DE69617396T2 - T-Zellen beeinflussende Peptide - Google Patents

T-Zellen beeinflussende Peptide

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche T-Zellen, vermutlich durch Einwirkung auf den T-Zellenantigenrezeptor, beeinflussen. Die vorliegende Erfindung betrifft wieters eine Therapie von Entzündungs- und Autoimmunkrankheitsbildern unter Verwendung dieser Peptide. Die Peptide sind speziell für die Behandlung von Erkrankungen nützlich, bei denen T-Zellen beteiligt sind oder rekrutiert werden.
  • T-Zellen sind eine Untergruppe von Zellen, welche zusammen mit andren Immunzellentypen (polymorphonukleare, esinophile, basophile, Mastzellen, B-, NK-Zellen) die zelluläre Komponente des Immunsystems bilden. Unter physiologischen Bedingungen wirken T-Zellen in der Immunüberwachung und in der Eliminierung fremder Antigene. Es gibt jedoch überzeugende Beweise, dass T-Zellen unter pathologischen Bedingungen eine wesentliche Rolle in der Verursachung und Ausbreitung der Krankheit spielen. Bei diesen Krankheiten ist der Zusammenbruch der T-Zellenimmuntoleranz, entweder zentral oder peripher, ein fundamentaler Vorgang in der Verursachung von Autoimmunerkrankungen.
  • Die zentrale Toleranz involviert die Thymusdeletion von selbstreaktiven Zellen (negative Selektion) und positive Selektion von T-Zellen mit geringer Affinität für Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Antigenen (MHC). Im Gegensatz dazu gibt es vier sich gegenseitig nicht ausschließende Hypothesen, die vorgeschlagen worden sind, um die periphere T-Zellentoleranz, welche an der Verhinderung von gewebespezifischen Autoimmunerkrankungen beteiligt sind, zu erklären. Diese umfassen: Anergie (Verlust von co-stimulierenden Signalen, Down-Regulation der für T-Zellenaktiverung maßgeblichen Rezeptoren), Deletion reaktiver T-Zellen, ignorieren des Antigens durch das Immunsystem und Suppression autoreaktiver T-Zellen. Eine einmal induzierte Toleranz dauert nicht notwendigerweise unbeschränkt an. Ein Zusammenbruch jedes einzelnen dieser Mechanismen, kann zu einer Autoimmunerkrankung führen.
  • Autoimmunerkrankungen und andere T-zellenvermittelte Störungen sind durch das Rekrutieren von T-Zellen zu den Entzündungsstellen charakterisiert. T-Zellen an diesen Stellen, gemeinsam mit ihrer Fähigkeit, Zytokine zu produzieren und zu regulieren und die B-Zellenfunktion zu beeinflussen, bilden den Hintergrund der Immunantwort und gestalten das letztliche klinische Ergebnis. Ein Verständnis des Vorgangs der Antigenerkennung und nachfolgenden T-Zellenaktivierung, welche zu T-Zellenproliferation und -differenzierung führen, hat daher sowohl für Gesundheit als auch für Krankheit eine zentrale Stellung. Die entscheidende Komponente der Antigenerkennung an der Oberfläche von T-Zellen ist der komplexe Antigenrezeptor (TCR), welcher eine Multiuntereinheitenstruktur ist, die das Antigen im Kontext mit MHC-kodierten Proteinen an der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen erkennt. Eine Störung dieser komplizierten Struktur-Funktionsbeziehung des TCR, das Zusammenschließen der Antigenerkennung mit T-Zellenaktivierung, könnte ein therapeutisches Werkzeug bereitstellen, um mit Entzündungen und T-zellenvermittelten Störungen umzugehen.
  • Die WO 93117699 offenbart Fragmente der polymorphen Domänen von Klasse I-HLA- Antigendomänen, die zur Modulation der T-Zellenaktivität verwendet werden.
  • Der TCR ist aus mindestens sieben Transmembranproteinen zusammengesetzt. Das Disulfid-verknüpfte (αß-Ti) Heterodimer bildet die klontypische Antigenerkennungseinheit, wogegen die invarianten Ketten von CD3, bestehend aus ε-, γ-, δ- und und η-Ketten, sind für die Kopplung der Ligandenbindung mit Signalstoffwechselwegen verantwortlich, welche in T-Zellenaktivierung und der Entwicklung von zellulären Immunantworten resultiert. Trotz der genetischen Vielfalt der TCR-Ketten sind zwei strukturelle Eigenschaften allen bekannten Untereinheiten gemein. Erstens sind sie Transmembranproteine mit einer einzelnen transmembrandurchdringenden Domäne; vermutlich eine α-Helix. Zweitens haben TCR-Ketten die ungewöhnliche Eigenschaft, eine geladene Aminosäure innerhalb der vorhergesagten Transmembrandomäne zu besitzen. Die invarianten Ketten haben eine einzelne negative Ladung, die zwischen Maus und Mensch konserviert ist, und die varianten Ketten besitzen eine (TCR-β) oder zwei (TCR- α) positive Ladungen. In der nachstehenden Tabelle 1 ist die Transmembransequenz von TCR-α in einer Anzahl von Spezies aufgelistet, was zeigt, dass diese Region phylogenetisch hochkonserviert ist, was auf eine wichtige funktionelle Rolle hinweist. Die Substitutionen zwischen den Spezies sind sehr konservativ.
    • Tabelle 1 Sequenzvergleich der TCR-α-Transmembranregion Spezies Sequenz
  • Maus NLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTL
  • Ratte NLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTL
  • Schaf NLSVTVFRILLLKVVGFNLLMTL
  • Kuh NLSVI VFRILLLKVVGFNLLMTL
  • Mensch NLSVI GFRILLLKVAGFNLLMTL
  • Studien über die Assemblierung der Multikomponenten-TCR von Manolios et al (1990, 1991, 1994) zeigten, dass die stabile Wechselwirkung zwischen TCR-α und CD3-δ und TCR-α und CD3-ε in acht Aminosäuren innerhalb der TCR-α-Transmembrandomäne lokalisiert war (die oben fettgedruckt sind) und dass die geladenen Aminosäuren Arginin und Lysin für diesen Vorgang entscheidend waren. Dieser Befund exemplifiziert die Tatsache, dass Aminosäuren innerhalb der Transmembrandomäne nicht nur zur Verankerung von Proteinen dienen, sondern auch in der Assemblierung von Untereinheitenkomplexen und Protein-Protein-Wechselwirkungen wichtig sind.
  • Das obige System hängt von der Modifizierung von Komplementärstrang-DNA (cDNA) ab, um eine Anzahl von Proteinmutanten hervorzubringen. Chimäre cDNA-Moleküle wurden in COS-Zellen (Fibroblastenlinie) transfiziert, um das erforderliche Protein zu exprimieren. Die Koexpression dieser chimären Proteine diente dazu, die Region der Wechselwirkung zu ermitteln. Um Obiges zu wiederholen, umfasst die Technologie cDNA-Manipulation, metabolische Markierung, Immunpräzipitation und Gelelektrophorese.
  • Transmembrandomänen haben eine geringe Größe, und Proteine, die diese Region transversieren, besitzen gewöhnlich zwangsweise eine α-Helix-Konfiguration. Diese biophysikalischen Eigenschaften, gemeinsam mit der Fähigkeit zur Konstruktion von Protein-Protein-Wechselwirkungen über geladene Transmembrangruppen ließen den Erfinder auf einen möglichen neuen Ansatz schließen, in die TCR-Funktion einzugreifen und sie potentiell zu stören.
