DE3751834T2

DE3751834T2 - Selbstantigen der primären lebercirrhose

Info

Publication number: DE3751834T2
Application number: DE3751834T
Authority: DE
Inventors: Ross Coppel; Merrill Gershwin
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Current assignee: CSL Innovation Pty Ltd
Priority date: 1986-12-16
Filing date: 1987-12-16
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2007-12-17
Also published as: ATE139259T1; JP2815582B2; EP0293471B1; JP2875226B2; US5891436A; EP0293471A1; JPH01502077A; AU1086888A; ZA879403B; US5196319A; WO1988004689A1; JPH09308490A; CA1341231C; AU604087B2; JPH1175864A; DE3751834D1; EP0293471A4; NZ222942A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung, Klonierung und Expression eines Autoantigens, das als Target bei der charakteristischen Autoantikörperantwort bei primärer bihärer Zirrhose (PBC) erkannt wird, und die Verwendung dieses Proteins, von Fragmenten hiervon oder das Protein oder Fragmente hiervon enthaltenden Fusionspolypeptiden in Diagnosetests auf PBC und bei der Behandlung von an PBC leidenden Patienten.
Primäre bihäre Zirrhose (PBC) ist eine chronische Erkrankung, die durch eine fortschreitende entzundliche Obliteration der intrahepatischen Gallengänge gekennzeichnet ist. Die Erkrankung wird durch ein Autoantikörperansprechen gegen Mitochondrien1-4 angezeigt, so wie ursprünglich durch Irtimunofluoreszenz nachgewiesen wurde&sup5;. Durch die Verwendung von Iminunoblotting-Verfahren in jüngster Zeit wurden spezifische Proteine als Target bzw. Ziel der antimitochondrialen Antikörper (AMA) von PBC2,6,7 erkannt. Insbesondere wurden bei mehr als 95% der an PBC leidenden Patienten, jedoch nicht bei Patienten, die an anderen Autoimmunlebererkrankungen leiden, Serumantikörper zu einem 70 Kilodalton (kd)-Protein gefunden2,8. In PBC-Seren wurden darüber hinaus zwei andere Proteine mit 45 bzw. 39 kd in geringerer Häufigkeit nachge wiesen1,2,9 Die Identität eines jeden dieser Autoantigene war unbekannt, so wie es die Beziehung dieser Antigene zur Pathogenese der Erkrankung ist. Das 70-kd-Antigen blieb jedoch im Zuge der Evolution in hohem Maße konserviert und findet sich in Säugetieren, Hefe und Bakterien¹&sup0;. Es wird folglich angenommen, daß dieses Antigen eine wichtige strukturelle oder biologische Funktion besitzt².
Trotz der Armut an Daten über den Mechanismus der antimitochondrialen Antikörperbildung zeigte sich mit Hilfe von Festphasen-Enzymimmunoassays (ELISA), daß klinisch mehr als 95% der an PBC leidenden Patienten derartige antimitochondriale Antikörper besitzen2,6 Wenn rohe mitochondriale Antigenzubereitungen verwendet werden, kann ferner gezeigt werden, daß an den verschiedensten Erkrankungen leidende Patienten, einschließlich an von PBC verschiedenen Leberer krankungen, bestimmten Bindegewebserkrankungen und Arzneimittelreaktionen leidenden Patienten, und gelegentlich sogar gesunde Menschen Antikörper gegen Mitochondrien besitzen. Folglich vermögen Assays, die sich derartiger roher Zubereitungen bedienen, keine spezielle PBC-Diagnose zu liefern. Beispielsweise ist in der deutschen Patentveröffentlichung DE-A-3 237 602 ein ELISA zum Nachweis und zur Bestimmung von antiniitochondrialen Antikörpern im Serum unter Verwendung einer rohen mitochondrialen Antigenzubereitung beschrieben. Aus der vorgeschlagenen Verwendung des Assays bei der speziehen Diagnose von Störungen, wie PBC, sowie der cholestatischen Form chronisch aktiver Hepatitis, von Syphilis (II), des Pseudo-Lupus-Erythematodes-Syndroms, bestimmter primärer nicht hepatischer Immunopathien, einer durch Iproniazid induzierten Hepatitis und von Nebeneffekten bestimmter Medika mente, wie beta-Rezeptorblockern, ist ersichtlich, daß dem Assay die Spezifität fehlt. Durch bessere Isolierung der mitochondrialen Membranen wird das Problem der antigenen Heterogenität klarer. Dies führte zur Definitionen spezieller mitochondrialer Antigene auf der Basis der Trypsin-Empfind lichkeit und des Antigenorts in den inneren bzw. äußeren mitochondrialen Membranen. Nichts desto trotz konzentriert sich die PBC-Diagnose immer noch in starkem Maße auf die Demonstration von antimitochondrialen Antikörpern mit Hilfe des relativ unempfindlichen Vorgehens der Immunofluoreszenz oder mit Hilfe von empfindlicheren, jedoch noch relativ nichtspezifischen Verfahren, beispielsweise Komplementfixierung, ELISA und Immunofällung²³&supmin;²&sup8;.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung eines aus einer Rattenlebergenexpressionsbibliothek stammenden cDNA-Klons, das das mitochondriale 70-kd-Autoantigen von PBC (von einigen Forschergruppen als M2 bezeichnet1,9) exprimiert, und der Sequenzbestimmung hiervon. Die Sequenz wird durch die nukleare und nichtmitochondriale DNA kodiert.
Die vorliegende Erfindung schafft somit die Basis einer extrem empfindlichen und spezifischen diagnostischen ELISA für die bei PBC gefundenen anti-70-kd-Antikörper.
Gegenstand eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Molekül mit Kodierung für das mitochondriale 70-kd-Autoantigen primärer bihärer Zirrhose (PBC) oder ein antigenisch aktives Fragment hiervon, das eine Nucleotidsequenz mit Kodierung für ein Peptid oder Polypeptid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil hiervon eine im wesentlichen in Fig. 6 oder in Fig. 8 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein Fragment hiervon umfaßt, umfaßt.
Vorzugsweise ist das DNA-Molekül gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil hiervon eine im wesentlichen in Fig. 6 dargestellte Basensequenz oder ein Fragment hiervon umfaßt.
Gegenstand eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes DNA-Molekül mit der oben beschriebenen Nucleotidsequenz, das operativ an eine Expressionssteuersequenz gebunden ist. Ein derartiges rekombinantes DNA-Molekül kann beispielsweise einen Expressionsvektor, beispielsweise einen Bakteriophagen oder ein Plasmid, oder eine Wirtzelle, beispielsweise ein Bakterium oder einen anderen hiermit transformierten Mikroorganismus, umfassen.
