vytvořeného interakcí mezi sondou a nespecifickými členy knihovny DNA, která je méně než desetkrát, upřednostňuje se méně než stokrát silnější než je specifická pozorovaná interakce s cílovou DNA. Intenzita interakce se může měřit například radioaktivním značením sond například pomocí ³²P.

Hybridizační podmínky jsou založeny na teplotě tání Tm vazebného komplexu nukleové kyseliny (popisuje se v publikaci Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Clonning Techníques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academie Press, San Diego CA) a udílejí hybridizaci definovanou přísnost, jak se vysvětluje dále v textu.

Maximální přísnost se v typickém případě objevuje při hodnotě Tm okolo -5°C (to znamená 5 °C pod poloviční teplotou denaturace (teplota tání) sondy). Vysoká přísnost je při teplotě přibližně 5 až 10 °C pod Tm. Střední přísnost je při teplotě okolo 10 až 20 °C pod Tm a nízká přísnost je při • · · · · · • · • · 4 4 44 • 4 444 44 • 4 4 · 4· • 4 4 44 teplotě okolo 20 až 25 °C pod Tm. Jak je dobře známo v oboru maximální přísnost hybridizace se může _f použít k identifikaci nebo detekci střední nebo identických nukleotidových nízká přísnost sekvencí, zatímco hybridizace se může použít k identifikaci nebo detekci podobných nebo příbuzných nukleotidových sekvencí.

Vynález dále popisuje nukleotidové hybridizovat s nukleotidovou sekvencí přísných podmínek (například při teplotě sekvence, které mohou

SSC je 0,15 M NaCl, 0,015 M citrát třisodný podle vynálezu °C a 0,1 x SSC při hodnotě za (lx pH dvouřetězcová,

7,0). Nukleotidová sekvence podle vynálezu je kdy oba řetězce duplexu buď jednotlivě nebo v popsány vynálezem. V případě, že nukleotidová sekvence je jednořetězcová, je nutné porozumět, že komplementární sekvence nukleotidové sekvence je také zahrnuta v rozsahu vynálezu.

kombinaci jsou

Expresívní vektory

Nukleotidové sekvence podle vynálezu se mohou začlenit do se může rekombinantního replikovatelného vektoru. Vektor použít při replikaci a expresi nukleotidové sekvence řídit za v kompatibilní hostitelské buňce. Exprese se může použití řídících sekvencí, které zahrnují promotory/zesilovače a jiné expresívní regulační signály. Mohou se použít prokaryontní promotory a

Mohou se použít promotory funkční v eukaryontních buňkách.

tkáňově specifické promotory a specifické pro promotory obsahující sekvenční elementy z více různých promotorů promotory chimérové stimuly.

Mohou se také použít ze dvou nebo popsaných shora v textu.

Látka produkovaná hostitelskou rekombinantní buňkou se ‘může vylučovat nebo může být obsažena uvnitř buňky sekvenci a/nebo vektoru. Sekvence kódující látku se mohou navrhnout se signálními sekvencemi,

• · · · ·· které řídí sekreci látky kódující sekvence prostřednictví určité prokaryontní nebo eukaryontní buněčné membrány.

Fúzní proteiny

Látka podle vynálezu se může také produkovat ~ jako fúzní protein, například při extrakci a čištěni. Příklady partnerů fúznich proteinů zahrnují glutathion-S-transferázu (GST), 6x His, GAL4 (domény vázající DNA a/nebo aktivující transkripci) a β-galaktozidázu. Může být také vhodné zahrnout partnery fúzního proteinu místo proteolytického štěpení a tak je možné odstranit ze sekvencí fúzního proteinu proteinovou sekvenci, která nás zajímá.

V jednom podle vynálezu fúzní protein antigen- nebo vynálezu. V provedení antigenní tomto provedení vynálezu fúzní protein obsahuj e determinantu fúzovanou s látkou podle nepřirozeně se vyskytující která může působit jako fúzní protein je obsahující látku, adjuvans ve smyslu poskytnout generalizovanou stimulaci imunitního antigenní determinanta nebo karboxylový konec se může připojit látky.

systému. Antigen a buď na aminokyselinový

V jiném provedení podle vynálezu látka podle vynálezu se může ligovat s heterologní sekvencí, aby kódovala fúzní protein. Například v případě testování peptidových knihoven za účelem získat činidla schopná ovlivnit aktivitu látky, může se použít ke kódování chimérové látky obsahující heterologní epitop, který je rozeznáván komerčně dostupnými protilátkami.

Protilátky

V dalším provedení vynálezu test vhodný pro identifikaci činidla, jako je cílový receptor, nebo činidla schopného regulovat transkripční aktivitu CD25 se může uskutečnit za použití vázaného fúzního proteinu.' • ··· · ·· ······ ·· · ··· ·· · • · ······· • · ♦ · · · ·♦ · • · · · · ·· ··· · · · · · ·· · ·

V jednom provedeni vynálezu uvedenou látkou mohou být protilátky. Tyto protilátky jsou schopny působit jako napodobeniny podle vynálezu.

Protilátky se mohou produkovat standardním způsobem, jako je imunizace s látkou podle vynálezu nebo použitím knihovny vykazující fága.

Pro účely podle vynálezu termín „protilátka není-li uvedeno jinak zahrnuje polyklonální, monoklonální, chimérové, jednořetězcové fragmenty Fab a fragmenty produkované knihovnou exprimující Fab. Takové fragmenty zahrnují fragmenty celých protilátek, které si uchovávají vazebnou aktivitu pro cílovou látku, fragmenty FV, F(ab') a F(ab')2, stejně jako jednořetězcové protilátky (scFv), fúzní proteiny a jiné syntetické proteiny, které obsahuji místo protilátek vázající antigen. Protilátky a jejich fragmenty mohou být humanizované protilátky, jak se například popisuje v souladu s látkou A239400. Neutralizující protilátky, to znamená protilátky, které inhibují biologickou aktivitu polypeptidů, jsou zvláště preferovány při diagnostice a terapii.

V jednom provedení vynálezu se také popisují monoklonální nebo polyklonální protilátky proti látkám podle vynálezu, jako jsou polypeptidy nebo jejich fragmenty. Vynález dále popisuje způsob produkce monoklonálních nebo polyklonálních protilátek proti látce, jako je polypeptid podle vynálezu.

