JP2875226B2

JP2875226B2 - 原発性胆汁肝硬変自己抗原

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Publication number: JP2875226B2
Application number: JP9000184A
Authority: JP
Inventors: ロス・レオン・コペル; メリル・エリク・ガーシュイン
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Current assignee: CSL Innovation Pty Ltd
Priority date: 1986-12-16
Filing date: 1997-01-06
Publication date: 1999-03-31
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: AU1086888A; ATE139259T1; JPH1175864A; CA1341231C; EP0293471A4; EP0293471B1; US5196319A; AU604087B2; ZA879403B; JPH09308490A; DE3751834D1; NZ222942A; WO1988004689A1; JP2815582B2; JPH01502077A; EP0293471A1; DE3751834T2; US5891436A

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、原発性胆汁肝硬変
（ＰＢＣ）における特有の自己抗体応答のターゲットと
して認識される自己抗原の同定、クローニングおよび発
現に関し、また本蛋白質、そのフラグメントまたは蛋白
質もしくはフラグメントを含む融合ポリペプチドのＰＢ
Ｃ診断テスト、およびＰＢＣにかかっている患者の処置
における利用に関する。【０００２】原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）は、肝臓内胆
汁管の進行性炎症性閉塞により特徴づけられた慢性病で
ある。この病気は、当初免疫蛍光法⁵により同定された
ミトコンドリアに対する自己抗体応答^1-4を特徴とし
た。【０００３】ブロット免疫検出の最近の利用により、特
定の蛋白質が、ＰＢＣの抗ミトコンドリア抗体（ＡＭ
Ａ）のターゲットとして認識されるに至った²,⁶,⁷。具
体的には、７０キロダルトン(kd)蛋白質に対する血清抗
体が、ＰＢＣ患者の９５％以上にみられるが、他の自己
免疫肝臓病の患者にはなく²,⁸、４５と３９kdの２つの
他の蛋白質はＰＢＣ血清では頻度が少なく検出される¹,
²,⁹。これらの自己抗原の各々の本体は、病気の病原性
とこれらの抗原の関連と同様に知られていない。しかし
ながら、７０kdの抗原は、進化上高度に保存され、哺乳
類、酵母や細菌に存在するので¹⁰、重要な構造もしくは
生物学的機能をもつと信じられる²。【０００４】抗ミトコンドリア抗体の生成のメカニズム
の資料が少ないにもかかわらず、固相酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）によると、ＰＢＣによる患者の９５％以
上に臨床的に上記のような抗ミトコンドリア抗体が見ら
れた²,⁶。粗製のミトコンドリア抗原製品を使うと、Ｐ
ＢＣや真性結合組織病や薬物反応以外の肝臓病を含む様
々の病気の患者および、時々健康な個体でさえも、ミト
コンドリアに対する抗体をもつことが証明できる。従っ
て、このような粗製の製品を使った検定は、ＰＢＣの特
有な診断を可能にし得ない。例として、ドイツ特許公開
３,２３７,６０２号では、粗製のミトコンドリア抗体製
品を使った血清中の抗ミトコンドリア抗体の検出と定量
のＥＬＩＳＡを発表している。検定の特異性の欠如は、
たとえばＰＢＣや慢性活動性肝炎の胆汁うっ滞、梅毒(I
I)、エリテマトーデス症候群型薬疹、ある種の一次性非
肝性免疫疾患、イプロニアジド誘導肝炎やβ受容器しゃ
断薬の副作用の病気の特別な診断におけるこの検定の利
用が提案されていることから明らかである。ミトコンド
リア膜のより活発な単離により、抗原性の不均質の問題
はより明らかになり、トリプシン感受性およびミトコン
ドリア膜内対膜外の抗原の位置に基づいた特有なミトコ
ンドリア抗原の定義が導かれた。これにもかかわらず、
ＰＢＣの診断は、免疫蛍光の相対的感度の低さもしくは
補完固定、ＥＬＩＳＡや免疫沈降を含む方法が感度が高
いが非特異性のため、抗ミトコンドリア抗体の呈示に、
まだ大きく依存している^23-28。【０００５】本発明は、ＰＢＣの７０kdのミトコンドリ
ア自己抗原（いくつかの研究グループによりＭ２と命名
¹,⁹）を発現するラットの肝臓遺伝子発現ライブラリー
由来cＤＮＡの同定におよびその配列決定に基づく。配
列は、ミトコンドリアＤＮＡではなく核ＤＮＡによって
暗号化されている。【０００６】本発明は、ＰＢＣにみられる抗７０kdの抗
体の極めて感受性が高く特異的な診断ＥＬＩＳＡの基礎
