MXPA01002387A

MXPA01002387A - Fragmetos de peptido de toxina b del colera o enterotoxina b como adyuvantes de vacunas.

Info

Publication number: MXPA01002387A
Application number: MXPA01002387A
Authority: MX
Inventors: Timothy Raymond Hirst
Original assignee: Univ Bristol
Priority date: 1998-09-07
Filing date: 1999-09-07
Publication date: 2002-05-08
Also published as: ZA200100758B; PL346549A1; BR9913501A; IS5829A; CN1317013A; WO2000014114A1; AU5751699A; AU772015B2; IL141695A0; CA2338384A1; CZ2001839A3; GB9819484D0; NO20011075D0; EP1109828A1; GB2357507A; HUP0104090A2; NZ509631A; NO20011075L; JP2002524469A; EA200100314A1

Abstract

Se describe una sustancia; la sustancia comprende una o mas secuencias de aminoacidos que comprenden la secuencia presentada como SEQ ID No. 2 o una variante de la misma, o un homologo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma, o un imitador de la misma; cuya sustancia es capaz de actuar en una manera que es la misma o similar a EtxB y/o CtxB; y en donde la sustancia no presenta actividad de union a GM-1.

Description

FRAGMENTOS DE PEPTIDO DE TOXINA B DEL COLERA O ENTEROTOXINA B COMO ADYUVANTES DE VACUNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sustancia. En particular, la presente invención se refiere a una sustancia que puede presentar una o más propiedades que son útiles en medicina. A manera de ejemplo, la sustancia es útil para ser usada como un inmunomodulador y/o un adyuvante y/o un inhibidor de diarrea inducida por toxina. De manera más particular, la presente invención se refiere al uso de una sustancia inmunomoduladora para modular una respuesta inmune - tal como la asociada con una enfermedad autoinmune. Más en particular, la presente ¡nvención se refiere a la utilización de la sustancia como un adyuvante cuando se administra en combinación con un antígeno relacionado o no relacionado. En particular, la presente invención se refiere al uso de la sustancia para inhibir la diarrea inducida por toxina. La presente invención también se refiere a una prueba para seleccionar agentes que puedan interactuar con la sustancia de la presente ¡nvención.

« * ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enterotoxina lábil al calor (Etx) de Escherichia coli (E. Coli) y su homólogo cercanamente relacionado, toxina del cólera (Ctx) proveniente 5 de Vibrio cholerae, son ejemplos de toxinas proteínicas que se unen a los receptores de glucolípidos sobre las superficies de la célula hospedera. Cada toxina consiste de seis cadenas polipeptídicas unidas en forma no covalente, incluyendo una subunidad A individual (27 kDa) y cinco subunidades B idénticas (11.6 kDa) las cuales se unen a los receptores de gangliósido GM-1 10 encontrados sobre las superficies de células de mamífero (Nashar et al 1996 Proc Nati Acad Sci 93:226-230). Las subunidades A es responsable de la toxicidad que posee actividad de adenosin difosfato (ADP) ADP- ribosiltransferasa, mientras que las subunidades B (EtxB y CtxB) son oligómeros no tóxicos que se unen y entrecruzan con el gangliósido glicolípido 15 de la superficie celular ubicuo, denominado GM-1 , facilitando de esta manera que la subunidad A entre a la célula. Contrario a la baja inmunogenicidad de la subunidad A sola, ambas EtxB y CtxB son inmunógenos excepcionalmente potentes y se sabe que sus holotóxinas respectivas, Etx y Ctx (las cuales comprenden la 20 subunidades A y B) son adyuvantes potentes cuando se administran por vía oral en combinación con antígenos no relacionados (Ruedl et al 1996 Vaccine 14: 792-798; Nashar eí al 1993 Vaccine 11 : 235; Nashar y Hirst 1995 Vaccine 13: 803; Elson y Ealding 1984 J Immunol 133: 2892; Lycke y Holmgren 1986 ¡^tttfü Immunology 59: 301). Debido a su inmunogenicidad, ambas EtxB y CtxB han sido utilizadas como vehículos para otros epítopes y antígenos (Nashar et al 1993 ibid) y han sido utilizados como componentes de vacunas contra el cólera y enfermedades diarreícas mediadas por E. coli (Jetborn eí al 1992 Vaccine 10: 130). Se han realizado varios estudios sobre el epítope ¡nmunodominante de las subunidades CtxB y EtxB con la intención de desarrollar una vacuna contra la toxina del cólera y la toxina lábil al calor de E. coli. A manera de ejemplo, la siguientes descripciones representan parte del trabajo que ha sido realizado en esta área. La solicitud de patente del Reino Unido No. 2 415 419A describe una vacuna sintética contra el cólera y contra la toxina lábil al calor de E. Coli que comprende un conjugado de un vehículo con un polipéptido sintético correspondiente a una parte de la secuencia de CtxB. El documento WO 85/02611 describe polipéptidos sintéticos que corresponden a secuencias particulares de EtxB las cuales son consideradas útiles como conjugados o como un ingrediente activo para crear anticuerpos contra la subunidad B y para proteger un animal hospedero contra la infección mediada por enterotoxinas. El documento WO 89/10967 describe una secuencia de aminoácidos que representa los números de residuos 50-64 de la CtxB los cuales pueden ser utilizados en combinación con los epítopes de un organismo heterólogo, tal como Flagellum y/o Salmonella, en formulaciones para vacuna con el propósito de proveer protección contra la infección ocasionada por el organismo heterólogo o para proveer protección contra las condiciones o trastornos causados por un antígeno del organismo. El documento WO 90/03437 se refiere a una proteína híbrida que fusiona la subunidad CtxB con la secuencia activa de un antígeno heterólogo que se considera útil para propósitos de vacunación, particularmente para ayudar a estabilizar los antígenos heterólogos en el entorno intestinal. El documento WO 94/06465 se refiere a fragmentos de aminoácidos que están ligados, ya sea con o sin un enlazador a un vehículo apropiado de tal modo que el fragmento de aminoácido ligado al vehículo genere una respuesta inmune de opsonización o protectora hacía los epítopes del fragmento. El documento WO95/29701 describe una vacuna contra Vibrio cholera la cual comprende un conjugado de la subunidad B de la toxina del cólerai (CTB) o un péptido de fragmento sintético que consiste de una porción del mismo, tal como un péptido CTP 3 que comprende la secuencia de aminoácidos 50-64 de la cadena B ligada a un vehículo inerte. El documento WO96/26282 describe sistemas de expresión para expresar los productos génicos provenientes de cepas de Bordetella recombinantes en los cuales el producto génico puede ser una molécula de toxina del cólera. El documento WO96/34893 describe moléculas híbridas entre EtxB / CtxB las cuales podrían ser útiles como una vacuna y para prevenir y/o ¿^^ tratar las enfermedades inducidas por enterotoxina en un individuo. El documento WO 98/21344 describe una subunidad EtxB la cual está modificada para que incluya un péptido antigénico insertado. La molécula quimérica antígeno-EtxB se utiliza para inducir una respuesta de anticuerpos contra un péptido antigénico en los animales hospederos. Estos estudios están relacionados ya sea al uso de (i) un péptido que comprende parte de la secuencia de CtxB/EtxB o (ii) un péptido que comprende parte de la secuencia de CtxB/EtxB acoplada a una segunda entidad (tal como antígeno) para inducir y/o llevar al máximo la respuesta inmunológica hacia ese péptido. Por consiguiente, estos documentos se refieren a la utilización de un epítope inmunodominante de CtxB/EtxB o partes del mismo como un inmunógeno para inducir una respuesta inmune contra esas subunidades con el propósito de desarrollar inmunidad contra el cólera y/o enfermedades diarréicas mediadas por E. coli. El documento WO 91/07979 describe una proteína quimérica que incluye una porción de CtxB y una región de epítope de un antígeno deseado las cuales están diseñadas para ser utilizadas como una vacuna para inducir una respuesta inmune en un sujeto hacia un antígeno deseado. En este sentido, la porción de CtxB es utilizada como un adyuvante pero no como un inmunomodulador. Por consiguiente, ninguno de los documentos antes citados se refiere al uso del pépticlo CtxB/EtxB o parte del mismo como un agente inmunoterapéutico que pueda modular la respuesta inmune. Se ha demostrado que la subunidad EtxB puede actuar como un ^^^^^^ inmunomodulador en los trastornos inmunes. A manera de ejemplo, se ha descrito en el documento WO 97/02045 que EtxB se une a los receptores de gangliósido GM-1 los cuales se encuentran sobre la superficie de las células de mamífero y que esta unión induce efectos diferenciales en las poblaciones de linfocitos incluyendo un agotamiento específico de las células T CD8+ y una activación asociada de las células B. Estos efectos no existen cuando se utiliza una proteína mutante de EtxB (G33D) (que carece de actividad de unión a GM-1 ). Por consiguiente, estos resultados experimentales podrían sugerir que todas las funcionalidades asociadas con EtxB y CtxB se pueden atribuir a la capacidad de las subunidades EtxB y CtxB de unirse al receptor GM-1 ya que los mutantes que carecen de la capacidad de unirse a GM-1 (tal como EtxB (G33D)) no pueden actuar como adyuvantes o inmunomoduladores. Por lo tanto, la técnica anterior hasta la fecha ha sugerido que la inmunomodulación y otros efectos de Etx y Ctx son mediados a través de la unión a GM-1. Sin embargo, hasta la fecha, no se han realizado investigaciones sobre mutantes CtxB/EtxB que conserven la capacidad de unión al receptor de GM-1 pero que carezcan de un efecto inmunomodulador. Se ha descubierto en forma sorpresiva que no todos los efectos de Etx y Ctx son mediados a través de la unión a GM-1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención se ha descubierto que los efectos de inmunomodulación y algunos efectos de Etx y Ctx no son mediados a través de la unión a GM-1. Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones anexas y en la descripción y análisis siguientes. En un aspecto de la presente invención se provee una sustancia que comprende cualquiera de una o más de: una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia presentada como SEQ ID No. 2, o una variante de la misma, o un homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma, o un imitador de la misma; cuya sustancia puede actuar en una forma que es ¡gual que o es similar a EtxB y/o CtxB; pero en la cual la sustancia no puede presentar actividad de unión a GM-1. En un aspecto preferido de la presente invención se provee una sustancia que comprende cualquiera de una o más de: una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia presentada como SEQ ID No. 2, o una variante de la misma, o un homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma, o un imitador de la misma; cuya sustancia puede actuar en una forma que es igual a o es similar a la formación de un bucle de ExtB y/o CxtB; pero en la cual la sustancia no presenta actividad de unión a GM-1.