  • Der Erfinder hat eine Reihe von Peptiden entwickelt, die Inhibitoren der Funktion dieses entscheidenden Rezeptors sind, wahrscheinlich durch Eingriff in die Assemblierung. Der Erfinder hat auch herausgefunden, dass diese Peptide eine Wirkung auf T-Zellenvermittelte Entzündungen haben und dass die carboxyterminale Konjugation die Funktion dieser Peptide nicht beeinflusste. Dies wird am Beispiel der Kopplung von Peptid an ein Lipidtransportsystem mit gesteigerter Wirkung und ohne Verlust der Funktion gezeigt. Zusätzlich hat der Erfinder auch gefunden, dass die Peptide für sich die Fähigkeit hatten, sich intrazellulär zu verlagern, was es zu einem potentiell effektiven Wirkstoffzufuhrsystem macht. Die wirksame klinische Manifestation des verabreichten Peptids wäre eine Herabsetzung der Entzündung, wie z. B. durch Herabsetzung von Arthritis in einem Adjuvans-Modell von Arthritis gezeigt werden kann.
  • Demgemäß besteht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt in einem Peptid der folgenden Formel:
  • A-B-C-D-E, worin:
  • A fehlt oder 1 oder 2 hydrophobe Aminosäure(n) ist;
  • B eine positiv geladene Aminosäure ist;
  • C ein Peptid, bestehend aus 3 bis 5 Aminosäuren ist;
  • D eine positiv geladene Aminosäure ist; und
  • E fehlt oder aus bis zu 8 hydrophoben Aminosäuren besteht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht C aus 3 oder 4 hydrophoben Aminosäuren.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht A aus 2 hydrophoben Aminosäuren und E aus 1 bis 3, vorzugsweise 1, hydrophoben Aminosäure(n).
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist B Arginin und D Lysin oder ist B Lysin und D Arginin.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val, Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val, Gly-Phe- Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val oder Phe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val.
  • In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einer therapeutischen Zusammensetzung, umfassend das Peptid des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung und ein therapeutisch annehmbaren Träger.
  • In einem dritten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung eines an einer Störung leidenden Patienten, an welcher T-Zellen beteiligt sind oder rekrutiert werden, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Zusammensetzung des zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfasst.
  • Die therapeutische Zusammensetzung kann auf jede beliebige geeignete Weise verabreicht werden, die von fachkundigen Personen als geeignet erkannt wird. Solche Wege umfassen orale, transdermale, intranasale, parenterale, intraartikuläre und intraokulare Wege.
  • In einem vierten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem Verfahren der Zufuhr eines chemischen Bestandteils zu einer Zelle, wobei die Zelle dem, vorzugsweise an das carboxyterminale Ende des Peptids konjugierten, chemischen Bestandteil ausgesetzt wird, wie in den Ansprüchen 1 bis 10 beansprucht wird.
  • Eine nichterschöpfende Liste von Störungen, bei denen die T-Zellen involviert sind bzw. rekrutiert werden, umfasst:
  • Allergische Veranlagungen, z. B. Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ, Kontaktdermatitis;
  • Autoimmunerkrankungen, z. B. systemischer Lupus erythematodes, Rheumatoidarthritis, multiple Sklerose, Diabetes, Guillain-Barre-Syndrom, Hashimoto-Syndrom, perniziöse Anämie;
  • gastroenterologische Zustände, z. B. Darmentzündungenn, Morbus Crohn, primäre biliäre Leberzirrhose, chronisch aktive Hepatitis;
  • Hautprobleme, z. B. Psoriasis, Pemphigus vulgaris;
  • Infektiöse Krankheiten, z. B. AIDS-Virus, Herpes Simplex/Zoster;
  • Atemwegserkrankungen, z. B. allergische Alveolitis, kardiovaskuläre Probleme, z. B. Autoimmun-Pericarditis;
  • Organtransplantation;
  • Entzündliche Zustände, z. B. Myositis, Spondylarthritis.
  • Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Patient" sowohl humanoide als nichthumanoide Tiere umfassen.
  • Wie aus der obigen Diskussion zu erkennen ist, basiert das Peptid der vorliegenden Erfindung auf einem Teil der Transmembrandomäne von TCR-α. Die vollständige murine Sequenz dieses Teils ist NLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS, wogegen die entsprechende humane Sequenz NLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTL lautet. In den letzten 15 Aminosäuren der TCR-α-Kette distal zur Sequenz, auf der das Peptid der vorliegenden Erfindung basiert (fettgedruckt gezeigt), besteht vollständige Sequenzhomologie über eine Reihe von Spezies. Peptide, die diese zusätzlichen 15 Reste enthalten, könnten eine dem Peptid der vorliegenden Erfindung ähnliche Aktivität enthalten. Die essentielle Eigenschaft ist, dass die Peptide zwei positiv geladene Aminosäuren enthalten, die durch 3 bis 5 hydrophobe Aminosäuren voneinander getrennt sind. Wie aus den folgenden Beispielen deutlich wird, kann das Peptid der vorliegenden Erfindung weiters carboxyterminal ohne Aktivitätsverlust modifiziert werden. Demgemäß ist beabsichtigt, dass der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung Peptide umfasst, die zusätzlich zur "Kern"-Sequenz des Peptides der vorliegenden Erfindung Aminosäuren beinhalten, und die den T-Zellen-Antigenrezeptor beeinflussen.
  • Wie in den folgenden Beispielen demonstriert wird, ist das Peptid der vorliegenden Erfindung in der Lage, in Zellen einzudringen. Demgemäß wird ins Auge gefasst, dass - abgesehen von dessen anderen Verwendungen - das Peptid der vorliegenden Erfindung als "Träger" verwendet werden könnte, um andere therapeutische Agenzien an Zellen heranzuführen. Dies könnte z. B. erreicht werden, indem das in die Zellen zu transportierende Therapeutikum an das Peptid der vorliegenden Erfindung konjugiert wird.
  • Wie einem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres verständlich sein wird, sind hydrophobe Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr und Met, während Lys, Arg und His positiv geladene Aminosäuren sind.
  • Um den Charakter der vorliegenden Erfindung klarer verständlich zu machen, werden nun deren bevorzugte Formen unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
    • Beispiel 1 Synthese des Peptids
  • Der erste Schritt war die Synthese eines kurzen hydrophoben Peptids, gitsprechend der vorbestimmten Assemblierungssequenz. Die Aminosäuresequenz des kompetitiven Peptids ist NH&sub2;-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH, hierin in der Folge als "Kernpeptid" bezeichnet. Anschließend wurden eine Anzahl anderer, in Tabelle 2 aufgelisteter Peptide synthetisiert (> 95% Reinheit, gemäß Auspep Australia, Melbourne, Australien) und auf ihre Wirkung auf die T-Zellenfunktion und Entzündung untersucht.
    • Tabelle 2 Peptide und ihre Sequenzen Peptid Sequenz
  • Kernpeptid Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH
  • A Met-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-O H
  • B Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Gly-Val-OH
  • C Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val-OH
  • D Leu-Asp-Ile-Leu-Leu-Leu-Glu-Val-OH
  • E Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Ile-Lys-Val-OH
  • F Leu-Arg-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OH
    • Beispiel 2 Löslichkeit
  • Das Kernpeptid und die weiteren oben aufgelisteten Peptide waren hydrophob und in Wasser unlöslich. Eine Vielzahl von Lösungsmitteln und Trägern wurde getestet. Diese umfassten Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Trifluoressigsäure (TFA), Squalan-Öl (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan) und Lipidkonjugation durch Hinzufügung von Palmitinsäure an das Kernpeptid via TRIS-Konjugation (Whittaker R. G., Bender V. J., 1991) um die Löslichkeit zu erhöhen. Das bevorzugte Lösungsmittel war DMSO, und die für Zellkulturen verwendete Endkonzentration öag bei 0,1%-0,2%. Höhere DMSO-Konzentrationen als 1% waren für die Zellen toxisch. Stammlösungen von Peptid und Lipopeptidkonjugaten wurden in DMSO gelöst und in einer Verdünnung von 1/1000 eingesetzt.