を提供する。本発明の最初の見地によると、原発性胆汁
肝硬変（ＰＢＣ）の７０kdミトコンドリア自己抗原また
はその抗原活性を有するフラグメントを暗号化している
塩基配列の全部または一部に実質的に対応するヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡ分子が提供される。本発明の見地
によるＤＮＡ分子は、少なくとも実質的に図６に示され
た塩基配列またはそのフラグメントを含む部分によって
特徴づけられたものであるのが好ましい。【０００７】もう１つの見地では、本発明は、上記に記
載し、および発現調節配列に機能し得るように結合した
ヌクレオチド配列からなる組換え体ＤＮＡ分子を提供す
る。この組換え体ＤＮＡ分子は、例えばバクテリオファ
ージやプラスミドのような発現ベクターまたはそれで形
質転換した細菌や他の微生物のような宿主細胞からなっ
ている。【０００８】本発明のさらに他の見地では、原発性胆汁
肝硬変の７０kdミトコンドリア自己抗原またはその抗原
活性を有するフラグメントの全部または一部の抗原性を
表示する合成ペプチドまたはポリペプチドが提供され
る。本発明の見地による合成ペプチドまたはポリペプチ
ドは、少なくとも実質的に図６もしくは図８に示された
アミノ酸配列またはその抗原活性を有するフラグメント
を含む部分によって特徴づけられるのが好ましい。本合
成ペプチドまたはポリペプチドは、上記に広く記載され
た組換え体ＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞の発現に
より融合ポリペプチドとしてまたは直接製造される。【０００９】別法として、例えば既知のメリフィールド
固相合成方法のような化学的合成により製造される。本
発明は、７０kd自己抗原全体に対応する合成ペプチドお
よび、自己抗原全体を暗号化しているヌクレオチド配列
およびそのフラグメントに及ぶ。例として、この１つの
フラグメントは、図６に示されたヌクレオチド７６−６
７９によって暗号化されたフラグメントである。約２０
０残基のこのフラグメントは、天然の自己抗原に対する
すべての抗体を患者血清から吸収することができる。こ
のフラグメントの中に、実質的に自己抗体に対する反応
性をもつことがわかった、アミノ酸配列２０残基フラグ
メント、ＡＥＩＥＴＤＫＡＴＩＧＦＥＶＱＥＥＧＹＬがある。本フラグメントは、図６および図８両方の配列
に共通している。したがって、本発明は、診断検定法に
おける上記のような抗原性活性フラグメントの使用およ
び自己抗原全体の使用に及ぶ。【００１０】本発明は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡテク
ノロジーを使用するか、抗原を被覆したビーズ等を用い
た患者の血清中の抗ミトコンドリア抗体の検出または力
価の定量による、ＰＢＣの診断試験における抗原として
の本発明の合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメ
ントの使用にも及ぶ。後者の見地では、この処置方法は
ＰＢＣ抗体または患者の反応細胞を除去するための吸着
剤としての合成抗原の使用や、ＰＢＣ自己抗原に対する
患者の反応性を除去または減少させるための減感剤とし
て患者に直接投与するこれらの活性成分の使用を含む。【００１１】血清サンプル中の抗ミトコンドリア抗体の
検出における合成自己抗原の使用に加えて、本発明の特
異的なタイピング試薬を使ったクラス特異的免疫グロブ
リン力価の測定における合成ペプチド、ポリペプチドま
たはフラグメントの使用に及ぶ。応用は、自己抗体の全
体の親和性または自己抗体の各々のクラスまたはサブク
ラスの親和性の測定にも及ぶ。親和性は、例えばグアニ
ジンチオシアネートの異なった洗液を使用した複製ＥＬ
ＩＳＡ検定法のような様々の方法により測定される⁴²。
さらに診断用の検定法の拡張は、７０kd自己抗原の酵素
機能による自己抗体の妨害の程度の測定である（後に示
すがリポエートアセチル転移酵素を表す)。酵素の源
は、天然のポリペプチドまたは融合ポリペプチドとして
完全な長さのクローンの発現または、酵素的活性フラグ
メントまたはミトコンドリアから精製したタンパク質の
発現から誘導される。酵素検定法は、当技術において既
知の標準な検定法であるが、サンプルの血清または細胞
とインキュベートする段階を含むように修正した。さら
に合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグメントの使
用の拡張とし、自己抗原に対する患者の細胞の反応性の
測定を含む。合成ペプチド、ポリペプチドまたはフラグ
メントは、溶液中または固体支持体に結合して、末梢血
管または組織バイオプシーから誘導された非分画、分画
または連続セルラインの患者細胞に加えることができ
る。自己抗原に対する反応性は、トリチウム化したチミ
ジンの取り込みのような標準増殖検定法、標的細胞から
のマーカー放射能の遊離のような標準細胞障害検定法ま
たは、当技術に既知の細胞反応性の他の標準検定法によ
り測定できる。【００１２】本発明の特に重要な見地では、血清試料中