Polyklonální protilátky

Jestliže jsou nutné polyklonální protilátky, pak vybraný savec (myš, králík, koza, kůň atd.) se imunizuje imunogenním polypeptidem, který nese epitop(y), jenž je možné získat z identifikovaného činidla a/nebo látky podle vynálezu. V závislosti na druzích hostitele, aby došlo k zesílení imunologické odpovědi, se může použít různé adjuvans. Takové adjuvans zahrnuje, ale není omezeno na Freundovo adjuvans, • · · · minerální gely, jako je hydroxid hlinitý a povrchově aktivní látky, jako je lyzolecitin, pluronní polyoly, polyanion, peptidy, olejové emulze, hemocyanin přílipkových plžů a dinitrofenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum jsou potencionálně použitelné lidské adjuvans, které se mohou použít v případě, že čištěná látka se aplikuje imunologicky kompromitovaným jednotlivcům za účelem stimulace systémové obrany.

Sebralo se sérum z imunizovaného zvířete a ošetřilo se známým postupem. V případě, že sérum obsahující polyklonální protilátky proti epitopu získatelného z identifikovaného činidla a/nebo látka podle vynálezu obsahuje protilátky vůči jiným antigenům, pak se polyklonální protilátky mohou čistit imunoafinitní chromatografii. Metody produkce a zpracování polyklonálního antiséra jsou dobře známy v oboru. Za účelem připravení uvedených protilátek vynález také popisuje polypeptidy nebo jejich fragmenty haptenizované s jiným

polypeptidem lidí.	za účelem použití jako	imunogenů	u zvířat nebo
Monoklonální	protilátky
Odborník může sám snadno	produkovat	monoklonální
protilátky	určené proti epitopům,	které je	možné získat

z identifikovaného činidla a/nebo látky podle vynálezu. Obecné metody vhodné pro přípravu monoklonálních protilátek pomocí hybridomů jsou dobře známy v oboru. Buněčné linie produkující protilátky se mohou vytvořit buněčnou fúzí a dále dalšími metodami, jako je transformace B lymfocytů s onkogenní DNA nebo transfekci virem Epstein-Barrové. Panely monoklonálních protilátek produkované proti orbitálním epitopům se mohou testovat za účelem zjištění různých vlastností, to znamená izotypová nebo epitopová afinita.

Monoklonální protilátky proti látce a/nebo identifikovanému činidlu podle vynálezu se mohou připravit za použiti metody, která poskytuje produkci molekul protilátek kontinuální buněčnou linií v kultuře (popisuje se v publikaci Koehler and Milstein, 1975, Nátuře 256: 495-497), metodu lidského hybridomu B-buňky (Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4;· 72, Cote et al. , 1983 Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 2026-2030) a technika EBV hybridomu (popisuje se v publikaci Cole et al., 1985, Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss lne. pp. 77-96). Navíc se mohou použít metody vyvinuté pro produkci „chimerových protilátek, které sestřihávají geny myších protilátek na geny lidských protilátek za vzniku molekuly s vhodnou antigenní specifitou a biologickou aktivitou (popisuje se v publikaci Morrison et al., 1984), Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6851-6855, Neuberger et al., 1984 Nátuře 312: 604-608, Takeda et al., 1985 nátuře 314: 452-454). V jiném případě metody popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (patent US č. 4,946,779) se mohou adaptovat, přičemž dochází k produkci jednořetězcových protilátek specifických pro látku.

Protilátky, jak monoklonální tak polyklonální, které jsou řízeny proti epitopům získatelným z identifikovaného činidla a/nebo látky podle vynálezu, je možné zvláště použít při diagnostice. Ty protilátky, které jsou neutralizující je možné použít při pasivní imunoterapii. Monoklonální protilátky se mohou zvláště použít při vzniku antiidiotypových protilátek. Antiídiotypové protilátky jsou imunoglobuliny, které nesou „vnitřní zobrazení látky a/nebo činidla, proti kterému je nutná ochrana. Metody vhodné pro vznik antiidiotypických protilátek jsou dobře známy v oboru. Tyto antiidiotypické protilátky je také možné použít při terapii.

Protilátky se mohou také produkovat vyvoláním in vivo produkce v populaci lymfocytů nebo testováním rekombinantní • ···· ♦ · φφφφ ·Φ ·· · · φ φ φ · φ • φ φ φ φ φ φ φφ φ φ · · φ φφφ φ φ · φ · φφφ φφφφ φ φ φ · φ ·· φ imunoglobulinové knihovny nebo panelů s vysoce specifickými vazebnými činidly, jak se popisuje v publikaci Orlandi et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci 86: 3833-3837 a Winter G and Milstein C, 1991, Nátuře 349: 293-299.

Mohou se vytvořit protilátkové fragmenty, které obsahuji specifická vazebná místa vhodné pro látku. Takové fragmenty například zahrnují fragmenty F(ab')₂, které mohou vznikat trávením molekuly protilátky pepsinem, fragmenty Fab, které mohou vzniknout redukcí disulfidových můstků fragmentů F(ab')₂. V jiném případě se mohou zkonstruovat knihovny exprimující Fab, aby umožnily rychlou a jednoduchou identifikaci monklonálních fragmentů Fab s požadovanou specifitou (popisuje se v publikaci Huse WD et al., 1989 Scinece 256: 1275-1281).

Testy pro imunomodulační látky

Imunomodulace imunitní odpovědi se může měřit transkripční profilací například testováním aktivace transkripce markérů na povrchu buněk CD25, přičemž se měří signál z navázaného reportního genu.

Značení

V testovacích metodách podle vynálezu je možné použít různé značení, přičemž preferované značky poskytují detekovatelné signály (například spektroskopií) . Reportní gen může kódovat enzym, který katalyzuje reakci, která mění absorpční vlastnosti světla.

Příklady reportních molekul zahrnují například βgalaktozidázu, invertázu, zelený fluorescenční protein, luciferázu, chloramfenikol, acetyltransferázu, β-glukuronidázu, exoglukanázu a glukoamylázu. V jiném případě radioaktivně nebo fluorescenčně značené nukleotidy se mohou začlenit do nascentních transkriptů, které se pak identifikují, když se vážou na oligonukleotidové sondy.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se produkce reportní molekuly měří na základě enzymatické aktivity produktu reportního genu, jako je β-galaktozidáza.