  • Der Zusatz von Peptid/Lipopeptid in DMSO zu wässrigen Lösungen führte zu "Fett"- oder "Kristall"-Kügelchen, die sich am Boden der Gewebekulturflaschen absetzten und schlecht lösten. Diese Kügelchen konnten mit Phasenkontrastmikroskopie gesehen werden, waren aber im Falle von Lipidkonjugaten weniger offensichtlich.
  • Kernpeptid, welches C¹&sup4;-Glycin enthielt (C¹&sup4;-Peptid), wurde von Auspep Australia synthetisiert und zur Untersuchung der Löslichkeit verwendet. C¹&sup4;-Peptid, gelöst/suspendiert in DMSO, wurde in einer Endkonzentration von 100 mM zu T-Zellenmedium (RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0,3% Mercaptoethanol: TCM) zugesetzt und geschüttelt. Das Medium wurde zentrifugiert und der Überstand entweder durch ein 0,2 uM-Filter filtriert oder ungetrennt belassen. Die Gesamtradioaktivität im nichtgetrennten Medium lag bei 20000 cpm, 1000 cpm nach der Zentrifugation des Mediums und 500 cpm nach der Filtration des Mediums. Diese Experimente heben den unlöslichen Charakter des Peptids in vitro heraus, und weisen darauf hin, dass ungefähr 5% in Lösung gehen.
    • Beispiel 3 Eintritt des Peptids in Zellen
  • Um zu untersuchen, ob Peptide in Zellen eindringen, wurde das C¹&sup4;-Peptid in einen Kolben mit 5 · 10&sup6; 2B4.11-Zellen (T-Zellenhybridom, spezifisch für Cytochrom C) in einer Endkonzentration von 100 mM und 0,1% DMSO zugegeben und über Nacht inkubiert. Die anhaftenden Zellen wurden vier Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Kolben gewaschen, mit Triton-enthaltendem Puffer solubilisiert und die Radioaktivität gezählt. Die Menge an Radioaktivität im überstand betrug 70000 cpm, und 5000 cpm in den solubilisierten Zellen..
  • In einer Variante des obigen Experiments wurden 2B4.11-Zellen (7,5 · 10&sup4;) in Petrischalen gezüchtet, die 2 ml TCM enthielten, und es wurde ein "Transwell" mit 0,4 mM Membran in die Petrischale gegeben. C¹&sup4;-Peptid wurde in einer Endkonzentration von 100 mM und 0,1% DMSO zum "Transwell" zugegeben und nach 24 Stunden und 48 Stunden Inkubationszeit wurden die Counts an beiden Seiten des Filters und in den Zellen bestimmt. Ungefähr 85% der Radioaktivität wurden im "Transwell", 8% im Petrischalenmedium und 7% innerhalb der Zellen zurückgehalten. Die obigen Experimente demonstrierten, dass das Peptid in der Lage war, in die Zellen einzudringen. In Anbetracht der niedrigen Löslichkeit des Peptids (5% bis 10%) drang das gesamte in Lösung verfügbare Peptid in die Zellen ein (7%).
    • Beispiel 4 Intrazelluläre Lokalisation von Fluorescein-markiertem Peptid in T-Zellen
  • Experimente wiesen darauf hin, dass der geringe Prozentsatz des Peptids, welches in Lösung geht, in die Zellen eindringen oder von den Zellen aufgenommen werden kann. Um dies zu bestätigen, wurde kovalent mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) verbundenes Peptid den T-Zellen zugesetzt, um die intrazelluläre Lokalisierung durch Sichtbarmachung mittels konfokaler oder konventioneller UV-Mikroskopie bestimmt.
  • Fluoresceinmarkiertes Peptid wurde wie folgt hergestellt: 10,25 mg des Kernpeptids wurden in 0,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst. 2 mM FITC in 0,5 ml DMF wurden tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Der pH wurde mit N-Methyl- N,N-diisopropylamin auf 9 eingestellt, und die Reaktion wurde für 1 Stunde fortgesetzt. Semipräparative HPLC wurde dann verwendet, um FITC-Peptid vom freien FITC zu trennen, unter Verwendung einer C4-Säule (6 ml/min. Puffer A, 0,1% TFA; Puffer B, 80% Acetonitril, 20% Wasser; 0,1% TFA; linearer Gradient von 40%-100% B).
  • Fraktionen wurden mittels analytischer HPLC detektiert und die reines Fluorescein-markiertes Kernpeptid (FITC-Peptid) enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.
  • Zwei Kolben kultivierter 2B4.11-Zellen (5 · 10&sup6;) wurden zentrifugiert und in PBS, welches Calcium und Magnesium enthielt, resuspendiert. In einen Kolben wurde in DMSO gelöstes FITC in einer Endkonzentration von 10 mM, und in den anderen Kolben 10 mM FITC-Peptid zugegeben. Die Endkonzentration von DMSO in beiden Kolben war 0,1%, eine Konzentration, die, wie vorher gezeigt, keinen Effekt auf T-Zellen hatte. Zellen wurden für 30 min bei 37ºC inkubiert und dann unter dem konfokalen Mikroskop untersucht.
  • Die Beobachtungen können wie folgt zusammengefasst werden: (i) FITC und FITC-Peptid drangen in die Zellen ein; (ii) freies FITC gab hellere Fluoreszenz als das FITC-Peptid in den Zellen; (iii) das intrazelluläre Färbungsmuster zeigte keinen Unterschied zwischen freiem FITC und FITC-Peptid. Nukleus- und besonders helle Nukleolus- Färbung wurde beobachtet; (iv) Konjugation von Peptid mit FITC verhinderte nicht das Eindringen von Peptid in Zellen; (v) es trat über einen 5-Stunden-Zeitraum kein "Leaching" des FITC-Peptids aus den Zellen auf. Diese Experimente demonstrieren, dass das FITC-Peptid von den Zellen aufgenommen und intrazellulär lokalisiert werden konnte. In Verbindung mit den vorher beschriebenen Experimenten, die die intrazelluläre Aufnahme des C¹&sup4;-Peptids zeigten, ist es evident, dass es der inhärente Charakter der Peptidsequenz und nicht der ihrer Konjugate (FITC, C¹&sup4;) ist, der die zelluläre Aufnahme erlaubt.
    • Beispiel 5 Tris-Fett-Konjugation am carboxylterminalen Ende des Kernpeptids
  • Der Effekt der Carboxylkonjugation des Kernpeptids, wie am Beispiel Lipidkonjugation veranschaulicht, auf die Fähigkeit des Peptids, die Funktion dieses entscheidenden Rezeptors kompetitiv zu inhibieren, wurde untersucht. Die wirksame klinische Manifestation des verabreichten Lipopeptids wäre eine Abnahme der Entzündung, wie z. B. durch eine dem Peptid entsprechende Abnahme von Arthritis in einem Adjuvans- Arthritismodell gezeigt werden kann. Zusätzlich zur Lipokonjugation von Kernpeptid wurde eine Anzahl anderer Lipopeptide synthetisiert und als Vergleiche in nachfolgenden Experimenten verwendet. Die Lipopeptide wurden gemäß den von Whittaker, R. G., Hayes, P. J., und Bender V. J (1993) und im australischen Patent Nr. 649242 dargelegten Verfahren synthetisiert. Die Offenbarung dieser Literaturstellen ist hierin durch Querverweis aufgenommen.