の抗ミトコンドリア抗体検出のための診断試験であっ
て、(ｉ) 上記血清試料を、ＰＢＣの７０kdミトコンド
リア自己抗原またはその抗原活性を有するフラグメント
を表示する合成ペプチドまたはポリペプチドと接触さ
せ、上記合成ペプチドまたはポリペプチドは、支持体上
に固定されているものとし、(ii) 上記合成ペプチドま
たはポリペプチドに結合した上記血清中の抗ミトコンド
リア抗体の存在を検出する工程を含む試験が提供され
る。【００１３】この見地では、本発明は、血清試料中の抗
ミトコンドリア抗体の検出のための診断試験用キットで
あって、(ｉ) ＰＢＣの７０kdミトコンドリア自己抗原
またはその抗原活性を有するフラグメントの全部または
一部の抗原性を表示する合成ペプチドまたはポリペプチ
ドがその上に固定されている支持体および(ii) 上記合
成ペプチドまたはポリペプチドに結合した上記血清中の
抗ミトコンドリア抗体の存在を検出する手段を含むキッ
トを提供する。【００１４】結合したＡＭＡの存在の検定は、既知のＲ
ＩＡまたはＥＬＩＳＡ技術の使用によるのが好ましい。
ＰＢＣの７０kdミトコンドリア自己抗原の抗原性を表示
した組換え体融合ポリペプチドの製造の結果、本自己抗
原はリポエートアシル転移酵素として同定された。さら
に、抗ミトコンドリア抗体の免疫グロブリンのイソタイ
プが決定しており、ＩgＧ３がＰＢＣ患者のグループの
著しいアイソトープであり、次いでＩgＭが多い。健康
で正常な大人とＰＢＣ患者の血清免疫グロブリンのイソ
タイプの含量を比較すると、血清ＩgＧ３およびＩgＭが
ＰＢＣでは高く、正常よりＩgＧ３では５.５倍、ＩgＭ
では４.３倍も高い。【００１５】本発明によれば、ミトコンドリア自己抗原
またはそのフラグメントを暗号化したcＤＮＡ挿入断片
の発現は、種々の異なった方法により達成される。本発
明の詳細な説明では、ＪＭ１０１、ＪＰＡ１０１や７１
１８のようなエシエリヒア・コリ株の宿主細胞を使用し
たベクターλgt１１およびpＢＴＡ２２４のβ−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質として発現させている。融合
タンパク質としての自己抗原の成功した発現は、既知の
ＰＶＣベクター、グルタチオンＳ−転移酵素融合タンパ
ク質の発現によりここでも宿主細胞としてエシエリヒア
・コリを用いて達成された。別法として、ミトコンドリ
ア自己抗原は適当なベクターおよび宿主細胞の組み合わ
せを使うことにより、融合しないポリペプチドとして発
現することができる。本発明により使用できる他のベク
ターおよび宿主細胞の組み合わせは、多数の既知の酵母
細胞中に生育させた酵母シャトルベクターの連続したセ
ルライン中の真核ベクターまたは遺伝形質転換動物を含
んでいる。【００１６】本発明によるＰＢＣの７０kdミトコンドリ
ア抗原の同定、クローニングおよび発現並びにＥＬＩＳ
Ａによる使用を次の添付の図面を参考にして詳細に述べ
る。図１は融合ポリペプチドの特異性を示す。レーンＡ
およびＢでは、１０００分の１に希釈した２つの異なっ
たＰＢＣ血清を、pＲＭＩＴで形質転換したＪＭ１０１
細胞の溶菌液に対してプローブした。血清は両方とも１
６０kdのポリペプチドと反応した。対照的に、レーンＣ
およびＤでは、β−ガラクトシダーゼと融合した無関係
の挿入断片を含んだ対照細胞の溶菌液に対してプローブ
したところ同血清は無反応であった。レーンＣおよびＤ
の反応バンドは、エシエリヒア・コリタンパク質と一致
した。１００分の１および１０００分の１希釈の正常血
清を用いた２重ブロットでは、融合ポリペプチドを検出
せず、図示しなかった。３６kdに反応性の融合タンパク
質の破片がみられた。【００１７】図２は、pＲＭＩＴ融合ポリペプチドの同
定を示す。ＰＡＧＥ後のヒト胎盤ミトコンドリアタンパ
ク質に対する吸収および無吸収ＰＢＣ血清の反応性が測
定された。レーンＡでは、プローブを、最終希釈２００
０分の１の無吸収ＰＢＣ血清にした。レーンＢでは、プ
ローブを、非組換え体pＢＴＡ２２４で形質転換した細
胞で７２時間充分に吸収しおよび非組換え体pＢＴＡ２
２４で形質転換した細胞の溶菌液を結合した固体支持体
に通した最終希釈２０００分の１の同血清にした。レー
ンＣでは、プローブを、非組換え体pＢＴＡ２２４で形
質転換した細胞で７２時間吸収しおよび発現pＲＭＩＴ
で形質転換した細胞の溶菌液を結合した固体支持体に通
した最終希釈２０００分の１の同血清にした。血清はま
た、２００分の１および２０,０００分の１で研究した
（表２)。【００１８】図３は、親和性−精製抗体の特異性を示
す。レーンＡでは、２０００分の１の無吸収のＰＢＣ血
清を７０および４５kdタンパク両方に反応する胎盤ミト
コンドリアに対してブロットした。レーンＢでは、カラ
ム溶出液を同ミトコンドリア製品に対してブロットし
た。注意することは、反応性が７０kdタンパク質だけで
あり、シグナルの減少はこのような溶出液の予期した回
収と一致したことである。１週間の長時間オートラジオ
グラフ露出でさえ、活性は７０kdタンパク質だけであっ
た（データは示していない)。レーンＣでは、溶出液