Testy inhibitorů průjmových onemocnění indukovaných toxinem

Látka podle vynálezu nebo její derivát, homolog a/nebo buněčná linie, která exprimuje látku podle vynálezu nebo její derivát nebo homolog se může využít k testování činidel (jsou to například protilátky, peptidy, organické a anorganické molekuly), které jsou schopné ovlivnit aktivitu látky. Libovolné činidlo schopné inhibovat aktivitu látky se může testovat za účelem zjištění, zda může sloužit jako inhibitor toxinu, který vyvolává průjem, přičemž se identifikují činidla schopná způsobit průjmové onemocnění zprostředkované cholerou a/nebo enterotoxinem.

V jiném provedení vynálezu se mohou identifikovat antagonisty látky podle vynálezu, jako . jsou protilátky, peptidy nebo malé organické molekuly, které jsou schopny působit jako inhibitory průjmového onemocnění vyvolaných toxinem.

Testy činidel

Vyjevení fága se může použít při identifikaci činidel, jako například receptor na povrchu buňky, který je obsazen látkou. Pozitivní identifikace takového receptoru může umožnit použití kombinačních knihoven pro identifikaci napodobenin schopných působit stejným nebo podobným způsobem jako látka podle vynálezu.

Vyjevení fága je protokol vhodný pro testování molekul, který využívá rekombinantního bakteriofága. Technologie zahrnuje transformačního bakteriofága s genem, který kóduje vhodný ligand (v tomto případě kandidáta činidla) schopného reagovat s cílovou látkou (nebo nebo nukleotidovou sekvenci (nebo

	« •	• 44 · • • • * ·	• 4 4444 44 4 • ♦ · 4 4 « 4 4 4 444 4 4 4 ♦ · 4 4 · 4 ·· ♦·· ·· 444
j eho	derivát	nebo	homolog)
její	derivát	nebo	homolog) ,

bakteriofág (který se který kóduje to samé.

Transformovaný přednostně naváže na pevný povrch) exprimuje vhodný ligand (jako je kandidát činidla) a vyjevuje se na obalu fága. Izolují se a amplifikují se entity (jako jsou buňky) nesoucí molekuly cílové látky, které rozeznávají kandidáta činidla.

Pak se charakterizuje úspěšný kandidát činidla. Vyjevení fága je ve srovnání s technologií testování afinity ligandu výhodnější. Povrch fága vykazuje kandidáta ligandu ve trojrozměrné konfiguraci, což je uspořádání blízké jejich přirozeně se vyskytujícímu uspořádání. To umožňuje více specifické navázání a navázání s vyšší afinitou.

Testy napodobenin

V jednom provedení vynálezu se mohou identifikovat napodobeniny látky podle vynálezu, jako jsou protilátky nebo jiné chemické sloučeniny, které mají imunomodulační a/nebo adjuvanční účinek.

Takové napodobeniny se mohou aplikovat samotné nebo v kombinaci s jinými léčebnými prostředky, které jsou vhodné pro léčbu podle vynálezu.

Testy

Látka podle vynálezu se může použít při identifikaci imunomodulátorů, adjuvans, napodobenin a/nebo inhibitorů průjmového onemocnění vyvolaného toxinem v libovolném variantě metod testování léků. Látka použitá v takovém testu může být volná v roztoku, fixovaná na pevném podkladu, může se na pevném podkladu tvořit nebo se může nacházet uvnitř buněk. Odstranění aktivity látky nebo vytvoření vazebných komplexů mezi látkou a činidlem se testuje měřením.

···* !«·»««»« · • · · · Φ ··· • · · ··· Φ ·φ • · · Φ Φ · · ·Φ • · ♦ Φ · ΦΦ ··· · ·· ·♦· ΦΦ ···

Jinou metodou testováni je testování s vysokou prostupností (HTS) činidel, která mají vhodnou vazebnou afinitu vůči látkám a jsou založeny na metodě popsané detailněji v dokumentu WO 84/03564.

Očekává se, že testovací metody podle vynálezu budou vhodné pro testování v malém i velkém měřítku sloučenin, stejně jako při kvantitativních testech.

Farmaceutické prostředky

Vynález dále poskytuje farmaceutický prostředek zahrnující aplikaci terapeutického účinného množství látky podle vynálezu a farmaceuticky přijatelného nosiče, ředidla nebo ekcipientu (zahrnujícího jejich kombinace).

Farmaceutické prostředky se mohou využívat v souvislosti se zvířaty a lidmi v lidském a veterinárním lékařství a budou v typickém případě obsahovat jeden nebo více farmaceuticky přijatelných ředidel, nosičů nebo ekcipientu. Přijatelné nosiče nebo ředidla vhodná pro terapeutické použití jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Volba farmaceutického nosiče, ekcipientu nebo ředidla se může vybrat na základě způsobu aplikace a standardní farmaceutické praxe. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat nosič, ekcipient nebo ředidlo, libovolné vhodné pojidlo, lubrikant, suspendační činidlo, potahovací činidlo a rozpouštěcí činidlo.

Ve farmaceutickém prostředku se může vyskytovat konzervační činidlo, barviva a dokonce ochucovadlo.

Příklady konzervačního činidla zahrnují benzoát sodný, kyselinu sorbovou a ester kyseliny p-hydroxybenzoové.

Mohou se také použít antioxidanty a suspendační činidla.

Φ ···· ·«··«· ··

Φ · · · * φ♦

Φ 99 999 99

9.9 9 9 9 99

9 9 9 99

9 99 9 999 9 9

Existují různé požadavky na sloučeniny/prostředky v závislosti na různých způsobech zavedení. Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou zavádět za použití miničerpadel nebo do svalu nebo například nosním sprejem aerosolem pro účely inhalování nebo stravitelným roztokem nebo parenterálně, když je prostředek vytvořený v injektovatelné formě vhodné pro intravenózní, intramuskulámí nebo podkožní zavedení. V jiném případě se může vytvořit formulace, kterou je možné zavést několika způsoby.

V případě, že se činidlo zavede prostřednictvím sliznice, například gastrointestinální sliznicí, mělo by zůstat stabilní během tranzitu gastrointestinálním prostředím. Například by činidlo mělo zůstat odolné vůči proreolytickému· rozkladu, vůči kyselému pH a detergentním účinkům žluči.