Gegenstand eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein synthetisches Peptid oder Polypeptid, das die Antigenität des gesamten mitochondrialen 70 kd Autoantigens der primären biliären Zirrhose oder eines Teils hiervon zeigt, oder ein antigenisch aktives Fragment hiervon, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie durch die in Fig. 6 dargestellten Nucleotide 76 bis 679 kodiert ist.
Ein derartiges synthetisches Peptid oder Polypeptid kann beispielsweise durch Expression einer Wirtzelle, die mit einem ausführlich oben beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, entweder in Form eines Fusionspolypeptid oder direkt hergestellt werden. Andererseits kann es durch chemische Synthese, beispielsweise durch das allgemein bekannte Merrifield-Festphasen-Synthesevorgehen hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf synthetische Peptide gemäß der obigen Definition und auf Nucleotidsequenzen mit Kodierung für das gesamte Autoantigen sowie Fragmente hiervon.
Das durch die Nudeotide 76 bis 679 von Fig. 6 kodierte Fragment mit etwa 200 Resten vermag aus einem Patientenserum alle gegen das native Autoantigen gerichteten Antikörper zu adsorbieren. In diesem Fragment ist ein 20 Reste umfassendes Fragment mit der folgenden Aminosäuresequenz vorhanden:
AEIETDKATIGFEVQEEGYL,
von der gezeigt wurde, daß sie eine merkliche Reaktivität gegenüber Autoantikörpern besitzt. Dieses Fragment ist den Sequenzen sowohl in Fig. 6 als auch in Fig. 8 gemeinsam. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich folglich auch auf die Verwendung von antigenisch aktiven Fragmenten, beispielsweise den obigen Fragmenten.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf die Verwendung eines erfindungsgemäßen synthetischen Peptids oder Polypeptids oder Fragments als Antigen in einem Diagnosetest auf PBC durch Nachweis oder Bestimmung des Titers der antimitochondrialen Antikörper im Serum eines Patienten, beispielsweise mit Hilfe von ELISA oder der RIA-Technologie oder eines Agglutinationsassays unter Verwendung von mit Antigen beschichteten Perlen o.dgl.. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf die Verwendung des synthetischen Peptids oder Polypeptids oder eines Fragments hiervon bei der Behandlung von Patienten. In diesem letzteren Aspekt umfassen derartige Behandlungsverfahren die Verwendung des synthetischen Antigens als Adsorbens zur Entfernung von PBC- Antikörpern oder reaktiven Zellen aus Patienten sowie die Verwendung dieser aktiven Komponenten bei der direkten Verabreichung an Patienten als Desensibilisierungsmittel zur Unterbindung oder Verminderung der Patientenreaktionsfähigkeit mit dem PBC-Autoantigen.
Neben der Verwendung des synthetischen Autoantigens beim Nachweis antimitochondrialer Antikörper in einer Serumprobe erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung des synthetischen Peptids oder Polypeptids oder eines Fragments hiervon bei der Bestimmung von klassenspezifischen Immunoglobulintitern unter Verwendung von spezifischen Typisierungsreagenzien. Die Anwendungen erstrecken sich auch auf die Bestimmung der Affinität entweder des gesamten Autoantikörpers oder der Affinität einzelner Klassen oder Unterklassen des Autoantikörpers. Die Affinität kann mit Hilfe einer Reihe von Vorgängen, beispielsweise durch Replikat-ELISA-Assays, die mit Hilfe von unterschiedlichen Waschvorgängen mit Guanidinthiocyanat durchgeführt werden&sup4;², gemessen werden. Eine weitere Ausdehnung des Diagnosetests ist die Messung des Grads der Interferenz der Autoantikörper mit der Enzymfunktion des 70-kd-Autoantigens (von dem sich jetzt gezeigt hat, daß es eine Lipoatacetyltransferase ist, siehe später). Die Enzymquelle kann von einer Expression der die vollständige Länge aufweisenden Klone in Form von nativen Polypeptiden oder Fusionspolypeptiden oder von der Expression enzymatisch aktiver Fragmente oder eines gereinigten Proteins aus Mitochondrien herrühren. Der Enzymassay ist ein Standardassay, der auf dem einschlägigen Fachgebiet gut bekannt ist, jedoch so modifiziert wurde, daß er die Stufe einer Inkubation mit Probenserum oder Zellen umfaßt. In einer weiteren Ausdehnung der Verwendung des synthetischen Peptids oder Polypeptids oder Fragments hiervon ist auch die Bestimmung der Reaktivität von Patientenzellen auf das Autoantigen eingeschlossen. Das synthetische Peptid oder Polypeptid oder Fragment kann in Lösung oder gebunden an einen festen Träger Patientenzellen, die aus peripherem Blut oder aus Gewebebiopsien, die entweder nicht fraktioniert, fraktioniert oder als kontinuierliche Zellinie vorliegen, stammen, zugesetzt werden. Die Reaktivität gegenüber dem Autoantigen kann dann durch Standardproliferationsassays, beispielsweise den Einbau von trituertem Thymidin, Standardcytotoxizitätsassays, wie der Freisetzung einer Markerradioaktivität aus Targetzellen, oder andere Standardassays bezüglich zellulärer Reaktivität, die auf dem einschlägigen Fachgebiet gut bekannt sind, gemessen werden.
Gegenstand eines besonders wichtigen Aspekts der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosetest zum Nachweis eines Anti- Mitochondrien-Antikörpers in einer Serumprobe, der die folgenden Stufen umfaßt:
(i) Kontaktieren der Serumprobe mit einem erfindungsgemäßen synthetischen Peptid oder Polypeptid oder einem Teil des mitochondrialen 70-kd-Autoantigens von PBC oder eines antigenisch aktiven Fragments hiervon, wobei das synthetische Peptid oder Polypeptid auf einem Träger immobilisiert ist, und
(ii) Nachweisen der Anwesenheit eines an das synthetische Peptid oder Polypeptid gebundenen Anti-Mitochondrien-Antikörpers in dem Serum.
In diesem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ferner einen Diagnosetestkit bzw. ein Diagnosetestbesteck zum Nachweis eines Anti-Mitochondrien-Antikörpers in einer Serumprobe, der (das)
(i) einen Träger mit einem darauf immobilisierten erfindungsgemäßen synthetischen Peptid oder Polypeptid oder einem antigenisch aktiven Fragment desselben und
(ii) Mittel zum Nachweis des Vorhandenseins eines an das synthetische Peptid oder Polypeptid gebundenen Anti- Mitochondrien-Antikörpers in dem Serum umfaßt.
Vorzugsweise erfolgt der Nachweis der Anwesenheit von gebundenen AMAN mit Hilfe von wohlbekannten RIA- oder ELISA-Techniken.