を、pＲＭＩＴで形質変換した誘導ＪＭ１０１の音波処
理物に対してブロットした。１６０kd融合ポリペプチド
の強度は、発現した融合ポリペプチドが多いためであ
る。レーンＤでは、溶出液を、豊富な融合ポリペプチド
を暗号化した無関係なプラスミドで形質転換した誘導Ｊ
Ｍ１０１の音波処理物に対してブロットした。【００１９】図４は、pＲＭＩＴ誘導融合ポリペプチド
で免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答を示す。胎盤
ミトコンドリアは、７.５％ゲル上でＰＡＧＥにより分
離し、ニトロセルロース上にブロットした。そして、分
画化したタンパク質は１０００分の１の希釈濃度（レー
ンＡ）またはＰＢＳの患者の血清１０００分の１でプロ
ーブした。免疫したマウスは７０kdに対しての抗体が誘
導されたが４５kdのタンパク質には否であった。【００２０】図５は、ＨＥp−２細胞の免疫蛍光を示
す。ＢＡＬＢ／Ｃマウスは、精製した融合ポリペプチド
で免疫され、血清は、ＨＥp−２細胞とインキュベート
した。反応性の典型的なミトコンドリアパターンが注目
されている。【００２１】図６は、pＲＭＩＴのヌクレオチド配列お
よび推測したＰＢＣの７０kdミトコンドリア抗原のアミ
ノ酸配列を示す。【００２２】図７は、ＰＢＣのＡＭＡ検出におけるＥＬ
ＩＳＡ（＋）および免疫蛍光法（□）の間の感度の比較
を示す。ＰＢＣ血清は、ＥＬＩＳＡでは１：１０００か
ら始めて１０倍希釈ごとに試験しているのに対して、Ｈ
ep−２細胞の免疫蛍光法では、１：１０から始めて２倍
希釈ごとに試験をしている。ＥＬＩＳＡにおける陽性
は、正常血清の平均値上の２Ｓ.Ｄ.Ｏ.Ｄ.として定義し
た。【００２３】図８は、ヌクレオチド配列および図６のヌ
クレオチド１０５−１０６５領域のヒト対応部を含む、
図６に描かれたヒト対応部の配列を暗号化した２.２kb
cＤＮＡ挿入断片の推定アミノ酸配列を示す。本ヒトcＤ
ＮＡクローンは、既知の技術によるハイブリッド形成プ
ローブとしてpＲＭＩＴを使うことによるヒト胎盤ライ
ブラリーのプローブにより得られた。配列は相同性が高
く、自己ミトコンドリア抗体との反応性において超似性
がある。それ故に、いずれの抗原配列も、抗ミトコンド
リア抗体または自己反応細胞を検出する診断試験の基礎
として使用され得る。【００２４】Ａ．材料および方法 cＤＮＡライブラリーのスクリーニング１５,０００の組換え体からなり、平均長１.４kbのλgt
１１−Ａmp３内のラット肝臓cＤＮＡライブラリーを、
ＰＢＣを有する患者由来の血清を用いてプローブした。
スクリーニングに使用した血清は、ひと胎盤ミトコンド
リア²の電気泳動で分離した蛋白の免疫ブロット分析に
よってミトコンドリアに対する抗体を持つことが示され
ている典型的ＰＢＣを有する各々３人の患者から得た。
ＰＢＣを有する患者のある者はエシエリヒア・コリに対
して高力価の抗体を持つため、非組換え体ファージに感
染したエシエリヒア・コリに充分量に血清を前吸収させ
た。最終濃度１：１０００¹¹,¹²でプローブするのに血
清を使用した。λ−Ａmp３ライブラリーを、ＳＴ９株の
エシエリヒア・コリを用いて１５分間３７℃でインキュ
ベートし、その後２時間、４２℃でＬＢ寒天中で培養し
た。その後、あらかじめ１０mlイソプロピル−チオガラ
クトシダーゼ（ＩＰＴＧ）中に浸漬し、風乾させたニト
ロセルロースフィルターを各プレート上に積層した。そ
の後プレートを一夜３７℃でインキュベートした。整列
後ニトロセルロースを取り出し、１時間５％粉乳を有す
るＰＢＳ（pＨ７.４）中で洗浄した。その後４５分間、
ＰＢＳを有する患者のあらがじめ吸収させた血清と共に
ろ過物をインキュベートし、３０分間で３回洗浄し、そ
の後¹²⁵Ｉ−プロテインＡ（３００,０００cpm／ml）を
用いて、４５分間インキュベートした。最終的に、ろ過
物を３回洗浄し、風乾させ、一夜（１２時間）照射の
間、増強スクリーンを伴ったＸＲＰ−１フィルム上に置
いた。血清の全ての洗浄および希釈を粉乳を用いて行っ
た。陽性推定クローンを取り出し、プラーク精製¹²,¹³
のため再スクリーニングした。【００２５】サブクローニング３つのクローンは、５０,０００クローンに約１つの頻
度で陽性徴候を呈した。これらの陽性クローンをプラー
ク精製した。これらのクローンの各々は、約１.４kdの
同一寸法の挿入物を生成した。λ−Ａmp３の挿入部位と
一致する外来ＤＮＡの挿入部位を有する高複製プラスミ
ド発現ベクターである、プラスミド・ベクターpＢＴＡ
２２４中で挿入物をサブクローニングした。従って、挿
入物がλ−Ａmp３としての同様の解読わく内にあるた
め、サブクローンの５０％は、イムノアッセイにおいて
陽性徴候を示す。ラット肝臓非関連のcＤＮＡ（Ｆ同種
抗原）を発現するクローンを対照として使用した。pＢ
ＴＡ２２４クローンの配列を作成して免疫反応性クロー
ンを同定した。１６時間、３７℃でコロニー群をインキ
ュベートし、その後１０mＭ・ＩＰＴＧを用いて４時間
誘導した。コロニー群を溶菌させ、文献記載¹¹のように
抗体プロービングを製造した。希釈率１／１０００のＰ