  • Herstellung von fluoresceinmarkierten Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Gly-Tris-Mono- und -Tripalmitaten: Zu einer Lösung jedes dieser Lipopeptide (15 und 6 mg) mit entfernten Schutzgruppen in DCM (1 ml) wurde unter Rühren eine Lösung von FITC (4 mg 10 umol) in DMF (500.M) zugegeben. Der scheinbare pH der Reaktion wurde durch Zusatz von Triethylamin (TEA) bei 9,0 gehalten. Die Fluorescein-markierten Mono- und Tripalmitoylderivate des Peptids wurden mittels semipräparativer HPLC (C4-Säule, System B) gereinigt. Die gereinigten Verbindungen wurden zur Trockene eingedampft und aus tert-Butylalkohol lyophilisiert, und lieferten Fluorescein-markiertes Peptid- Monopalmitat (RtB, 7,83) und -Tripalmitat (RtB, 9,85), die wie unten beschrieben getestet wurden.
  • DC der Fluorescein-markierten Lipopeptide (DCM : MeOH = 95 : 5) zeigten das Fehlen von freiem FITC und von freiem Gly-Tris-Monopalmitat und Gly-Tris-Tripalmitat (für die Lipopeptidsynthese verwendet) (durch Ninhydrin-Färbung).
  • Festphasen Peptidsynthese: Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val (Kernpeptid) und dessen vollständig geschützte Form Boc-Gly-Leu-Arg(PMC)-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Val- OH (und das C14-markierte Peptid) wurden von Auspep Pty Ltd. bezogen. Beide wurden mittels FMOC-Chemie im manuellen Modus synthetisiert.
  • Ebenso ist dem Fachkundigen ohne weiters einsichtig, dass es eine Anzahl allgemein bekannter Linker gibt, die zur Verknüpfung von Verbindungen (wie z. B. Peptiden) mit Carboxylgruppen an eine Aminogruppe verwendet werden können. Diese umfassen:
  • a) Linker mit einer Aminogruppe hin zur Verbindung und einer Carboxylgruppe zum Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), wie z. B. Aminosäuren oder Antibiotika.
  • b) Linker mit einer Aminogruppe hin zur Verbindung und einer Sulfonsäuregruppe zum Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), wie z. B. 2-Aminoethansulfonsäure (Taurin).
  • c) Linker mit einer Hydroxylgruppe hin zur Verbindung und einer Carboxylgruppe zum Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), wie z. B. Glykolsäure, Milchsäure, usw.
  • d) Linker mit einer Hydroxylgruppe hin zur Verbindung und einer Sulfonsäuregruppe zum Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), wie z. B. 2-Hydroxyethansulfonsäure (Isethonsäure).
  • e) Linker mit einer Hydroxylgruppe hin zur Verbindung und einer reaktiven Halogenidgruppe zum Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), wie z. B. 2-Chlorethanol.
  • f) Andere Beispiele potentiell geeigneter Linker zwischen einer Verbindung mit einer reaktiven Carboxylgruppe und der Aminogruppe von Tris (oder Aminosäure, falls vorhanden), umfassen Verbindungsklassen, die durch die Beispiele p-Hydroxybenzaldehyd, 2-Chloressigsäure, 1,2-Dibromethan und Ethylenoxid exemplifiziert werden.
  • Linker könnten auch Disulfidgruppen enthalten, die die intrazelluläre Freisetzung modifizierter Peptide herabsetzen würden.
    • Beispiel 6 Lokalisierung von FITC-konjugierten Lipopeptiden in COS-Zellen
  • Die Fähigkeit von FITC-konjugierten Lipopeptiden in Nicht-T-Zellen (COS-Zellenfibroblasten) einzudringen, wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.
    • Materialien:
  • Konzentration der Stammlösung in DMSO: Kernpeptid.Tris.Monopalmitat.FITC (MM 1862) 10 mM; Kernpeptid.Tris.Dipalmitat.FITC (MM 2334) 10 mM; Kernpeptid.Tris. Tripalmitat.FITC (MM 2806) 10 mM; Glycin.Tris.Monopalmitat.FITC (MM 805) 10 mM; Glycin.Tris.Tripalmitat.FITC (MM 1286) 10 mM; FITC, (MM 390) 6,4 mM.
    • Verfahren:
  • COS-Zellen wurden auf Objektträgern bis 80% Zusammenfluss gezüchtet, 2 Mal mit PBS gewaschen und für 15 min oder 2 Stunden mit FITC-konjugierten Lipopeptiden inkubiert. Die Endkonzentration der Lipopeptide war 10 mM, und 6,4 mM für FITC, für jeden Zeitpunkt. Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in PBS/Glycerin eingebettet und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.
    • Ergebnisse:
  • Die Experimente wiesen darauf hin, dass Fluorescein-konjugierte Lipopeptide Zellmembranen durchwandern und sich innerhalb des zellulären Cytoplasmas lokalisieren können und sogar in das endoplasmatische Retikulum (ER), wo die Proteinsynthese0 stattfindet, vordringen können. Das Ausmaß der zellulären Penetration wurde durch den an das Peptid geknüpften Lipidteil beeinflusst. Von den Lipopeptiden hatte Monopalmitat die bessere Fähigkeit, Fibroblasten und T-Zellen, soweit sie untersucht wurden (siehe unten), zu infiltrieren. Das ER ist die beste Stelle, um die Assemblierung zu untersuchen und zu beeinflussen. Wenn einmal alle Ketten assembliert und an die Zelloberfläche transportiert sind, könnte es wesentlich schwieriger sein, den Rezeptor an der Zelloberflächenmembran zu stören. Peptide gezielt an das ER zu führen, ist ideal, um den TCR-Komplex zu stören.
    • Beispiel 7 Lokalisierung von FITC-konjugierten Lipopeptiden in T-Zellen
  • Die Fähigkeit von FITC-konjugierten Lipopeptiden, in T-Zellen einzudringen wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.
    • Materialien:
  • Lipopeptide wie oben. 2B4.11 T-Zellenhybridomzellinie.
    • Verfahren:
  • 2B4.11 T-Zellen wurden in TCM gezüchtet und in einer Konzentration von 8 · 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert. Lebensfähigkeit > 95% mittels Tryptophanblau. Ein ml Zellen wurden in Polypropylenröhrchen gefüllt und 2 Mal mit PBS gewaschen. Zellen wurden in PBS resuspendiert und mit einem Mikroliter Stammlösung FITC-konjugierter Lipopeptide versetzt. Zellen wurden mit PBS gewaschen, in PBS/Glycerin eingebettet und mittels konfokaler Mikroskopie betrachtet.
    • Ergebnisse:
  • Ähnlich denen mit COS-Zellen (siehe oben). Die Ergebnisse zeigten, dass die Lipopeptide in der Lage waren, in T-Zellen einzudringen. Die Lipokonjugation des Peptids verhindert nicht das Eindringen der Peptide in Zellen und hat das Potential zur Verwendung als Trägervehikel zur Steigerung der Löslichkeit.