Als Ergebnis der Bildung eines rekombinanten Fusionspolypeptids, das die Antigenität des mitochondrialen 70-kd-Autoantigens von PBC zeigt, wurde dieses Autoantigen nun als Lipoatacyltransferase identifiziert. Darüber hinaus wurden die Immunoglobulinisotypen der antimitochondrialen Antikörper bestimmt, wobei festgestellt wurde, daß IgG3 der vorherrschende Isotyp und IgM der am nächsten häufigste bei einer Gruppe von PBC-Patienten sind. Ein Vergleich der Serumimmunoglobulinisotypspiegel von PBC-Patienten mit gesun den normalen Erwachsenen hat gezeigt, daß bei PBC-Patienten die Serum-IgG3- und -IgM-Spiegel stark erhöht waren.
Gegenüber den Normalwerten waren IgG3 um das 5,5fache und IgM um das 4,3fache erhöht.
Erfindungsgemäß kann die Expression eines cDNA-Inserts mit Kodierung für das mitochondriale Autoantigen oder Fragmente hiervon auf eine Reihe von verschiedenen Wegen erreicht werden. Die hier und im folgenden gegebene detaillierte Beschreibung liefert Beispiele für die Expression in Form von beta-Galactosidasefusionsproteinen in den Vektoren λgt11 und pBTA224 unter Verwendung von E.-coli-Stämmen, beispielsweise JM101, JPA101 und 7118, als Wirtzellen. Eine erfolgreiche Expression des Autoantigens in Form eines Fusionsproteins kann unter Verwendung der gut bekannten PVC-Vektoren oder unter Verwendung der PGEX-Reihe, die eine Expression von Glutathion-S-Transferasefusionsproteinen liefert, wobei abermals E. coli als Wirtzellen verwendet werden, erreicht werden. Andererseits kann das mitochondriale Autoantigen in Form eines nicht fusionierten Polypeptids unter Verwendung geeigneter Kombinationen aus Vektor und Wirtzellen exprimiert werden. Weitere erfindungsgemäß verwendbare Kombinationen aus Vektor und Wirtzellen umfassen eine Reihe von ausreichend beschriebenen Hefeschüttelvektoren, die in Hefezellen wachsen, oder eukaryontischen Vektoren in kontinuierlichen Zellinien oder transgene Tiere.
Die Identifizierung, Klonierung und Expression des mitochondrialen 70-kd-Autoantigens von PBC gemäß der vorliegenden Erfindung und seine Verwendung in einem ELISA werden im folgenden unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen de tailliert beschrieben.
Fig. 1 zeigt die Spezifität des Fusionspolypeptids. In Spur A und B wurden zwei unterschiedliche PBC-Seren in einer Verdünnung von 1/1000 gegen Lysate von mit pRMIT transformierten JM101-Zellen sondiert bzw. hybridisiert. Beide Seren reagierten mit einem Polypeptid bei 160 kd. Im Gegensatz dazu waren dieselben Seren nicht reaktiv, wenn sie gegen Lysate von Vergleichszellen sondiert wurden, die ein irrelevantes Insert enthielten, das auch an β-Galactosidase fusioniert ist. Die reaktiven Banden in den Spuren C und D entsprechen E.-coli-Proteinen. Bei Duplikatblots, die mit normalen Seren in Verdünnungen von 1/100 und 1/1000 sondiert wurden, konnte das Fusionspolypeptid nicht nachgewiesen werden. Sie sind folglich nicht dargestellt. Es gibt einen gewissen Zusammenbruch des Fusionsproteins hinsichtlich der Reaktivität bei 36 kd.
Fig. 2 zeigt die Identifizierung des pRMIT-Fusionspolypeptids. Die Reaktivität von absorbiertem und nicht absorbiertem PBC-Serum gegen mitochondriale Proteine aus der menschlichen Placenta nach PAGE wurde bestimmt. In Spur A war die Sonde ein nicht absorbiertes PBC-Serum in einer Endverdünnung von 1/2000. In Spur B war die Sonde dasselbe Serum bei einer Endverdünnung von 1/2000 nach ausgiebiger 72stündiger Absorption an Zellen, die mit nicht rekombinantem pBTA224 transformiert waren, und einem Leiten über einen festen Träger, an den ein Lysat aus mit nicht rekombinantem gBTA224 transformierten Zellen gebunden worden war. In Spur C war die Sonde dasselbe Serum bei einer Endverdünnung von 1/2000 nach 72stündiger Absorption an Zellen, die mit nicht rekombinantem pBTA224 transformiert worden waren, und einem Leiten über einen festen Träger, an den ein Lysat aus mit exprimierendem pRMIT transformierten Zellen gebunden worden war. Das Serum wurde ferner bei Verdünnungen von 1/200 und 1/20.000 untersucht (Tabelle II).
Fig. 3 zeigt die Spezifität eines affinitätsgereinigten Antikörpers. In Spur A wurde ein nichtabsorbiertes PBC-Serum in einer Verdünnung von 1/2000 (ed. 1.2000) gegen Placentamitochondrien sondiert, wobei eine Reaktion sowohl mit dem 70- als auch mit dem 45-kd-Protein erfolgte. In Spur B wurde das Säuleneluat gegen dieselbe Mitochondrienzubereltung sondiert. Es sei darauf hingewiesen, daß lediglich eine Reaktivität gegenüber dem 70-kd-Protein auftrat, wobei die Signalverringerung der erwarteten Rückgewinnung für eine derartige Verdünnung entspricht. Selbst bei einer sehr langen autoradiographischen Belichtungszeit von 1 Woche verblieb lediglich eine Aktivität gegenüber dem 70-kd-Protein (Daten nicht dargestellt). In Spur C wurde das Eluat gegen eine beschallte Probe von mit pRMIT transformierten, induzierten JM101-Zellen sondiert. Die Intensität des 160-kd-Fusionspolypeptids basierte auf der großen Menge des exprimierten Fusionspolypeptids. In Spur D wurde das Eluat gegen eine beschallte Probe von mit einem nicht relevanten Plasmid, das für ein ausgiebiges Fusionspolypeptid kodiert, transformierten, induzierten JM101-Zellen getestet.
Fig. 4 zeigt die Immunantwort von BALB/c-Mäusen, die mit durch pRMIT induziertem Fusionspolypeptid immunisiert worden waren. Die Placentamitochondrien wurden durch PAGE auf einem 7,5% Gel abgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet, worauf die fraktionierten Proteine mit Seren bei einer Verdünnung von 1/1000 (Spur A) oder mit Serum aus einem PBS-Patienten bei einer Verdünnung von 1/1000 sondiert wurden. Die immunisierten Mäuse bildeten Antikörper gegen das 70-kd-Protein, nicht jedoch gegen das 45-kd-Protein.