ＢＣ吸収血清または希釈率１／１００の通常血清のいず
れかを用いて、ろ過物をプローブした。さらに研究する
ために１６０kdの融合ポリペプチドを発現したpＲＭＩ
Ｔと称される１つの陽性クローンを選択した。【００２６】ミトコンドリアたんぱくのイムノブロッテ
ィングひとの胎盤由来のミトコンドリアを文献記載²,¹⁴のよう
に製造した。０.１％ＳＤＳ内の１mm厚のスラブ・ゲル
上で、３.８％スタッキング・ゲルおよび１０％分解ゲ
ルを用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）を行った。ＰＡＧＥの前に、精製ミトコンドリアを
４mgたんぱく／mlの濃度で懸濁させてから、３０分間１
０,０００Ｕのやぎ膵臓ＤＮＡアーゼ１を用いて、３７
℃でインキュベートし、その後等量の水性３％オクチル
グルコシドで１５分間４℃で保持した。最終生成物を４
％ＳＤＳ、２０％グリセロールおよび５％の２−メルカ
プトエタノール（試料緩衝液）を含有するトリス−ＨＣ
l（pＨ６.８）を用いて希釈し、５分間煮沸させた。約
１０μgのたんぱくを各ゲルレーン²に装填した。【００２７】pＲＭＩＴ融合ポリペプチドの特徴 pＲＭＩＴが、ＰＢＣを持った患者由来の血清と特異的
に抗原反応性を発現することを示すために、発現クロー
ンの溶菌物を健常者由来または異なった自己免疫病にか
かっている患者由来の血清を用いてプローブした。すな
わち、pＲＭＩＴで形質転換させたＪＭ１０１細胞の１
００mlの一夜培養物を１０mＭＩＰＴＧを含有するＬ−
ブロスで１／１０に希釈した。４時間後培養物を５００
×Ｇで１０分間遠心し、２０mlのりん酸緩衝生理食塩水
を加えた後冷凍した。１mm厚の０.１％ＳＤＳ含有スラ
ブ・ゲル上で、３.８％スタッキング・ゲルおよび７.５
％分解ゲルを用いてＰＡＧＥを行った。上記試料緩衝液
で試料を１／１００に希釈し、５分間煮沸した。各々の
レーンは、約５から１０μgのたんぱくを含有した。１
／１０００に希釈したＰＢＣ血清を用いて試料をプロー
ブし、反応性は、¹²⁵Ｉ−プロテインＡおよび１８時間
照射を使用して上述のように測定した。これらの同一血
清も、非組換え体対照クローンまたは無関係なＤＮＡ挿
入物によってコード化された融合ポリペプチドを発現す
るクローンの溶菌物のイムノブロットをプローブするの
に使用した。使用した血清はＰＢＣ、全身性紅斑性狼
瘡、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、慢性活動
性肝炎を有する患者および健常提供者由来のものであっ
た。全ての対照血清を１／１００の希釈率で調査した。【００２８】融合ポリペプチドの同定 pＲＭＩＴによって発現した融合ポリペプチドを特徴づ
けをして、ＰＢＣ血清によって認識されたミトコンドリ
ア抗原があるかどうかを決定した。クローンpＲＭＩＴ
を液体培地中で一夜生育させた。それから対数期に入
り、１０mＭ・ＩＰＴＧを用いて４時間融合したポリペ
プチドの最大発現物を付与するために誘導した。細菌溶
菌物を上述のように製造し、臭化シアン−セファロ−ス
¹⁵と結合させた。その後この固体支持体を７つの異なっ
たＰＢＣ血清由来の抗体を選択的に結合するアフィニテ
ィー試薬として使用した。最初、ＰＢＣを有する７人の
患者由来の血清を、非組換え体pＢＴＡ２２４で形質転
換したエシエリヒア・コリの超音波処理物を用いて大量
に吸収させた。その後、１／２００、１／２０００およ
び１／２００００の希釈率の血清を固体支持体と結合し
たpＲＭＩＴ形質転換細菌の溶菌物を通過させた。非吸
収抗体を採取し、最終希釈時の非操作血清と比較して、
上述のように製造した胎盤ミトコンドリアをプローブす
るのに使用した。【００２９】アフィニティー精製抗体の製造ＪＭ１０１の超音波処理物を用いて、非組換え体pＢＴ
Ａ２２４を用いて形質転換した５つの異なった反応性血
清を最初に大量に前吸収させ、その後この吸収血清を、
非組換え体pＢＴＡ２２４¹⁵を用いて形質転換させたＪ
Ｍ１０１のカラムを通すことで、アフィニティー精製抗
体を製造した。pＲＭＩＴを用いて形質転換させた誘導
ＪＭ１０１細胞のカラムに各血清を通し、その後２４時
間、カラムのベッド量の１００倍量でカラムを洗浄し
た。その後リジンＨＣlを使用して結合抗体¹⁵を溶出さ
せた。分画した胎盤ミトコンドリア、pＲＭＩＴを発現
している溶菌物、および対照の組換え体クローンの溶菌
物に対してpＲＭＩＴ吸収剤と結合した抗体をプローブ
させた。またそれらをＨＥp−２細胞または肝臓組織切
片のいずれかを用いた免疫蛍光法によって反応させた。【００３０】融合ポリペプチドとして発現したミトコン
ドリア抗原の単離ＳＤＳの存在下でゲルろ過を使用することによって融合
ポリペプチドの単離を行って、不溶性ペレットを分画
し、免疫化に適応する材料を得た。１０μg／mlアンピ
シリンを含有するＬ−ブロス中で、一夜、３７℃でpＲ
ＭＩＴのクローンをインキュベートした。８時間後対数
期生長用に希釈し、１０mＭ・ＩＰＴＧを用いて４時間
誘導した。その後エシエリヒア・コリ製品を５０００×
Ｇで、１０分間回収し、１０mＭトリス−ＨＣl（pＨ８.