    • Beispiel 8 Effekt von Peptiden und Lipopeptiden auf die TCR-Assemblierung und Zelloberflächenexpression auf T-Zellen mittels Durchflusszytometrie Materialien:
  • Das T-Zellenhybridom 2B4.11, welches einen vollständigen TCR an der Zelloberfläche exprimiert wurde als positiver Vergleich verwendet, um den Einfluss von Peptiden auf die TCR-Expression zu bewerten. Die Zellen wurden in TCM gezüchtet. Die β-defiziente Variante 21.2.2 und die β-und -defiziente Zellinie 3.12.29, welche durch wiederholtes Subklonieren von 2B4.11 Zellen (Sussman et al., 1988) gewonnen wurde, und bei denen TCR-Expression fehlt, wurden als negative Vergleiche verwendet.
  • Die getesteten Peptide umfassten das Kernpeptid, Lipopeptide und ein Peptid aus Tumornekrosefaktor-Rezeptor, genannt 558 (verwendet als negativer Vergleich). Die Endkonzentration jeder für die Inkubation verwendeten Substanz betrug 10 mM.
    • Antikörper:
  • Die folgenden Antikörper wurden für Immunpräzipitations- und Durchflusszytometrie- Analysen verwendet: Maus-IgG2a-monoklonaler Antikörper (MAb) gegen die TCR-α-Kette des T-Zellenhybridoms 2B4 (A2B4-2, Samelson et al., 1983), MAb gegen die 2B4.11 TCR-β-Kette (KJ25), Hamster-IgG-Anti-CD3-ε MAb (145-2C11 [2C11], Leo et al., 1987), Kaninchen-Anti-CD3-ε polyklonales Antiserum gegen gereinigtes Maus-CD3-ε (127, Minami et al., 1987), Anti-CD3-δ polyklonaler Antikörper (R9) aus Ziege, immunisiert mit COOH-terminalem Peptid der Maus-CD3-δ-Kette (Samelson et al., 1986).
    • Verfahren:
  • FASC-Analysen: 1 · 10&sup6; Zellen (2B4.11, 21.2.2) wurden mit einer Anzahl gesonderter Peptide und Lipopeptide in einer Endkonzentration von 10 mM über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und mit 50 ml Primärantikörper (A2B4 oder 2C11) für 30 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden 2 Mal mit PBS und 0,1% BSA gewaschen und mit FITC-markiertem Sekundärantikörper für weitere 30 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden vor der Analyse in einem Becton-Dickson FACS-Analysator oder Becton-Dickson FACS-Scan zwei weitere Male mit PBS und 0,1% BSA gewaschen.
    • Ergebnisse:
  • Die Expression von TCR an mit Kernpeptid, Vergleichspeptid oder Lipopeptiden behandelten 2B4.11 Zellen veränderte nicht die Zelloberflächenexpression des Rezeptors. Diese Experimente wurden bei höheren Kernpeptidkonzentrationen (100 mM) und längeren Inkubationszeiten im Bereich von 1-10 Tagen wiederholt, wobei die Ergebnisse dieselben waren und keine Veränderung der T-Zellen-Oberflächenantigenrezeptor- Expression zeigten.
  • Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um den in vitro-Effekt von Peptiden/Lipopeptiden auf die T-Zellenfunktion zu bewerten.
    • Beispiel 9 Antigen-Präsentations-Assay I
  • Ein Antigen-Präsentations-Assay (unter beschrieben) untersuchte die Fähigkeit einer Anzahl von Peptiden, die der Antigenerkennung folgenden T-Zellenaktivierung zu inhibieren, und zwar durch Messung von Interleukin-2 (IL-2), dem Produkt der T-Zellenaktivierung.
    • Materialien:
  • Die folgenden Zellinien wurden verwendet: 2B4.11, ein Zellhybridom, welches einen vollständigen Antigenrezeptor an der Zelloberfläche exprimiert (Samelson et al., 1983) und nach der Antigenerkennung IL-2 produziert (Cytochrom C). Interleukin-2-abhängige Zellinie (CTLL) für konventionellen biologischen IL-2-Assay; und die B-Zellen- Hybridomzellinie LK 35.2 (LK, I-Ek-tragend; Kappler et al., 1982), welche als die antigenpräsentierende Zelle fungiert. Die Hybridom wurden in TCM gezüchtet. Cytochrom C (Sigma, USA) wurde dem Medium in einer Endkonzentration von 15 mM im Antigen-präsentierenden Assay zugesetzt.
  • Die untersuchten Peptide umfassten: Kernpeptid, sieben andere Vergleichspeptide aus einer Vielzahl von Quellen mit einer Länge äquivalent zum Kernpeptid und den Peptiden A, B, C, D, E und F. Die Endkonzentration der Peptide im Antigen-Präsentations- Assay wurde auf mehreren Ebenen im Bereich von 10 mM bis 100 mM untersucht.
    • Verfahren:
  • Für die T-Zellenantigenstimulierung wurden 2 · 10&sup4; LK35.2-Zellen mit 50 mM Tauben- Cytochom C, gelöst in PBS, und 2 · 10&sup4; 2B4.11 T-Zellen für 16 Stunden co-kultiviert. Der Assay wurde dreifach durchgeführt. Überstände wurden gewonnen und der IL-2- Gehalt mittels CTLL-Proliferation bestimmt. Die Inkorporation von ³H-Thymidin ist direkt proportional der im Überstand enthaltenen Menge von IL-2. Die Fähigkeit unterschiedlicher Peptide, die IL-2-Produktion zu inhibieren. wurde untersucht. Zusätzlich zur Messung der ³H-Thymidin-Inkorporation wurden auch IL-2-Messungen (IU/ml) durchgeführt.
    • Ergebnisse:
  • In Assays, wo entweder Cytochrom C (Antigen) oder LK-Zellen (antigenpräsentierende Zellen) fehlten, trat keine IL-2-Produktion auf. Das Fehlen von T-Zellenaktivierung unter solchen Bedingungen wies darauf hin, dass in den Lösungen kein Lipopolysaccharid (LPS) oder Endotoxin vorhanden war, welche die T-Zellen unspezifisch stimulieren hätten können. Die Kombination aller drei Bestandteile des Assays in den oben gezeigten Konzentrationen führte zur Produktion von IL-2, wie gemessen mittels ³H- Thymidin-Inkorporation durch CTLL-Zellen (22000 cpm). Wenn Kernpeptid oder andere Analoga dem Assay-System zugesetzt wurde, variierte die Menge an produziertem IL-2 entsprechend. Alle bei 10 mM getesteten Peptide hatten keine Wirkung auf die IL-2- Produktion. Die beste Wirkung wurde mit einer Kernpeptidkonzentration von 100 mM und Peptid C-Konzentration von 100 mM beobachtet, die im Vergleich zum Vergleich zu einer 15%-30%igen Reduktion der IL-2-Produktion führte. Dies war bei mindestens drei verschiedenen Gelegenheiten reproduzierbar. Die Peptide A, B, D und F hatten eine variable und geringe Wirkung auf die T-Zellenaktivierung. Die sieben Vergleichspeptide äquivalenter Länge, aber ohne Sequenzhomologie zum Peptid hatten keine Wirkung auf die IL-2-Produktion.
  • Die Vorinkubation des Kernpeptids und anderer Peptide in TCM bei 37ºC vor dem Zusatz zum Antigen-Präsentations-Assay verbesserte Löslichkeit und Aktivität, was sich in einem zusätzlichen Anstieg über der mit frisch hergestelltem Peptid beobachteten Grundlinienaktivität widerspiegelte.
    • Beispiel 10 Antigen-Präsentations-Assay II
  • Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um den in vitro-Einfluss von Lipopeptiden auf die T-Zellenfunktion zu bewerten.
    • Materialien:
  • Die untersuchten Lipopeptide umfassen: Kernpeptid-Tris-Monopalmitat (100 mM und 0,2% DMSO) und Kernpeptid-Tris-Tripalmitat (100 mM und 0,2% DMSO). Die Endkonzentration der beiden Lipopeptide im Antigenstimulations-Assay ist in eckigen Klammern angegeben.