Fig. 5 zeigt die Immunofluoreszenz von HEp-2-Zellen. BALB/c- Mäuse wurden mit dem gereinigten Fusionspolypeptid immunisiert, worauf Seren mit HEp-2-Zellen inkubiert wurden. Das typische Mitochondrienmuster bezüglich der Reaktivität ist zu beachten.
Fig. 6 zeigt die Nucleotidsequenz von pRMIT und einer abgeleiteten Aminosäuresequenz des mitochondrialen 70-kd-Antigens von PBC.
Fig. 7 zeigt einen Vergleich der Empfindlichkeit zwischen der ELISA (+) und der Immunofluoreszenz ( ) beim Nachweis von AMA in PBC. PBC-Seren wurden in jeder 10fachen Verdünnung ausgehend von 1/1000 in einem ELISA getestet, während bei der Immunofluoreszenz gegenüber HEp-2-Zellen jede 2fache Verdünnung ausgehend von 1/10 verwendet wurde. Die positiven Proben im ELISA wurden als 2 Einheiten der Standardabweichung über dem Mittelwert O.D. (2 S.D.O.D.-units) über den Mittelwert für Normalseren definiert.
Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines 2,2 kb langen cDNA-Inserts mit Kodierung für das Humanäquivalent der in Fig. 6 angegebenen Sequenz, das das Humanäquivalent des Bereichs der Nudeotide 105 bis 1065 in Fig. 6 umfaßt. Dieses menschliche cDNA-Klon wurde durch Sondieren einer menschlichen Placentabibliothek unter Verwendung von pRMIT als Hybridisierungssonde gemäß bekannten Techniken erhalten. Die Sequenzen sind hoch homolog und besitzen eine vergleichbare Reaktivität gegenüber automitochondrialen Antikörpern. Folglich konnte jede Antigensequenz als Basis eines Diagnosetests zum Nachweis antimitochondrialer Antikörper oder autoreaktiver Zellen verwendet werden. A. MATERIALIEN UND METHODEN Screening einer cDNA-Bibliothek
Mit Hilfe von Seren von PBC-Patienten wurde eine Rattenleber-cDNA-Bibliothek in λgt 11-Amp3 aus 15.000 Rekombinanten einer mittleren Länge von 1,4 kb sondiert. Die zum Screening verwendeten Seren stammten aus drei verschiedenen Patienten, die an klassischer PBC litten und bei denen es sich durch Immunoblottinganalyse von elektrophoretisch getrennten Proteinen von menschlichen Placentamitochondrien gezeigt hatte², daß sie Antikörper gegen Mitochondrien besitzen. Da einige PBC-Patienten einen hoher Titer aufweisenden Antikörper gegen E. coli besitzen, wurden die Seren intensiv gegen mit nicht rekombinanten Phagen infizierte E. coli präabsorbiert. Die Seren wurden zur Sondierung bei einer Endkonzentration von 1/1000 verwendet11,12. Die -Amp3-Bibliothek wurde 15 min bei 37ºC mit dem E.-coli Stamm ST9 inkubiert und anschließend 2 h bei 42ºC in LB-Agar plattiert. Jede Platte wurde danach mit zuvor in 10 ml Isopropylthiogalactosidase (IPTG) eingeweichten und anschließend luftgetrockneten Nitrocellulosefiltern überschichtet. Die Platten wurden danach über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Nitrocellulose wurde nach dem Übereinanderanordnen entfernt und 1 h in PBS mit 5% Milchpulver eines pH-Werts von 7,4 gewaschen. Die Filter wurden anschließend 45 min mit zuvor absorbierten Seren von PBC-Patienten inkubiert, 3mal 30 min gewaschen und 45 min mit ¹²&sup5;I-Protein A (300.000 cpm/ml) inkubiert. Schließlich wurden die Filter 3mal gewaschen, an Luft getrocknet und auf einen XRP-1-Film mit einem Verstärkungsschirm aufgebracht, um über Nacht (12 h) belichtet zu werden. Alle waschvorgänge und Verdünnungsvorgänge der Seren und des ¹²&sup5;I-Proteins A erfolgten mit Milchpulver. Vermutliche positive Klone wurden aufgenommen und zur Plaquereinigung abermals gescreent12,13. Subklonieren
Drei Klone lieferten positive Signale, eine Häufigkeit von etwa einem in 50.000 Klonen. Diese positiven Klone wurden plaquegereinigt. Jedes dieser Klone lieferte ein Insert identischer Größe von etwa 1,4 kd. Die Inserte wurden in dem Plasmidvektor pBTA224, bei dem es sich um einen eine hohe Kopienzahl aufweisenden Plasmidexpressionsvektor mit einer Insertionsstelle für fremde DNA, die der von λ-Amp3 entspricht, handelt, subkloniert. Folglich sollten auch 50% der Subklone beim Immunoassay ein positives Signal liefern, da das Insert im selben Leserahmen vorliegt wie λ-Amp3. Als Vergleichsproben wurden eine nichtverwandte Rattenleber-cDNA (das F Albantigen) exprimierende Klone verwendet. Zur Identifizierung von immunoreaktiven Klonen wurden Gruppen von pBTA224-Kolonien hergestellt. Die Kolonien wurden 16 h bei 37ºC inkubiert und anschließend 4 h mit 10 mMol IPTG induziert. Die Kolonien wurden danach lysiert und wie beschrieben¹¹ für eine Antikörpersondierung zubereitet. Die Filter wurden entweder in einer 1/1000-Verdünnung von absorbierten PBC-Seren oder einer 1/100-Verdünnung von Normalserum sondiert. Ein als pRMIT bezeichnetes positives Klon, das ein Fusionspolypeptid einer Länge von 160 kd exprimierte, wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Immunoblotting von mitochondrialen Proteinen
Mitochondrien aus menschlicher Placenta wurden wie beschneben2,14 hergestellt. Es erfolgte eine Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) auf 1 mm dicken Plattengelen in 0,1% SDS unter Verwendung eines 3,8% Stapelgels und eines 10% Trenngels (resolving gel). Vor der PAGE wurden die gereinigten Mitochondrien in einer Konzentration von 4 mg Protein/ml suspendiert und anschließend 30 min bei 37ºC mit 10.000 Einheiten Rinderpankreas-DNAse-1 inkubiert. Nach einem lsminütigen Halten mit einem gleichen Volumen von 3%igem wäßrigem Octylglycosid bei 4ºC wurden die Endzubereitungen mit 4% SDS, 20% Glycerin und 5% 2-Mercaptoethanol enthaltendem Tris-HCl (Probenpuffer) eines pH-Werts von 6,8 verdünnt und 5 min gekocht. Etwa 10 mg Protein wurden auf jede Gelspur aufgetragen². Spezifität des pRMIT-Fusionspolypeptids