Je-li to vhodné, farmaceutické prostředky se mohou aplikovat inhalaci, ve formě čípků nebo formě roztoku, pleťové vody, krému, použitím náplastí, orálně ve formě tablet, pesaru, povrchově ve masti nebo prášku, které obsahují ekcipienty, jako je škrob nebo laktóza nebo samotné nebo ve formě směsi v kapsulích buď nebo ve formě elixíru, roztoku nebo suspenze, které obsahují barviva, příchutě nebo které se mohou zavést parenterální 'injekcí například intravenózně, intramuskulárně nebo podkožně.

V případě parenterální aplikace se kompozice může nejlépe využít ve formě sterilních vodných roztoků, které mohou obsahovat jiné látky například sole nebo monosacharidy, přičemž dochází k přípravě rozteku, který je izotonický z krvi. V případě bukální nebo sublinguální aplikace se sloučeniny mohou aplikovat ve formě tablet nebo pastilek, které mohou vznikat vhodným způsobem.

Vakcíny • · · · • · · ·

* · • ο» ·

V jednom provedení vynálezu je látka adjuvans, které je začleněno do vakcinačního prostředku, přičemž se používá při léčbě nebo prevenci autoimunitního onemocnění, lidské leukémie T buněk, odmítnutí transplantátů anebo GVHD, alergické nebo infekční onemocnění.

V jiném provedení vynálezu vakcinační prostředek může navíc obsahovat antigen(y) nebo antigenní detreminantu(y). Taková vhodná činidla a/nebo antigenní determinanty se popisují v dokumentu WO 99/34817.

Upřednostňuje se, aby vakcinační prostředek obsahoval antigen a/nebo antigenní determinantu.

Upřednostňuje se, aby antigen byl samo-antigen nebo jeho homolog.

Upřednostňuje se, aby jedna nebo více látek podle vynálezu se použila při přípravě terapeutické nebo profylaktické vakciny.

Termín „profylaktická vakcína se aplikuje nepostiženým jedincům, aby se předešlo vývoji onemocnění.

Termín „terapeutická vakcína se aplikuje jedincům, u kterých už existuje infekce, aby se redukovala nebo minimalizovala infekce nebo aby se odstranily imunopatologické účinky onemocnění.

Příprava vakcín, které obsahují jednu nebo více látek, jako aktivní složku, je dobře známa v oboru. V typickém případě se takové vakciny připravují jako injektovatelné kapalné roztoky nebo suspenze. Mohou se vyskytovat v pevné formě a jsou vhodné pro vytvoření roztoků nebo suspenzí nebo kapalin těsně před použitím. Z přípravku se může vytvořit emulze nebo se protein může uzavřít do lipozomových kapsulí. Aktivní složky se často smíchají s ekcipienty, které jsou φφφφ · · · ·· · ·· * · · · · · · φ φ φ ··· φ φ φ φ φ φφφ • ΦΦΦ φφ φφφ φφ φ farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s aktivní složkou.

Vhodné ekcipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol atd. a jejich kombinace.

Navíc je-li to nutné vakcína může obsahovat minoritní množství auxiliárních látek, jako jsou smáčecí a emulgační činidla a činidla upravující pH.

Vakcinační prostředky mohou obsahovat kombinaci adj uvans, které zvyšuje účinnost vakcíny.

Příklady dalších adj uvans, která v kombinaci mohou být účinná, zahrnují, ale nejsou • omezeny na hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitodraselný (alum), síran berylnatý, siliku, kaolín, uhlík, emulze voda v oleji, emulze olej ve vodě, muramyldipeptid, bakteriální endotoxin, lipid X,

Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertusis, polyribonukleotidy, alginát sodný, lanolin, lyzolecitin, vitamin A, saponin, lipozomy, levamisol, DEAEdextran, blokované kopolyméry nebo jiná syntetická adjuvans. Taková adjuvans jsou dostupná běžným způsobem z různých zdrojů, jako je například Měrek Adjuvant 65 (Měrek and Company, lne., Rahway, N.J.) nebo Freundovo nekompletní adjuvans a kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detro.it,

Michigan).

V typickém případě se používají adjuvans jako je Amphigen (olej ve vodě), Alhydrogel (hydroxid hlinitý) nebo směs Amphigenu a Alhydrogelu. V případě použití na lidech je možné použít pouze hydroxid hlinitý.

Aplikace

V typickém případě aktuální dávku, která je vhodná pro jednotlivce, stanoví lékař a bude kolísat podle věku, hmotnosti a odpovědi určitého pacienta. Klasickým průměrným případem mohou být nízké dávky. Mohou existovat individuální příklady, kde je výhodné stanovit nejvyšší a nejnižší možné

3β

• 4444	• 4	4444	• 4
• 4 ·	4 ·	•	• 4
4 4	4	4	444	4 4
4 4 4	4 4	4	4 4 4
4 4	•	•	«	• 4
444 4	44	4 44	44

rozmezí.

Kompozice podle vynálezu se mohou aplikovat přímou injekcí. Kompozice podle vynálezu se může vytvořit tak, aby se mohla aplikovat parenterálně, sliznicí, do svalu, intravenózně, podkožně, do oka nebo transdermálně. V typickém případě se každý protein může aplikovat v dávce 0,01 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti, přičemž se upřednostňuje dávka 0,1 až 10 mg/kg, více se upřednostňuje dávka 0,1 až 1 mg/kg tělesné hmotnosti.

Termín „aplikace zahrnuje zavedení pomocí virové a nevirových technik. Mechanizmy virového zavedení zahrnují, ale nejsou omezeny na adenovirové vektory, adeno-asociované virové (AVV) vektory, vektory založené na herpes viru, retrovirové vektory, lentivirové vektory a bakulovirové vektory. Mechanizmy nevirového zavedení zahrnují transfekcí zprostředkovanou lipidy, lipozomy, imunolipozomy, lipofektinem, kationtové faciální amfifily (CFA) a jejich kombinace. Způsoby takových zaváděcích mechanizmů zahrnují, ale nejsou omezeny na mukozální, nasální, orální, parenterálni, gastrointestinální, povrchové nebo sublinguální způsoby.

Termín „aplikace zahrnuje způsob aplikace sliznicí, jako jsou například nosní spreje nebo areosoly vhodné pro inhalaci nebo jako stravitelné roztoky, parenterálni způsob zavedení je formou injekcí například intravenózní, intramuskulární nebo podkožní cestou.