    • Verfahren:
  • Wie in Beispiel 9 beschrieben.
    • Ergebnisse:
  • Anfangs bestand, wenn das Kernpeptid-Tripalmitat (100 mM und 0,2% DMSO) zugesetzt wurde, eine Reduktion der T-Zellenaktivität von 75% (höchster Count 5190 cpm, im Vergleich 22000 cpm im Vergleich). Der Zusatz des Kernpeptid-Tris-Monopalmitats (100 mM und 0,2% DMSO) hatte mit nur 137 gemessenen cpm (ähnlich dem Hintergrund) eine ausgeprägte Wirkung auf die IL-2-Produktion. Die im Testsystem verwendeten Konzentrationen von 0,1% DMSO und 0,2% DMSO wurden untersucht und zeigten keinen Einfluss auf die IL-2-Produktion. Nachfolgende Experimente haben diese Ergebnisse bestätigt und zeigen eine im Vergleich zur Kontrolle 86-92%ige IL-2- Reduktion. Palmitinsäure alleine (100 mM), welche für die Konjugation des Peptids verwendet wurde, beeinflusste nicht die IL-2-Produktion wenn es dem Antigen- Präsentations-Assay zugesetzt wurde.
  • Die folgenden Experimente untersuchten die Fähigkeit des Kernpeptids, nach der Verabreichung im Tier zu zirkulieren und die Wirkung auf experimentell induzierte Entzündungen.
    • Beispiel 11 Verteilung des C14-Kernpeptids
  • Um die Verteilung von subkutan injiziertem Peptid in Mäusen zu untersuchen, wurde C14-Kernpeptid (5 mg/Maus) in 150 Mikroliter Squalan-Öl gelöst und an der Schwanzwurzel von Balb/c-Mäusen injiziert. Nach 24 Stunden wurden die Counts der zerbreiten Organe gemessen. Verteilung von Peptid wurde beobachtet in Thymus (5%), Milz (7%), Blut (3%), und ein großer Anteil in Lymphknoten (28%), Niere (30%) und Leber (28%).
  • Die Experimente wurden ausgedehnt, um die Fähigkeit des Kernpeptids, Krankheiten in Tiermodellen von Entzündungen zu verhindern, zu untersuchen. Drei in vivo-experimentelle Modelle, Adjuvans-induzierte Arthritis in Ratten, Cyclophosphamid-induzierte Diabetes in NOD-Mäusen und experimentelle allergische Neuritis in Ratten wurden verwendet. In diesen zwei Spezies umfassenden Modellen, war das Peptid in der Lage, den Grad der Entzündung zu beeinflussen.
    • Beispiel 12(a)Adjuvans-induzierte Arthritis in Ratten
  • Das Ratten-Adujvans-Arthritismodell ist ein klassisches Modell von Entzündungen, welches über die letzten 30 Jahre in vielen Laboratorien sehr häufig verwendet worden ist, um den Krankheitsfortschritt und die Effekte von potentiell neuen entzündungshemmenden Medikamenten zu untersuchen (Pearson et al., 1961; Cremer et al., 1990; Holmdahl and Kvick, 1962; Cannon et el., 1993). Dieses Modell ist während der letzten 10 Jahre auch von Wissenschaftern des Royal North Shore Hospital häufig angewandt worden, und es sind Verfahren für das Studium dieses Modells der Entzündung etabliert worden. Alle Verfahren an Tieren wurden unter Halothan/Sauerstoff/Distickstoffmonoxid-Anästhesie (3 Vol.-% Halothan in 1 Liter/min O&sub2; und 2 Liter/min N&sub2;O). Den Ratten wurde intradermal an der Schwanzwurzel eine minimale Adjuvansdosis (1 mg hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis [MTB] in 100 ml Squalan) einmal und nur einmal injiziert. Die Methode zur Co-Verabreichung von Testproben mit MTB wurde zuerst von Whitehouse et al., 1990, beschrieben. In regelmäßigen Intervallen vom 0-28 Tagen wurden die Tiere gewogen und ihre arthritischer Zustand durch Messung der größten Schwanzdicke und Hinterpfotendicke (mit einem Mikrometerschraubenmessgerät) beurteilt. Die Ratten wurden nach der anfänglichen Schwanzinjektion in Kästen gehalten und hatten uneingeschränkten Zugang zu Wasser und Pellet-Futter. Am Tag 29 wurden die Tiere getötet.
    • Materialien:
  • Das erste Experiment bestand aus 12 Ratten mit 190-210 Gramm Gewicht, die vom Perth Animal Resource Center (ARC) bezogen und im Gore Hill Animal House gehalten wurden. Verwendet wurden Kernpeptid (30 mg), suspendiert in Adjuvans (0,6 ml Squalan, enthaltend 7 mg MTB), Kernpeptid-Tris-Monopalmitat (15 mg), suspendiert in 0,6 ml Adjuvans, Kernpeptid-Tris-Triplamitat 20 mg/0,6 ml Adjuvans.
  • Die Ratten wurden in vier Gruppen zu je drei Ratten eingeteilt. Die erste Gruppe erhielt nur Adjuvans (positiver Vergleich), die zweite Gruppe erhielt Adjuvans mit Kernpeptid, die dritte Gruppe erhielt Kernpeptid.Tris.Monoplamitat, suspendiert in Adjuvans, und die letzte Gruppe erhielt Kernpeptid.Tris.Tripalmitat in Adjuvans. Die Ratten wurden mit den obigen Verbindungen in einem Volumen von 0,1 ml an der Schwanzwurzel injiziert. Grundlinienmessungen von Rattengewicht, Pfotenweite und Schwanzdurchmesser wurden durchgeführt am Tag 0 und danach am Tag 4, 7, 9, 14, 16, 18, 21, 25 und 28. Die Arthritis wurde eingestuft und die Tiere wurden, falls deutliche Schwellung, Rötung oder offensichtliche Beschwerden auftraten, getötet. Nicht alle mit MTB behandelten Ratten entwickelten Arthritis. Im Allgemeinen entwickelten mehr als 80% der Vergleichsratten Arthritis.
    • Ergebnisse:
  • Nach 18 Tagen entwickelten alle Tiere, denen Adjuvans verabreicht worden war, Arthritis und mussten getötet werden. Zwei der drei mit Kernpeptid behandelten Tiere (2/3) zeigten keine Anzeichen von Arthritis. In ähnlicher Weise zeigten zwei von drei Tieren, denen Kernpeptid.Tris.Tripalmitat gegeben wurde, keine Anzeichen von Arthritis. Alle Tiere, denen Kernpeptid.Tris.Monoplamitat und Adjuvans gegeben wurde, entwickelten Arthritis. Einsetzen und Entwicklung von Arthritis in dieser letzten Gruppe war jedoch 3- 5 Tage verzögert und die klinische Schwere (Anzahl der Gelenke, Pfotenschwellung, Gewichtsverlust) war im Vergleich mit den Vergleichen sehr herabgesetzt.
  • Experimente unter Verwendung von Adjuvans-induzierter Arthritis in Ratten zeigten in diesem Tiermodell, dass das Peptid und dessen Lipidkonjugat einen Schutzeffekt auf die Induktion von Arthritis hatten. Ergebnisse von Nachfolgeexperimenten unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Peptide (7 mg/Ratte) und Medikamenten sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 Wirkung verschiedener Peptide auf Adjuvans-induzierte Arthritis bei Ratten
  • *) CS = Cyclosporin, 50 mg/kg; DXM = Dexamethason (2 mg/kg).