０）４０ml中で２mＭ・ＥＤＴＡを含有するペレットを
再懸濁した。その後リゾチームを加えて最終濃度０.２
５mg／mlにし、混合物を３０分間、室温で回転させた。
溶液をさらに１０分間室温で混合を続けながらトリトン
Ｘ−１００の０.２％までにした。２mＭ・ＥＤＴＡ、５
０mＭＮaＣlおよび１０mＭ・ＭgＣＯ₂を有する等量の１
０mＭトリス−ＨＣlを、最終濃度２mg／mlのＤＮＡエー
スと共に加えた。これを室温で１５分間回転させ、その
後１５００×Ｇで５分間遠心した。ペレットを捨て、上
清を３０分間１００００×Ｇで遠心した。２％ＳＤＳお
よび１０mＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を有する０.
１Ｍりん酸緩衝液（pＨ６.０）でぺレットを分散後、こ
の最終ペレットを、セファクリルＳ−４００と直列に並
べたセファクリルＳ−３００カラムで分画した。画分を
５０ml／時で溶出させて、６つの小画分を分析ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびイムノブロッテイングによる分析のため
に採集した。最終的に、０.５Ｍりん酸緩衝液（pＨ６.
８）および１mＭ・ＤＴＴを用いて希釈した後、ＳＤＳ
をヒドロキシアパタイトカラム上で取り除いた。上記の
ようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッテイングに
よって画分の純度を確認した。【００３１】マウスの免疫化完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１０μgの
精製融合ポリペプチドを用いて６匹のＢＡＬＢ／c雌性
マウスの群を免疫化した。３週間後、ＣＦＡ中の同一用
量を用いて量を高めた。初期免疫化６週間後、マウスを
採血し、血清を単離した。これらの血清を１／１０００
の希釈率でアッセイし、アフィニティー精製¹²⁵Ｉ−や
ぎ抗マウスＩgを使用する以外は上記のようにＰＡＧＥ
−分離胎盤ミトコンドリアに対してプローブした。免疫
蛍光法によって、上記¹,²,⁵のようにＨＥp−２細胞の切
片および肝臓組織切片を使用して血清を１／１００で調
べた。【００３２】ヌクレオチドおよびアミノ酸配列 pＲＭＩＴのcＤＮＡ挿入物をＭ１３中にサブクローン化
し、ヌクレオチド配列を決定¹⁶,¹⁷した。発現クローン
の二重鎖シーケンシングによって挿入物の正確なフレー
ムおよび配向を決定した¹⁷。両方の配向で配列を決定
し、合成オリゴヌクレオチドをプライム反応¹⁸に用い
た。【００３３】固相酵素免疫測定法炭酸緩衝液で２μg／mlに希釈した精製組換え体融合ポ
リペプチドをイムロン１マイクロタイタープレート（ダ
イナテック・ラボラトリーズ社、アレクサンドリア、バ
ージニア）に一夜４℃で吸収させた。胎児仔牛血清（Ｆ
ＣＳ）緩衝液（ＰＢＳ中５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、０.