En un aspecto bastante preferido de la presente invención se provee una sustancia que comprende cualquiera de una o más de: una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia presentada como SEQ ID No. 2, o una variante de la misma, o un homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma, o un imitador de la misma; cuya sustancia puede actuar en una forma que es igual a o es similar al bucle ß4-a2 de EtxB y/o CtxB; pero en la cual la sustancia no presenta actividad de unión a GM-1. La sustancia de la presente invención puede ser una secuencia de aminoácidos o un derivado químico de la misma. La sustancia puede ser un péptido sintético o una variación de péptido sintético- tal como un péptido D retro inverso. La sustancia puede incluso ser un compuesto orgánico u otro compuesto químico. Estos últimos ejemplos son ejemplos de imitadores de la secuencia SEQ ID No. 2. La sustancia de la presente invención puede actuar en una forma que es ¡gual que o es similar a EtxB y/o CyxB. El término "igual que o similar a" es un término cualitativo más que un término cuantitativo. En este sentido, podría ser deseable tener una afinidad de unión incrementada. Los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente una prueba para determinar si es que una sustancia puede actuar en una forma que sea igual que o similar a EtxB y/o CtxB. Por ejemplo, la prueba podría medir y/o determinar un efecto sobre las poblaciones celulares, tales como las poblaciones celulares de linfocitos. Estos efectos pueden incluir pero no se limitan a la inducción de apoptosis en las células T CD8+, la activación mejorada de las células T CD4+ y la activación policlonal de las células B. Ademas, o como alternativa, la prueba podría basarse en la determinación y/o medición de los marcadores de la superficie celular que indican la activación de ciertos efectos intracelulares (por ejemplo medir un incremento en la expresiión de CD25). La sustancia de la presente invención no puede presentar actividad de unión a GM-1. Los expertos en la técnica podrían determinar fácilmente una prueba para determinar la carencia de actividad de unión GM-1. Por ejemplo, la prueba podría utilizar GM-1 ligado a un soporte sólido y en la cual la sustancia se hace pasar después a través del GM-1 ligado. La elución de la sustancia indica que no se une a GM-1. En un aspecto más preferido, la prueba es la que se describe en el documento WO 97/02045. Cabe mencionar que la actividad de unión de la sustancia no es necesariamente dependiente de un evento de unión primario como el que se encuentra con las subunidades Ctx y EtxB de longitud completa. Con Ctx y EtxB de longitud completa, la actividad de unión primaria es la actividad de unión a GM-1. En este sentido, la sustancia puede presentar un solo evento de unión. Sin embargo, para algunos casos, la sustancia podría poseer la capacidad de tener más de una actividad de unión.

De preferencia, la sustancia está sustancialmente aislada y/o sustancialmente pura. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "aisladas" y "purificadas" se refiere a moléculas, ya sea secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, que se remueven de su entorno natural y/o se aislan o separan de por lo menos algún otro componente con el cual estos están asociados en forma natural. Una proteína podria estar mezclada con vehículos o diluyentes los cuales no interfieren con el propósito pretendido de la sustancia e incluso podrían ser considerada como sustancialmente aislada. La presente ¡nvención se basa en el hallazgo sorprendente de que existen mutantes que pueden unirse al receptor de GM-1 pero que carecen de un efecto inmunomodulador. Estos mutantes facilitan la elucidación de los mecanismos mediante los cuales actúan las subunidades B de Ctx y/o Etx, particularmente en relación con un efecto inmunomodulador. Otros aspectos de la presente invención son como sigue. Una sustancia de conformidad con la presente invención para ser utilizada en medicina. Una sustancia de conformidad con la presente invención para ser utilizada como un inmunomodulador. Una sustancia de conformidad con la presente invención para ser utilizada como un adyuvante. Una sustancia de conformidad con la presente invención para ser ulilizada como un inhibidor de diarrea inducida por toxina.

Una sustancia de conformidad con la presente invención en la cual la sustancia en forma adicional comprende un antígeno o un determinante antigénico. Una composición farmacéutica que comprende la sustancia de 5 conformidad con la presente invención, mezclada en forma opcional con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El uso de una sustancia de conformidad con la presente invención para la fabricación de un medicamento que pueda tratar y/o prevenir y/o modular una enfermedad y/o condición asociada con un trastorno inmune 10 y/o un trastorno mediado por toxina. Un método de prueba para determinar uno o más agentes que puedan interactuar y/o afectar a la sustancia de conformidad con la presente invención; en el cual la prueba comprende poner en contacto la sustancia con un agente que se va a probar y después determinar si es que el agente afecta 15 o no a la sustancia. Un agente identificado mediante el método de prueba de conformidad con la presente invención. Un método de tratamiento, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento de y/o prevención de y/o modulación de 20 una enfermedad y/o condición asociada con un trastorno inmune y/o un trastorno mediado por toxina, una sustancia de conformidad con la presente invención. ^gg¡* Estos aspectos se presentan bajo encabezados de secciones separadas. Sin embargo, deberá entenderse que las enseñanzas bajo cada encabezado de sección no están necesariamente limitadas a ese encabezado de sección particular. 5 Inmunomulador Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunomodulador" significa una sustancia que puede modular la respuesta inmune induciendo, por ejemplo, un efecto diferencial sobre las células, tales 10 como las células linfocito - conduciendo de preferencia a la inducción de apoptosis en las células T CD8+ y/o la activación incrementada de las células CD4+ y/o la activación policlonal de las células B. El término "efecto diferencial sobre las células leucocito" podría incluir, pero no se limita a, un agotamiento específico de las células CD8+ (por 15 ejemplo mediante apoptosis), la activación incrementada de las células T CD4+ y/o la activación asociada de las células B. De preferencia el inmunomodulador puede regular negativamente la respuesta patológica de las respuestas inmunes asociadas con Th1 y/o Th2. 20 De preferencia el inmunomodulador puede regular positivamente la producción de anticuerpos en las superficies de la mucosa. y»í--yyriíai^&^,y!,-,y~ g.

Adyuvante Tal como se utiliza en la presente invención, un "adyuvante" es una sustancia que incrementa en forma no específica la respuesta inmune hacia un antígeno. Este también incluye cualquier sustancia que pueda afectar el grado de la respuesta inmune hacia una identidad tal como un antígeno y/o un determinante antigénico, alterando la antigenicidad del antígeno o alterando la reactividad específica o los mecanismos asociados con el efector no específico del hospedero de modo que se induzca una respuesta inmune en una célula hospedera y/o se guíe en una dirección particular. En un aspecto preferido, el adyuvante puede actuar como un adyuvante de las mucosas. De preferencia el adyuvante puede prolongar la presentación al antígeno y proveer una memoria inmunológica sostenida en un individuo mamífero.

Antíqeno Tal como se utiliza en la presente invención, un "antígeno" significa una entidad la cual, cuando se introduce en un hospedero inmunocompetente, estimula la producción de un anticuerpo o anticuerpos específicos que se pueden combinar con la entidad. El antígeno puede ser una sustancia pura, una mezcla de sustancias o un material soluble o en partículas (incluyendo células o fragmentos celulares). En este sentido, el término incluye cualquier determinante antigénico apropiado, un autoantígeno, un anlígeno del propio organismo, un antígeno de reacción cruzada, un aloantígeno, un xenoantígeno, un tolerógeno, un alérgeno, un hapteno y un inmunógeno o partes de los mismos, así como cualquier combinación de los mismos, y estos términos se usan en forma intercambiable a lo largo del texto. Un "alérgeno" incluye cualquier antígeno que estimule una reacción alérgica, induciendo una reacción de hipersensibilidad de tipo I. Los ejemplos de fuentes de alérgenos comunes incluyen pero no se limitan a ambrosía, sorgo, grama, avena silvestre, fleo, pasto de Bermuda, azul de Kentucky, artemisa pegajosa, aliso, abedul, avellano, haya, Cupressae, roble, olivo, Aspergillus spp., Cladosporium spp., Alternaría spp., basidosporas, ascomicetos, trigo, sorgo, avena, gatos, perros, caballos, conejos, cobayos, cuyos, pericos australianos, pericos, pichones, patos, pollos, Dermatophagoides pteronyssinus, D. farínae, Euroglyphus maynei, cucaracha, moscas, algarabo, jejenes, mariscos, leguminosas, cacahuates, nueces, cereales, productos lácteos, huevos, frutas, tomates, hongos, bebidas alcohólicas, café, chocolate, penicilinas, sulfonamidas y otros antibióticos, sulfasalazina, carbamazepina, picaduras de abejas y avispas, mordidas de hormiga y mosquito, productos sanguíneos, suero, vacunas, medio de contraste, fármacos (incluyendo fármacos contra el asma y antibióticos).

Determinante antigénico El término "determinante antigénico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un sitio en un antígeno que es reconocido por un anticuerpo o un receptor de la célula T. De preferencia es un péptido corto derivado a partir de o como parte de un antígeno proteináceo. Se pretende sin embargo que el término también incluya los glicopéptidos y los epítopes de carbohidrato. El término también incluye secuencias modificadas de aminoácidos o carbohidratos que estimulan respuestas que reconoce el organismo en su totalidad. Es ventajoso si el determinante antigénico es un determinante antigénico del agente infeccioso (tal como una bacteria o un virus) el cual ocasiona la enfermedad infecciosa. A manera de ejemplo, si el agente infeccioso es EBV, el determinante antigénico podría ser un determinante antigénico de gp340 o gp350 o de una proteína latente (por ejemplo EBNAs 1 ,2 3B, 3C y -LP, LMP-1 , -2A y 2-B o un EBER). Si el agente infeccioso es un virus de influenza, el determinante antigénico podría ser un determinante antigénico de la proteína de la cubierta viral (por ejemplo hemaglutinina y neuraminidasa) o de una proteína interna (por ejemplo nucleoproteína). Si el agente infeccioso se selecciona a partir del grupo que consiste de E. coli, enteropatogénica, enterotoxigénica, enteroinvasiva, enterohemorrágica y enteroagregante, entonces el determinante antigénico podría ser un determinante antigénico de una toxina bacteriana o del factor de adhesión. También es ventajoso si el determinante antigénico es un determinante proveniente de un autoantígeno.