  • +) Tiere entwickelten Arthritis, jedoch war das Einsetzten der Arthritis um 3-4 Tage verzögert.
  • Die Ergebnisse der obigen Experimente wiesen darauf hin, dass das Kernpeptid sowohl auf die Entzündung als auch auf deren Verzögerung, die Abnahme des Schweregrads und die Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit einen Einfluss hatte. Diese Wirkung war ähnlich jener, die bei der Co-Verabreichung von Cyclosporin und Adjuvans erzielt wurde. Cyclosporin ist ein gut bekanntes und vielfach verwendetes Immunsuppressivum. Es bestand kein willkürlicher Effekt der Peptidwirkung. Beste Ergebnisse wurden mit Kernpeptid, Peptid C und F erhalten. Kernpeptid und Peptid C haben beide geladene Aminogruppen an derselben Stelle, jedoch in umgekehrter Aminosäurenreihenfolge. Dies weist darauf hin, dass die geladene Gruppe und nicht die spezifische Aminosäure wichtig war. Im Gegensatz dazu wurde mit Peptid B oder D, die entweder ungeladene oder negativ geladene Aminosäuren enthielten, keine Wirkung beobachtet. Fortsetzung der Aminosäuren stromab zum Carboxyterminus zeigte keine negative Wirkung. Diese Beobachtung bestätigt, dass Carboxymodifizierung ohne Verlust der biologischen Aktivität durchgeführt werden kann. Daher können diese Peptide als Trägerpeptide zum Transport anderer chemischer Gruppen verwendet werden. Erhöhung der Aminosäureanzahl zwischen den beiden polaren geladenen Gruppen (Peptid E) ergab geringere Effizienz. Herabsetzung der Aminosäureanzahl zwischen den geladenen Gruppen (Peptid F) zeigte keine negative Wirkung.
    • Beispiel 12(b) Dosierungseffekt des Kernpeptids
  • Basierend auf früheren, von Whitehouse et al. (persönliche Mitteilung) durchgeführten Experimenten wurde eine anfängliche Dosis von 5-7 mg/Ratte verabreicht. Um die untere Grenze abzuschätzen, wurde eine Anzahl unterschiedlicher Kernpeptidkonzentrationen untersucht. Die Ergebnisse (Tabelle 4) wiesen darauf hin, dass zusätzlich zu einer spezifischen Wirkung des Kernpeptids, diese in ihrer Wirkung durch die Dosierung limitiert war. Tabelle 4 Wirkung der Kernpeptiddosierung auf Adjuvans-induzierte Arthritis
    • Beispiell 2(c) Schwanzdurchmesser-Messungen
  • Ein Merkmal von Adjuvans-induzierter Arthritis ist die Entwicklung von Entzündungen im Schwanz. Schwanzmessungen (mm) zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Ratten, denen Kochsalzlösung injiziert wurde, und Ratten, die mit Kernpeptid behandelt wurden. Die Schwanzdurchmesser MTB-behandelter waren jedoch signifikant erhöht (p < 0,001) im Vergleich zu kochsalzlösungs-oder kernpeptidbehandelten Ratten (p < 0,001); siehe Tabelle 5. Tabelle 5 Wirkung von Kernpeptid auf Schwanzentzündungen, bewertet anhand der Schwanzdicke (mm)
  • Zusätzlich zu den in den Schwänzen beobachteten Ödemen verursachte MTB alleine Geschwürbildung und Entzündungen an der Stelle der Injektion, welche bei Ratten, denen Kernpeptid oder Kochsalz verabreicht wurde, fehlten.
    • Beispiel 13 Experimentelle allergische Neuritis (EAN)
  • Um die Fähigkeit von Kernpeptid, die Schwere der durch T-Zellen induzierten Krankheit zu verzögern und zu verringern, weiter zu bestätigen, wurde ein anderes Modell (experimentelle allergische Neuritis) durch unabhängige Experimentatoren an einer anderen Institution (University of Sydney) "blind" getestet (Professor Pollard und Herr J. Taylor).
    • Materialien und Verfahren: Tiere:
  • Männliche Lewis-Ratten mit 239-451 Gramm Gewicht wurden aus einer Kolonie des Bosch Animal House, University of Sydney, oder von ARC, Perth, erhalten. Alle Experimente wurden gemäß der von der Animal Care and Ethics Committee of the University of Sydney genehmigten experimentellen Richtlinien durchgeführt.
    • Induktion von EAN:
  • Lewis-Ratten wurden in jeder Hinterbein-Fußsohle mit 50-75 ml Rinder-Peripher-Nervenmyelin (PNM), emulgiert in komplettem Freunds Adjuvans immunisiert. Die Immunisierungsemulsion bestand aus gleichen Volumina von Kochsalzlösung und inkomplettem Freunds Adjuvans (Sigma, USA), vermischt mit Rinder-PNM und MTB (Stamm H37RA, DIFCO), zugesetzt in 15 mg/ml bzw. 5 mg/ml. Wenn Tiere Eialbumin/Peptid erhielten, wurde das Peptid mit 70 mg/ml zur Immunisierungsemulsion zugegeben. Den Experimentatoren, die diese Experimente durchführten, war nicht bekannt, welches Peptid sich in der Immunisierungsemulsion befand.
  • Die Tiere wurde mindestens jeden 2. Tag nach der Immunisierung auf klinische Symptome untersucht und wurden unter Verwendung der folgenden Skala gereiht: 0 - normal; 0,5 - schwacher Schwanz; 1 - schlaffer Schwanz; 1,5 - schlaffer Schwanz und Ataxie der Hinterbeine; 2 - Paraparese; 2,5 - schlaffer Schwanz und schwere Paraparese; 3 - Paraplegie; 3,5 - schlaffer Schwanz und Paraplegie und Vorderbein-Parese; 4 - Quadriparese; 4,5 - schlaffer Schwanz und Quadriparese; 5 - tot.
    • Isolierung von peripherem Nervenmyelin:
  • Rinder-PMN wurde im Wesentlichen wie von Norton und Podulso (1973) beschrieben hergestel It.
    • Ergebnisse:
  • Ein stellvertretendes Beispiel ist in Fig. 1 gezeigt. In diesem Experiment verzögerte das Kernpeptid die Induktion und klinische Schwere der Krankheit. Ähnliche Daten wurden für Peptid C beobachtet. Diese Daten bestätigen die Effizienz von Kernpeptid und Peptid C als allgemeine Immunsuppressoren.
    • Beispiel 14 Diabetes in NOD/Lt (F)-Mäusen
  • In einem weiteren Modell T-Zellen-vermittelter Krankheit wurde der Effekt subkutan injizierten Kernpeptids auf die Induktion von Diabetes in NOD/Lt (F)-Mäusen durch einen unabhängigen Experimentator (Professor L Harrison, WEHI, Melbourne) "blind" getestet.
  • Es wird angenommen, dass ein zellulärer Autoimmunprozess, welcher die Pankreas- Insel-Betazellen selektiv zerstört, für die Entwicklung der insulinabhängigen Diabetes melfitus (IDDM) im Menschen und in den spontanen Tiermodellen, einschließlich der NOD-Maus (Leiter et al., 1987) verantwortlich ist. Eine häufige mit der Entwicklung von IDDM verbundenen histopathologische Eigenschaft ist Insulitis, das Vorhandensein von mononuklearen Zellen, überwiegend bestehend aus T-Lymphozyten und in einem geringeren Ausmaß aus Makrophagen (Foulis et al., 1986) innerhalb und um die Inseln. Experimentelle Strategien zielten auf die Unterdrückung zellulärer Autoimmunität, wie z. B. Neugeborenen-Thymektomie, Verabreichung von Cyclosporin A oder Verabreichung von Anti-T-Lymphozyten-Antikörpern, welche die Entwicklung von Diabetes verhindern (Campbell et al., 1991).