Um zu zeigen, daß pRMIT ein Antigen exprimierte, das spezifisch mit Seren von PBC-Patienten reagiert, wurden Lysate des exprimierenden Klons mit Seren von gesunden Personen oder von an verschiedenen Autoimmunkrankheiten leidenden Patienten sondiert. Kurz gesagt wurde eine 100 ml Übernachtkultur von mit pRMIT transformierten JM101-Zellen in 10 mMol IPTG enthaltender L-Brühe 1/10 verdünnt. Vier Stunden später wurden die Kulturen 10 min bei 5000 g zentrifugiert und nach Zugabe von 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung schnell gefroren. Die PAGE erfolgte auf 1 mm dicken Plattengelen mit 0,1% SDS unter Verwendung eines 3,8%igen Stapelgels und eines 7,5%igen Trenngels. Die Proben wurden in dem obigen Probenpuffer 1/100 verdünnt und 5 min gekocht. Jede Spur enthielt etwa 5 bis 10 µg Protein. Die Proben wurden mit auf 1/1000 verdünnten PBC-Seren sondiert, wobei die Reaktivität wie oben unter Verwendung von ¹²&sup5;I-Protein A und durch 18- stündiges Belichten bestimmt wurde. Dieselben Seren wurden ferner zur Sondierung von Immunoblots von Lysaten von nicht rekombinanten Vergleichsklonen oder von Klonen, die ein Fusionspolypeptid, das durch ein nicht relevantes DNA-Insert kodiert wird, exprimieren, verwendet. Die verwendeten Seren stammten von Patienten, die an PBC, systemischem Lupus Erythematosus, rheumatoider Arthritis, dem Sjogrenschen Syndrom und chronischer aktiver Hepatitis leiden, sowie von gesunden normalen Freiwilligen. Alle Vergleichsseren wurden bei einer Verdünnung von 1/100 untersucht. Identifizierung des Fusionspolypeptids
Das durch pRMIT exprimierte Fusionspolypeptid wurde charakterisiert, um zu bestimmen, ob es ein von PBC-Seren erkanntes mitochondriales Antigen ist. Der Klon pRMIT wurde in einer Flüssigkultur über Nacht gezüchtet. Er wurde daher in die logarithmische Wachstumsphase gebracht und 4 h mit 10 mMol IPTG induziert, um die maximale Expression des Fusionspolypeptids zu liefern. Die Bakterienlysate wurden wie oben hergestellt und an Cyanogenbromid-Sepharose¹&sup5; gekuppelt. Dieser feste Träger wurde anschließend als Affinitätsreagens, um Antikörper selektiv aus sieben verschiedenen PBC- Seren zu binden, verwendet. Zuerst wurden die Seren von sieben PBC-Patienten ausgiebig an beschallte Proben von mit nicht rekombinanten pBTA224 transformierten E.-coli-Zellen absorbiert. Dazu wurden die Seren in Verdünnungen von 1/200, 1/2000 und 1/20.000 durch das Lysat von mit pRMIT transformierten Bakterien, die an einen festen Träger gebunden waren, geleitet. Die nicht absorbierten Antikörper wurden gesammelt, mit nicht manipulierten Seren bei der gleichen Endverdünnung verglichen und dazu verwendet, die wie oben hergestellten Placentamitochondrien zu sondieren. Herstellung eines affinitätsgereinigten Antikörpers
Ein affinitätsgereinigter Antikörper wurde durch anfängliches ausgiebiges Vorabsorbieren von fünf unterschiedlichen reaktiven Seren an beschallte Proben von JM101, die mit nicht rekombinantem pBTA224 transformiert worden waren, und anschließendes Leiten dieses absorbierten Serums über eine Säule von mit nicht rekombinantem pBTA224 transformierten JM101-Zellen hergestellt¹&sup5;. Jedes Serum wurde über eine Säule von mit pRMIT transformierten induzierten JM101-Zellen geleitet, worauf die Säule 24 h mit dem bofachen des Bettvolumens der Säule gewaschen wurde. Dazu wurde Lycin.HCl verwendet, um die gebundenen Antikörper zu eluieren¹&sup5;. Die Antikörper, die an das pRMIT-Adsorbens gebunden waren, wurden gegen fraktionierte Placentamitochondrien, ein Lysat von exprimierendem pRMIT und ein Lysat eines rekombinanten Vergleichsklons sondiert. Sie wurden ferner durch Immunofluoreszenz entweder mit HEp-2-Zellen oder mit Nierengewebebereichen umgesetzt. Isolieren eines als Fusionspolypeptid exprimierten mitochondrialen Antigens
Die Isolierung des Fusionspolypeptids erfolgte durch Gelfiltration in Anwesenheit von SDS zur Fraktionierung des unlöslichen Pellets und zur Gewinnung von Material mit Eignung zur Immunisierung. Ein pRMIT-Klon wurde über Nacht bei 37ºC in 10 µg/ml Ampicillin enthaltender L-Brühe inkubiert. Achtzehn Stunden später wurde er für ein Wachstum in der log- Phase verdünnt und mit 10 mMol IPTG 4 h induziert. Die E.- coli-Zubereitung wurde anschließend 10 min bei 5000 g geerntet, worauf die Pellets in 40 ml 10 mMol Tris-HCl eines pH Werts von 8,0, das 2 mMol EDTA enthielt, resuspendiert wurden. Nach Zugabe von Lysozym auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml wurde das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur umlaufengelassen (rotated). Die Lösung wurde unter kontinuierlichem Mischen weitere 10 min bei Raumtemperatur auf 0,2% Triton X-100 gebracht. Nach Zugabe eines gleichen Volumens von 10 mMol Tris-HCl mit 2 mMol EDTA, 50 mMol NaCl und 10 mMol MgCO&sub2; auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml DNAse wurde das Gemisch 15 min bei Raumtemperatur umlaufengelassen (rotated) und anschließend 5 min bei 1500 g zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand 30 min bei 10.000 g zentrifugiert. Dieses Endpellet wurde anschließend auf einer Sephacryl-S-300-Säule in Reihe mit einer Sephacryl-S-400-Säule nach Dispergieren des Pellets in 0,1 Mol Phosphatpuffer eines pH-Werts von 6,0 mit 2% SDS und 10 mMol Dithiothreit (DTT) fraktioniert. Die Fraktionen wurden in Mengen von 50 ml/h eluiert, wobei 6-min-Fraktionen für Tests mit Hilfe einer analytischen SDS-PAGE und eines Immunoblottingvorgehens gesammelt wurden. SDS wurde schließlich auf einer Hydroxyapatitsäule nach Verdünnen mit 0,5 Mol Phosphatpuffer eines pH-Werts von 6,8 und 1 mMol DTT entfernt. Die Reinheit der Fraktionen wurde durch SDS-PAGE und Immunoblotting wie oben beschrieben bestätigt. Immunisierung von Mäusen