; ^,. ¿ ** Agente El agente puede ser una secuencia de aminoácidos o un derivado químico de la misma. La sustancia puede incluso ser un compuesto orgánico u otro compuesto químico. El agente podría ser una secuencia de nucleótidos - las cuales podrían ser secuencias sentido o antisentido. El agente podría ser un anticuerpo. En un aspecto preferido, el agente es un receptor celular que se puede enganchar por la sustancia.

Inhibidor de diarrea inducida por toxina El término "inhibidor de diarrea inducida por toxina" incluye cualquier sustancia que pueda afectar la actividad de las holotoxinas Etx/Ctx de tal manera que se puedan evitar las consecuencias patológicas de Etx/Ctx, tales como diarrea.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención demuestra el hallazgo bastante sorpresivo de que: (i) la sustancia de la presente invención puede actuar como un inmunomodulador y/o un adyuvante y/o un inhibidor de diarrea inducida por toxina que puede afectar las enfermedades diarréicas mediadas por enterotoxina. (ii) la sustancia de la presente invención puede actuar en una forma que es la misma a o es similar a EtxB y/o CtxB. La actividad de la sustancia de la presente invención puede ser mediada por el "denominado" bucle IJ4-a2 de EtxB y CtxB, el cual es un bucle flexible incluido dentro de los residuos de aminoácidos 45-65. (iii) las moléculas EtxB con mutaciones puntuales en tres sitios separados dentro del bucle ß4-a2 (posiciones 55, 56 y 57) conservan actividad de unión a GM-1 , pero carecen de otras actividades, tales como toxicidad y la capacidad de regulación positiva de CD25 y desencadenar la apoptosis de las células T CD8-positivas. Además, las holotoxinas Ctx que comprenden subunidades B con mutaciones también muestran un defecto en una capacidad para desencadenar la secreción electrogénica de cloruro, el evento de secreción primario responsable para mediar la diarrea. Estos hallazgos son particularmente sorpresivos, ya que normalmente se cree que los bucles flexibles sirven únicamente para unir dos elementos de estructura secundaria juntos, y en raras ocasiones tienen una función importante por sí mismos. (iv) la actividad de unión de la sustancia no es necesariamente dependiente de un evento de unión primaria como el que se encuentra con Ctx y EtxB de longitud completa. Con Ctx y EtxB de longitud completa, la actividad de unión primaria es la actividad de unión a GM-1.

Toxinas Ctx/Etx Tal como se utiliza en la presente invención, el término "Ctx" se refiere a la toxina del cólera y el término "CtxB" se refiere a la subunidad B de la toxina del cólera. En otros textos, estos podrían algunas veces ser identificados como CT o Ct o CTB o CtB respectivamente. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "Etx" significa en la presente invención la enterotoxina lábil a calor de E. coli y el término "EtxB" es la subunidad B de Etx. En otros textos, estos podrían algunas veces ser identificados como LT o Lt y LTB o LtB respectivamente.

Bucle ß4-a2 En un aspecto, la presente invención se refiere a una sustancia que comprende la secuencia EVPGSQG (SEQ ID No. 2) la cual puede actuar de una manera que es la misma o es similar a EtxB y/o CtxB o una variante de la misma, o un homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma o un imitador de la misma pero que no puede presentar actividad de unión a GM-1. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que la unión de las cinco subunidades B de Etx/Ctx a GM-1 es una interacción de alta afinidad, la cual permite que se presente una actividad de unión secundaria de baja afinidad de EtxB/CtxB. Esta unión es mediada por el bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB. La estructura del bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB se puede entender haciendo referencia a la estructura molecular de Etx tal como se describe en detalle en Sixma eí al. J. Mol. Biol. (1993) 230; 890-918) y como se ilustra en la figura 1. En resumen, cada subunidad B de Etx o Ctx consiste de una hélice N-terminal pequeña (a1), dos hojas anti-paralelas de cadena triple (hoja I, compuesta por las cadenas ß2, ß3, ß4 y la hoja II, compuesta por las cadenas ß1 , ß5 y ß6), y una a-hélice larga ( 2). Las dos hojas ß forman un barril ß. Los bucles que unen estos elementos de estructura secundaria en la subunidad B se pueden dividir en dos clases, haciendo referencia a los dos extremos de las hojas. En un extremo de la subunidad, el extremo "estrecho" (o "A"), los bucles son por lo general cortos, implicando las conexiones ß1-ß2, ß3-ß4 y a2-ß5 así como el extremo C-terminal. La subunidad se dilata en el otro extremo, con bucles mucho más largos que conectan a los elementos de la estructura secundaria a1-ß1 , ß2-ß3, ß4-a2. El bucle más largo conecta a ß4 y a2 (de aquí en adelante el "bucle ß4-a2"), incluye los residuos Glu 51 a Asp 59, y se extiende por debajo del plano de las hojas ß. Este bucle es completamente flexible, pero de conformidad con Sixma eí al (Nature (1992) 355; 561-564) se hace distintivamente menos móvil después de la unión a lactosa. La presente invención demuestra que el bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB es responsable de la actividad de unión secundaria y de esta manera el uso de este bucle para aislarlo del resto de la molécula EtxB/CtxB (por ejemplo como un péptido), podría permitir que la actividad de unión secundaria se presente en ausencia del primero. La mutación selectiva del bucle ß4- 2, o un péptido derivado de este bucle podría ser explotado con el propósito de incrementar la afinidad de la actividad de unión secundaria. Incrementando la afinidad de la actividad de unión secundaria, también podría evitarse la interacción con GM-1. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB" es la entidad que es responsable de la actividad de unión secundaria de las subunidades B de las toxinas tales como la toxina del cólera y la toxina lábil a calor de E. coli. Cuando el bucle ß4-a2 se utiliza para aislarlo del resto de la molécula EtxB y/o CtxB (por ejemplo como un péptido), la actividad de unión secundaria se podría presentar en ausencia del primero y es por lo tanto conocida de aquí en adelante como una actividad o actividad de unión. De preferencia la sustancia de la presente invención comprende un bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB. De preferencia la sustancia comprende un imitador del bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB. De preferencia la sustancia comprende un imitador del bucle ß4-a2 de EtxB/CtxB con una actividad de unión de alta afinidad. De preferencia la sustancia comprende un péptido de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40 aminoácidos. De preferencia el péptido tiene menos de 25 aminoácidos. Si el péptido es una proteína de fusión, el péptido de preferencia tiene más de 25 aminoácidos.

De preferencia la sustancia comprende la secuencia VEVPGSQHIDSQ (SEQ ID No.3). De preferencia la sustancia comprende la secuencia GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI (SEQ ID No.4). De preferencia la sustancia comprende la secuencia GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI (SEQ ID No.5) obtenible a partir de los residuos 45-65 de E. Coli porcina. De preferencia la sustancia comprende los residuos 45-65 obtenibles a partir de EtxB de la variante humana de E. Coli obtenible a partir de EtxB de la variante porcina de E Coli.

Secuencia de aminoácidos La presente invención provee una sustancia que comprende las secuencias de aminoácidos de la presente invención que puede actuar como un inmunomodulador y/o un adyuvante y/o un inhibidor de la diarrea inducida por toxina la cual puede afectar las enfermedades diarréicas mediadas por enterotoxina. La sustancia también puede ser utilizada en pruebas para identificar uno o más agentes que puedan interactuar con y/o afectar la actividad de la sustancia. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de aminoácidos" se refiere a secuencias de péptidos, polipéptidos, secuencias de proteínas o porciones de las mismas.

Efecto El término "efecto" incluye modulación, tal como tratamiento, prevención, supresión, alivio, restauración, elevación, modificación de la actividad de la sustancia. El término "modificación" incluye pero no se limita a deshabilitación, silenciamiento, mutación, eliminación, mejoramiento, incremento, agonismo, antagonismo, reducción o bloqueo de la actividad de la sustancia.

Variantes/homóloqos/derivados La secuencias de aminoácido preferidas de la invención son SEQ ID No 2 o SEQ ID No 3 o SEQ ID No 4 o SEQ ID No 5 o las secuencias que puedan ser obtenidas a partir de la sustancia de la presente invención pero también incluyen secuencias homologas obtenidas a partir de cualquier fuente, por ejemplo proteínas vírales/bacterianas relacionadas, homólogos celulares y péptidos sintéticos, así como variantes o derivados de la misma. Por lo tanto, la presente invención cubre variantes, homólogos o derivados de las secuencias de aminoácido presentadas en la presente ¡nvención, así como variantes, homólogos o derivados de la secuencia de nucleótidos que codifica para aquellas secuencias de aminoácidos. En el contexto de la presente ¡nvención, se considera que una secuencia homologa incluye una secuencia de aminoácidos que podría ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, de preferencia por lo menos 95 o 98% idéntica al nivel de aminoácidos sobre por lo menos los 7 aminoácidos de SEQ ID No 2, por ejemplo como se muestra en el listado de secuencias de la presente invención. En particular la homología típicamente debe ser considerada con respecto a aquellas regiones de la secuencia (tales como los aminoácidos en las posiciones 51, 56 y 57) que se sabe son esenciales para una actividad que es la misma o es similar a EtxB y/o CtxB más que a unas secuencias circunvecinas no esenciales. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir residuos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Las comparaciones de homología se pueden realizar en forma visual, o más comúnmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de computadora disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se denomina como alineación "sin espacio". Típicamente, tales alienaciones sin espacio se realizan únicamente sobre un número relativamente corto de residuos.