３％ゼラチン）を用いて非特異的部位を保護した後、Ｆ
ＣＳ緩衝液で希釈したＰＢＣ血清を１時間インキュベー
トした。ＰＢＳ／０.１％ツインを用いてプレートを３
回洗浄し、その後以下に示すひと長鎖イソタイプに対し
て特異的なマウスモノクローナル抗体の各々を用いてイ
ンキュベートした。ＩgＧ１に対するＳＧ−１１、ＩgＧ
２に対するＧＯＭ−１、ＩgＧ３に対するＳＪ−３３、
ＩgＧ４に対するＳＫ−４４、ＩgＭに対するＭＢ−１
１、ＩgＡに対するＧＡ−１（マイルズ・サアイエンテ
ィフィック社、ネイパービル、イリノイ)。マウスＭoＡ
bsの結合を、ペルオキシダーゼ結合やぎ抗マウスＩgＭ
（テイゴ社、バーリンガム、カリフォルニア）を用いて
検出されるＳＪ−３３を除く全てのペルオキシダーゼ結
合やぎ抗体マウスＩgＧ（テイゴ社、バーリンガム、カ
リフォルニア）を用いて検出した。ＡＢＴＳをペルオキ
シダーゼの色の基質として使用した。全てのイソタイプ
のＡＭＡの検出のために、ＨＲＰ−ＧＨulgをイソタイ
プの特異的モノクローナルの代わりに使用した。【００３４】ひと骨髄腫蛋白を使用して最適の希釈のイ
ソタイプの特異的ＭoＡbsを得た。骨髄腫蛋白の予じめ
定めた希釈物をミクロタイタープレートの上に被覆し、
イソタイプ特異的ＭoＡbsの連続希釈物、ついでペルオ
キシダーゼ結合試薬によって、前述のように固相酵素免
疫測定法を行った。ほぼ同等の血清イソタイプ濃度で同
様のＯ.Ｄ.単位を示すイソタイプ特異的ＭoＡbsの希釈
物を酵素結合イムノ吸着アッセイに使用した。【００３５】スクリーニングのための最適な血清希釈物
を得るために、最初にスクリーンした（免疫蛍光法によ
り）ＡＭＡ陽性ＰＢＣ、進行性軟骨炎および正常血清を
固相酵素免疫測定法によって力価測定した。血清希釈率
１：１０００がノイズ比に対して最も高い信号を生じる
ことが分り、この希釈率を使用して全ての結果を得た。
陰性の切捨点を正常血清の平均Ｏ.Ｄ.上の２標準偏差と
して決定した。【００３６】Ｂ．結果ＢＴＡ２２４中のpＲＭＩＴの配列ＰＢＣを有する患者由来の血清を用いてプローブした
際、ＪＭ１０１中のpＲＭＩＴのサブクローンは非常に
免疫反応性があったが、対照クローンは非反応性であっ
た。対照的に正常提供者由来の血清は、ＪＭ１０１中の
pＲＭＩＴにもまたは対照クローンにも反応しなかっ
た。アレイ由来の陽性コロニーを全ての後の研究に使用
した。【００３７】pＲＭＩＴ融合ポリペプチドの特異性ＰＢＣを有する患者２５名中２５名からの１／１０００
の希釈率の血清は、pＲＭＩＴ内で作られた１６０kdの
融合ポリペプチドと反応した（表１および図１)。この
バンドはβ−ガラクトシダ−ゼに対するうざぎ抗血清と
も反応した（デ−タは示さず)。約３６kdの血清を含
め、明らかに１６０kdの破砕生成物である低分子量の成
分に対応する多くのバンドが認められた。これらの低分
子量材料はpＲＭＩＴのみにあり、ＰＢＣ血清に免疫反
応性があった。これら２５の血清の反応性の力価は、
１：１,０００から１：１,０００,０００の範囲であっ
た。同じ２５の血清の使用によって、非組換え体pＢＴ
Ａ２２４によって生成された細菌または不適切な挿入物
で形質転換し、種々の融合ポリペプチドの発現を誘導し
た細菌の溶菌物にはこの融合ポリペプチドは検出されな
かった。全身性紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチまたは慢
性活動性肝炎を有する患者由来の血清は、１／１００の
希釈率で融合蛋白と反応し、４日までのオートラジオグ
ラフ露出でも反応した。【００３８】【表１】【００３９】融合ポリペプチドの同定 pＲＭＩＴの溶菌物で吸収後、ＰＢＣを有する７人の患
者全てからの血清が、７０kd抗原に反応性を有する抗体
を奪われたことを示した（表２)。反対照に、上記吸収
は４５kdまたは３９kd抗原に対する反応性を変化しな
い。上記奪取は、固体支持体に結合した対照クローンの
溶菌物にＰＢＣ血清が吸収される際には見られない。p
ＲＭＩＴ融合ポリペプチドとＰＢＣ血清の反応が、検出
可能な抗７０kd反応性を取り除くことの発見は、cＤＮ
Ａが７０kd抗原に対する自己抗体によって認識される全
決定基を暗号化することを示している（表２、図２)。【００４０】アフィニティー精製抗体５つの異なるＰＢＣ血清の溶出抗体は、分画された胎盤
ミトコンドリアの７０kdポリペプチドと反応し、pＲＭ
ＩＴ中の１６０kdの融合ポリペプチドと反応し（図
３)、更にpＲＭＩＴが７０kd抗原を暗号化することを示
している。溶出抗体は、対照肝臓cＤＮＡを発現するク
ローン由来の細菌たん白の溶菌物とは反応しなかった。
溶出抗体は、ＨＥp−２細胞またはじん臓組織切片を用
い、免疫蛍光法によって染色する抗ミトコンドリアの特
異的パターンも付与した。【００４１】マウスの免疫応答 pＲＭＩＴ融合ポリペプチドの注入後、ＢＡＬＢマウス
は７０kd胎盤ミトコンドリアたん白に応答する抗体を生
成した。対照非免疫化マウス血清は非反応性であった
（図４)。更に、これらの血清は、ＨＥp−２細胞および
じん臓組織切片の両方での抗ミトコンドリア免疫蛍光法
の典型的パターンを生じた（図５)。【００４２】ヌクレオチドおよびアミノ酸配列挿入物は、１３７０の塩基対長で、全てのコード化領域
から成る（図６)。４５６のアミノ酸は、クローンによ
って生成された融合ポリペプチドの観察寸法と一致する
約４８kdのポリペプチドをコード化する。従って、全長
の配列の抗原ではない。配列は、１１％プロリンを含有