Gruppen von sechs BALB/c-Mäuseweibchen wurden mit 10 µg gereinigtem Fusionspolypeptid in vollständigem Freundschern Adjuvans (CFA) immunisiert. Drei Wochen später wurden sie mit derselben Dosis in CFA nachimmunisiert. Sechs Wochen nach der anfänglichen Immunisierung wurden die Mäuse ausbluten gelassen und die Seren isoliert. Diese Seren wurden in einer Verdünnung von 1/1000 getestet und gegen durch PAGE abgetrennte Placentamitochondrien wie oben beschrieben sondiert, mit der Ausnahme, daß affinitätsgereinigtes ¹²&sup5;I-Ziegen- Antimäuse-Ig verwendet wurde. Die Seren wurden ferner in einer Verdünnung von 1/100 durch Immunofluoreszenz untersucht, wobei Bereiche von HEp-2-Zellen und Nierengewebebereiche wie oben beschrieben verwendet wurden1,2,5. Nucleotid- und Aminosäuresequenz
Das cDNA-Insert von pRMIT wurde in M13 subkloniert und die Nucleotidsequenz bestimmt16,17. Der richtige Rahmen und die richtige Orientierung des Inserts wurden durch Doppelstrangsequenzierung eines exprimierenden Klons bestimmt¹&sup7;. Die Sequenz wurde in beiden Orientierungen bestimmt, wobei zum Starten der Reaktionen synthetische Oligonudeotide verwendet wurden¹&sup8;. ELISA
Kurz gesagt wurde das in Carbonatpuffer in einer Menge von 2 µg/ml verdünnte, gereinigte rekombinante Fusionspolypeptid über Nacht bei 4ºC an Immulon-1-Mikrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) absorbiert. Nach Blockieren der nichtspezifischen Stellen mit fötalem Kalbserum (FCS)- Puffer (5% FCS, 1% BSA, 0,3% Gelatine in PBS) wurden die in FCS-Puffer verdünnten PBC-Seren 1 h inkubiert. Die Platten wurden 3mal mit PBS/0,1% Tween gewaschen und anschließend mit einem jeden der folgenden, gegen eine schwere Kette aufweisende Humanisotypen spezifische, monoklonale Mäuseantikörper:SG-11 für IgG1, GOM-1 für IgG2, SJ-33 für IgG3, SK-44 für IgG4, MB-11 für IgM und GA-1 für IGA (Miles Scientific, Naperville, IL) inkubiert. Das Binden der monoklonalen Mäuseantikörper wurde in allen Fällen mit Ausnahme von SJ-33, der mit durch Peroxidase konjugiertem Ziegen-Antimäuse-IgM (Tago, Burlingame, CA) nachgewiesen wurde, mit durch Peroxidase konjugiertem Ziegen-Antimäuse-IgG (Tago, Burlingame, CA) nachgewiesen. Als Farbsubstrat für die Peroxidase wurde ABTS verwendet. Zum Nachweis aller Isotypen von AMA wurde anstelle der isotypspezifischen monoklonalen Antikörper HRP- G-Hulg verwendet.
Menschliche Myelomproteine wurden zur Gewinnung der optimalen Verdünnungen der isotypspezifischen monoklonalen Antikörper verwendet. Vorbestimmte Verdünnungen der Myelomproteine wurden auf Mikrotiterplatten aufgebracht, worauf ein ELISA wie oben beschrieben mit seriellen Verdünnungen der isotypspezifischen monoklonalen Antikörper und anschließend mit den durch Peroxidase konjugierten Reagenzien durchge führt wurde. Die Verdünnungen der isotypspezifischen monoklonalen Antikörper, die ähnliche O.D-Einheiten bei etwa gleichen Serumisotypkonzentrationen lieferten, wurden im ELISA verwendet.
Um die optimalen Serumverdünnungen zum Screening zu erhalten&sub1; wurden mit Hilfe eines ELISAS zuvor (durch Immunofluoreszenz) gescreente, AMA-positive PBC-Seren, Seren progressiver primär-sklerosierender Cholangitis und Normalseren titriert. Es wurde festgestellt, daß eine Serumverdünnung von 1/1000 das höchste Signalrauschverhältnis lieferte. Diese Verdünnung wurde zum Erhalt aller Ergebnisse verwendet. Der Trennpunkt bzw. die Trennlinie für negative Proben wurde mit zwei Standardabweichungen über dem mittleren O.D. der Normalseren festgelegt. B. ERGEBNISSE pRMIT-Gruppen in BTA224
Subklone von pRMIT in JM101 waren sehr immunoreaktiv, wenn sie mit Seren aus PBC-Patienten sondiert wurden, während Vergleichsklone nicht reaktiv waren. Im Gegensatz dazu reagierten die Seren von normalen Freiwilligen weder mit pRMIT in JM101 noch mit Vergleichsklonen. Positive Kolonien aus Gruppen wurden in allen nachfolgenden Studien verwendet. Spezifität des pRMIT-Fusionspolypeptids
Seren in einer Verdünnung von 1/1000 von 25 auf 25 PBC-Patienten reagierten mit dem in pRMIT hergestellten 160-kd-Fusionspolypeptid (Tabelle I und Fig. 1). Diese Bande reagier te auch mit einem Kaninchenantiserum gegen β-Galactosidase (Daten nicht dargestellt). Mehrere Komponenten eines niedrigeren Molekulargewichts entsprechende Banden wurden auch erkannt. Hierzu gehörte eine Bande bei etwa 36 kd, bei der es sich vermutlich um ein Zerfallsprodukt des 160-kd-Moleküls handelte. Diese ein geringeres Molekulargewicht aufweisenden Materialien finden sich nur in Verbindung mit pRMIT und waren gegenüber PBC-Seren immunoreaktiv. Der Reaktivitätstiter für diese 25 Seren lag im Bereich von 1/1000 bis 1/1.000.000. Bei Verwendung derselben 25 Seren wurde das Fusionspolypeptid in Lysaten von durch nicht rekombinantes pBTA224 gebildeten Bakterien oder von mit einem nicht relevanten Insert transformierten und derart induzierten, daß sie ein reichliches Fusionspolypeptid exprimieren, Bakterien nachgewiesen. Keines der Seren von Patienten, die an systemischem Lupus Erythematosus, rheumatoider Arthritis oder chronischer Hepatitis leiden, reagierte mit dem Fusionsprotein in Verdünnungen von 1/100, selbst bei autoradiographischer Belichtung von bis zu 4 Tagen. TABELLE 1: Reaktivität von Humanseren mit dem pRMIT-Fusionspolypeptid
a Die PBC-Seren wurden bei einer Serenverdünnung von 1/1000 untersucht. Andere Gruppen wurden bei einer Serenverdünnung von 1/100 untersucht.