Aunque éste es un método muy simple y consistente, no puede tomar en consideración que, por ejemplo, en otro par de secuencias de alguna otra manera idénticos, una inserción o deleción ocasionará que los siguientes residuos de aminoácidos queden fuera de alineación, dando como resultado potencialmente una reducción grande en el % de homología cuando se realiza una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que toman en consideración las posibles inserciones y deleciones sin castigar indebidamente la puntuación de homología global. Esto se logra insertando "espacios" en la alineación de la secuencia para intentar llevar al máximo la homología local. Sin embargo estos métodos más complicados asignan "castigos por espacios" a cada espacio que se presenta en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con tan pocos espacios como sea posible - lo que refleja una alta relación entre las dos secuencias comparadas - permitirá obtener una puntuación mayor que una con muchos espacios. "Los costos de espacio afín" se utilizan típicamente para cobrar un costo relativamente alto por la existencia de un espacio y un castigo más pequeño para cada residuo subsecuente en el espacio. Esto es el sistema de puntuación de espacio utilizado en forma más común. Los castigos por espacio altos producirán desde luego alineaciones optimizadas con menos espacios. La mayoría de los programas de alineación permiten que los castigos por espacio se modifiquen. Sin embargo, se prefiere ^ggB¡toSg utilizai los valores por omisión cuando se utiliza tal software para las comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase más adelante) el castigo de espacio por omisión para las secuencias de aminoácido es -12 para un espacio y -4 por cada 5 extensión. El cálculo del % de homología máximo por lo tanto requiere primero la producción de una alineación óptima, tomando en consideración los castigos por espacio. Un programa de computadora apropiado para realizar tal alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, 10 E.U.A ; Devereux eí al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otro software que puede realizar las comparaciones de secuencia incluyen pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel eí al., 1999 ibid- capítulo 18), FASTA (Atschul eí al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA 15 están disponibles para investigación fuera de línea y en línea (véase Ausubel eí al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit. Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el procedimiento de alineación por sí mismo típicamente no se basa 20 en una comparación todo o nada de pares. En cambio, se utiliza por lo general una matriz de marcación de similitud con escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares tomando como base la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz utilizada comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por omisión para la serie de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin por lo general utilizan ya sea los valores por omisión públicos o un cuadro de comparación de símbolos confeccionados a la medida si se suministran (véase el manual del usuario para mayores detalles). Se prefiere utilizar los valores por omisión públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software la matriz por omisión, tal como BLOSUM62. Una vez que el software ha producido una alineación óptima es posible calcular el % de homología, de preferencia el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico. Los términos "variantes" o " derivados" en relación con las secuencias de aminoácidos de la presente invención presentadas como SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4 y SEQ ID No 5 incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de, o adhesión de 1 (o más) aminoácidos provenientes de o a la secuencia siempre y cuando la entidad resultante conserve una actividad, de preferencia que tenga por lo menos la misma actividad y/o actividad similar que CtxB y/o EtxB. Las secuencias SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 4 o SEQ ID No. 5 podrían ser modificadas para ser utilizadas en la presente invención. Típicamente, las modificaciones se hacen para que mantengan la actividad de la secuencia. Por ejemplo se pueden hacer sustituciones de aminoácidos desde 1 , 2 ó 3 hasta 10 ó 20 sustituciones con la condición de que la secuencia modificada conserve su actividad. La sustancia de la presente invención también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultando una sustancia funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácido deliberadas se pueden hacer tomando como base la similitud en polaridad, carga, solubilidad, carácter hidrofóbico, carácter hidrofílico y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre y cuando se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen glicina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de carácter hidrofílico similares incluyen leucina, isoleucina, valina glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Por ejemplo se pueden hacer sustituciones conservadoras de conformidad con el cuadro siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y de preferencia en la misma línea en la tercera columna pueden ser sustituidos uno por otro.

« Secuencia de nucleótidos En un aspecto, la presente invención provee secuencias de nucleótido que codifican para la sustancia de la presente invención las cuales pueden actuar como una plantilla o como objetivos en las pruebas (tales como la prueba de dos híbridos de levadura) para identificar uno o más agentes y/o derivados de los mismos que puedan afectar la sustancia. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de nucleótidos" se refiere a secuencia de nucleótidos, secuencias de oligonucleótidos, secuencias de polinucleótidos y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de las mismas (tales como porciones de las mismas). La secuencia de nucleótidos puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético o recombinante los cuales pueden ser de cadena doble o de cadena sencilla sea o no que representen la cadena sentido o antisentido o combinaciones de las mismas. De preferencia, el término secuencia de nucleótidos se prepara mediante el uso de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante). De preferencia, el término "secuencia de nucleótidos" significa ADN: La secuencia de nucleótidos que codifica para la sustancia puede ser la misma que la forma que se presenta en la naturaleza para este aspecto. De preferencia la secuencia de nucleótidos que codifica para la sustancia es una secuencia de nucleótidos no nativa - o es una variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma. De esta manera, en una modalidad preferida, la presente invención no cubre la secuencia que codifica para nucleótidos nativa de conformidad con la presente invención en su ambiente natural cuando está bajo el control de su promotor nativo el cual también está en su ambiente natural. Para facilidad de referencia, se ha denominado esta modalidad preferida como "la secuencia de nucleótido no nativa". Tal como se utiliza en la presente invención "que se presenta en la naturaleza" se refiere a una sustancia con una secuencia de aminoácidos que se encuentra en la naturaleza. Tal como se utiliza en la presente invención "biológicamente activa" se refiere a una sustancia que tiene funciones reguladoras o bioquímicas de la sustancia que se presenta en la naturaleza.

Variantes/homólogos/derivados Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" con relación a la secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1 de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, remplazo de, deleción de o adhesión de uno (o más) ácidos nucleicos a partir de o hacia la secuencia con la condición de que la secuencia de nucleótídos resultante codifique para una sustancia que tenga una actividad, de preferencia que tenga por lo menos la misma actividad que las secuencias SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 5 presentadas en el listado de secuencias.

Como se indicó anteriormente, con respecto a la homología de secuencia, de preferencia existe por lo menos 75%, más preferido por lo menos 85%, más preferido aún por lo menos 90% de homología a la secuencia mostrada en el listado de secuencias de la presente ¡nvención. En forma más preferida existe por lo menos 95%, más preferido aún por lo menos 98% de homología. Las comparaciones de homología de nucleótidos pueden ser conducidas como se describió anteriormente. Un programa preferido para comparar secuencias es el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuación por omisión tiene un valor de apareamiento de 10 para cada nucleótido idéntico y -9 para cada desapareamiento. El castigo por creación de espacio por omisión es -50 y el castigo por extensión de espacio por omisión es -3 para cada nucleótido. La presente ¡nvención también abarca secuencias de nucleótidos que puedan hibridar en forma selectiva a las secuencias presentadas en la presente ¡nvención, o cualquier variante, fragmento o derivado de la mismas, o al complemento de cualquiera de las anteriores. Las secuencias de nucleótidos de preferencia son de por lo menos 15 nucleótidos de longitud, más preferido por lo menos 20, 30, 40 ó 50 nucleótidos de longitud. Tal como se utiliza en la presente invención una "deleción" se define como un cambio ya sea en la secuencia de nucleótidos o en la secuencia de aminoácidos en la cual están ausentes uno o más nucleótidos o residuos de aminoácido, respectivamente.

Tal como se utiliza en la presente invención una "inserción" o "adición" es ese cambio en una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácidos, respectivamente, en comparación con la sustancia presente en forma natural. Tal como se utiliza en la presente invención "sustitución" resulta del reemplazo de uno o más nucleótidos o amino ácidos con nucleótidos diferentes o amino ácidos diferentes, respectivamente.

Hibridación El término "hibridación" tal como se utiliza en la presente invención deberá incluir "el procedimiento mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante el apareamiento de bases", así como el procedimiento de amplificación tal como el realizado en la tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las secuencias de nucleótido de la invención que pueden hibridar en forma selectiva a las secuencias de nucleótido presentadas en la presente invención, o a su complemento, por lo general serán de por lo menos 75%, de preferencia por lo menos 85 o 90% y más preferido por lo menos 95% o 98% homologas con las secuencias de nucleótido correspondientes presentadas en la presente ¡nvención a través de una región de por lo menos 20, de preferencia por lo menos 25 a 30, por ejemplo por lo menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos. Las secuencias de nucleótidos preferidas de la invención comprenderán regiones homologas con nucleótidos que ^¡¿2S^j¡ gÉlj comprenden SEQ ID No. 1 de preferencia con por lo menos 80 o 90% y más preferido por lo menos 95% de homología con SEQ ID No. 1. El término "que hibrida en forma selectiva" significa que la secuencia de nucleótidos utilizadas como una sonda se utiliza bajo condiciones en las cuales se encuentra que una secuencia de nucleótidos objetivo de la invención hibrida a la sonda a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridación de fondo puede presentarse debido a que están presentes otras secuencias de nucleótidos por ejemplo, en la genoteca de ADNc o ADN genómico que está siendo seleccionada. En este caso, el fondo implica un nivel de señal generado por la interacción entre la sonda y un elemento de ADN no específico de la genoteca el cual es menos de 10 veces, de preferencia menos de 100 veces tan intenso que la interacción específica observada con el ADN objetivo. La intensidad de interacción se puede medir, por ejemplo, mediante radio marcado de la sonda, por ejemplo con 32P. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico, como se enseña en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una "astringencia" definida como se explica más adelante. La astringencia máxima típicamente se presenta aproximadamente a Tm-5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); la astringencia alta aproximadamente entre 5°C y 10°C por debajo de Tm; la astringencia intermedia aproximadamente entre 10°C y 20°C por debajo de Tm; y la astringencia baja aproximadamente entre 20°C y 25°C por debajo de la Tm. Como los expertos en la técnica entenderán, se puede utilizar una hibridación con astringencia máxima para identificar o detectar secuencias de nucleótido idénticas mientras que se puede utilizar una hibridación con astringencia intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias de nucleótidos similares o relacionadas. En un aspecto preferido, la presente ¡nvención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse a la secuencias de nucleótido de la presente ¡nvención bajo condiciones astringentes (por ejemplo 65°C y O.lxSSC {1xSSC=0.15 M NaCI, 0.015 M Na3 Citrato pH 7.0). En el caso en el cual la secuencia de nucleótidos de la ¡nvención es de doble cadena, ambas cadenas de dúplex, ya sea en forma individual o en combinación, quedan abarcadas por la presente ¡nvención. En caso que la secuencia de nucleótido sea una sola cadena, deberá entenderse que la secuencia complementaria de la secuencia de nucleótidos también queda incluida dentro del campo de la presente ¡nvención.