し、プロリンは例えば５４から１０２のヌクレオチドに
みられるように、しばしばアラニンおよびバリンのよう
な疎水性アミノ酸の短鎖によって先行されることが分か
った。７０kdミトコンドリア自己抗原の配列および公知
たん白とＤＮＡ配列の比較は、よく一致する配列をなん
ら示さなかった。配列は、ミトコンドリアＤＮＡ中には
存在しなく（データは示さず)、従って７０kdたん白は
核遺伝子によってコード化されている。【００４３】固相酵素免疫測定法の感受性を、ＰＢＣを
有する３７名の患者に対する免疫蛍光法と比較した（図
７)。固相酵素免疫測定法は約２５０倍以上の感度であ
ることが分かった。固相酵素免疫測定法によって検出し
た平均力価は、１０^5.4であるが、免疫蛍光法による
と、僅か１０³であった。【００４４】【表２】【００４５】参考文献１．Ｐ.Ａ.バーグ、Ｒ.クレインおよびＪ.Ｊ.リンデン
ボーン−フォチノス、ヘパトロジー第２巻、第１２３〜
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モロソ、Ｆ.ロジナ、Ｐ.コスタンティニ、Ｐ.ベラン
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ジー第１８巻、第４４５頁(１９８３年)。【００５２】３６．Ｊ.Ｊ.バン・デン・オール、Ｊ.フ
ェバリー、Ｊ.デ・グルーテおよびＶ.Ｊ.デスメ、リバ
ー第４巻、第２６４頁(１９８４年)。３７．Ｍ.シミズ、Ｋ.コウ、Ｓ.アオヤマ、Ｉ.イチハ
ラ、Ｈ.ワタナベ、Ｈ.シロおよびＭ.オクムラ、リバー
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ネイグルおよびＥ.Ａ.ジョーンズ、ヘパトロジー第６
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１６巻(Ｐt.２)、第２８９頁(１９８１年)。４０．Ｊ.ニューバーガー、Ｂ.ポートマン、Ｂ.Ｒ.Ｄ.
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ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン
第３０６巻、第１頁(１９８２年)。【００５３】４１．Ｈ.Ｈ.ハンドレイ、Ｍ.Ｃ.グラッシ
ー、Ｐ.Ｈ.クレベランドおよびＩ.ロイスタン、ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッド第５４巻、第
２９１〜２９８頁(１９８２年)。４２．Ｒ.Ａ.マクドナルド、Ｃ.Ｓ.ホスキングおよび
Ｃ.Ｌ.ジョーンズ、ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソッド、１９８７年出版。

【図面の簡単な説明】【図１】図１は融合ポリペプチドの特異性を示す電気
泳動の写真である。【図２】図２は、pＲＭＩＴ融合ポリペプチドの同定
を示す電気泳動の写真である。【図３】図３は、親和性−精製抗体の特異性を示す電
気泳動の写真である。【図４】図４は、pＲＭＩＴ誘導融合ポリペプチドで
免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫応答を示す電気泳動
の写真である。【図５】図５は、ＨＥp−２細胞の免疫蛍光を示す顕
微鏡写真である。【図６】図６は、pＲＭＩＴのヌクレオチド配列およ
び推測したＰＢＣの７０kdミトコンドリア抗原のアミノ
酸配列を示す。【図７】図７は、ＰＢＣのＡＭＡ検出におけるＥＬＩ
ＳＡ（＋）および免疫蛍光法（□）の間の感度の比較を
示す。【図８】図８は、ヌクレオチド配列および図６のヌク
レオチド１０５−１０６５領域のヒト対応部を含む、図
６に描かれたヒト対応部の配列を暗号化した２.２kb c
ＤＮＡ挿入断片の推定アミノ酸配列を示す。

フロントページの続き (56)参考文献ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．135，Ｎｏ. ３，ｐ．1739−1745（1985) ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．62，ｐ．371−379（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/12 ,1/21

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．原発性胆汁肝硬変（ＰＢＣ）のミトコンドリア自己
抗原活性を有し、少なくともアミノ酸配列：ＡＥＩＥＴ
ＤＫＡＴＩＧＦＥＶＱＥＥＧＹＬを含むポリペプチドを
暗号化している、ＤＮＡ分子。２．少なくとも実質的に図６もしくは図８に示された塩
基配列またはそのフラグメントを含む請求項１記載のＤ
ＮＡ分子。３．少なくとも実質的に図６に示されたヌクレオチド７
６−６７９に対応する塩基配列を含む請求項２記載のＤ
ＮＡ分子。４．機能し得るように発現調節配列に結合した請求項１
−３の何れかに記載のＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡ
分子。５．機能し得るように発現調節配列に結合した請求項１
−３の何れかに記載のＤＮＡ分子を含む、発現ベクタ
ー。６．機能し得るように発現調節配列に結合した請求項１
−３の何れかに記載のＤＮＡ分子を含む、形質転換した
宿主細胞。