Termín „společná aplikace znamená, že místo nebo doba aplikace každé látky podle vynálezu a další entity, jako je například antigen a/nebo antigenní determinanta jsou takové, že je nezbytné dosáhnout modulace imunitního systému. Zatímco antigen a substance se může aplikovat v jeden okamžik a na • *444 ·· 4444·· ·· · · · · 4 44 • · 4 4 444 ·· • · 4 · ·4 ··· · 44 444 4«4 stejné místo, může být výhodné aplikovat látku v různý okamžik a na odlišné místo než antigen. Látka a antigen se mohou dokonce zavést do stejného zaváděcího vehiklu a látka a antigen se mohou párovat a/nebo nepárovat a/nebo geneticky spojovat a/nebo nespojovat.

Antigenní determinanta a peptid nebo homolog nebo jejich napodobenina se mohou aplikovat odděleně nebo společnou aplikací hostiteli ve formě jediné dávky nebo ve více dávkách.

Vakcinační prostředek podle vynálezu se může aplikovat řadou různých způsobů, jako je injekce (zahrnující parenterální, podkožní a intramuskulární injekce), ale také intranasální, slizniční, orální, intravaginální, uretrální nebo okulární cestou.

Vakcíny obsahující látku podle vynálezu se běžně aplikují parenterálně, injekcí a to například podkožně nebo do svalu. Další formulace, které jsou vhodné pro jiné módy aplikace zahrnují čípky a v některých případech orální formulace. V případě čípků tradiční pojidla a nosiče mohou zahrnovat například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy. Takové čípky se mohou tvořit ze směsi obsahující aktivní složku v rozmezí 0,5 % až 10%, je výhodné, když jsou 1% až 2%. Orální formulace zahrnují normálně používané ekcipienty, jako jsou například manitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodíku, celulóza, uhličitan hořečnatý a podobně a. musí dosahovat stupně čistoty vhodného pro' farmaceutické účely. Tyto prostředky se mohou vyskytovat ve formě roztoků, suspenzí, tablet, pilulí, kapsulí, formulací pro nepřerušované uvolňování nebo prášku a obsahují 10 % až 95 % aktivní složky, upřednostňuje se koncentrace 25 až 70 %. Když se vakcinační prostředek lyofilizuje, lyofilizovaný materiál se může před aplikací rekonstituovat za vzniku například suspenze. Rekonstituce se přednostně provádí v pufru.

··*· • 4 ··« 9

9

Onemocněni

Látka podle vynálezu se používá při léčbě nebo prevenci autoimunitního onemocnění, lidské leukémie T buněk, odmítnuti transplantátů anebo GVHD, alergické nebo infekční onemocnění. Do skupiny infekčního onemocnění patří nemoci, ve kterých se během infekce infekční činidlo váže na sliznici, kolonizuje jí nebo sliznici ve velkém množství prochází. Většinou jde o onemocnění, ve kterých jsou běžně zahrnuty imunopatologická onemocnění.

Příklady infekčního onemocnění podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na HSV-1, HSV-2, EBV, VZV, CMV, HHV-β, HHV7 a HHV-8, hepatitidu A, B, C, D a E, Neisseria meningitides, Haemophilus influanzae typ B a Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila a Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonnorheae, HIV-1, HIV-2 a Chlamydia trachomatism, E. coli, rotavirus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Helicobacter pylori, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni and Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes a Streptococcus mutans, malaria, Trypanasoma spp., Taxoplasma gondii, Leishmania donovani and Oncocerca spp. .

Příklady alergického onemocnění podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na astma, alergický kašel, alergickou rinitidu a zánět spojivek, atopický ekzém a dermatitidu, kopřivku, vyrážky, alergie na bodnuti hmyzem, alergie na mléčné produkty a jisté léky.

Příklady autoimunitních onemocnění zahrnují, ale nejsou omezeny na onemocnění, jako jsou revmatoidní artritida, roztroušená skleróza a diabetes.

Sady • ···· fcfc ···· fcfcfc • fc · · · · · ·· · • · · · ··· · ·· • · · · · · · · fcfc • fc ·· ···· • fcfc · ·· ··· fcfc fcfc*

Vynález dále popisuje diagnostické testy a kity obsahující látku podle vynálezu. Takové kity se mohou použít k prevenci a/nebo k léčbě a/nebo modulaci onemocnění podle vynálezu.

V jednom provedení vynálezu sada může také obsahovat antigen a antigenní determinantu a/nebo oddělené adjuvans pro účely společné aplikace s uvedeným terapeutickým nebo profylaktickým prostředkem.

V jiném případě sada může obsahovat napodobeniny podle vynálezu ve formě protilátek podle vynálezu vázané na pevný povrch a/nebo balené do sady ve vhodném kontejneru spolu s vhodnými činidly, kontrolami, instrukcemi a podobně.

Shrnutí

Vynález popisuje látku obsahující libovolného jednoho nebo více zástupců ze skupiny zahrnující aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 2 nebo její variantu nebo homolog nebo fragment nebo derivát nebo napodobeninu, přičemž látka je schopna působit stejným nebo podobným způsobem jak EtxB a/nebo CtxB. Látka však nevykazuje GM-1 vazebnou aktivitu.

Vynález také popisuje testovací metodu vhodnou pro stanovení jednoho nebo více činidel, které jsou schopny interagovat s látkou podle vynálezu a/nebo ji ovlivňovat. Tento test zahrnuje kontakt látky s testovaným činidlem a stanovení, zda činidlo ovlivňuje látku nebo ne.

Dále vynález popisuje předmětné věci uvedené v odstavcích dále v textu.

1. Peptid obsahující sekvenci EVPGSQH nebo její homolog nebo napodobeninu.

2. Peptid popsaný v odstavci 1, který obsahuje sekvenci VEVPGSQHIDSQ.

Peptid popsaný v odstavci 2, který obsahuje •· •* ♦ < ·

99

9 9

9

9>

•·

999 sekvenci

GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI nebo sekvenci GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI.

Profylaktický nebo terapeutický prostředek, který obsahuje peptid popsaný v libovolném z předchozích odstavců nebo jeho homolog nebo napodobeninu.