Vectores de expresión Las secuencias de nucleótido de la presente invención pueden ser incorporadas en un vector recombinante que pueda ser replicado. El vector podría ser utilizado para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos en y/o a partir de una célula hospedera compatible. La expresión podría ser controlada utilizando secuencias de control que incluyan promotores/mejoradores y otras señales de regulación de expresión. También se pueden utilizar los promotores procarióticos y los promotores funcionales en células eucarióticas. Se podrían utilizar promotores específicos de tejido o específicos de estímulo. También podrían utilizarse promotores quiméricos que comprendan los elementos de secuencia provenientes de dos o más promotores diferentes descritos anteriormente. La sustancia producida por una célula recombinante hospedera podría ser secretada o podría estar contenida en forma intracelular dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Las secuencias que codifican para las sustancias se pueden diseñar con secuencias de señal que dirijan la secreción de las secuencias que codifican para las sustancia a través de una membrana celular procariótica o eucariótica particular.

Proteínas de fusión La sustancia de la ¡nvención también puede ser producida como proteína de fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación. Ejemplos de compañeros de proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o de activación de transcripción) y ß-galactosidasa. También podría ser conveniente incluir un sitio de corte proteolítico entre el compañero de la proteína de fusión y la secuencia de proteína de interés para permitir la eliminación de las secuencias de proteína de fusión. De preferencia la proteína de fusión no V^^^ impedirá la actividad de la sustancia que comprende a la secuencia de amino ácidos de la presente invención. En una modalidad de la presente invención, la proteína de fusión comprende un antígeno o un determinante antigénico fusionado a la sustancia de la presente invención. En esta modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión no presente en la naturaleza que comprende una sustancia que podría actuar como un adyuvante en el sentido de proveer una estimulación generalizada del sistema inmune. El antígeno o determinante antigénico podría estar unido a cualquiera del extremo amino terminal o carboxi terminal de la sustancia. En otra modalidad de la invención, la sustancia de la invención puede ser ligada a una secuencia heteróloga para codificar para una proteína de fusión. Por ejemplo, para seleccionar las genótecas de péptido en cuanto a agentes que puedan afectar la actividad de la sustancia, podría ser útil codificar una sustancia quimérica que exprese un epitope heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo comercialmente disponible. En otra modalidad, puede realizarse un ensayo para identificar un agente, tal como un receptor objetivo, o para un agente capaz de regular la actividad de transcripción de CD25, utilizando una proteína de fusión ligada.

Anticuerpos En una modalidad de la presente invención, la sustancia de la presente invención puede ser un anticuerpo. Este anticuerpo puede ser capaz de actuar como un imitador de la presente invención. Los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas estándares, tales como inmunización con la sustancia de la invención o al utilizar una genoteca de despliegue de fagos. Para los propósitos de esta ¡nvención, el término "anticuerpo", a menos que se especifique lo contrario, incluye pero no se limita a, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena individual, de Fab y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Dichos fragmentos incluyen fragmentos de todos lo anticuerpos que retienen su actividad de unión para una sustancia objetivo, fragmentos de Fv, F(ab') y F(ab') , como también anticuerpos de cadena individual (scFv), proteínas de fusión y otras proteínas sintéticas que comprenden el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Además, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos humanizados, por ejemplo como se describe en la sustamcia-A-239400. Los anticuerpos de neutralización, es decir, aquellos que inhiben la actividad biológica de los polipéptidos de sustancia, son especialmente preferidos para diagnósticos y para agentes terapéuticos. En una modalidad, la invención también provee anticuerpos monoclonales o policlonales para sustancias de la invención, tales como polipéptidos o fragmentos de los mismos. De esta forma, la presente invención además provee un procedimienfb para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales a sustancias, tales como polipéptidos de la invención.

Anticuerpos policlonales Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico que tiene un epítope (s) que se obtiene a partir de un agente identificado y/o sustancia de la presente invención. Dependiendo de las especies hospederas, pueden utilizarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen pero no se limitan a, geles minerales de Freund tales como hidróxido de aluminio, y sustancias con actividad de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, y dinitrofenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles que pueden emplearse si se administra el polipéptido de sustancia purificada a individuos inmunológicamente comprometidos con el propósito de estimular la defensa sistémica. El suero del animal inmunizado se recolecta y trata de conformidad con procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales para un epítope que se obtiene a partir de un agente identificado y/o sustancia de la presente invención contiene anticuerpos para i «, .*»«. - *.í * . .. m am ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ^^^^^ ¿g^¡g^ otros antígenos, los anticuerpos policlonales pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar antisuero policlonal son conocidas en la técnica. De manera que puedan hacerse dichos anticuerpos, la invención también provee polipéptidos de la invención o fragmentos de los mismos haptenizados con otro polipéptido para utilizarlo como ¡nmunogenes en animales o humanos.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopes que se obtienen a partir de un agente y/o sustancia identificados de la presente invención también pueden producirlos fácilmente los expertos en la técnica. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. Las líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos pueden crearse mediante fusión celular, y también por otras técnicas tales como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con virus Epstein-Barr. Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epítopes orbitales pueden seleccionarse para varias propiedades; es decir, para isotipo y afinidad de epítope. Los anticuerpos monoclonales de la sustancia y/o agente identificado de la presente invención pueden preparase utilizando cualquier técnica que se encargue de la producción de moléculas de anticuerpo para líneas celulares continuas en el cultivo. Estas incluyen pero no se limitan a, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Koehler y Milstein (1975 Nature 256:495-497), la técrflca de hibridoma de la célula B de humano (Kosbor eí al (1983) Immunol Today 4:72; Cote eí al (1983) Proc Nal Acad Sci 80:2026-2030) y la técnica de hibridoma de EBV (Colé et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cáncer Theapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96). Además, se pueden utilizar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de los genes de anticuerpos de ratones a genes de anticuerpos de humanos para obtener una molécula con una especificidad de antígeno apropiada y actividad biológica (Morrison eí al (1984) Proc Nati Acad Sci 81 :6851-6855; Neuberger eí al (1984) Nature 312:604-608; Takeda eí al (1985) Nature 314:452-454). De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (patente de E.U.A. 4,946,779) pueden adaptarse para producir los anticuerpos de cadena individual específicos de sustancia. Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, que se dirigen contra epítopes que se obtienen a partir del agente y/o sustancia identificados de la presente ¡nvención son, particularmente útiles en diagnósticos, y aquellos que se encuentran neutralizados, son útiles en inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, pueden utilizarse para elevar anticuerpos anti-idiotipo. Los anticuerpos anti-idiotipo son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" de la sustancia y/o agente en contra, cuya protección se desea. Las técnicas para elevar los anticuerpos anti-idiotipos son conocidas en la técnica. Estos anticuerpos anti-idiotipo también son útiles en terapia.

Los anticuerpos pueden también producirse al inducir producción in vivo en la población de linfocitos o al tamizar genotecas o paneles de inmunoglobulina recombinante de reactivos de unión muy específicos como se describe en Orlandi eí al (1989, Proc Nati Acad Sci 86: 3833-3837), y Winter G y Milstein C (1991 ; Nature 349:293-299). También pueden generarse los fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos para la sustancia. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos de F(ab')2 que pueden producirse mediante digestión de pepsina de la molécula del anticuerpo y los fragmentos de Fab que pueden generarse al reducir los puentes disulfuro de los fragmentos de F(ab')2. Alternativamente, las genotecas de expresión de Fab pueden construirse para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD e a/ (1989) Science 256:1275-128 1 ).

Ensayos para sustancias inmunomoduladoras La inmunomodulación de la respuesta inmune puede medirse mediante perfilación de transcripción, por ejemplo, al someter a prueba la activación de transcripción del marcador de superficie celular CD25 al medir la señal desde un gen reportero ligado.

Reporteros Preferiblemente pueden utilizarse una amplia variedad de reporteros en los métodos de ensayo de la presente invención proveyendo los reporteros preferidos señales convenientemente perceptibles (por ejemplo, mediante espectroscopia). Por medio de ejemplo, un gen reportero puede codificar para una enzima que cataliza una reacción que altera propiedades de absorción de luz. Ejemplos de moléculas reporteras incluyen pero no se limitan a ß-galactosidasa, invertasa, proteína verde fluorescente, luciferasa, cloranfenicol, acetiltransferasa, ß-glucuronidasa, exo-glocanasa y glucoamilasa. Alternativamente, los nucleótidos marcados con una señal fluorescentes o radiomarcados pueden incorporarse en transcritos nacientes que se identifican posteriormente cuando se unen a sondas de oligonucleótidos. En una modalidad preferida, la producción de moléculas reportero se mide mediante la actividad enzimática del producto del gen reportero, tal como ß-galactosidasa.

Ensayos para inhibidores de diarrea inducida por toxina La sustancia de la presente invención o un derivado u homólogo de la misma y/o una línea celular que expresa la sustancia de la presente invención o un derivado u homólogo de la misma puede utilizarse para seleccionar agentes (tales como anticuerpos, péptidos, moléculas orgánicas o TÉ?*" inorgánicas) capaces de afectar la actividad de la sustancia. Por medio de ejemplo, puede seleccionarse cualquier agente capaz de inhibir la actividad de la sustancia para inhibidores de diarrea inducida por toxina identificando así agentes capaces de afectar el cólera y/o enfermedades diarreicas mediadas 5 por enterotoxína. En una modalidad, los tamices de la presente invención pueden identificar antagonistas de la sustancia de la presente invención, como anticuerpos, péptidos o moléculas orgánicas pequeñas que son capaces de actuar como inhibidoras de diarrea inducida por toxina. 10 Ensayos para agentes El despliegue de fagos puede emplearse en la identificación de agente;s, tales como un receptor superficial celular que se acopla mediante la sustancia de la presente invención. La identificación positiva de dicho receptor 15 puede facilitar el uso de genotecas combinatorias para identificar imitadores capaces de actuar en la misma forma o en forma similar que la sustancia de la presente invención. El despliegue de fagos es un protocolo del tamizado molecular que uieiliza bacteriófagos recombinantes. La tecnología implica transformar 20 bacteriófagos con un gen que codifica para un ligando apropiado (en este caso un agente candidato) capaz de reaccionar con una sustancia objetivo (o un derivado u homólogo del mismo) o la secuencia de nucleótidos (o un derivado u homólogo del mismo) codificando el mismo. El bacteriófago transformado (que preferiblemente se une a un soporte sólido) expresa el ligando apropiado (tal como el agente candidato) y lo despliega en su revestimiento de fagos. La entidad o entidades (tales como células) que tienen las moléculas de sustancia objetivo que reconoce el agente candidato se aislan y se amplifican. Los agentes candidatos exitosos posteriormente se caracterizan. El despliegue de fagos tiene ventajas sobre las tecnologías de tamizado de ligando de afinidad estándar. La superficie de fagos despliega el agente candidato en una configuración tridimensional, asemejándose más a su conformación naturalmente ocurrente. Esto permite una unión con gran afinidad y más especifica para propósitos de tamizado.