    • Tiere:
  • Am experimentellen Tag 0 10 Wochen alte NOD/Lt (F)-Mäuse. Dies ist ein Stamm hoher Inzidienzrate der gewöhnlich als Tiermodell für Diabetes verwendet wird.
    • Materialien:
  • Das Kernpeptid wurde in Squalan in einer Konzentration von 3,33 mg/ml in der Stammlösung gelöst. Eialbumin wurde als Vergleich verwendet und in Squalan in einer Konzentration von 3,33 mg/ml in der Stammlösung gelöst. Peptid und Eialbumin wurden kurz vor der Injektion mittel Vortex "solubilisiert". Insgesamt 250 mg (75 ml) wurden am Tag -1, 0 und 1 an der rechten Flanke subkutan injiziert. Am Tag 0 wurde den Mäusen 300 mg/mg Cyclophosphamid in Wasser peritoneal verabreicht. Blutzuckermessungen wurden an Tag 0, 10, 14 und 21 durchgeführt. Die behandelte Gruppe bestand aus 16, die Eialbumin-Vergleichsgruppe ebenfalls aus 16 Mäusen.
    • Ergebnisse:
  • Die Experimente demonstrieren eine Schutzwirkung des Kernpeptids auf die Induktion von Autoimmunbetazellenzerstörung, welche sich als Diabetes manifestiert (Tabelle 6). Dieser Befund bestätigt von neuem die allgemeine immunsuppressive Fähigkeit von Kernpeptid in einem anderen TCM-vermittelten Krankheitsmodell Tabelle 6 Wirkung von Kernpeptid auf die Induktion von Diabetes in NOD/Lt (F)-Mäusen
    • Zusammenfassung
  • In den letzten Jahren wurden eine sehr große Zahl unterschiedlicher Verfahren angewendet und ersonnen, um die Wechselwirkung zwischen TCR, MHC oder Antigen (trimolekularer Komplex) zu stören und so die Immunantwort zu beeinflussen. Das therapeutische Potential, das mit der Entwicklung dieser Ideen und Verfahren der Anwendung verbunden war, ist nicht übersehen worden. Die Strategien umfassten die Verwendung monoklonaler Antikörper zur Blockierung von MHC- oder TCR-Wechselwirkungen, die Blockierung von wichtigen Antikörpern gegen co-stimulierende oder regulatorische Proteine an der Zelloberfläche, die Vaccination mit krankheitsinduzierenden T-Zellen oder TCR-Epitopen, konkurrierenden Antigenen und Inhibierung von Cytokinen und deren Rezeptoren. Die Fähigkeit eines spezifischen kompetitiven Peptids, konstruiert zur Beeinflussung der Assemblierung, um die TCR-Funktion zu zerstören, ist bisher nicht berichtet und untersucht worden. Der Erfinder hat klar gezeigt, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, T-zellenvermittelte Immunantworten zu verhindern, und zwar durch einen bisher nicht beschriebenen Mechanismus in mindestens drei verschiedenen Modellen.
  • Die hierin beschriebenen Experimente wurden prinzipiell mit einem Kernpeptid durchgeführt, welches bewusst so ausgewählt wurde, dass es homolog zur bekannten Sequenz von Maus- und Ratten-TCR-Alphakette ist. Um die Homologie zur bekannten Humansequenz (Tabelle 1) zu maximieren, wäre jedoch für die klinische Behandlung von Menschen möglicherweise zu ein Peptid, welches anstelle von Leucin einen Phenylalaninrest in Richtung Aminoterminus des Kernpeptids enthält, zu bevorzugen.
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Claims (19)

1. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine Peptid der folgenden Formel:
A-B-C-D-E-, worin
A fehlt oder Glycin und eine 1 hydrophobe Aminosäure ist oder 1 oder 2 hydrophobe Aminosäuren ist,
B eine positiv geladene Aminosäure ist,
C ein Peptid ist, das aus 4 hydrophoben Aminosäuren besteht,
D eine positiv geladene Aminosäure ist und
E fehlt oder 1 bis 8 hydrophobe Aminosäuren ist.
2. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der A 2 hydrophobe Aminosäuren ist.
3. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der E 1 bis 3 hydrophobe Aminosäuren ist.
4. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der B Arginin ist und D Lysin ist oder B Lysin ist und D Arginin ist.
5. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Peptid die Sequenz Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val (Seq.-ID Nr. 5) aufweist.
6. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Peptid die Sequenz Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val (Seq.-ID Nr. 7) aufweist.
7. Therapeutische Zusammensetzung, nach Anspruch 1, in der das Peptid die Sequenz Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val (Seq.-ID Nr. 6) aufweist.
8. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Peptid die Sequenz Phe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val (Seq.-ID Nr. 8) aufweist.
9. Peptid mit der Sequenz Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val (Seq.-ID Nr. 5).
10. Peptid mit der Sequenz Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val (Seq.-ID Nr. 7).
11. Peptid mit der Sequenz Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val (Seq.-ID Nr. 6).
12. Peptid mit der Sequenz Phe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val (Seq.-ID Nr. 8).
13. Peptid der Formel:
A-B-C-D-E, worin:
A fehlt oder Glycin und 1 hydrophobe Aminosäure ist oder 1 oder 2 hydrophobe Aminosäuren ist,
B eine positiv geladene Aminosäure ist,
C ein Peptid ist, das aus 3 bis 5 hydrophoben Aminosäuren besteht,
D eine positiv geladene Aminosäure ist und
E fehlt oder bis zu 8 hydrophobe Aminosäuren ist,
zur Verwendung zum Hemmen der T-Zellen-Rezeptorfunktion.
14. Peptid nach Anspruch 13, worin das Peptid aus Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8 ausgewählt ist, zur Verwendung zum Hemmen der T- Zellen-Rezeptorfunktion.
15. Verwendung eines Peptids der Formel:
A-B-C-D-E, worin:
A fehlt oder Glycin und 1 hydrophobe Aminosäure ist oder 1 oder 2 hydrophobe Aminosäuren ist,
B eine positiv geladene Aminosäure ist,
C ein Peptid ist, das aus 3 bis 5 hydrophoben Aminosäuren besteht,
D eine positiv geladene Aminosäure ist und
E fehlt oder bis zu 8 hydrophobe Aminosäuren ist,
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, bei der T-Zellen rekrutiert werden oder an der sie beteiligt sind.
16. Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, bei der C ein Peptid ist, das aus 4 Aminosäuren besteht.
17. Verwendung nach Anspruch 16, worin das Peptid aus Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8 ausgewählt ist.
18. Verfahren zum Abgeben einer chemischen Gruppe an eine Zelle, welches das In vitro-Aussetzen der Zelle gegenüber der chemischen Gruppe umfasst, die an ein Peptid der Formel:
A-B-C-D-E konjugiert ist, worin:
A fehlt oder Glycin und 1 hydrophobe Aminosäure ist oder 1 oder 2 hydrophobe Aminosäuren ist,
B eine positiv geladene Aminosäure ist,
C ein Peptid ist, das aus 3 bis 5 hydrophoben Aminosäuren besteht,
D eine positiv geladene Aminosäure ist und
E fehlt oder bis zu 8 hydrophobe Aminosäuren ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, worin das Peptid aus Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8 ausgewählt ist.
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