Profylaktický	nebo	terapeutický	prostředek	popsaný
v odstavci 4,	který	obsahuje antigen nebo	antigenní
determinantu.
Profylaktický	nebo	terapeutický	prostředek	popsaný

v odstavci 4 nebo 5, kde terapeutické nebo profylaktické činidlo se používá jako adjuvans nebo imunomodulátor. Profylaktický nebo terapeutický prostředek popsaný v odstavci 4 nebo 5, kde terapeutické nebo profylaktické činidlo se používá k pozitivní regulaci produkce protilátek a povrchu sliznice. Profylaktický nebo v odstavci 4 nebo činidlo se používá stálé imunologické

Profylaktický nebo v odstavci 4 nebo 5, činidlo se používá terapeutický prostředek popsaný 5, kde terapeutické nebo profylaktické k prodloužení působení antigenů a vzniku paměti u savce.

terapeutický prostředek popsaný kde terapeutické nebo profylaktické k negativní komponentů imunitní odpovědi spojené Profylaktický nebo terapeutický v libovolném odstavci 4 nebo 9, který a prevenci autoimunitniho onemocnění, buněk, odmítnutí transplantátů, štěp verzus hostitel nebo regulaci patologických

Thi a Th2.

prostředek popsaný se používá při léčbě lidské leukémie T infekční onemocnění.

Profylaktický nebo terapeutický prostředek, který obsahuje činidlo, které se specificky váže na smyčku β4-α2 EtxB nebo

CtxB.

Profylaktický v odstavci 11, nebo terapeutický prostředek popsaný kde činidlo je protilátka.

• ··· ·* ·· · · ·« ·· · ♦ 9 9 ··· _Λ - ····*···· ·*··»···» ♦ · · · · · · ♦ ·· · ·· ··· ·· ·

13. Profylaktický nebo terapeutický prostředek popsaný v odstavci 11 nebo 12, který se používá při léčbě průjmu.

14. Vakcinační prostředek vhodný pro použití při prevenci onemocnění, který zahrnuje peptid popsaný v libovolném odstavci 1 až 3 nebo jeho homolog nebo napodobeninu.

15. Vakcinační prostředek popsaný v odstavci 14, který také zahrnuje antigenní determinantu.

16. Vakcinační prostředek popsaný v odstavci 14 nebo 15, který se používá při léčbě nebo prevenci infekčního onemocnění, autoimunitního onemocnění, leukémi lidských T buněk, odmítnutí transplantátu nebo onemocnění hostitele verzus štěp (GVHD).

17. Sada obsahující terapeutický nebo profylaktický prostředek popsaný v odstavci 4 až 13.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je znázorněna podjednotka B Etx/Ctx (popisuje se v publikaci Sixma et al. , J. Mol. Biol. (1993) 230: 890-918, přidalo se značení).

Na obrázku č. 2 je znázorněna identifikace zbytků ve smyčce v CtxB, které se podílejí na apoptóze T-buněk CD8+.

Na obrázku č. 3 jsou znázorněny mutované podjednotky B, které vykazují defekt apoptózy T buněk CD8+, přičemž si zachovaly schopnost vázat se na receptory na buněčném povrchu.

Obrázek č. 4 zobrazuje celkové množství imunoglobulinu vytvořeného proti EtxB a EtxB(H57S) v séru myší imunizovaných intranasálně 10 pg každé podjednotky B.

Obrázek č. 5 zobrazuje, že His-57 v Ctx a Etx definuje oblast nezbytnou, aby látka fungovala jako adjuvans.

•	• ·* »			mat	··	•
9 4	•	•	9	4	•	•	4 4
•	•	•	•	• · ·	• 4	4
•	• ·	•	«	4 4	•	4	4
•	•	€	•	•	• 4	4
444	4		44	444	4 4	• 44

Obrázek č. 6 vykazuje podjednotku B peptidu E51-158, která vykazuje schopnost indukovat imunomodulaci T-buněk CD8+.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace zbytků Glu-51 ve smyčce Ile-58 CtxB, které způsobují imunomodulační účinky na leukocyty

Samci myší NIH se usmrtily a následně se vyňala tkáň mesentrických lymfatických uzlin a přenesla se do Hanksova vyváženého solného roztoku (HBSS bez hořčíku a vápníku a doplněného 20 mM Hepes). Lymfocyty vytvořily v roztoku disperzi a separovaly se od vláknité tkáně jemným protlačením tkáně skrz drátěné síto. Po třech promytích v HBSS se buňky lymfatických žláz resuspendovaly v upraveném Eagle médiu (Gibco) (α-MEM), které obsahuje 20 mM Hepes, 4 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilinu, 100 gg/ml streptomycinu a 5xl0^-5 M2merkaptoetanolu v koncentraci 2 x 10⁶ buněk/ml a vše se pak zamíchala, aniž se přidal CtxB nebo EtxB divokého typu (kontrola PBS) nebo se přidalo 3,45 μΜ (40 μg/ml) CtxB divokého typu nebo EtxB divokého typu nebo různé mutantní podjednotky B, jako je EtxB(G33D), CtxB(E51A), CtxB(V52A), CtxB(P53A), CtxB(G54A), CtxB(S55A), CtxB(Q56A), CtxB(H57A) nebo CtxB(I58A) vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu 96 hodin. Po té se buňky promyly a resuspendovaly v pufru obsahujícím 0,4 ml HBSS/20 mM Hepes/0,1% azid sodný/10 % krysí sérum. Pak se přidal fykoerytrin (PE) konjugovaný s anti-CD8 (PharMingen) a anti-CD4 konjugované s FITC (PharMingen) v ředění 1/400 a buňky se inkubovaly na ledu po dobu 30 minut. Pak následuje inkubace protilátek a suspenze buněk se promyly jednou v přípravku ISOTON (Becton-Dickinson) a resuspendovaly se v 0,4 ml přípravku ISOTON. Provedla se analýza FACS a z každého vzorku se sebralo 10 000 výsledků a vynesly se do grafu za

····	··	····	··	f.
•	•	•	•	•	•	• ·
•	•	•	···	•	•
• ·	• ·	•	• ·	•
•	•	•	•	•	•
• ·	>·	»··	··	··

použiti softwaru WinMDI. Buňky s anti-CD8 s navázaným PE jsou znázorněny ve spodním kvadrantu po pravé straně.