b Ein positiver Blot war einer, bei dem nach einem 12stündigen autoradiographischen Belichten ohne Schwierigkeiten eine Reaktivität mit einer 160-kd-Bande sichtbar war (vgl. Fig. 1). Identifizierung des Fusionspolypeptids
Nach der Absorption an das Lysat von pRMIT zeigte sich, daß den Seren von sieben PBC-Patienten gegenüber dem 70-kd-Antigen reaktive Antikörper fehlten (Tabelle II). Im Gegensatz dazu veränderte eine derartige Absorption die Reaktivität gegenüber dem 45-kd- oder 39-kd-Antigen nicht. Es wurde keine derartige Verarmung festgestellt, wenn die PBC-Seren gegen ein Lysat eines an einen festen Träger gebundenen Vergleichsklons absorbiert wurden. Die Erkenntnis, daß die Reaktion der PBC-Seren mit einem pRMIT-Fusionspolypeptid scheinbar die nachweisbare Anti-70-kd-Reaktivität entfernt, zeigt, daß die cDNA für alle durch die Autoantikörper zu dem 70-kd-Antigen erkannten Determinanten kodiert (Tabelle II, Fig. 2). Affinitätsgereinigter Antikörper
Die eluierten Antikörper der fünf verschiedenen PBC-Seren reagierten mit dem 70-kd-Polypeptid fraktionierter Placentamitochondrien und mit dem 160-kd-Fusionspolypeptid in pRMIT (Fig. 3). Dies zeigt, daß pRMIT für das 70-kd-Antigen kodiert. Die eluierten Antikörper reagierten nicht mit einem Lysat von bakteriellen Proteinen aus einem eine einen Vergleich darstellende Leber-cDNA exprlmierenden Klon. Die eluierten Antikörper lieferten ferner bei Immunofluoreszenz mit entweder HEP-2-Zellen oder Nierengewebebereichen ein charakteristisches Muster einer antimitochondrialen Anfärbung. Immunantwort von Mäusen
BALB/c-Mäuse lieferten nach Injektion des pRMIT-Fusionspolypeptids ein Antikörperansprechen auf das mitochondriale 70- kd-Placentaprotein. Seren von nicht immunisierten Vergleichsmäusen waren nicht reaktiv (Fig. 4). Darüber hinaus lieferten diese Seren sowohl mit HEP-2-Zellen als auch mit Nierengewebebereichen ein typisches Muster einer antimitochondrialen Immunofluoreszenz (Fig. 5). Nucleotid- und Aminosäuresequenz
Das Insert ist 1370 Basenpaare lang und besteht vollständig aus Kodierbereich (Fig. 6). Die 456 Aminosäuren würden für ein Polypeptid einer Länge von etwa 48 kd kodieren. Dies steht im Einklang mit der beobachteten Größe des durch das Klon gebildeten Fusionspolypeptids. Dies ist somit nicht die die vollständige Länge aufweisende Sequenz des Antigens. Die Sequenz enthält 11% Prolin, wobei das Prolin häufig an Stellen gefunden wird, denen kurze Strecken hydrophober Aminosäuren, wie Alanin und Valin, vorausgehen, beispielsweise von den Nudeotiden 54 bis 102. Ein Vergleich der Sequenz des mitochondrialen 70-kd-Autoantigens mit bekannten Proteinen und DNA-Sequenzen lieferte keinerlei nahe homologe Sequenzen. Die Sequenz ist nicht in mitochondrialer DNA vorhanden (Daten nicht dargestellt). Das 70-kd-Protein wird folglich durch nukleare Gene kodiert.
Die Empfindlichkeit des ELISAs wurde mit der der Immunofluoreszenz bei 37 PBC-Patienten verglichen (Fig. 7). Es zeigte sich, daß der ELISA etwa 250mal empfindlicher ist. Der durch ELISA nachgewiesene mittlere Titer betrug 105,4, während der durch Immunofluoreszenz nachgewiesene Titer lediglich 10³ betrug. TABELLE II: Absorption von PBC-Seren an das pRMIT-Fusionspolypeptid Literatur
1. P.A. Berg, R. Klein und J.J. Lindenborn-Fotinos, Hepatology 2:123-131, 1986.
2. I.H. Frazer, I.R. Mackay, S. Jordan-Wittingham und S. Marzuki, J.Immunol. 135:1739-1745, 1985.
3. J.G. Kenna, J. Neuberger, E. Davies, A.L.W.F. Eddleston und R. Williams, J.Immunol. Methods 73:401-413, 1984.
4. M.M. Kaplan, J.V. Gandolfo, E.G. Quaroni, Hepatology 4:727-730, 1984.
5. J.G. Walker, D. Doniach, 1. Roitt und S. Sherlock, Lancet 1:827-831, 1965.
6. J. Lindenborn-Fotinos, H. Baum und P.A. Berg, Hepatology 5:763-769, 1985.
7. I. Mendel-Hartvig, B.D. Nelson, L. Loof und T.J. Totterman, Clin. Exp. Immunol. 62:371-379, 1985.
8. H. Baum und C. Palmer, Mol. Aspects Med. 8:201, 1985.
9. K. Miyachi, S. Watanabe, T. Yamashiki-Hiwatashi und F. Ichida, Am. J. Gastro. 79:704-709, 1984.
10. P.N. Uzoegwu, H. Baum und J. Williamson, Cell Biol. Intl. Reports 8:987-992, 1984.
11. D.J. Kemp, R.L. Coppel, A.F. Cowman, R.B. Samt, G.V. Brown und R.F. Anders, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3787-3791, 1983.
12. A.A. Young und R.W. Davis, Science 222:778, 1983.
13. H.D. Stahl, R. L. Coppel, G . V. Brown, R. Samt, K. Lingelbach, A.F. Cowman, R. F Anders und D.J. Kemp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2456, 1984.
14. J.F. Hare, E. Ching und C. Attardi, Biochemistry 19:2023-2027, 1980.
15. P.E. Crewther und Mitarbeiter, J. Immunol. Meth. 86:257-264, 1986.
16. J. Messing und J. Vieira, Gene 19:269-276, 1982.
17. F. Sanger, Science 214:1205, 1981.
18. J. Vieira und J. Messing, Gene 19:259, 1982.
19. N.D. Smith und J.L. Boyer, Hepatology 6:739, 1986.
20. E.C. Hurt und A.P.G.M. vanLoon, Trends Biochem. Sci. 2:204, 1986.
21. S. Anderson, A.T. Bankier, B.G. Barrell, M.H.L. debruim, A.R. Coulson, J. Drouin, I.C. Eperon, D.P. Nierlich, B.A. Roe, F. Sanger, P.H. Schreier, A.J.H. Smith, R. Staden und I.G. Young., Nature 290:457, 1981.