Ensayos para imitadores En una modalidad, los tamices de la presente invención pueden identificar imitadores de la sustancia de la presente invención, tal como anticuerpos, u otros compuestos químicos que tienen un efecto inmunomodulador y/o adyuvante. Dichos imitadores pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades de la presente invención.

Tamices La sustancia de la presente invención se utiliza para identificar inmunomodulares, adyuvantes, imitadores y/o inhibidores de diarrea inducida por toxina en cualquier variedad de técnicas de tamizado de fármacos. La sustancia empleada en dicha prueba puede encontrarse libre en la solución, fija a un soporte sólido, puede ser llevada a una superficie celular, o puede ser localizada intracelularmente. Puede medirse la supresión de la actividad de la sustancia o la formación de complejos de unión entre la sustancia y el agente que se va a someter a prueba. Otra técnica para tamizar provee tamizado de alto rendimiento (HTS) de agentes que tienen afinidad de unión adecuada a la sustancia y se basa en el método descrito con detalle en WO 84/03564. Se espera que los métodos de ensayo de la presente ¡nvención sean adecuados tanto para tamizado a pequeña escala como a gran escala de compuestos de prueba como también en ensayos cuantitativos.

Composiciones farmacéuticas La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la sustancia de la presente invención y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, (incluyendo combinaciones de los mismos). Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso en humanos o en animales, en humanos y medicina veterinaria y comprenderá típicamente uno o más diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los portadores aceptables o diluyentes para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, "*i por ejemplo en Remington's Pharmaéeutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). El portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de administración propuesta y a la 5 práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente de suspensión, agente(s) de revestimiento, agente(s) solubilizante adecuado. Los conservadores, estabilizadores, colorantes o aún los agentes 10 saborizantes pueden proveerse en la composición farmacéutica. Ejemplos de conservadores incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y esteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden utilizarse antioxidantes y agentes de suspensión. Pueden existir diferentes requerimientos de 15 composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de suministro. Por medio de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para suministrarse utilizando una pequeña bomba o por las mucosas, por ejemplo, un aspersor o aerosol nasal para inhalación o soluci n que se puede ingerir, o de manera parenteral en la cual la 20 composición se formula mediante una forma inyectable, para suministro, por ejempio, por una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. De manera alternativa, la formulación puede diseñarse para suministrarse por ambas vías.

En donde el agente debe suministrarse de manera mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debe ser capaz de permanecer estable durante el transito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a la degradación proteolítica, estable al pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis. En donde sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción, solución, crema, ungüento o polvo, por medio de un parche corporal, oralmente en forma de tabletas que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos ya sea solos o en combinación con excipientes, o en forma de elíxires, soluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden inyectarse parenteralmente, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo sales o monosacáridos suficientes para hacer la solución isotónica con sangre. Para administración bucal o sublingual las composiciones pueden administrarse en forma de tabletas o pastillas que pueden formularse en una manera convencional.

Vacunas En una modalidad de la presente invención, la sustancia es un adyuvante que se incorpora en una composición de vacuna que se utiliza para tratar o prevenir enfermedad autoinmune, leucemia de células T humanas, rechazo de transplantes o enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), enfermedades alérgicas o infecciosas. En otra modalidad de la invención, la composición de la vacuna puede comprender adicionalmente un antígeno(es) o determinante(s) antigénico. Antígenos y/o determinantes antigénicos adecuados se describen en WO 99/34817. Preferiblemente, la composición de vacuna comprende un antígeno y/o determinante antigénico. Preferiblemente el antígeno es un auto-antígeno o un homólogo del mismo. Preferiblemente, una o más sustancias de la presente invención se utilizan en la preparación de un agente terapéutico o vacuna profiláctica. Una "vacuna profilactiva" es una vacuna que se administra a individuos atacados por enfermedad para prevenir el desarrollo de enfermedades. Una "vacuna terapéutica" es una vacuna que se administra a individuos con una infección existente para reducir o reducir al mínimo la infección o para anular las consecuencias inmunopatológicas de la enfermedad. La preparación de vacunas que contienen una o más sustancias como un ingrediente(s) activo, la conocen los expertos en la técnica. Típicamente, dichas vacunas se preparan como soluciones inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también se preparan formas sólidas adecuadas para soluciones en, o suspensiones en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsificarse, o puede encapsularse la proteína en liposomas. Los ingredientes activos con frecuencia se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. , Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificantes y agentes reguladores de pH. La composición de vacuna también puede comprender una combinación de adyuvantes que mejoran la efectividad de la vacuna. Ejemplos de adyuvantes adicionales que, en combinación, pueden ser efectivos, incluyen pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio-potasio (alum), sulfato de berilio, sílice, caolín, carbono, emulsiones agua en aceite, emulsiones aceite en agua, dipéptido de muramilo, endotoxina bacteriana, lípido X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnés), Bordetella pertussis, polirribonucleótidos, arginato de sodio, lanolina, lisolecitina, vitamina A, saponina, liposomas, levamisol, DEAE-dextran, copolímeros bloqueados u otros adyuvantes sintéticos. Dichos adyuvantes se encuentran disponibles comercialmente de varias fuentes, por ejemplo, Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) o Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Típicamente, se utilizan adyuvantes tales como Amphigen (aceite en agua), Alhydrogel (hidróxido de aluminio), o una mezcla de Amphigen y Alhydrogel. Únicamente el hidróxido de aluminio se aprueba para uso en humanos.

Administración Típicamente, un médico determinará la dosis real que sea la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del paciente en particular. Las dosis que se presentan a continuación son ejemplos del caso promedio. Desde luego, puede haber casos en donde los individuos necesiten escalas de dosificación mayores o menores. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por inyección directa. La composición puede formularse por administración parenteral, mucosa, intramuscular, intravenosa, subcutánea, ¡ntraocular o transdérmica. Típicamente, cada proteína puede ser administrada a una dosis de alrededor de 0.01 a 30 mg/kg en peso corporal, preferiblemente de 0.1 a 10 mg/kg, más preferiblemente de 0.1 a 1 mg/kg en peso corporal. El término "administrar" significa suministrar por técnicas virales o no virales. Los mecanismos de suministro viral incluyen pero no se limitan a vectores adenovirales, vectores virales adeno-asociados (AAV), vectores virales; de herpes, vectores retrovirales, vectores lentivirales, y vectores báculovirales. Los mecanismos de suministro no virales incluyen transfección mediada por lípido, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfifilos faciales catiónícos (CFA) y combinaciones de los mismos. Las vías para dichos mecanismos de suministro incluyen pero no se limitan a vías mucosas, nasales, orales, parenterales, gastrointestinales, tópicas, o sublinguales. El término "administrar" incluye pero no se limita al suministro por una vía mucosa, por ejemplo, un aspersor o aerosol nasal para inhalación o una solución que se pueda ingerir, una vía parenteral en donde el suministro se hace en forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. El término "co-administrar" significa que el sitio y tiempo de administración de cada sustancia de la presente invención y una entidad adicional tal como un antígeno y/o determinante antigénico son tales que se logra la modulación necesaria del sistema inmunológico. De esta forma, aunque la sustancia y el antígeno pueden administrarse al mismo tiempo y en el misrno lugar, existen ventajas al administrar la sustancia a diferente tiempo y en diferente lugar desde el antígeno. La sustancia y el antígeno pueden aún suministrarse en el mismo vehículo de suministro, y la sustancia y el antígeno pueden acoplarse y/o no acoplarse y/o acoplarse genéticamente y/o no acoplarse.

El determinante antigénico y péptido u homólogo o imitador del mismo puede administrarse en forma separada o co-administrarse al sujeto hospedero como una dosis individual o en dosis múltiple. La composición de vacuna de la invención puede administrarse por diferentes vías tales como inyección (que incluye inyección parenteral, subcutánea e intramuscular) intranasal, mucosa, oral, ¡ntra-vaginal, uretral u ocular. Las vacunas que comprenden la sustancia de la presente invención se administran convenientemente de manera parenteral, por inyección, por ejemplo, ya sea subcutáneamente o intramuscularmente. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos formulaciones orales. Para supositorios, aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en la escala de 0.5% a 10%, y puede ser de 1% a 2%. Las formulaciones orales incluyen los excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman las formas de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10% a 95% del ingrediente activo, preferiblemente 25% a 70%. En donde se liofiliza la composición de vacuna, el material liofilizado puede volverse a construir antes de la administración, por ejemplo, como una suspensión. La reconstitución se realiza preferiblemente en el regulador de pH.

Enfermedades La sustancia de la presente invención se utiliza para tratar o evitar enfermedades autoinmunes, leucemia de la célula T de humano, rechazo de transplantes, transplantes alogenéicos o xenogenéicos, enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), enfermedades alérgicas o infecciosas. Dentro del grupo de "enfermedades infecciosas", se encuentran las enfermedades en las cuales, durante la infección, el agente infeccioso se une a, coloniza o gana acceso a través de la mucosa, como lo son las enfermedades en las que se involucran comúnmente mecanismos inmunopatológicos. Ejemplos de enfermedades infecciosas de la presente invención incluyen pero no se limitan a HSV-1 , HSV-2, EBV, VZV, CMV, HHV-6, HHV-7 y HHV-8, hepatitis tipo A, B, C, D, y E, Neissería meningitides, Haemophilus influenza tipo B y Streptococcus pneummoniae, Legionella pneumophila y Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonnorheae, HIV-1 , HIV-2 y Chlamydia tacomatism, E.coli, rotavirus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Helicobacter pylori, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni y Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus mutans, malaria, Trypanasoma spp., Taxoplasma gondii, Leishmania donovani y Oncocerca spp.