Výsledky 1

Výsledky na obrázku č. 1 ukazují, že inkubace buněk MLN s CtxB divokého typu nebo EtxB divokého typu způsobuje depleci T buněk CD8+, která se neobjevuje v případě, že se buňky inkubují v přítomnosti PBS (kontrola) nebo s mutantní formou EtxB, EtxB(G33D), které chybí schopnost vázat se na buněčný povrch gangliosidu GM-1. Analýza mutantů CtxB obsahující substituce Ala ve zbytcích E51 až 158 ukázala, že CtxB(E51A) a CtxB(H57A) také nezpůsobují depleci T-buněk CD8+. Navíc CtxB(V52A) a CtxB(I158A) částečně vykazuje účinek při depleci T-buněk CD8+. Tato zjištění ukazují, že zbytky E51 a H57 vykazují podstatnou úlohu při spuštění modulačních účinků na lymfocyty, na čemž se také podílí zbytky V52 a 158.

Příklad 2: Mutantní podjednotky B, které vykazují defekt při apoptóze T buněk CD8+ a které si zachovaly schopnost vázat se na receptory na buněčném povrchu

Samci myši NIH se usmrtily a následně se vyňala tkáň mesentrických lymfatických uzlin a přenesla se do Hanksova vyváženého solného roztoku (HBSS bez hořčíku a vápníku a doplněného 20 mM Hepes). Lymfocyty vytvořily v roztoku disperzi a separovaly se od vláknité tkáně jemným protlačením tkáně skrz drátěné síto. Po třech promytích v HBSS se buňky lymfatických žláz resuspendovaly ve 300 ml předem chlazeného pufru MACS, který neobsahoval plyny (pufr obsahuje PBS, 5 mM EDTA, 0,5 % BSA, hodnota pH je 7,2). 50 ml každých protilátek anti-CD4 a anti-B220 MACS se přidalo k buňkám a populace Tbuněk CD8 se čistila negativní selekcí v magnetické koloně

MACS. T-buňky CD8+ se promyly a resuspendovaly v Eagle médiu (Gibco) (α-ΜΕΜ) , které obsahuje 20 mM pufru Hepes, 4 mM Lglutamin, 100 IU/ml penicilinu, 100 μρ/ιηΐ streptomycinu a ·· ···· ♦·· • · ····· · · Λ Λ ········· ······· ···· ·· · ·· ·· ·

5χ10*⁵ M2-merkaptoetanolu v koncentraci 2χ10⁶ buněk/ml a pak se vše zamíchalo, aniž se přidal CtxB nebo EtxB divokého typu (kontrola PBS) nebo se přidalo 3,45 μΜ (40 μg/ml) CtxB divokého typu nebo EtxB divokého typu nebo různé mutantní podjednotky B, jako je EtxB(G33D), CtxB(E51A), CtxB(V52A), CtxB(P53A), CtxB(G54A), CtxB(S55A), CtxB(Q56A), CtxB(H57A) nebo CtxB(l58A) vše se inkubovalo na ledu po dobu 20 minut. Po té se buňky promyly a resuspendovaly v pufru obsahujícím 0,4 ml HBSS/20 mM Hepes/0,1% azid sodný/10 % krysí sérum. Pak se k buňkám inkubovaným v EtxB, EtxB(G33D) nebo EtxB(H57S) přidaly antiEtxB monoklonální protilátky 118-8 v ředění 1/500 a k buňkám inkubovaných s CtxB a s mutanty CtxB se přidaly anti-CtxB monklonální protilátky LT-39 v ředění 1/800. Po 30 minutách se buňky promyly a resuspendovaly v pufru obsahujícím HBSS/20 mM Hepes/0,1% azid sodný/10 % krysí sérum. Pak se přidaly protilátky anti-myší IgG značené FITC. Následovala inkubace se sekundárními protilátkami po dobu 30 minut. Suspenze buněk se promyla jednou v přípravku ISOTON (Becton-Dickinson) a resuspendovala se v 0,4 ml přípravku ISOTON. Analýzou FACS se odhadla síla fluorescence FITC, což reprezentuje rozsah navázání EtxB, CtxB a různých mutantů na T-buňky CD8+. Z každého vzorku se sebralo 10 000 výsledků a vynesly se do grafu, což ukazuje závislost intenzity fluorescence T-buněk CD8+ inkubovaných v nepřítomnosti podjednotek B (to je kontrola PBS, červená čára) proti fluorescenci, která přispívá k navázání podjednotek B (černá čára) (zobrazeno na obrázku č. 3) .

Výsledky 2

Výsledky na obrázku č. 3 ukazují, že všechny podjednotky B s výjimkou nevazebného mutantu EtxB(G33D) se vážou na T-buňky

CD8+ v podobném rozsahu. Intenzita fluorescence detekovaná po navázání CtxB(H57A) a EtxB(H57S) byla vyšší ve srovnáni s intenzitou vykazovanými podjednotakami B divokého typu, což indikuje, že dva mutanti vykazují vyšší aviditu na buněčný povrch. Tento výsledek je konzistentní se zjištěním, že CtxB(H57A) a EtxB(H57S) se váží se slabě vyšší aviditou na mikrotitrační destičky potažené GM-1 a vykazují slabě vyšší hodnotu konstanty Kd v případě GM-1, jak se stanovilo metodou plasmonové povrchové rezonance (data nejsou uvedeny).

Příklad 3: Zbytek His-57 v EtxB je nutný při vyvolání potencionální anti-EtxB odpovědi

Skupiny samic myší NIH (n = 8) se imunizovaly třikrát v intervalech jednoho týdne intranasálně 10 μρ EtxB nebo EtxB(H57S) v objemu 20 μΐ. Myši se usmrtily 14 dní po třetí imunizaci a odebrala se krev kardiální punkcí. V séru se analyzovalo množství protilátek IgG proti EtxB pomocí testu GM-l-ELISA za použití mikrotitračních destiček potažených 1 μς/ιηΐ EtxB. V sérech se stanovily koncové hodnoty titrů (ekvivalentní k ředění vykazující absorbanci 0,1 nad pozadí).

Výsledky 3

Výsledky na obrázku č. 4 ukazují, že následující intranásální imunizace se sérem, které vykazuje vysoký titr Etx-B divokého typu, vyvolává velké množství anti-EtxB IgG protilátek (titr = 5757 +/- 785), zatímco imunizace s EtxB(H57S) vyvolává podstatně nižší odpověď (p=0,001) (titr je 1205 +/- 222).