22. S. Andereson, M.H. de Bruiin, A.A. Coulson, I.C. Eperon, F. Sanger und I.G. Young, J. Mol. Biol. 156:683, 1982.
23. P.A. Berg und H. Baum, Sem. Immunopath. 3:355-373, 1980.
24. R. Klein, J. Lindenborn und P.A. Berg, J. Immunol. Methods 64:227-238, 1983.
25. K. Miyachi, R.C. Gupta, E.R. Dickson und E.M. Tan, Clin. Exp. Immunol. 39:599-606, 1980.
26. L.E. Munoz, H.C. Thomas, P.J. Scheurer, D. Doniach und S. Sherlock, Gut. 136-140, 1981.
27. B.G. Taal, S.W. Schalm, F.W.J. Ten Kate, J. Hermans, R.G. Geertzen und B.E.W. Feltkamp, Hepato-Gastro. 30:178-182, 1984.
28. S. Eriksson und S. Lindgren, Scand J. Gastro. 19:971- 976, 1984.
29. P.A. Berg, K.H. Wiedmann, T. Sayers, G. Kloppel und H. Lindner, Lancet 1:1329, 1980.
30. P. Weber, J. Brenner, E. Stechemesser, R. Klein, U. Weckenmann, G. Kloppel, M. Kirchhof, V. Fintelmann und P.A. Berg, Hepatology 6:553, 1986.
31. V. Modena, C. Marengo, A. Amoroso, F. Rosina, P. Costantini, P. Bellando, R. Coppo und M. Rizzetto, Clin. Exp. Rheumatol. 4:129, 1986.
32. F. Udeenfelt und A. Danielsson, Ann. Clin. Res. 18:148, 1986.
33. H.-P. Schultheiss, P.A. Berg und M. Klingenberg, Clin. Exp. Immunol. 58:596, 1984.
34. S.P. James, J.H. Hoofnagle, W. Strober und E.A. Jones, Ann. Int. Med. 99:500, 1983.
35. T. Namihisa, H. Kuroda und H. Imanan, Jpn. Soc. Gastroenterol. 18:445, 1983.
36. J.J. Van den Oord, J. Fevery, J. De Groote und V.J. Desmet, Liver 4:264, 1984.
37. M. Shimizu, K. Yuh, S. Aoyama, I. Ichihara, H. Watanabe, H. Shilo und M. Okumura, Liver 6:1, 1986.
38. M.I. Avigan, G. Adamson, J.H. Hoofnagle und E.A. Jones, Henatology 6:999, 1986.
39. R.H. Fennell, Pathol. Annu. 16(Pt.2):289, 1981.
40. J. Neuberger, B. Portmann, B.R.D. MacDougall, R.Y. Calne und R. Williams, N. Engl. J. Med. 306:1, 1982.
41. H.H. Handley, M.C. Glassy, P.H. Cleveland und I. Roystan, J. Immunol. Meth. 54:291-298, 1982.
42. R.A. MacDonald, C.S. Hosking und C.L. Jones, J. Immunol. Meth. Im Druck, 1987.
1. DNA-Molekül mit Kodierung für das 70kd Mitochondrien-Au toantigen primärer bihärer Zirrhose (PBC) oder ein antigenisch aktives Fragment desselben, umfassend eine Nucleotidsequenz mit Kodierung für ein Peptid oder Polypeptid, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Teil derselben eine im wesentlichen in Fig. 6 oder Fig. 8 dargestellte Aminosäuresequenz, oder ein Fragment derselben umfaßt.
2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil desselben eine im wesentlichen in Fig. 6 oder Fig. 8 dargestellte Basensequenz oder ein Fragment derselben umfaßt.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil desselben eine im wesentlichen den in Fig. 6 dargestellten Nudeotiden 76 bis 679 entsprechende Basensequenz umfaßt.
4. DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil desselben eine Basensequenz mit Kodierung für die Aminosäuresequenz:
umfaßt.
5. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die operativ an eine Expressionssteuersequenz gebunden ist.
6. Expressionsvektor mit einer Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die operativ an eine Expressionssteuersequenz gebunden ist.
7. Transformierte Wirtzelle, die eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die operativ an eine Expressionssteuersequenz gebunden ist, enthält.
8. Synthetisches Peptid oder Polypeptid mit der Antigenität des gesamten oder eines Teils des 70kd Mitochondrien-Autoantigens primärer bihärer Zirrhose oder eines antigenisch aktiven Fragments desselben, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil desselben eine durch die Nudeotide 76 bis 679 gemäß Fig. 6 kodierte Aminosäuresequenz umfaßt.
9. Synthetisches Peptid oder Polypeptid mit der Antigenität des gesamten oder eines Teils des 70kd Mitochondrien-Autoantigens primärer bihärer Zirrhose oder eines antigenisch aktiven Fragments desselben, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil desselben die Aminosäuresequenz AEIETDKATIGFEVQEEGYL
umfaßt.
10. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Peptids oder Polypeptids mit der Antigenität des gesamten oder eines Teils des 70 kd Mitochondrien-Autoantigens primärer bihärer Zirrhose oder eines antigenisch aktiven Fragments desselben durch Züchten einer transformierten Wirtzelle nach Anspruch 7 unter geeigneten Bedingungen und Isolieren und Reinigen des exprimierten Peptids oder Polypeptids.
11. Verwendung eines synthetischen Peptids oder Polypeptids nach Anspruch 8 oder 9 oder eines antigenisch aktiven Fragments desselben zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Verwendung bei der Behandlung von an primärer bihärer Zirrhose leidenden Patienten.
12. Verwendung eines synthetischen Peptids oder Polypeptids nach Anspruch 8 oder 9 oder eines antigenisch aktiven Fragments desselben als Antigen bei einem Diagnosetest.
13. Diagnosetest zum Nachweis eines Anti-Mitochondrien-Antikörpers in einer Serumprobe durch
(i) Kontaktieren der Serumprobe mit einem synthetischen Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 oder einem antigenisch aktiven Fragment desselben, wobei das synthetische Peptid oder Polypeptid auf einem Träger immobilisiert ist und
(ii) Nachweisen der Anwesenheit eines an das synthetische Peptid oder Polypeptid gebundenen Anti-Mitochondrien- Antikörpers in dem Serum.
14. Diagnosetestkit zum Nachweis eines Anti-Mitochondrien- Antikörpers in einer Serumprobe, umfassend
(i) einen Träger mit einem darauf immobilisierten synthetischen Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9 oder einem antigenisch aktiven Fragment desselben und
(ii) Mittel zum Nachweis des Vorhandenseins eines an das synthetische Peptid oder Polypeptid gebundenen Anti-Mitochondrien-Antikörpers in dem Serum.