Ejemplos de trastornos alérgicos de la presente invención incluyen pero no se imitan a enfermedades que incluyen asma, tos alérgica, rinitis alérgica y conjuntivitis, exsema y dermatitis atópica, urticaria, alergia a la picadura de insectos y enjambres, alergia a alimentos y ciertos fármacos. 5 Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen pero no se limitan a enfermedades tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes.

Estuches 10 La presente invención además provee ensayos y estuches de diagnósticos que comprenden la sustancia de la presente invención. Dichos estuches pueden utilizarse para evitar y/o tratar y/o modular las enfermedades de la presente ¡nvención. En una modalidad de la presente ¡nvención, el estuche puede 15 también comprender un antígeno y/o determinante antigénico y/o un adyuvante separado para coadministración con dicho agente terapéutico o composición profiláctica. Alternativamente, un estuche puede estar provisto con imitadores de la presente invención en forma de anticuerpos de la ¡nvención 20 unidos a un soporte sólido y/o empaquetados en estuches en un contenedor adecuado junto con reactivos, controles, instrucciones y similares adecuados.

Sumario En resumen, la presente invención se refiere a una sustancia que comprende una o más: secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia presentada como SEQ ID No. 2, o una variante de la misma, o un 5 homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma o un imitador de la misma; cuya sustancia es capaz de actuar en una forma que es ¡gual o es similar a EtxB y/o CtxB; pero en donde la sustancia no presenta actividad de unión a GM-1. La presente ¡nvención también se refiere a un método de ensayo 10 para determinar un agente o agentes que son capaces de ¡nteractuar con y/o afectar la sustancia de la presente invención en donde el ensayo comprende poner en contacto la sustancia con un agente que va someterse a prueba, y posteriormente determinar si o no el agente afecta la sustancia. Otros aspectos de la presente ¡nvención se presentan a 15 continuación por medio de párrafos enumerados que incluyen: 1.- Un péptido que comprende la secuencia EVPGSQH, o un homólogo o imitador del mismo. 2.- Un péptido de conformidad con el párrafo 1 , que comprende la secuencia VEVPGSQHIDSQ. 20 3.- Un péptido de conformidad con el párrafo, 2 que comprende la secuencia GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI o la secuencia GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI. ÉjÉ^j^j 4.- Una composición profiláctica o terapéutica que comprende un péptido de conformidad con cualquier párrafo anterior o un homólogo o imitador del mismo. 5.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 4, que también comprende un antígeno o un determinante antigénico. 6.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 4 ó 5, en donde el agente terapéutico o profiláctico se utiliza como un adyuvante o inmunomodulador. 7.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 4 ó 5, en donde el agente terapéutico o profiláctico se utiliza para regular positivamente la producción de anticuerpos en superficies mucosas. 8.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 4 ó 5, en donde el agente terapéutico o profiláctico se utiliza para prolongar la presentación del antígeno y para dar memoria inmunológica sostenida en un mamífero. 9.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 4 ó 5, en donde el agente terapéutico o profiláctico se utiliza para regular negativamente los componentes patológicos de las respuestas inmunes asociadas con Th1 y Th2. 10.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con cualquiera de los párrafos 4 a 9, que se utiliza para tratar o evitar . . , » i. enfermedades autoinmunes, leucemia de células T humanas, rechazo de transplante, enfermedad de injerto contra hospedero o enfermedades infecciosas. 11.- Una composición profiláctica o terapéutica que comprende un agente que se une específicamente al bucle ß4-a2 de EtxB o CtxB. 12.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 11 , en donde el agente es un anticuerpo. 13.- Una composición profiláctica o terapéutica de conformidad con el párrafo 11 ó 12, que se utiliza para tratar diarrea. 14.- Una composición de vacuna para utilizarse contra una enfermedad, que comprende un péptido de conformidad con cualquiera de los párrafos 1 a 3 o un homólogo o imitador del mismo. 15.- Una composición de vacuna de conformidad con el párrafo 14, que también comprende un determinante antigénico. 16.- Una composición de vacuna de conformidad con el párrafo 14 ó 15, que se utiliza para tratar o evitar enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, leucemia de células T humanas, rechazo de transplante o enfermedades de injerto contra hospedero (GVHD). 17.- Un estuche que comprende una composición terapéutica o profiláctica de conformidad con cualquiera de los párrafos 4 a 13. La presente invención se describirá ahora por medio de ejemplos únicamente, en los cuales se hace referencia a las siguientes figuras: la figura 1 muestra un dibujo del listón estereoscópico que muestra una subunidad B de Etx/Ctx (de Sixma et al. J. Mol. Biol. (1993) 230:890-918, con etiquetas adheridas); la figura 2 muestra la identificación de los residuos de bucle en 5 CtxB involucrados en la apóptosis de células T CD8+; la figura 3 muestra subunidades B mutantes que tienen defectos en las apóptosis de célula T CD8+ que mantienen su capacidad para unirse a los receptores de superficie celular; la figura 4 muestra niveles de inmunoglobulina totales contra 10 EtxB y EtxB (H57S) en suero de ratones inmunizados por vía intranasal con 10ug e cada subunidad B; la figura 5 muestra que His-57 en CtxB y EtxB define una región necesaria para el carácter de adyuvante ; la figura 6 muestra el péptido de subunidad B E51-158 que 15 presenta una capacidad para inducir la inmunomodulación de células T CD8+. k^¿^jjjji EJEMPLOS EJEMPO 1 Identificación de residuos en el bucle Glu-51 a lle-58 de CtxB que desencadenan efectos inmunomoduladores en leucocitos Se sacrificaron ratones macho NIH y se removió subsecuentemente el tejido de nodulo linfático mesentérico en solución salina balanceada de Hanks (HBSS sin calcio y magnesio y se suplemento con 20mM de Hepes). Los linfocitos posteriormente se dispersaron en la solución y lejos del tejido fibroso al presionar de manera suave el tejido a través de una malla de alambre. Después de tres lavadas en HBSS, las células del nodulo linfático se volvieron a suspender en medio de Eagle modificado (Gibco) (a-MEM) que contiene 20 mM de Hepes, 4mM de L-glutamina, 100 lU/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina, y 5x10"5 M de 2-mercaptoetanol, a una concentración 2x106 células /ml y después se mezclaron sin (control de PBS) o con 3.45 uM (40 ug/ml) de CtxB tipo silvestre o EtxB tipo silvestre, o varias subunidades B mutantes, principalmente EtxB (G33D), CtxB (E51A), CtxB (V52A), CtxB (P53A), CtxB (G54A), CtxB (S55A), CtxB (Q56A), CtxB (H57A), o CtxB (I58A) y se incubaron a 37°C durante 96 horas. De ahí en adelanle, las células se lavaron y se volvieron a suspender en 0.4 ml de HBSS/20 mM de Hepes/0.1 % de azida de sodio/10% de suero de rata. El anti-CD8 conjugado con picoeritrina (PE) (PharMíngen) y anti-CD4 conjugado con FITC (PharMingen) se agregaron a una disolución de 1/400 y la células se incubaron en hielo durante un período de 30 minutos. Después de las incubaciones de anticuerpos, las suspensiones celulares se lavaron una vez más en ISOTON (Becton-Dickinson) y se volvieron a suspender en 0.4 ml de ISOTON. El análisis FACS se llevó a cabo, con 10,000 eventos recolectados para cada muestra y después se graficaron utilizando el software WinMDI. Las células con un anti-CD4 unidas a las FITC se representaron en el cuadrante superior izquierdo de cada figura; las células con anti-CD8 unidas a PE se representaron en el cuadrante inferior derecho, mostrando el porcentaje en número de los eventos en cada cuadrante.

RESULTADOS 1 Los resultados en la figura 2 demuestran, que la incubación de células MLN con CtxB tipo silvestre o EtxB tipo silvestre provoca el agotamiento de las células T CD8+; que no ocurre si las células se incuban en presencia de PBS (control) o una forma mutante de EtxB, EtxB(G33D) que no tiene la capacidad para unirse al gangliosido GM-1 de superficie celular. Un análisis de los mutantes CtxB que contienen sustituciones Ala en residuos E51 a I58 reveló que CtxB(E51A) y CtxB(H57A) no desencadenaron el agotamiento de las células T CD8+. Además, CtxB(V52A) y CtxB(l58A) mostraron un defecto parcial al desencadenar el agotamiento de la célula T CD8+. Estos descubrimientos indican que los residuos, E51 y H57 juegan un papel primordial al desencadenar efectos moduladores en linfocitos con una función de contribución para los residuos V52 y 158.