Příklad 4: Zbytek His-57 v EtxB a CtxB je nezbytný pro podjednotky B, aby působily jak mukozální adjuvans

Skupiny samic myší NIH (n = 8) se imunizovaly intranasálně 10 μρ samotného ovalbuminu (Ova) nebo 10 μg samotného ovalbuminu smíchaného buď s 10 μρ EtxB, CtxB, EtxB(H57S) nebo CtxB(H57A) a směsi se aplikovaly v objemu 20 μΐ třikrát v intervalu jednoho týdne. Navíc dvě skupiny myší se intranásálně imunizovaly 10 μg EtxB nebo CtxB jako negativní

kontroly. Myši se usmrtily 14 dní po třetí imunizaci a odebrala krev kardiální punkcí. V séru se analyzovalo množství protilátek IgG proti Ova pomocí testu ELISA za použití mikrotitračních destiček potažených 5 gg/ml Ova. V sérech se stanovily koncové hodnoty titrů (ekvivalentní k ředění vykazující absorbanci 0,1 nad pozadí).

Výsledky 4

Výsledky uvedené na obrázku č. 5 ukazují, že EtxB divokého typu i CtxB působí jako mukozální adjuvans, což znamená, že v podstatě zvyšuje anti-Ova odpověď ve srovnání s myší imunizovanou samotným Ova (porovnávají se dráhy 4 a 5 s dráhou i 1). Naopak, když se Ova smíchal s EtxB(H57S) (dráha 6) nebo

CtxB(H57A) (dráha 7) vyvolaná anti-Ova odpověď byla podstatně nižší než odpověď způsobená inkluzí podjednotek B divokého typu. Data ukazují, že CtxB(H57A) postrádá aktivitu adjuvans. To potvrzuje důležitost podjednotky B smyčky E51-I58 a zvláště H57 při zprostředkování imunomodulačních vlastností molekuly.

Příklad 5: Syntetický peptid EVPGSQHI odpovídající smyčce E51 až 158 EtxB a CtxB vykazují imunomodulační vlastnosti

Za účelem posouzení, zda syntetický polypeptid odpovídají.čí smyčce E51 až 158 EtxB (a CtxB) způsobuje depleci T buněk CD8+ z kultur MLN, se izolovaly buňky mezenterických lymfatických žláz způsobem popsaným shora v textu. Buňky se inkubovaly s různými koncentracemi (0,1 μΜ až 20 μΜ) peptidu EVPGSQHI nebo náhodně vybraného kontrolního peptidu LRNETTTTKGDYC. Po 96 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se buňky promyly a resuspendovaly se v objemu 0,4 ml pufru HBSS/20 mM Hepes/0,1 /azidu sodného/10 % krysího séra a pak se analýzou FACS odhadl relativní poměr buněk CD4+ a CD8+ stejným způsobem, který se popisuje v příkladu 1. Stanovily se procenta T-buněk CD8+ zbývající v kultuře ošetřené peptidem EVPGSQHI (uzavřené červené kroužky a čáry) nebo kontrolním peptidem (uzavřené černé čtverce a čára) a vynesly se do grafu proti koncentraci použitého peptidu (obrázek č. 6) .

Výsledky 5

Výsledky na obrázku č. 5 zobrazuji, že inkubace kultur MLN v přítomnosti peptidu EVPGSQHI způsobuje snížení počtu T-buněk CD8+ na rozdíl od kultur ošetřených kontrolním peptidem. To naznačuje, že syntetický peptid korespondující se smyčkou E51 až 158 EtxB a CtxB je aktivní při přímém modulačním působeni na lymfocyty.

Seznam sekvencí

SEQ ID No 1

GAA GTA CCA GGT AGT CAA CAT ATA GAT

SEQ ID No 2

EVPGSQH

SEQ ID No 3

VEVPGSQHIDSQ

SEQ ID No 4

GATFQVEVPGSQHDDSQKKAI

SEQ ID No 5

GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI • ·

P V ŽW7 - (f ΐ

Claims

'PATENTOVÉ NÁ R 0 K Y

1. Látka zahrnující libovolný jeden nebo více zástupců ze skupiny zahrnující aminokyselinovou sekvenci obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ ID NO: 2 nebo její variantu nebo homolog nebo fragment nebo derivát nebo napodobeninu, přičemž uvedená látka je schopná působit stejným nebo podobným způsobem jako EtxB a/nebo CtxB, ale nevykazuje GM1 vazebnou aktivitu.
2. Látka podle nároku 1 vhodná pro použití v medicíně.
3. Látka podle nároku 1 vhodná pro použití jako imunomodulátor.
4. Látka podle nároku 1 vhodná pro použití jako adjuvans.
5. Látka podle nároku 1 vhodná pro použití jako inhibitor průjmu vyvolaného toxinem.
6. Látka podle libovolného z nároků 1 až 6, která navíc obsahuje antigen nebo antigenní determinantu.
7. Farmaceutický prostředek vyznačuj ící se tím, že obsahuje látku podle libovolného z nároků 1 až 6, která může být ve směsi s jedním nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, ředidel nebo ekcipientů.
8. Použití látky podle libovolného z nároků 1 až 7 při výrobě léčiva, které je schopno léčit a/nebo předcházet a/nebo modulovat onemocnění a/nebo stav spojený s poruchou imunity a/nebo průjmového onemocnění vyvolané toxinem.
9. Způsob testování vhodný pro stanovení jednoho nebo více činidel, které jsou schopny interagovat s látkou podle libovolného z nároků 1 až 7 a/nebo tuto látku ovlivňovat, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt látky s testovaným činidlem a stanovení zda činidlo ovlivňuje látku.
10. Činidlo identifikované testovací metodou podle nároku 9.

• 44 · • 4 4 · · ·

50 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 · 4444 44 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 11. Způsob léčby, vyznačuj ící se ti m, že zahrnuje aplikaci látky podle libovolného z nároků 1 až 7 subjektu, který vyžaduje léčbu a/nebo prevenci a/nebo

modulaci onemocnění a/nebo stavu spojeného s poruchou imunity a/nebo poruchou zprostředkovanou toxinem.