EJEMPLO 2 5 Sublimidades B mutantes que tienen defectos en apóptosis de células T CD8+ que mantienen su capacidad para unirse a los receptores de superficie celular Se sacrificaron los ratones macho NIH y se removió 10 subsecuentemente el tejido de nodulo linfático mesentérico en solución salina balanceada de Hanks (HBSS sin calcio y magnesio y suplementado con 20 mM de Hepes). Los linfocitos posteriormente se dispersaron en solución y lejos del tejido fibroso al presionar con suavidad el tejido a través de una malla de alambre. Después de tres lavadas en HBSS, las células linfocíticas se 15 volvieron a suspender en 300 ml de regulador de pH MACS desgasificado y pre-enfriado (PBS, 5 mM de EDTA, 0.5% de BSA, pH 7.2). Se agregaron 50 ml de anticuerpos MACS antiCD4 y anti-B220 a las células y la población de células T CD8 se purificó mediante selección negativa en una columna MACS magnética. Las células T CD8+ que contienen la población, se lavaron y se 20 volvieron a suspender en un medio Eagle modificado (Gibco))(a-MEM) que contiene 20 mM de Hepes, 4 mM de L-Glutamina, 100 lU/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina, y 5x10"5 M de 2-mercaptoetanol, a una concentración de 2x106 células/ml y posteriormente se mezclaron sin (control de PBS) o con 3.45 uM (40 ug/ml) de CtxB tipo silvestre o EtxB tipo silvestre, o varias subunidades B mutantes, principalmente EtxB (G33D), CtxB (E51A), CtxB (V52A), CtxB (P53A), CtxB(G54A), CtxB (S55A), CtxB (Q56A), CtxB (H57A), EtxB (H57S), o CtxB (I58A) y se incubaron en hielo durante 20 minutos. De ahí en adelante, las células se lavaron y se volvieron a suspender en 0.4 ml de HBSS en hielo frío/ 20mM de Hepes/0.1% de azida de sodio/10% de suero de rata. El anticuerpo monoclonal 118-8 anti-EtxB se agregó a una dilución de 1/500 a EtxB, EtxB (G33D) o EtxB (H57S) incubados en células, y se agregó el anticuerpo monoclonal LT-39 anti-CtxB a una dilución de 1/800 a células incubadas con mutantes CtxB y CtxB. Después de 30 minutos, las células se lavaron y se volvieron a suspender en HBSS/20 mM de Hepes/01% de azido de sod?o/10% de suero de rata seguido por la adición de un anticuerpo de IgG anti-ratón marcado con FITC. Después de la incubación con un anticuerpo secundario durante 30 minutos, las suspensiones celulares se lavaron una vez más en ISOTON (Becton-Dickinson) y se volvieron a suspender en 0.4 ml de ISOTON. Se sometieron a prueba los niveles de fluorescencia FITC como un representativo del grado de unión de EtxB, CtxB y varios mutantes a células T CD8+ mediante análisis FACS. Los resultados de 10,000 eventos de cada muestra se graficaron mostrando la intensidad de fluorescencia de las células T CD8+ incubadas en ausencia de las subunidades B (es decir control de PBS; línea roja) contra la fluorescencia que se atribuye a subunidades B unidas (línea negra) (figura 3).

RESULTADOS 2 Los resultados en la figura 3 muestran que todas las subunidades B, salvo los mutantes no enlazados EtxB (G33D) se unen a un grado similar, a las células T CD8+. La intensidad de fluorescencia detectada después de la unión de CtxB (H57A) y EtxB(H57S) fue un poco más elevada que la que presentaron las subunidades B tipo silvestre que indican que los dos mutantes tienen una avidez mayor para la superficie celular. Este resultado es consistente con el descubrimiento de que tanto CtxB (H57A) como EExtB (H57S) se unen con una avidez ligeramente mayor a las placas de microtitulación revestidas con GM-1 y que exhiben un Kd ligeramente mayor para GM-1 como lo determinó la resonancia de superficie de plasmón (datos que no se muestran).

EJEMPLO 3 Se requiere que el residuo His-57 en EtxB induzca una respuesta anti- EtxB potente Los grupos de ratones hembra NIH (n=8) se inmunizaron por vía ¡ntranasal con 10 ug de EtxB o EtxB (H57S) en un volumen de 20 ul en 3 ocasiones con intervalos de una semana. Los ratones se sacrificaron y se removió la sangre mediante perforación cardíaca 14 días después de la tercera inmunización. Los sueros se analizaron para niveles de anticuerpos de IgG anti-EtxB mediante una prueba GM-1 -ELISA utilizando placas de microtitulación revestidas con 1 ug/ml de EtxB. Se determinó el punto final de la titulación (equivalente a una dilución dando una absorbancia de 0.1 arriba de la inicial).

RESULTADOS 3 Los resultados en la figura 4 muestran que la siguiente inmunización por vía intranasal con niveles de anticuerpos de IgG de anti-EtxB en el suero de alta titulación de EtxB de tipo silvestre se induce (título=5757+/- 785) en donde la inmunización con EtxB (H57S) induce una respuesta significativamente inferior (p=0.001) (título 1205+/-222).

EJEMPLO 4 Es necesario el residuo His-57 en ExtB y CtxB para que las subunidades B actúen como adyuvantes mucosos.

Los grupos de ratones hembras NIH (n = 8) se inmunizaron por vía intranasal con 10 ug de ovalbúmina (Ova) sola o con 10 ug de Ova mezclada con 10 ug de ExtB, CtxB, EtxB (H57S) o CtxB (H57A) y se administró en un volumen de 20 ul en 3 ocasiones en intervalos de una semana. Además, se inmunizaron por vía intranasal dos grupos de ratones con 10 ug de EtxB o CtxB como controles negativos. Todos los ratones se sacrificaron 14 días después de la tercera inmunización y la sangre se removió mediante perforación cardíaca. El suero posteriormente se analizó para niveles de anticuerpos de IgG anti-Ova mediante una prueba ELISA utilizando placas de microtitulación revestidas con 5 ug/ml de Ova. Se determinó el punto final de la titulación (equivalente a una dilución dando una absorbancia de 0.1 ).

RESULTADOS 4 Los resultados en la figura 5 muestran que tanto EtxB como CtxB de tipo silvestre actúan como adyuvantes para mucosas, sustancialmente aumentando la respuesta anti-Ova en comparación con los ratones inmunizados con Ova sola (comparando la ruta 4 y 5 con la ruta 1 ). En contraste, cuando se mezcló Ova con EtxB (H57S) (ruta 6) o CtxB (H57A) (ruta 7) la respuesta anti-Ova inducida fue sustancialmente menor a la que se desencadeno mediante inclusión de las subunidades B tipo silvestre. Los datos demostraron que CtxB (H57A) carece de actividad adyuvante. Esto confirma la importancia del bucle E51-I58 de la subunidad B, y en particular H57 en mediar las propiedades inmunomoduladoras de la molécula.

EJEMPLO 5 Un péptido EVPGSQHI sintético que corresponde al bucle E51 a I58 de EtxB y CtxB posee propiedades inmunomoduladoras Para evaluar si un péptido sintético correspondiente al bucle E51 a I58 de EtxB (y CtxB) provoca agotamiento de las células T CD8+ desde los cultivos MLN, se aislan las células del nodulo linfático mesentéricas como se describió en el ejemplo 1 , y se incuban con varias concentraciones (0.1 uM -20 uM) del péptido EVPGSQHI o un péptido de control seleccionado aleatoriamente, LRNE l I I I KGDYC. Después de 96 horas de incubación a 37°C, las células se lavaron y se volvieron a suspender en 0.4 ml de HBSS/20 mM de Hepes/0.1 % de azida de sodio/10% de suero de rata y después se evaluaron para la proporción relativa de las células CD4+ y CD8+ mediante el análisis FACS, en un modo idéntico al que se reportó en el ejemplo 1. Los porcentajes de las células T CD8+ permanecieron en cultivos tratados con el péptido EVPGSQHI (círculos rojos encerrados y línea) o el péptido de control (cuadros negros cerrados y línea) se determinó y se gráfico contra la concentración del péptido utilizado (figura 6).

RESULTADOS 5 Los resultados en la figura 6 muestran que la incubación de cultivos MLN en presencia del péptido EVPGSQHI provoca una reducción en el número de células T CD8+, en contraste con el tratamiento con un péptido de control. Esto muestra que un péptido sintético corresponde al bucle E51 a I58 de* EtxB y CtxB es activo al ejercer efectos modulatorios directos en linfocitos. 5 Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente por referencia. Serán evidentes varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistema descritos de la invención para los expertos en la técnica, sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la ¡nvención se ha descrito en relación con la 10 modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la ¡nvención como se reclama, no deben limitarse a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de las modalidades descritas pueden llevarse a cabo en la invención por los expertos en biología molecular o campos relacionados, que se encuentren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. ^^iB2^SÍídj ¿^»^ ^^^^^^^^^^.

LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID No 1 GAA GTA CCA GGTAGT CAA CATATA GAT 5 SEQ ID No 2 EVPGSQH SEQ ID No 3 10 VEVPGSQHIDSQ SEQ ID No 4 GATFQVEVPGSQHIDSQKKAI 15 SEQ ID No 5 *, GETFQVEVPGSQHIDSQKKAI % ¡s&m

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 5 1.- Una sustancia que comprende uno o más: secuencias de 1 aminoácidos que comprenden la secuencia presentada como SEQ ID No. 2, o una variante de la misma, o un homólogo de la misma, o un fragmento de la misma, o un derivado de la misma, o un imitador de la misma; cuya sustancia es capaz de actuar en una manera que es la misma o similar a EtxB y/o CtxB, 10 pero en donde la sustancia no muestra actividad de unión GM-1. 2.- La sustancia de conformidad con la reivindicación 1 , para utilizarse en medicina. 3.- La sustancia de conformidad con la reivindicación 1 , para utilizarse como un inmunomodulador. 15 4.- La sustancia de conformidad con la reivindicación 1 , para -i utilizarse como un adyuvante. 5.- La sustancia de conformidad con la reivindicación 1 , para utilizarse como un inhibidor para diarrea inducida por toxina. 6.- La sustancia de conformidad con cualquiera de las 20 reivindicaciones anteriores, en donde la sustancia comprende adicionalmente un antígeno o un determinante antigénico. 7.- Una composición farmacéutica que comprende la sustancia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, mezclada sm^tá?.üt opcionalmente con uno o más portador(es), diluyente(s) o excipiente(s) farmacéuticamente aceptables. 8.- El uso de una sustancia como la que se reclama en las reivindicaciones 1 a 7 para utilizarse en la fabricación de un medicamento que es capaz de tratar y/o prevenir y/o modular una enfermedad y/o condición relacionada con un trastorno inmune y/o una diarrea inducida por toxina. 9.- Un método de ensayo para determinar uno o más agentes que son capaces de interactuar con y/o afectar la sustancia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; en donde el ensayo comprende poner en contacto la sustancia con un agente que se va a someter a prueba, y posteriormente determinar si o no el agente afecta la sustancia. 10.- Un agente identificado por el método de ensayo de conformidad con la reivindicación 9. 11.- Un método de tratamiento, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento de y/o prevención de y/o modulación de una enfermedad y/o condición relacionada con un trastorno inmune y/o un trastorno mediado por toxina, una sustancia como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.